Les techniques de fragmentation des immunoglobulines

A-Sepharose. On peut même pousser la purification en ajoutant une étape de chromatographie d’exclusion
moléculaire (Figure 2). La pureté finale des fragments Fab est vérifiée par SDS-PAGE. Ce protocole peut
être brièvement décrit comme suit:
- Faire dissoudre la quantité nécessaire de la papaïne dans un volume de tampon de digestion égal à celui de
la solution d’IgG à faire digérer. Utiliser les quantités optimales d’enzymes et d’anticorps ainsi que les temps
d’incubation préalablement déterminés à l’échelle pilote.
- Ajouter la solution de la papaïne ainsi préparée à la solution d’IgG dont la concentration est supérieure ou
égale à 1 mg/ml de PBS. Mélanger et incuber dans un bain-marie à 37°C pendant le temps requis.
- Arrêter la réaction en ajoutant de l’iodoacétamide à une concentration finale 0,03 M. Mélanger
soigneusement pour dissoudre totalement l’iodoacétamide.
- Dialyser le produit de la digestion contre le PBS (pH 8), à 4°C et pendant 12 à 24 h.
- Charger le mélange dialysé dans une colonne de protéine A-Sepharose CL-4B et collecter la fraction non
retenue qui contient les fragments Fab et l’enzyme. Si nécessaire, laver la colonne avec du PBS pour récolter
la totalité des Fab. Les IgG non digérés restent accrocher à la colonne.
- Concentrer la solution contenant les fragments Fab à un volume inférieur ou égal à 5 ml
- Charger cette solution dans une colonne de Sephacryl S-200 superfine (26 x 900 mm) et collecter les
fractions d’éluat correspondant aux protéines ayant un poids moléculaire de 50 kDa. Avant d’être mélangées
ensemble, ces fractions peuvent être analysées par SDS-PAGE.
- Déterminer la pureté finale et la concentration des fragments Fab, respectivement par SDS-PAGE à 10 %
dans des conditions non réductrices et par mesure de l’absorbance à 280 nm.
- Conserver les fragments Fab dans un tampon borate à 4°C ou dans du PBS contenant 0,02 % de NaN3 à -
70°C.
III- LA FRAGMENTATION D’IgG EN F(ab’)2 EN UTILISANT LA PEPSINE
La préparation des fragments F(ab’)2 (bivalents) se fait par une protéolyse de la molécule d’IgG à
l'aide de la pepsine. Les sous-classes d’IgG de souris possèdent deux sites sensibles au clivage pepsique
situés de chaque côté des ponts disulfures inter-chaînes lourdes. Un premier clivage peut se passer au niveau
du site situé du côté COOH-terminal des ponts disulfures donnant des F(ab’)2, c’est le cas des IgG1, IgG2a et
IgG3. Ce premier clivage peut être suivi par un deuxième au niveau du site situé du côté NH2-terminal des
ponts disulfures donnant des Fab’. Les IgG2b ne sont généralement pas digérées en F(ab’)2, mais en Fab et
Fab/c qui a un poids moléculaire proche de celui des F(ab’)2. Ceci est expliqué par le fait que les chaînes
lourdes de cette sous-classe sont glycosylées de façon asymétrique ce qui inverse la sensibilité relative des
deux sites de clivage à l’action de la pepsine. D’autre part, bien que l’IgG1 soit sensible à la pepsine, une
digestion plus stable de cette sous classe en F(ab’)2 peut être obtenue par la papaïne en absence de cystéine.
La ficine est aussi utile pour digérer les IgG1 en F(ab’)2.
Comme pour la technique de préparation des fragments Fab, celle de préparation de grandes
quantités de fragments F(ab’)2 nécessite une mise au point préalable à l’échelle pilote.
III.1- La fragmentation d’IgG en F(ab’)2 à l’échelle pilote en utilisant la pepsine
Ce protocole de fragmentation des IgG pour préparer des F(ab’)2 est identique à celui de la
fragmentation pilote avec la papaïne à l’exception du pH et du temps de la digestion qui varient. Le pH
optimum pour une digestion pepsique est autour de 2. Cependant, à ce faible pH les anticorps pourrait être
dénaturés ou être fragmentés en Fab ou en fragments encore plus petits et par conséquent un pH autour de 4
est recommandé. D’autres part, il est possible que la pepsine provoque une altération des sites de liaison des
molécules d’anticorps et pour cette raison un rapport enzyme / anticorps ne dépassant pas 1/20 est
recommandé. Deux niveaux de pH (4 et 4,5) ont été testés dans ces expériences pilote de mise au point. Le
protocole peut être résumé comme suit:
- Dialyser, pendant 4h et à 4°C, deux échantillons de 2 ml d’une solution à 3 mg/ml d’IgG purifiée contre
200 ml de tampon acétate pH 4,5 et pH 4, respectivement.
- Déterminer la concentration des deux solutions dialysées d’IgG en mesurant l’absorbance à 280 nm.
- Ajuster la concentration de chaque solution dialysée d’IgG à 2 mg/ml avec le tampon acétate
correspondant.
- Distribuer dans une première série de 16 microtubes, 100 µl de la solution d’IgG à 2 mg/ml, pH 4. Dans
une deuxième série de 16 microtubes, procéder de la même façon avec la solution d’IgG à 2 mg/ml, pH 4,5.
- Ajouter 100 µl d’une solution de pepsine à 0,1 mg/ml dans du tampon acétate pH 4 dans 8 microtubes
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