Université Paris XI THESE - iramis - CEA

Université Paris XI
FACULTE DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY
ECOLE DOCTORALE :
INNOVATION THERAPEUTIQUE : DU FONDAMENTAL A L’APPLIQUE
PÔLE : PHARMACOTECHNIE ET PHYSICO-CHIMIE
ANNEE 2001-2002 SERIE DOCTORAT N° 741
THESE
Présentée
A L’UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE
FACULTE DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY
UNIVERSITE PARIS XI
pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XI
par
M elle Sandrine WEISSE
Titre : Complexes cyclodextrines / ester de vitamine A :
stabilisation, solubilisation et promotion de l’absorption cutanée.
Soutenance le 14 octobre 2002 devant la commission d’examen composé de :
J-C. DEBOUZY ………..Rapporteur E. FATTAL
D. WOUESSIDJEWE …..Rapporteur F. DJEDAÏNI-PILARD
D. DUCHÊNE ………….Président du jury P. ANDRE
B. PERLY

2
A mon père, à ma mère
présents dans les bons comme dans les pires moments.
« Le poison est dans chaque substance et rien n’est exempt de poison.
Ce n’est que le dosage qui en fait soit un poison, soit un remède »
Paracelse (1493-1541)

1 H-RMN : résonance magnétique nucléaire du proton
Ac : anticorps
AchE : acétylcholinestérase
Ag : antigène
BSA : bovine serum albumine
CCM : chromatographie couche mince
CD : cyclodextrine(s)
CMC : concentration micellaire critique
Chol-βCD-Ac : cholestéryl béta-cyclodextrine acylée
COSY : correlation spectroscopy
DIMEB : heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose
ou diméthyl béta-cyclodextrine
D2O : eau deutérée
DMPC : dimyristoylphosphatidylcholine
DMSO :diméthyle sulphoxyde
d6-DMSO : diméthyle sulphoxyde hexadeutéré
DSC : differential scanning calorimetry
DTNB : 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoique acide)
E : épiderme
EDTA : acide éthylène diamine tétra acétique
EIA : enzyme immuno-assay
HCl : acide chlorydrique
HPLC : high performance liquide chromatography
IgG : immonoglobuline G
LR : liquide récepteur
Na2CO3 : carbonate disodique
NOESY : nuclear Overhauser effect
PVA : propionate de vitamine A
SC : stratum cornéum ou couche cornée
RAMEB : randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose
ROESY : rotating frame Overhauser effect spectroscopy
T : température
T-ROESY : transverse rotating frame Overhauser effect spectroscopy
UV : ultra-violet
3

4
TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES
5
6
INTRODUCTION GENERALE 8
PRESENTATION DES ACTEURS ET DU SUJET 13
1.2 LE RETINOL 13
1.2.1Historique 13
1.2.2Structure et origine 13
1.2.3Devenir dans l’organisme 15
1.2.4Rôles physiologiques 17
1.2.5Pénétration et absorption percutanée 22
1.2.6Inconvénients liés à ses propriétés physico-chimiques 23
1.3LES CYCLODEXTRINES 24
1.3.1Historique des cyclodextrines 24
1.3.2Structure et propriétés des cyclodextrines 26
1.3.3Inclusion – Complexation 29
1.3.4Applications des cyclodextrines. 33
1.3.5Toxicité des cyclodextrines 34
1.3.6Interaction avec les membranes biologiques 36
2. TRAVAUX ANTERIEURS 42
2.1MOYENS UTILISES POUR AMELIORER LA STABILITE ET LA
SOLUBILITE DE LA VITAMINE A DANS LES FORMES PHARMACEUTIQUES 42
2.1.1Emulsions et antioxydants 42
2.1.2Microparticules 44
2.1.3Divers 46
2.2INCLUSION DU RETINOL DANS LES CYCLODEXTRINES 47
2.2.1Méthodes de caractérisation des complexes d'inclusion 47
2.2.2Essais d'inclusion du rétinol et/ou de ses esters dans les cyclodextrines
naturelles ou modifiées 52
3.TRAVAUX PERSONNELS 60
3.2Chapitre 1 63
3.2.2Article n°1 63
3.2.3Brevet FR0201241 82
3.2.4Article n° 2 95
3.2.5Article n° 3 108
3.2.6DISCUSSION 126
3.3 CHAPITRE 2 132
3.3.1Article n°4 138
3.3.2Article n° 5 164
3.3.3DISCUSSION 179
CONCLUSION GENERALE 183
ANNEXES 186

ANNEXE 1 : LA PEAU 187
ANNEXE 2 : DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES 201
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 214
6

7
INTRODUCTION GENERALE

INTRODUCTION GENERALE
L'organisme vivant, en particulier humain est constitué d'un ensemble d'organes
interconnectés qui communiquent entre eux par la voie de messagers, de connections directes
et en particulier de la vascularisation. Ce système complexe est fragile. Il est donc important
d'établir une barrière entre ce fragile assemblage de fonctions vitales et le milieu extérieur,
source d'agressions multiples telles que les irradiations diverses, l'oxydation et les toxiques
présents dans l'environnement. Ce rôle, dans le cas des mammifères est dévolu à la peau.
Toutefois, il ne faut pas se limiter à penser que cette dernière n'est qu'une cuirasse inactive.
Elle est en elle-même un élément très actif pour isoler les compartiments et limiter les
agressions extérieures. Parmi ces dernières, les processus d'oxydation par l'oxygène, l'ozone et
les irradiations sont des éléments majeurs car ils contribuent de façon active à la formation de
radicaux libres pouvant conduire à des réactions non réversibles entraînant des affections
multiples. Dans ce rôle d'interface, la peau elle-même est la première soumise à toutes ces
agressions, entraînant des modifications de l'élasticité, les rides, les affections cutanées
directes et pouvant aller jusqu'à la cancérisation.
Ces processus sont modulés et atténués par de nombreux composants présents dans les
diverses couches de la peau. Une structure détaillée de ces différentes strates sera présentée
dans la suite de ce mémoire. Parmi ces composés, la vitamine A et ses dérivés jouent un rôle
essentiel en particulier dans la destruction des radicaux libres. Ces composés sont présents
naturellement dans la peau mais il paraît utile d'en augmenter la teneur pour retarder les effets
délétères des agressions extérieures. Cette amélioration de la teneur intrinsèque en vitamine A
pose toutefois de nombreux problèmes :
- La vitamine A et ses dérivés sont strictement insolubles dans l'eau
- Ces composés sont très facilement oxydables et cette oxydation peut conduire à la
formation d'acides rétinoïques très toxiques s'ils passent dans la circulation. La localisation de
ces composés actifs dans les différentes strates de la peau n'est pas indifférente.
8
Afin d'améliorer les performances des dérivés de vitamine A trois objectifs sont
essentiels sans pour autant rêver à un "élixir de jouvence". Les compagnies pharmaceutiques,
para-pharmaceutiques et cosmétiques développent sans cesse de nouveaux produits mais qui

ne sont parfois que des composés destinés à formuler la vitamine A sous forme acceptable
pour la peau. Nos objectifs sont différents :
- Il faut que la vitamine A soit stabilisée vis à vis de la dégradation par l'oxygène, la
température et surtout la lumière.
- La formation d'un composé hydrosoluble permettrait de disposer de nouvelles
formulations.
- Il est essentiel que le principe actif soit dirigé et reste dans les strates de la peau où
son action sera optimale.
Certes, de nombreuses méthodes ont déjà été utilisées pour atteindre ces objectifs,
comme nous le verrons plus loin dans ce mémoire, qu’elles soient mécaniques, chimiques ou
galéniques. Mais les résultats en terme de stabilité et surtout de solubilité restent insuffisants.
Dans le but de remplir les objectifs précédemment cités, plusieurs solutions seront
envisagées et testées ici. Ces études feront appel à de très nombreuses et diverses approches
scientifiques allant de la physico-chimie aux études sur peau humaine en passant par
l’immunologie, pour assurer le suivi des espèces impliquées, et la galénique. Ne désespérons
donc pas de voir un jour une nouvelle classe de dérivés destinés à nous protéger d'une partie
des agressions qui ne feront sans doute que croître. La nature nous a fourni des pistes, à nous
de les optimiser.
Notre choix concernant l’outil à utiliser c’est porté sur les cyclodextrines (CD). Celles-ci
sont déjà largement utilisées dans le milieu pharmaceutique, principalement comme adjuvant
de solubilisation pour améliorer la biodisponibilité de la molécule active et elles sont
considérées en cosmétologie comme des promoteurs d’absorption. Notre approche consiste à
utiliser les propriétés des cyclodextrines afin d’obtenir une solution aqueuse contenant une
forme chimiquement stable de vitamine A et permettant une évaluation biologique de la
vectorisation de la vitamine A dans la peau. Il faut entendre propriétés au sens large, que ce
soit leurs propriétés d’inclusions ou de formation de systèmes organisés.
9
Nous avions aussi le choix quant au dérivé de vitamine A à choisir. En effet la vitamine
A pure, qui correspond au rétinol est trop instable pour permettre une utilisation courante à
l’échelle du laboratoire. Ainsi, il est bien plus courant d’utiliser un des esters de la vitamine

A, dont l’activité est proche. Le propionate de vitamine A (PVA) fut choisit parmi plusieurs
esters de la vitamine A sur la base d’une étude préalable destinée à évaluer leur efficacité en
terme de croissance sur des cultures de fibroblastes (cellules dermiques) humains. Cette étude
a été effectuée il y a plusieurs années par l’équipe du département de recherche et
développement de LVMH Branche Parfums et Cosmétiques à Orléans.
Ce travail de thèse débute par la présentation des acteurs - à savoir la vitamine A et les
cyclodextrines – et par une étude bibliographique des moyens utilisés par le passé pour
améliorer les propriétés physico-chimiques de la vitamine A, y compris les cyclodextrines.
La suite est consacrée aux travaux personnels et se divise en deux chapitres décrivant
chacun une approche différente et donc l’utilisation d’une cyclodextrine différente.
Dans le premier chapitre sont décrits les résultats obtenus avec des cyclodextrines
commerciales. Les premiers essais ont été faits au cours du stage de recherche de DEA qui a
précédé cette thèse, avec les cyclodextrines naturelles αCD, βCD et γCD et l’étude des
composés d’inclusion obtenus est présentée dans un premier article.
Les trois autres publications de ce premier chapitre sont consacrées aux résultats obtenus
avec la per(2,6-O-diméthyle)βCD commerciale (Rameb). Les caractéristiques de solubilité et
stabilité du complexe d’inclusion Rameb/PVA ont permis la formation d’un gel aqueux à base
de Rameb/PVA et l’étude de la pénétration de l’hôte et de son invité dans des échantillons de
peau. Le PVA est facilement dosé par HPLC et pour la Rameb nous nous sommes tourné vers
les dosages immunoenzymatiques.
10
Le second chapitre est consacré à des dérivés de cyclodextrines synthétisés au
Laboratoire sur le modèle des cholestéryl-cyclodextrines [Auzély-Velty, 1999, 2000], c’est à
dire des dérivés obtenus en greffant un cholestérol sur une cyclodextrine monofonctionnalisée.
Dans un premier article, nous regarderons les remarquables propriétés d’insertion dans les
membranes du dérivé Cholestéryl-per(2,6-O-diméthyle)βCD ou Chol-Dimeb, grâce à des
films modèles de phospholipides : les films noirs.
Nous avons ensuite choisi un dérivé insoluble dans l’eau et capable d’interactions avec
les bicouches lipidiques et l’avons rendu encore plus hydrophobe en acétylant la partie
cyclodextrine. Le but est d’obtenir un composé capable de former des nanoparticules afin

d’obtenir un nouveau type de vecteur pour le PVA et d’étudier la pénétration cutanée du PVA
à partir de ce vecteur.
Finalement, une comparaison pourra être faite entre les résultats de pénétration sur peau
obtenus avec le PVA sous forme moléculaire dans le complexe Rameb/PVA et les résultats
obtenus avec le PVA sous forme particulaire.
Toutes les études de pénétration sur peau ont été effectuées dans le laboratoire de
toxicologie de LVMH – R&D – Branche Parfums et Cosmétique, à Orléans.
L’étude des films noirs par réflectivité des rayons X a été effectuée sous la direction de
J.J Benattar au Service de Physique de l’Etat condensé du CEA Saclay.
11
Les dosages immunoenzymatiques par compétition de la Rameb ont été effectués sous la
direction de C. Créminon au Service de Pharmacologie et d’Immunologie du CEA Saclay.

12
1. PRESENTATION DES ACTEURS
ET DU SUJET

PRESENTATION DES ACTEURS ET DU SUJET
1.2 LE RETINOL
1.2.1 Historique
Dès l'antiquité, on a traité avec succès des malades atteints d'héméralopie (diminution
importante de la vision crépusculaire) en leur faisant absorber du foie, sans avoir la moindre
idée de l'existence de substances vitaminiques. Dans la seconde moitié du XIX ième siècle,
apparaît la notion que certaines affections ophtalmologiques surviennent essentiellement chez
des populations ou des individus malnutris, et peuvent donc être en rapport avec une
insuffisance quantitative ou qualitative de la ration alimentaire. C'est en 1909 que F.G.
Hopkins et W. Stepp s'aperçoivent que certaines substances liposolubles, présentes dans
l'alimentation, sont indispensables à la croissance des rats et des souris. Ce facteur de
croissance liposoluble, auquel on donne le nom de vitamine A, en reprenant le terme proposé
par C. Funk à propos de la thiamine, est ensuite extrait du beurre et du jaune d'œuf par E.V.
McCollum et M. Davis (1913). La structure chimique est définie par P. Karrer en 1931 et la
synthèse réalisée en 1947 par O. Isler dans les laboratoires F. Hoffman-La Roche [LeGrusse,
1993].
1.2.2 Structure et origine
13
La vitamine A (rétinol) est présente dans les produits d'origine animale. Elle se trouve
dans la fraction lipidique, matière grasse du lait et des fromages, et dans le foie des animaux
qui est l'organe de stockage. On peut donc l'extraire de ces produits naturels (huile de foie de
poisson par exemple), mais ceux ci contiennent plusieurs isomères [Lehninger, 1994] et donc
on n'utilise pratiquement plus actuellement en thérapeutique que la vitamine A synthétique. La
vitamine A peut aussi être synthétisée par le corps humain à partie de pro-vitamine A tels les
caroténoïdes (ex : béta-carotène, lycopène) que l'on trouve surtout dans les végétaux : carottes,
melons, abricots, mangues, épinards, tomates.. .

Figure 1. Structure de la béta-carotène
Les rétinoïdes, quant à eux, ne sont pas des vitamines mais des substances naturelles ou
synthétiques qui sont dérivées de la vitamine A ou qui lui sont apparentées structurellement.
Ils ne doivent pas être confondus avec elle. Ils sont pharmacologiquement plus actifs mais
tératogènes. De nombreux produits ont été synthétisés dans le but de développer certaines
propriétés de la vitamine A tout en diminuant les signes d'hypervitaminose. Cette dissociation
des propriétés de la vitamine A est mesurée par un index thérapeutique. Trois générations de
rétinoïdes ont vu le jour avec un index thérapeutique toujours plus élevé :
- Première génération : dérivés naturels de la vitamine A : trétinoïne (acide trans-
rétinoïque), isotrétinoïne (acide 13-cis-rétinoïque), rétinol…
- Deuxième génération : rétinoïdes monoaromatiques (étrétinate, acitrétine)
- Troisième génération : rétinoïdes polyaromatiques (arotinoïdes)
Ci-dessous quelques exemples de structures chimiques de rétinoïdes
14
Figure 2 . Rétinol R= CH2OH Rétinal R= CHO
Trétinoïne ou ac. rétinoïque R=COOH
Figure 3. Acide13-cis-rétinoïque ou isotrétinoïne R = COOH

Figure 4. Un arotinoïde
Figure 5. Etrétinate R=OC2H5
Le rétinol est un alcool primaire C20H30O composé d’un noyau à six atomes de carbone et
d’une chaîne latérale possédant 5 doubles liaisons conjuguées [diméthyl-3,7 (triméthyl-2,6,6
cyclohexène-1 yl)-9 nonatétraène-2,4,6,8ol-1]. La forme biologique la plus active est le rétinol
tout-trans ou trans-rétinol (les 5 doubles liaisons de forme trans).
1.2.3 Devenir dans l’organisme
15
L'alimentation nous apporte de la vitamine A sous différentes formes. Les produits
d'origine animale contiennent des esters du rétinol, principalement du palmitate. Les végétaux
contiennent des caroténoïdes. Dans l'estomac, tous sont libérés des protéines alimentaires pour
être hydrolysés dans l'intestin grêle sous l'action conjuguée de la bile et des enzymes
pancréatiques. Le rétinol et les caroténoïdes sont alors incorporés aux micelles présents et
absorbés par un mécanisme de transport actif. Le rétinol et les caroténoïdes sont absorbés et
métabolisés à l'intérieur de la cellule intestinale. La majorité du rétinol est réestérifiée en
palmitate et incorporé aux chylomicrons (lipoprotéine plasmatique constituée d’un cœur de
triacylglycérols stabilisé par une enveloppe protéique et phospholipidique et qui transporte les
lipides de l’intestin vers les tissus). Les caroténoïdes sont partiellement hydrolysés en rétinal
par une dioxygénase puis réduits en rétinol et également incorporés aux chylomicrons. Ceux
ci sont excrétés dans la lymphe qui rejoint la circulation générale par le canal thoracique. Une
petite partie de rétinol et de béta-catotène passe dans la circulation sans subir de
modifications. Les esters du rétinol plasmatiques sont captés par les cellules hépatiques et le
rétinol est libéré par une hydrolase. Il se lie alors à un transporteur spécifique cytoplasmique,

la Retinol Binding Protéine cytoplasmique (RBPc), qui le transporte vers le site de stockage :
les globules lipidiques des hépatocytes et des lipocytes. A partir du foie, le rétinol peut être
libéré dans le sang où il est transporté par la Retinol Binding Protéine plasmatique (RBPp). Le
rétinol lié à la RBPp se fixe sur l"albumine et le complexe ainsi formé constitue la principale
forme circulante de vitamine A. Au niveau des cellules, le rétinol est reconnu par un récepteur
membranaire spécifique, capté par la cellule et repris en charge par la RBPc. Il est transformé
dans la cellule cible car pour être actif le rétinol doit être oxydé. Il se forme alors du rétinal
qui peut se transformer par une nouvelle oxydation en acide rétinoïque tout-trans. La première
réaction est réversible, la seconde ne l'est pas. L'acide rétinoïque est transporté par la RABPc
dans le noyau où il exerce son action.
ALIMENTATION
ESTOMAC
INTESTIN
CELLULE
INTESTINALE
LYMPHE
SANG
CELLULE
HEPATIQUE
protéines animales
rétinyl esters
rétinyl esters
rétinol
micelles
protéines végétales
caroténoïdes
caroténoïdes
caroténoïdes
rétinol caroténoïdes
rétinyl esters rétinal
chylomicrons rétinol
rétinyl esters
rétinol-RBPc
rétinol
rétinyl
palmitate
chylomicrons
16
rétinyl esters rétinol - RBPp-préalbumine
globule
lipidique
RBPc-rétinol
RALBPc-rétinal
RABPc-acide
rétinoïque
Figure 6 . Shéma de l’absorption et distribution de la vitamine A
esters
phosphate
glucuronide
base de
Schiff
glucuronide
AUTRE
CELLULE

1.2.4 Rôles physiologiques
Lors de la découverte de la vitamine A au début du siècle, deux équipes (MacCollum et
Davis, Osborne et Mendel) tentèrent chacun la même expérience : une hypovitaminose induite
chez le rat jeune. Celle-ci entraîne une perturbation de la croissance, les os et le système
nerveux ne peuvent se développer normalement. La peau devient sèche et épaisse. La vision
est fortement altérée (surtout la vision nocturne). Enfin les sujets adultes deviennent stériles.
Ces molécules possèdent aussi un fort pouvoir tératogène, des malformations importantes sont
observables après administration de rétinoïdes à des animaux gravides. Au fil des études il est
apparu que la vitamine A était impliquée dans plusieurs fonctions majeures de l’organisme
[Sporn 1986].
a ) Vision (Fig.7)
La vision de nuit, ou l’adaptation à l'obscurité, est un phénomène physico-chimique lié à
la présence, dans les cellules en bâtonnets de la rétine, d'un pigment photosensible : la
rhodopsine dont la synthèse s'effectue à partir d'un dérivé de vitamine A, le 11-cis-rétinal, et
d'une protéine, l'opsine. Lorsque la rhodopsine est exposée à une lumière de faible intensité, le
11-cis-rétinal est isomérisé en trans-rétinal, ce qui entraîne une cascade de réactions dont la
conséquence finale est la décomposition de la rhodopsine et la production d'un influx nerveux.
La vision des formes et des couleurs fait appel au même mécanisme grâce à la présence dans
les cellules en cônes de la rétine de trois pigments photosensibles également synthétisés à
partir du 11-cis-rétinal. Il est important de savoir que la carence en vitamine A, qui est la
première cause de mortalité infantile dans de nombreux pays en voie de développement, est
aussi la première cause de cécité dans le monde [Head, 1999].
influx nerveux
rétinol plasmatique
cis-rétinal
+
opsine
trans-rétinal
+
opsine
obscurité
RHODOPSINE
lumière
de faible intensité
17

Figure 7. Rôle du rétinol dans le processus de vision
b) Différentiation cellulaire
Si le rétinal est la molécule impliquée dans la vision, c'est par contre l'acide rétinoïque
qui agit dans le noyau au niveau de la différentiation cellulaire. L’acide rétinoïque et ses
isomères agissent comme des hormones pour réguler l’expression des gênes et ainsi influencer
de nombreux processus physiologiques. L’acide rétinoïque tout-trans est transporté par une
protéine (Cytoplasmic Retinoic Acid Binding Protein) vers le noyau de la cellule où il se lie a
son récepteur, le Retinoic Acid Nuclear Receptor. Ce récepteur RAR appartient à la super
famille des récepteurs nucléaires recevant les stéroïdes, les prostaglandines, les hormones
thyroïdiennes, la vitamine D et certaines molécules intervenant dans la prolifération de
cellules spécifiques. Les isomères de l’acide rétinoïque tout-trans se lient à un récepteur
légèrement différent : le RXR. Une fois liés à un acide rétinoïque, RAR et RXR forment
ensemble un hétérodimère RAR/RXR qui va se lier à une région spécifique d’un chromosome
appelée RARE (retinoic acid response elements), stimulant ou inhibant la transcription de
certains gênes. Ainsi, en jouant le rôle de facteur de transcription de gênes spécifiques,
l ‘acide rétinoïque joue un rôle majeur dans la croissance, la différentiation et la mort des
cellules [Lampen, 2000 ; Lotan, 1980 ; Hoffman, 1994]. La plupart des effets physiologiques
attribués à la vitamine A résultent de ce rôle dans la différentiation cellulaire.
c) Reproduction
La vitamine A intervient dans le développement des spermatozoïdes, des ovaires et du
placenta, la croissance de l’embryon, ainsi que dans la prolifération et la différentiation de
l’épithélium. Un taux sérique faible en vitamine A chez la mère est associé à une mortalité et
une morbidité infantile accentuée. Une déficience en vitamine A peut donner différentes
malformations embryonnaires notamment au niveau des reins, de l’œil et des oreilles [Raz,
1999]. De même, les enfants de faibles poids à la naissance, les retards de croissance et les
infections respiratoires résultant d’immuno-déficience sont plus communs chez les enfants nés
de mère déficiente en vitamine A.
d) Système immunitaire
18

A ses débuts, la vitamine A était connue comme «la vitamine anti-infection » car elle est
essentielle au bon fonctionnement du système immunitaire. Elle joue un rôle important dans le
développement et la différentiation des cellules sanguines blanches, l’activation des
lymphocytes T passant par la liaison de l’acide rétinoïque tout-trans à son récepteur RAR.
e) Oncologie
Le rôle déterminant de la vitamine A (par l'intermédiaire de l'acide rétinoïque) dans le
contrôle de la croissance et de la différentiation cellulaire lui confère un intérêt particulier en
oncologie. La vitamine A et ses esters sont capables d’inhiber la carcinogénèse. En effet, ils
se sont montrés efficaces dans un certain nombre d’expériences in vivo sur des cancers du
poumon, du sein, du colon, de la prostate et de la peau [Niles, 2000 ; Lippman, 1994]. De
nombreux rétinoïdes on été utilisés seuls ou en association pour le traitement de plusieurs
cancers, tel le carcinome des cellules basales, le carcinome des cellules squameuses de la
peau, les mélanomes, le lymphome des cellules T cutanées, la leucémie aigüe à
promyélocytes, les carcinomes ovariens, les carcinomes du poumon, du sein, de la prostate, de
la bouche, des cellules rénales et des cellules squameuses de la tête et du cou et le syndrôme
nevus displasique [Hunter, 1994].
Les récepteurs RAR et RXR (qui se divisent chacun en plusieurs sous classes) semblent
être exprimés différemment en fonction du tissu et de son action biologique. La relation entre
les variations observées dans l’expression des récepteurs par l’organe cible et la réponse aux
agents anticancéreux est actuellement le sujet de nombreuses études. Les mécanismes par
lesquels les rétinoïdes exercent leur action anticancéreuse pourraient comprendre un large
éventail de voies. Par exemple, une étude in vitro a montré une activité limitée des dérivés de
l’acide rétinoïque sur des lignées cellulaires issues de cancer ovarien. Toutefois, une
inhibition significative de la prolifération a été obtenue en associant l’acide rétinoïque tout-
trans avec le TGF-bêta (transforming growth factor-beta). Ce dernier étant produit par la
surface épithéliale des ovaires sains, les dérivés de l’acide rétinoïque et les inducteur du TGF-
bêta pourraient avoir une activité in vivo chimio-préventive [Dabal, 1995].
Le béta-carotène, en dehors de son rôle de provitamine A, possède des propriétés propres
d'agent anti-oxydant. Il possède la faculté de piéger les radicaux libres et de désactiver les
molécules d'oxygène hautement réactives (oxygène singulet). Un grand nombre d'études
épidémiologique a démontré que de faibles apports en béta-carotène sont associés à une
augmentation du risque de développer certains cancers (poumon, col utérin, œsophage, sein,
vessie…..) [Le Grusse, 1994].
19

Le rétinol, ses esters et les isomères de l’acide rétinoïque (tout-trans, 9cis et 13cis) sont
les rétinoïdes les plus utilisés dans les essais cliniques actuellement. Mais les traitements par
voie systémique sont limités par la forte toxicité de ses produits qui résulte de l’activation de
nombreuses voies. Cette toxicité concerne la peau et les muqueuses (sécheresse,
desquamation, prurit, dermatoses, photosensibilité), le foie (élévation réversible des enzymes
hépatiques), le squelette (calcification des ligaments), le système nerveux central (migraines)
et le taux sérique des lipides [Smith, 1992 ].
f) Dermatologie
L’action de la vitamine A sur la prolifération et la différenciation des épithéliums en fait
une molécule de grand intérêt en dermatologie. La première utilisation des rétinoïdes en
dermatologie remonte à 1959 avec les travaux de Stüttgen [Stüttgen, 1959] qui compris que
puisque le rétinol et ses esters étaient efficaces dans le traitement de plusieurs pathologies,
lorsque donnés par voie cutanée mais pas par voie orale, la molécule efficace devait être un
métabolite, par exemple la forme acide. Plus tard, il rapporta des résultats probants dans le
traitement de kératoses actiniques et séborrhéiques, sur les verrues de type viral et le
carcinome des cellules basales. Quelques années plus tard, Kligman et coll. [Kligman, 1969]
rapportèrent des effets bénéfiques sur l’acné vulgaris, les ichtyoses, le psoriasis, le lichen et
les lésions précancéreuses, ainsi que les mélanomes de la peau. Plus tard, ces effets sur le
traitement du vieillissement de la peau induit par les rayons lumineux furent reportés.
20
Les mécanismes d’action des rétinoïdes sur la peau sont encore le sujet de nombreuses
recherches, mais certains faits ont déjà été clairement établis.
En ce qui concerne l’épiderme, ils jouent un rôle important dans la prolifération des
cellules épidermiques, la kératinisation et les phénomènes de desquamation [Torras, 1996 ;
Fisher, 1996]. Ils perturbent aussi la synthèse kératinique. Des études sur des kératinocytes en
culture ont montré la formation d’une kératine spécifique d’épithélium non différentié après
traitement des cellules avec de l’acide rétinoïque tout-trans. D’autres études in vitro ont
montré que les rétinoïdes sont capables d’inhiber la prolifération des sébocytes et de modifier
leur différentiation ainsi que la composition de la matrice extracellulaire. L‘effet des
rétinoïdes sur ces cellules semble être dose-dépendant [Gendimenico, 1993], en effet une
étude portant sur la morphogénèse d’épithélium reconstruit a montré qu’une faible dose
d’acide rétinoïque tout-trans permet une formation optimale de l’épiderme, une dose plus
importante produisant un effet inverse. Au niveau dermique, ils influencent la prolifération
des fibroblastes et le métabolisme du collagène. Lors de la réaction inflammatoire, ils

montrent une activité immunomodulatrice et préviennent la croissance tumorale. La forme
active dans la peau est l’acide retinoïque. Par voie topique, l’acide rétinoique tout-trans est
converti dans l’épiderme (et probablement dans le derme) en acide 13-cis, 9-cis, et 4-
hydroxyrétinoïque. Seule la moitié approximativement reste sous forme tout-trans.
Paradoxalement, in vivo, les rétinoïdes donnent des effets inverses de ce que l’on peut
observer sur cultures cellulaires : les rétinoïdes induisent une hyperprolifération des
kératinocytes se traduisant par une hyperplasie de l’épiderme avec accumulation de matière
intercellulaire, le stratum cornéum ainsi que l’épiderme apparaissent désorganisés. Cette
différence semble être due au fait que la réponse des cellules aux rétinoïdes diffère en fonction
du contexte des autres signaux. De plus les cellules en cultures expriment beaucoup moins de
récepteurs aux rétinoïdes que des cellules in vivo. Malgré ces observations tendant à montrer
un effet négatif des rétinoïdes in vivo, ils sont très efficaces dans de nombreuses indications
cliniques : acide rétinoïque tout-trans et 13-cis (Roaccutane ® ), adapalène (Differine ® ) pour
l’acné, l’étrétinate (Tigason ® ) pour le psoriasis…….
g) Cosmétologie
21
Dans le domaine de la cosmétologie, les rétinoïdes sont utilisés depuis une vingtaine
d’années. Le premier article sur l’utilisation topique d’acide rétinoïque pour le traitement du
vieillissement cutané induit par la lumière date de 1983. Cordero et coll. [Cordero, 1983]
observèrent une amélioration des rides faciales et un adoucissement de la peau après
traitement par 0.001 à 0.05% d’acide rétinoïque pendant 6 mois.
L’acide rétinoïque agit sur le vieillissement photo-induit en modulant le programme de
différentiation cellulaire impliqué dans la pathologie concernée [Torras, 1996]. Le
vieillissement photo-induit de la peau se traduit au niveau épidermique par d’importants
dommages, à savoir une grande atypie cellulaire, la mort prématurée de certaines cellules avec
contraction du cytoplasme et perte de la membrane cellulaire, enfin la perte de la polarité et
l’apparition de modèles désorganisés (dysplasie). Ces changements se traduisent rapidement
cliniquement par une atrophie avec diminution du nombre de couches cellulaires, par des
cellules plus petites, rétractées, par l’aplatissement de la jonction dermo-épidermique et par
l’apparition de gros granules de mélanines près du noyau des kératinocytes. Il est observé un
épaississement irrégulier avec des infiltrats inflammatoires et une dégénérescence massive
élastosique. Après traitement par l’acide rétinoïque on observe au microscope une disparition
quasi-totale de la dysplasie et de l’atypie, il y a restauration de la polarité, élimination des

kératoses actiniques, l’épiderme rosit et la couche cornée devient plus fine. Les mélanocytes
qui avaient tendance à emmagasiner des amas de grains de mélanine, donnant une apparence
tachetée à la peau, reprennent leur aspect normal et leur contenu en mélanine devient plus
uniforme. Les cellules de Langerhans sont plus actives, ce qui implique une plus grande
immunocompétence. Macrocospiquement, les rides profondes et l’aspect râpeux au toucher
sont significativement améliorés mais moins que les rides superficielles [Montassier, 1996].
Au niveau du derme, la peau présentant un vieillissement photo-induit contient peu de
fibrocytes, ceux ci sont déformés, peu actifs et dans certains cas la membrane est rompue. Le
collagène présent sous la lame basale est tacheté, éparpillé, rompu et distribué au hasard.
Après traitement par l'acide rétinoïque les fibroblastes deviennent hyperactifs, la lame basale
est réparée et du collagène nouvellement formé et d'apparence normale est retrouvé sous
forme de faisceaux orientés parallèlement à la basale, repoussant vers le derme plus profond le
vieux matériel élastosique. Tout ceci explique l'amélioration des fines ridules et tendrait à
prouver qu'un traitement prolongé pourrait améliorer les rides plus profondes.
1.2.5 Pénétration et absorption percutanée
Les rétinoïdes appliqués par voie cutanée sont thérapeutiquement actifs à faible
concentration. Les études de pharmacocinétique cutanée se concentrent sur le shéma de
distribution dans la peau, l’atteinte de la circulation sanguine et le mode d’excrétion. Deux
voies de pénétration doivent être prises en compte (cf. Annexe 1 – La peau) : la voie
transépidermale, qui donne lieu à une augmentation typique du gradient de concentration
épiderme/derme et qui fait très certainement partie du mode d’action impliqué dans les
désordres de la kératinisation ; et la voie transfolliculaire qui intervient dans les désordres
folliculaires tels que l’acné. La partie cutanée de la pharmacocinétique des rétinoïdes dépend
largemant de leur structure chimique et donc varie. Toutefois, on trouve des aspects communs
comme de hautes concentrations cutanées, alors que le passage dans la circulation générale
parait faible, donnant lieu à des concentrations difficilement mesurables. Pour la
pharmacocinétique, l’application topique présente des intérêts majeurs par rapport à la voie
systémique. Les rétinoïdes peuvent être ciblés vers le site voulu, avec une toxicité systémique
supprimée.
22

1.2.6 Inconvénients liés à ses propriétés physico-chimiques
Outre la toxicité, la vitamine A pose d’autres problèmes : insolubilité totale dans l’eau
et instabilité chimique. Le rétinol et ses esters se présente sous forme de cristaux ou de
solutions huileuses insolubles dans l’eau, solubles dans les solvants organiques (alcool,
acétone, éther, chloroforme..)
⇒ Solubilité : le rétinol tout-trans est un composé hydrophobe et liposoluble : il est
pratiquement insoluble dans l'eau mais facilement soluble dans les solvants organiques
(éthanol, chloroforme, éther, éther de pétrole,.......).
⇒ Stabilité : il est hautement instable en présence d'oxygène (ou d'oxydants) et se
décompose en quelques jours à l'air libre. Il est aussi très sensible à la lumière et à la chaleur :
la lumière catalyse l'isomérisation des doubles liaisons et lorqu'elle est très intense d'autres
réactions photochimiques plus drastiques ont lieu, provoquant une dimérisation et amenant à
la formation de kitol et autres dimères. En absence d'oxygène, la formation de kitol ou la
dégradation de la vitamine A sera beaucoup plus rapide si les échantillons sont éclairés. Et
même dans des conditions parfaitement inertes, la stabilité dans le noir de la vitamine A n'est
pas infinie Ceci est du à la formation de kitol induite par la chaleur [Runge, 2000].
La vitamine A est stable en milieu basique mais très sensible aux acides qui provoquent
des réarrangements des doubles liaisons de la chaîne aliphatique. On obtient alors un mélange
de produits déshydratés et réarrangés sous l'effet de l'oxydation [Blomhoff, 1994].
Les esters du rétinol sont un peu plus stables à l'air mais en fait l'isomérisation n'est que
ralentie. En effet, en solution en milieu acide, on aura toujours une évolution lente de la forme
native tout-trans vers la forme cis (i.e., 13-cis rétinol, 9-cis rétinol et 9, 13-di-cis rétinol) pour
aboutir à un mélange d'environ 66% de tout-trans et 33% de forme cis, qui est moins active
[Sarama , 1995].
23
Les chercheurs ont donc du faire preuve d’ingéniosité pour trouver des formulations
permettant d’améliorer la stabilité et la solubilité de la vitamine A afin de favoriser son
incorporation dans les différentes formes galéniques actuellement utilisées, comme nous le
verrons dans la section 2.1 (section Travaux antérieurs).

1.3 LES CYCLODEXTRINES
1.3.1 Historique des cyclodextrines
En 1891, Villiers [Villiers, 1891] isolait pour la première fois un groupe
d’oligosaccharides non réducteurs provenant de la dégradation enzymatique de l’amidon par
une amylase (cyclodextrine glucosyl transférase) produite par différents bacilles dont Bacillus
macerans. Villiers a isolé 3 g d’une substance cristalline ((C6H10O5)2 3H2O) à partir de la
digestion de 1 kg d’amidon par une souche de micro-organismes. Ces produits (Villiers met
en évidence la présence de deux produits, probablement l’α- et la β-cyclodextrine) possèdent
des particularités physico-chimiques proches de celles de la cellulose, il les baptise donc
« cellulosines ».
Schardinger [Schardinger, 1904 et 1905], 20 ans plus tard, isole la souche microbienne
responsable de la formation de ces « cellulosines », qu’il dénomme Bacillus Macerans et,
décrit le mode de purification et de préparation de ces oligosaccharides. Il met aussi en
lumière la capacité de ces dextrines (appellation générale des produits de dégradation de
l’amidon) à former des adduits particuliers avec les molécules de diiode. La distinction entre
l’α-dextrine et la β-dextrine est due à leur différence quant aux complexes cristallins formés
avec l’iode. Le complexe de l’α-dextrine est gris-vert alors que celui formé par la β-dextrine
est rouge-brun.
C’est en 1932 que Prigsheim [Prigsheim, 1932] et son équipe démontrent que ces
produits ont la propriété de former des complexes avec des molécules organiques. D. French,
F. Cramer et K. Freudenberg contribuèrent également grandement à la connaissance des
cyclodextrines et à l’élucidation de leur structure durant les années 30-40. Freudenberg et son
équipe démontrent alors que ces oligosaccharides sont constitués d’un enchaînement de n
unités α-D-glucopyranosidiques, la fraction principale contenant
l’alpha et la bêta-cyclodextrine (possédant respectivement 6 et 7 unités). De même le postulat
en la capacité des cyclodextrines à former des composés d’inclusion [Freudenberg, 1938] est
posé. C’est cette même équipe qui, en 1948, découvre la γ-cyclodextrine (constituée de 8
unités glucose) et qui détermine entièrement sa structure [Freudenberg,1953].
Au début des années 1950, les équipes de French et de Cramer étudièrent de façon
intensive les productions enzymatiques de cyclodextrines, leurs purifications, et leurs
caractérisations physico-chimiques.
24

HO
HO
HO
HO
O
O
O
O
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
HO
O
HO
OH
O
O
HO
OH
O
OH
OH
γ cyclodextrine
O
HO
HO
HO
O
HO
O
O
O
OH
OH
O
OH
OH
Forme spatiale
HO
4
3
Forme spatiale
OH
6 6 '
5
2
O
OH 1
O
1
Unité glucose en C4 Figure 8. Formule générale des CDs et représentation schématique de leur structure
tridimensionnelle.
Cette propriété des cyclodextrines à former des complexes d’inclusion devient alors le
sujet d’études intensives, notamment par l’équipe de Cramer [Cramer, 1954]. C’est ainsi que
le tout premier brevet concernant l’application des cyclodextrines pour la mise en forme d’un
composé à activité biologique est déposé en 1953 [Freudenberg, 1953]. A partir de ce
moment, on observe une recrudescence de l’étude des cyclodextrines, tant du point de vue de
leur fabrication industrielle, que de l’exploitation de leurs propriétés, de leurs modifications
chimiques ou bien encore, de leurs domaines d’applications [Duchêne, 1991 ; Atwood, 1996 ;
Wenz ,1994 ; Chem. review, 1998].
1.3.2 Structure et propriétés des cyclodextrines
Les cyclodextrines (CD) sont donc des oligosaccharides cycliques non-réducteurs
obtenus industriellement par dégradation enzymatique de l’amylose (forme linéaire de
l’amidon) à l’aide d’une enzyme, la cyclodextrine glucosyltranférase (CGTase). Les trois
types de CD les plus couramment rencontrés sont l’α, la β et la γCD, qui sont constitués
respectivement de 6, 7 et 8 unités D-glucopyranosiques, liées en α-1,4.
Nomenclature.
L’appellation IUPAC de la β-cyclodextrine, est : 5,10,15,20,25,30,35 -heptakis
(hydroxymethyl)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34-tétradécaoxaoctacyclo
25
[31.2.2.2 3,6 .2 8,11 .2 13,16 .2 18,21 .2 23,26 .2 28,31 ] nonatétracontane-36,37,38,39, 40,41,42,43,44,45,46,

47,48,49-tétradécole. Dans un souci de clarté, on retrouve diverses appellations dans la
littérature : β-dextrine de Schardinger, cyclomaltoheptaose, cycloheptaglucane,
cycloheptaamylose, β-CD, ou bien encore C7A pour la β-cyclodextrine. Dans cette étude
le terme βCD ou βcyclodextrine sera utilisé.
Les structures tridimensionnelles des CD ont pu être obtenues à partir de l’étude de leurs
monocristaux par diffraction des rayons X (et même, de quelques monocristaux de complexes
CD-invitée) ce qui a permis de mettre en évidence la structure tronconique des CD ainsi que
de déterminer les dimensions des cavités de chacune d’elles [Saenger, 1984].
Figure 9. Structures tridimensionnelles des cyclodextrines naturelles (α, β, et γCD de gauche à droite),
avec de haut en bas: une vue de la face des hydroxyles secondaires (« grand côté »), une vue latérale et, une
vue de la face des hydroxyles primaires (« petit côté »). En bas, les dimensions respectives des CD obtenues
d’après les données cristallographiques.
26

Ces études ont permis de montrer que l’extérieur des CD est tapissé par les fonctions
hydroxyles des unités glucose, tandis que les atomes de carbone et d’hydrogène tapissent
l’intérieur de la cavité. La structure des cyclodextrines, alliée à l’orientation particulière
adoptée par les diverses fonctions hydroxyles des unités glucopyrannose, donnent aux CD leur
caractère amphiphile caractéristique, du à un extérieur relativement hydrophile (surface de
contact avec le solvant) et à un cœur relativement hydrophobe (surface de contact avec la
molécule invitée).
Figure 10. Représentation d’un cycle α-D-glucose en conformation chaise 4 C1 et représentation
schématique de la coupe transversale d’une cyclodextrine avec numérotation des atomes de carbones.
Les cyclodextrines présentent donc une forme torique, le côté le plus étroit étant appelé
face primaire (les hydroxyles primaires y étant situés) et le côté le plus large, face secondaire
(les deux groupes hydroxyles secondaires de chaque unité y étant localisés).
De plus, on entrevoit sur la figure, que les hydroxyles primaires et secondaires forment un
réseau dense de liaisons hydrogène, contribuant ainsi à la rigidité du macrocycle, et stabilisant
la forme tronc-conique des molécules. Cette structure spatiale des CD est aussi responsable de
certaines de leurs caractéristiques physico-chimiques.
La cavité interne du tore est relativement apolaire car tapissée de deux couronnes de
groupes CH (protons H3 près de la face secondaire et protons H5 près de la face primaire),
séparées par les oxygènes glucosidiques. On peut distinguer sur la figure ci-dessus que tous
les protons H3 et H5 des différentes unités glucose pointent vers l’intérieur de la cavité des
CD, particularité importante pour l’étude par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) des
propriétés d’inclusion de ces molécules, comme cela sera explicité par la suite.
27

Tableau 1. Caractéristiques physico-chimiques des principales cyclodextrines [Szjetli1988]
αCD βCD γCD
Nombre d’unités glucose 6 7 8
M (g/mol) 972 1135 1297
Formule brute C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40
Solubilité dans l’eau à 298K (g/L) 145 18,5 232
[α] D 25°C 150 ±0,5 162,5 ± 0,5 177,4 ± 0,5
Volume approximatif de la cavité (10 6 pm 3 ) 174 262 427
Diamètre de la cavité (grand côté-petit côté)
( )
28
4,7-5,3 6,0-6,5 7,5-8,3
Il est à remarquer la faible solubilité de la βCD en comparaison de celles de l’α et de la
γCD. Cette perte de solubilité, dont les causes n’ont pas été totalement éclaircies, semble due
au réseau de liaisons hydrogène particulièrement fort dans le cas de CD à 7 unités. Lors de
synthèses de βCD modifiées, mono- ou poly-modifications, les solubilités obtenues sont alors
très largement augmentées par rapport à la CD naturelle, y compris après greffage de
groupements relativement hydrophobes, renforçant l’hypothèse du réseau stabilisant. Dans le
cas de l’αCD cette ceinture de liaisons H est incomplète, l’une des unités étant dans une
position distordue, il n’y a donc que 4 liaisons formées (au lieu des 6 prévues). Pour ce qui est
des CD de taille supérieure δ-, ε-… celles-ci se présentent sous forme de cylindre non

égulier, effondré en leur centre, de ce fait, leur cavité se trouve être plus petite que celle de la
γCD.
C’est le caractère amphiphile lié à leur structure tridimensionnelle qui donne aux
cyclodextrines leur propriété la plus intéressante, celle de former des complexes
supramoléculaires en solution aqueuse avec une (des) molécule(s) invitée(s).
1.3.3 Inclusion – Complexation
1.3.3.1 Inclusion
Les CD sont, de ce fait, des composés de choix pour l’inclusion de molécules
hydrophobes à la condition que la taille de ces invités s’accorde aux dimensions internes de la
cavité. Les CD peuvent ainsi inclure partiellement ou en totalité un composé invité, ce qui
donne alors lieu à la formation de complexes comportant éventuellement plusieurs molécules
(1 ou 2) de CD ou de molécules invitées. De nombreux exemples de complexes CD-invité,
avec divers arrangements structuraux, se trouvent ainsi décrits dans la littérature. Les
structures des principaux complexes ayant fait l’objet de publications sont représentées sur la
figure suivante.
Figure 11. Diverses structures de complexes cyclodextrines-invités, en solution aqueuse, décrites dans la
littérature a) inclusion complète ; b) inclusion « axiale » ; c) inclusion partielle ; d) complexe 2:1 ; e) complexe
1:2 ; f) complexe 2:2 ; g) complexe « non-spécifique ».
Ces structures peuvent être mises en évidence et caractérisées en employant diverses
techniques d’analyses physico-chimiques, comme la spectroscopie UV-visible,
la spectroscopie de fluorescence, l’analyse cristallographique, la spectroscopie RMN ou bien
encore, à l’aide des méthodes d’analyses électrochimiques [Szente, 1996].
29

La taille des CD peut être un facteur limitatif important quant à leur capacité à former des
complexes d’inclusion et à leurs stabilités relatives. Ainsi, en relevant diverses valeurs de
constantes de complexation (K de l’équilibre hôte-invité, dans des cas de complexes 1:1)
parues dans la littérature, Connors a tracé la fréquence de distribution des constantes de
complexation pour les complexes formés par l’α, la β et la γCD [Connors, 1997].
Figure 12. Distribution des constantes de complexation des complexes 1:1 formés par les différentes
cyclodextrines naturelles.
Une distribution quasi-gaussienne de ces constantes de complexation est observée, quelle
que soit la CD naturelle considérée. Une valeur moyenne de K a pu alors être extraite pour
chacune de ces CD, dans le cas de complexes 1:1 (avec σ l’ecart type observé).
Tableau II: Paramètres utilisés pour établir les courbes de distributions des constantes de complexation
des différentes CDs dans le cas de complexes 1:1.
30
Molécule
hôte
Nombre de constantes de
complexation prises en
compte
Nombre de systèmes
hôte-invité 1:1 différents
log (K)moy.
(M-1 )
σ
(M-1 )
αCD 960 663 2,11 0,90
βCD 1142 721 2,69 0,89
γCD 188 166 2,55 0,93
Il apparaît alors que toutes les cyclodextrines naturelles présentent une valeur moyenne
de constante de complexation relativement faible (Ka~10 3 M -1 ). Il est à noter que c’est grâce à
la faible sélectivité du processus de complexation par les CD qu’il a été possible de multiplier
le nombre et la diversité des molécules invitées.

Des modifications chimiques du macrocycle ont été envisagées de façon à permettre
l’accroissement des constantes de complexation des complexes supramoléculaires formés par
les CD. Il est même possible de synthétiser des CD “sur mesure”, c’est à dire modifiées de
façon à accroître leur affinité pour une molécule précise [Djedaïni-Pilard, 1993]
1.3.3.2 Energies mises en cause.
En solution aqueuse la cavité des CD est occupée par des molécules d’eau énergiquement
non-favorables (interaction polaire-apolaire), ce qui permet une substitution aisée par des
molécules invitées de moindre polarité que l’eau.
Plusieurs contributions énergétiques ont été mises en évidence pour expliquer les
interactions en jeu lors de la formation de complexes par des cyclodextrines.
- Adaptation stérique : par des changements conformationnels de la molécule invitée
et/ou de la cyclodextrine (conformation induite) lors du processus d’inclusion.
- Formation de liaisons hydrogène.
- Interactions de Van der Waals : forces de dispersion de London et interactions dipôle-
dipôle induit.
- Interactions hydrophobes, dipôle-dipôle, de transfert de charges et électrostatiques.
- Relargage de molécules d’eau à «haute-enthalpie» de la cavité de la cyclodextrine.
- Relargage de molécules de solvant de la cavité de la cyclodextrine avec un gain
d’entropie.
- Relâchement des tensions du macrocyle.
C’est l’action simultanée de plusieurs de ces interactions qui rend effective l’inclusion
spécifique, les phénomènes de reconnaissances moléculaires étant dus à la coopération de
multiples interactions faibles. Ce phénomène d’inclusion-complexation ne fait intervenir
aucune liaison covalente mais uniquement des forces telles que les liaisons hydrogène ou des
interactions de Van der Waals, ce qui permet ainsi le relargage de la molécule invitée, ouvrant
la voie à de multiples applications.
1.3.3.3 Conséquences.
31

L’inclusion d’invités dans la cavité des CD, influence nombres de propriétés de
ceux-ci, ouvrant la voie à de nombreuses études tant théoriques qu’industrielles. Les
propriétés physico-chimiques des invités se trouvent modifiées du fait de la formation de
complexe d’inclusion :
- Le déplacement chimique en RMN est modifié du fait de ce changement
d’environnement anisotropique.
- Lorsque des composés achiraux sont inclus dans une CD, le complexe formé est
optiquement actif et montre un important effet de Cotton induit en dichroïsme circulaire.
- Parfois le maximum en UV est déplacé de plusieurs nm.
- La fluorescence est aussi très influencée car la molécule fluorescente passe d’un milieu
aqueux à un milieu apolaire.
La réactivité chimique des molécules incluses est aussi modifiée lors de l’inclusion. Le
plus souvent elle est diminuée car l’invité se trouve stabilisé, mais la cyclodextrine peut aussi
agir comme catalyseur. La diffusion et la volatilité sont modifiées, ainsi que les propriétés
chromatographiques des molécules incluses, en particulier en chromatographie chirale.
1.3.4 Applications des cyclodextrines.
Le phénomène d’inclusion dans les molécules cages hydrophiles que sont les CD, fournit
à la recherche fondamentale un modèle d’étude des réactions enzymatiques, catalytiques, ou
de complexations. De nombreuses et diverses applications des CD sont décrites dans la
littérature, ainsi que dans les registres de brevets. Toutes ces applications tirent parti des
propriétés complexantes en milieu aqueux des CD avec un panel impressionnant de molécules
invitées. De nombreuses applications technologiques découlent de l’observation faite que, par
la formation du complexe d’inclusion, la stabilité, la solubilité, la bio-disponibilité, la durée
de vie, la toxicité et l’odeur de la molécule invitée se trouvent favorablement modifiées.
[ Loftsson, 1998b ; Duchêne, 1987 ; Chem. review, 1998]
- Complexant
32
La formation de ces complexes d’inclusion est mise à profit, non seulement dans le
domaine pharmaceutique (solubilisation, stabilisation, masquage d’effets secondaires)
[Duchêne, 1987 ; Duchêne 1991], mais aussi dans les industries chimiques et agro-
alimentaires [Hedges, 1998] (stabilisant d’arômes, protection des vitamines, extraction du

cholestérol). Citons aussi l’utilisation toute récente, dans des produits vaporisés sur tissus, de
la CD pour masquer les odeurs désagréables [Noh, 1998].
- Vectorisation
Les cyclodextrines sont aussi employées comme vecteur [Uekama, 1998], pour le ciblage
de médicaments. Quelques tentatives d’emploi des cyclodextrines dans un but de vectorisation
de principes actifs ont été réalisées. Le schéma employé est identique dans toutes les
approches relevées : on part de la structure de base des CD sur laquelle on greffe
chimiquement une «antenne » destinée à assurer la fonction de ciblage. L’originalité des
différentes approches réside essentiellement dans la pertinence du choix de cette antenne,
ainsi que dans l’approche synthétique employée lors de la réalisation de ces conjugués [Péan,
1998].
- Catalyseurs - Modèles d’enzymes artificielles
En plus de la sélectivité des complexes hôte-invité, les cyclodextrines possèdent des
propriétés catalytiques à rapprocher de celles des enzymes (inhibitions compétitives, cinétique
de Michaelis-Menten). Les CD ont été largement étudiées en tant que modèle enzymatique de
l’α-chymotrypsine, de l’anhydrase carbonique et, des ribonucléases ainsi que comme
inducteur de chiralité dans des réactions aussi diverses que la réduction de céto-acides,
l’halogénation, l’oxydation de sulfures, l’époxidation, certains réarrangements
sigmatropiques, l’addition de Michaël, les réactions de Diels-Alder et de Wittig, en utilisant
un réactif achiral et un substrat prochiral [Takahashi, 1994 ; Breslow, 1992 ; Breslow, 1998].
- Complexant chiral
Les CD sont aussi utilisées en séparation énantiomérique par électrophorèse capillaire,
chromatographie en phase gazeuse ou chromatographie liquide haute performance. Ce sont,
cependant, les applications en séparation chirale (colonnes CLHP, CPG), dans le domaine de
la formulation de médicaments (galénique) et de l’industrie
agro-alimentaire qui ont donné lieu aux plus nombreuses applications des CD. Celles-ci ont
eu pour conséquences les dépôts de nombreux brevets nationaux et internationaux couvrant
l’exploitation de ces applications. Les cyclodextrines ont aussi été utilisées en RMN comme
auxiliaires chiraux pour la détermination d’excès énantiomériques [Gosnat, 2000].
33

1.3.5 Toxicité des cyclodextrines
Le profil toxicologique des 3 cylodextrines naturelles les plus communes et de certains
dérivés chimiquement modifiés a récemment été passé en revue [Loftsonn, 1998b ;
Frömming, 1994]. En général, les cyclodextrines naturelles et leurs dérivés plus hydrophiles
sont seulement capables de passer à travers les membranes biologiques lipophiles, telles la
cornée, les muqueuses ou la peau, avec de grandes difficultés. Même la βCD méthylée qui est
plus ou moins lipophile ne passe pas facilement les membranes biologiques lipophiles, bien
qu’elle interagisse de manière plus efficace avec les membranes que les dérivés hydrophiles.
Gerloczy et coll. [Gerloczy, 1988] ont ainsi montré que seule une très faible quantité de
diméthyl-βcyclodextrine radiomarquée est absorbée transdermiquement. On peut supposer
que le haut poids moléculaire des CD est une des causes limitant ce passage.
Toutes les études de toxicité ont démontré que l’administration orale de cyclodextrines
est non-toxique, ceci étant du à leur très faible absorption gastro-intestinale (0.1 à 3%). Le
caractère hémolytique des cyclodextrines est bien connu mais n’apparaît en fait qu’à forte
concentration : en effet à faible concentration (5mmol pour l’αCD et 10mmol pour la βCD)
les cyclodextrines protègent les globules rouges contre l’hémolyse osmotique et l’hémolyse
induite par la chaleur alors qu’à forte concentration elles provoquent l’hémolyse en
complexant et relarguant le cholestérol des membranes cellulaires. Cette action hémolytique
est faible avec la γCD mais plus forte avec l’αCD et la βCD et cette propriété conditionne les
effets des CD par voie intraveineuse ou intramusculaire. Un certain nombre d’études
toxicologiques ont montré que la γCD, la 2-hydroxypropyl-βCD, la sulfobutyléther-βCD et
la maltosyl-βCD sont sans danger même pour l’administration parentérale. Par contre, l’αCD,
la βCD et les βCD méthylées ne sont pas acceptables pour l’administration parentérale
(irritation à l’injection pour les trois et très forte néphrotoxicité pour α et β).
34
Les cylodextrines ont longtemps été accusées de provoquer des irritations lors de leur
application cutanée [Uekama, 1982], ceci étant lié directement à leur pouvoir hémolytique et
donc à leur capacité à inclure les différents constituants des membranes biologiques. Mais une
étude, consistant en l’application de quantités équivalentes à 2mg de CD sur 1 cm 2 de peau
(volontaires sains avertis) et utilisant un vélocimètre laser Doppler afin de mesurer la

vasodilatation éventuelle de la peau, a démontré clairement l’absence d’effet irritant (après
24h d’occlusion) des cyclodextrines naturelles, de la diméthyl-βcyclodextrine et des dérivés
hydroxypropyl de la βCD et la γCD [Montassier, 1996]. Il a aussi été montré par cette même
technique que l’utilisation du complexe d’inclusion βCD/acide rétinoïque permettait de
réduire significativement l’irritation cutanée produite par le principe actif seul [Amdidouche,
1994]. De plus il faut souligner le fait que cet effet irritant “supposé” est lié aux
cyclodextrines vides et que dans leur utilisation habituelle celles-ci sont, pour un temps donné
sous forme compléxée.
Ainsi la per(2,6-O-diméthyle) βCD randomisée ou Rameb, qui sera largement utilisée
dans notre étude semble ne présenter ancune irritation lorsqu’elle est administrée par voie
nasale, cutanée ou oculaire [Loftsonn, 1998b]. Aucun effet tératogène ou embryotoxique n’a
été relevé au cours des différentes études effectuées dans ce but chez le rat.
1.3.6 Interaction avec les membranes biologiques
Figure 13. Représentation shématique d’une bicouche membranaire
35
Les membranes biologiques telles la peau, la cornée ou les muqueuses forment une
barrière lipophile vis à vis de la pénétration de principes actifs. Les principes actifs
relativement lipophiles sont capables de passer à travers ces membranes par diffusion passive.
La possibilité de passage des CD à travers les membranes biologiques a longtemps été
considérée comme très improbable du fait de leur hydrophilie et de leur haut poids

moléculaire. Mais, comme nous l’avons brièvement mentionné dans le chapitre précédent,
cette supposition a ensuite été démentie preuves à l’appui. Arima et coll. [Arima, 1990] ont
mis en évidence la pénétration importante des cyclodextrines au travers de la peau dans les
heures qui suivent leur application et dans l’ordre croissant suivant : βCD < diméthyl-βCD <
hydroxypropyl-βCD. Plus tard, Vollmer et coll. [Vollmer, 1992] ont montré, en travaillant sur
l’hydroxypropyl-βCD radio-marquée qu’elle pénétrait, en forte quantité dans le stratum
cornéum, couche superficielle compacte et hydrophile, ainsi que dans les couches profondes
hydrophiles tels le derme et l’épiderme.
La diffusion passive des molécules lipophiles à travers les membranes biologiques est
régie par la concentration en principe actif dans le milieu aqueux extérieur de la membrane
(larmes, salives) ou dans le vecteur aqueux qui contient le principe actif (hydrogels, crèmes
hydrophiles). Ainsi une plus grande perméabilité pourrait être obtenue avec des principes
actifs qui soient à la fois lipophiles et très solubles dans le milieu aqueux extérieur. Cette
réflexion a amené les chercheurs à utiliser les cyclodextrines comme un moyen d’améliorer la
pénétration de certains principes actifs et donc de conférer aux cyclodextrines le rôle de
promoteur d’absorption. Par exemple la solubilisation de la testostérone par la formation d’un
complexe avec l’hydroxypropyl-βCD provoque une augmentation significative de son
passage au travers de la peau de souris nue. Cette même expérience a montré qu’un excès d’
hydroxypropyl-βCD provoquait à l’opposé une réduction de la distribution dermique et
transdermique [Loftsson, 1998a]. Des résultats intéressants ont été obtenus avec les anti-
inflammatoires. Des travaux réalisés chez le rat ont montré que le pouvoir anti-inflammatoire
de ce produit était augmenté par inclusion dans une cyclodextrine dans l’ordre croissant
suivant : βCD < diméthyl-βCD < hydroxypropyl-βCD. Bien que ces cyclodextrines soient
capables de pénétrer dans la peau, la plus grande activité des produits n’est pas due à une
altération de celle-ci car un simple prétraitement local par une solution de cyclodextrine n’a
aucun effet sur l’absorption du principe actif. De plus les auteurs ont noté que la pénétration
de la CD dans la peau augmente la résistance de celle-ci au principe actif. Cet effet négatif est
donc plus que compensé par l’inclusion dans la CD qui augmente la quantité de principe actif
soluble disponible en surface. D’autres auteurs ont mis en évidence l’augmentation du
pouvoir anti-inflammatoire de l’indométacine lorsqu’elle est présente dans le gel aqueux sous
forme de complexe avec la βCD ou l’hydroxypropyl-βCD [Duchêne, 1996].
36

Mais comment les CD augmentent-elles la perméabilité d’un principe actif à travers les
membranes biologiques ?
Il est généralement reconnu que les CD se comportent comme de véritables vecteurs en
gardant le principe actif en solution et en le distribuant dans les membranes biologiques. Les
membranes lipophiles ayant peu d’affinité pour les cyclodextrines, la majeure partie de celles-
ci reste dans le milieu aqueux extérieur. Les promoteurs d’absorption classiques, comme les
alcools ou les acides gras, agissent en bouleversant les couches lipidiques de la membrane.
Mais ce n’est pas le cas pour les cyclodextrines, malgré leur faculté à inclure dans leur cavité
le cholestérol et les lipides, car on sait que le prétraitement de la peau par une solution de
cylodextrines n’améliore pas le passage cutané d’un principe actif, de plus les cylodextrines
présentes à la surface le sont sous forme déjà complexée et leur aptitude à capter les
constituants membranaires dépend alors, en solution, des différentes constantes d’affinité
mises en causes.
Les cyclodextrines exercent leur rôle de promoteur d’absorption en augmentant la
solubilité du principe actif et donc la quantité disponible à la surface de la barrière biologique.
En effet, la dissolution du principe actif est indispensable pour son absorption. Pourtant il a
été rapporté qu’un excès de cyclodextrines provoquait une moindre absorption au travers de la
peau ou de la cornée. Le mécanisme d’action des CD semble donc complexe.
37
Loftsson et coll. [Loftsson, 1999] ont étudié ce mécanisme en utilisant une membrane
de cellophane semi-perméable ou de la peau de souris comme membrane modèle dans des
cellules de Franz. Le flux de principes actifs est déterminé par dosages (HPLC) répétés du
liquide récepteur. La théorie veut que lorqu’un principe actif diffuse d’une phase aqueuse
donneuse (ici gel ou solution) à travers une membrane lipophile vers une phase réceptrice, il
rencontre 2 types de résistance. D’abord une résistance à sa diffusion dans la phase aqueuse
donneuse (Raq) puis une résistance à sa diffusion à travers la membrane elle-même (Rm). Le
premier terme dépend du coefficient de diffusion aqueux de la molécule en question et de
l’épaisseur de la couche de diffusion aqueuse, et le second terme dépend du coefficient de
partition de la molécule entre la phase aqueuse et la membrane, du coefficient de diffusion
membranaire et de l’épaisseur de la membrane.
En général, la diffusion à travers la peau est lente et requiert plusieurs heures avant que le
principe actif ne puisse être détecté dans la phase réceptrice. On estime donc que la
contribution de la résistance de la phase aqueuse donneuse est très faible. Ainsi, avec ce
modèle, le flux de principe actif (R -1 × [p.a]) de la solution saturée n’est pas affecté par la
concentration en CD dans la phase aqueuse donneuse. Mais les études citées précédemment

ont montré que le flux de principe actif à travers la peau augmente presque
proportionnellement avec la concentration en CD, et des observations comparables ont été
faites quand les effets des CD sur la perméabilité de principes actifs à travers la cornée ou les
muqueuses nasales ont été étudiés. Considérant cela, les auteurs ont établi qu’il devait exister
une couche de diffusion aqueuse en surface de la peau où le coefficient de diffusion et/ou la
constante de complexation sont différents de ceux de la phase aqueuse donneuse. De
nouvelles équations régissant le flux de passage du principe actif à travers les différentes
phases ont donc été décrites et comparées aux résultats obtenus dans les expériences sur
cellules de Franz.
Il en découle que l’amélioration du transport percutané d’un principe actif par des CD
peut s’expliquer par le modèle classique de double diffusion membranaire, aqueuse puis
lipophile, et que les données expérimentales peuvent être ajustées pour obtenir les constantes
qui décrivent ce système. La vitesse de diffusion dans la couche aqueuse doit être
considérablement plus faible que dans la phase aqueuse donneuse. La cyclodextrine
fonctionne donc comme un vecteur, amenant le principe actif de la phase aqueuse donneuse
vers la barrière aqueuse à partir de laquelle il passe dans la couche lipophile de la peau en
fonction de son coefficient de partition.
La participation des follicules pileux et des glandes sébacées n’est pas oubliée mais ceux-
ci ne couvrant que 0.1% de la surface de la peau, il est probable qu’ils ne jouent pas un rôle
significatif dans la diffusion trandermique. Notons tout de même que certaines études ont mis
en évidence que cette voie était la principale pour des molécules comme l’hydrocortisone
[Masson, 1999].
Les CD modifient le transport de principe actif au travers de la cornée et des muqueuses
de la même façon que dans les expériences au travers de la peau. Par contre la participation
annexe des follicules pileux et glandes sébacées n’existe pas. Ces membranes sont recouvertes
par un mucus relativement visqueux et qui représente une barrière potentielle pour la diffusion
de principe actif et peut donc être aussi une barrière aqueuse à la diffusion de principes actifs
à partir de solutions de CD.
38
Une autre approche, beaucoup plus mécanistique a été développée par certaines équipes,
en particulier Debouzy et coll. [Fauvelle, 1997]. Ils étudient essentiellement par 31 P RMN les
interactions entre cyclodextrines naturelle et parfois modifiées et des bicouches obtenues à

partir de phospholipides modèles. Les résultats semblent démontrer une grande complexité
dans les mécanismes.
Toutefois, de nombreuses zones d’ombres existent dans la compréhension du mécanisme
de pénétration membranaire des cyclodextrines, en particulier en l’absence de méthodes de
dosages très fines. Dans la suite de ce travail, nous expliquerons comment les dosages
immunologiques nous ont permis de doser, avec une haute sensibilité, des cyclodextrines dans
la peau.
39

2. TRAVAUX ANTERIEURS
40

2. TRAVAUX ANTERIEURS
2.1 MOYENS UTILISES POUR AMELIORER LA STABILITE ET LA SOLUBILITE
DE LA VITAMINE A DANS LES FORMES PHARMACEUTIQUES
Outre l'utilisation d'emballages protégeant les préparations de la lumière [Tagliaferri,
1989] la première et la plus évidente des solutions proposées pour améliorer la stabilité du
rétinol fut d'incorporer des antioxydants. On sait par exemple que l'ajout d'α-tocophérol,
d'acide ascorbique, de butyl-hydroxyanisole (BHA) ou de butyl-hydroxytoluène (BHT) permet
d'améliorer la stabilité d'une solution de rétinol ou d'esters de rétinol [Froix, 1996 ;
Shkunkova, 1973].Toutefois l'ajout d'antioxydants seul n'est d'aucune utilité pour améliorer la
solubilité du rétinol et la stabilité obtenue est très relative.
2.1.1 Emulsions et antioxydants
2.1.1.1 Emulsions eau-dans-huile (E/H)
Plusieurs préparations cosmétologiques comprenant une émulsion E/H à base de rétinol
ont été décrites et même commercialisées. Dans ce cas le but n'est pas d'incorporer le rétinol
en phase aqueuse mais d'obtenir une crème applicable sur la peau et pour laquelle le rétinol
conserve son activité au fil des mois.
41
Ainsi le brevet US 4826828 [Wilmott, 1989] décrit une émulsion E/H contenant le
rétinol, une huile siliconée (la cyclométhicone), ainsi qu'un solvant du rétinol et de la
silicone : l'éthanol. Or le rétinol se dégrade rapidement lorsqu'il est introduit dans l'émulsion.
Celle-ci devra donc se faire extemporanément : il faut préparer une solution contenant le
rétinol (mélange cyclométhicone, éthanol dénaturé, BHT, BHA, émulsifiant) et la mélanger au
moment de l'emploi à une émulsion E/H contenant aussi, dans sa phase aqueuse, des
antioxydants et des agents chélateurs des métaux lourds. La stabilité d'une telle composition,
comme l'indique Avon, le détenteur du brevet, sur ses produits Bioadvance ® et Bioadvance
2000 ® , n'excède pas un mois, ce qui est très insuffisant au regard d'une utilisation prolongée et
nécessite un réapprovisionnement rapide, donc couteux.

Clum et coll [Clum, 1991] proposent une stabilisation du rétinol dans une émulsion E/H
(rétinol en phase huileuse) par adjonction d'un complexe stabilisant, comprenant associés, un
antioxydant liposoluble et un agent chélatant d'ions métalliques.
Si, toutefois, la stabilité du rétinol semble améliorée dans de telles compositions (60% du
rétinol étant encore présent après trois mois de conservation à 40°C), il n'en demeure pas
moins que cette stabilité relative n'est due qu'à la présence dans la composition, d'une quantité
importante d'antioxydants et d'agents chélatants stabilisants. En effet, il apparait évident que le
rétinol se trouvant obligatoirement dans la phase externe de l'émulsion E/H il n'est en aucun
cas protégé de la dégradation par l'air ambiant.
2.1.1.2 Emulsions huile-dans-eau (H/E)
Par contre la formulation d'émulsions type huile-dans-eau (H/E), contenant le rétinol en
phase huileuse interne additioné d'antioxydants semble une solution plus efficace pour lutter
contre la dégradation et surtout incorporer le rétinol en phase aqueuse.
Cette solution s'est d'ailleurs montrée très efficace pour l'acide rétinoïque pour lequel de
nombreux produits commercialisés (crème Retin A ® , Roc S.A) sont constitués d'émulsion
H/E contenant l'acide rétinoïque et un antioxydant liposoluble dans la phase huileuse, voir
même parfois avec un chélatant type EDTA [Clum, 1991 ; Felty Lanny, 1975]. Cependant les
premiers essais de stabilité menés sur de telles émulsions H/E additionées d'antioxydants
liposolubles se sont montrés décevant pour le rétinol et certains de ses esters (acétate et
palmitate). On observe en effet que ces émulsions perdent rapidement leur activité en
s'oxydant ou s'isomérisant pour donner des formes chimiques inactives [Clum, 1991].
Il semblerait que les émulsions H/E facilitent la diffusion de l'oxygène vers le rétinol,
contrebalançant ainsi l'action des antioxydants [Froix, 1996].
Plus tard des émulsions H/E un peu plus stables ont pu être préparées obtenant des
stabilités supérieures à 90% sur plusieurs mois (2 mois à 50°C et 6 mois à température
ambiante) [Liu, 1996 ; Couval, 1994]. Mais ces résultats sont obtenus au prix de l'utilisation
de quantités importantes de produits stabilisateurs (plusieurs antioxydants et/ou plusieurs
chélatants dans chaque phase). Nous verrons dans les paragraphes suivants que de nombreuses
recherches ont été menées afin de diminuer au maximum, voire d'éliminer, la présence de tels
stabilisants dans les compositions cosmétiques et pharmaceutiques contenant du rétinol, tout
en conservant à celui-ci une bonne stabilité dans la composition , acceptable au regard de ses
effets et en relation avec une utilisation prolongée de la composition.
42

2.1.2 Microparticules
Les microparticules sont des structures supramoléculaires solides ultradispersées
généralement à base de polymères et ayant une taille supérieure à un micron. Elles existent
sous deux formes (Fig 14 et 15 ) :
• Microsphères : systèmes pleins constitués par une trame polymère.
• Microcapsules : systèmes dotés d'une cavité centrale huileuse, entourée d'une couche
polymérique.
Figure 14. Microsphère Figure 15. Microcapsule
2.1.2.1 Microsphères
Des microsphères de collagène ont été utilisées, à la surface desquelles était adsorbé du
rétinol. La stabilité du rétinol à long terme a été étudiée sur deux hydrogels à base
d'hydroxyéthylcellulose (témoin contre microsphères) qui ont montré que l'adsorption du
rétinol en surface réduit les phénomènes de cristallisation mais n'empêche pas l'oxydation de
la molécule [Roessler, 1994].
L'adsorption simple en surface n'apporte donc qu'une faible amélioration mais d'autres
techniques ont été étudiées.
43
Froix et coll. [Froix, 1996] ont utilisé des particules (ou suspensions de particules)
constituées d'une matrice polymère poreuse, le rétinol étant situé à l'intérieur de ce réseau
continu de pores. Ces particules microscopiques sont solides, insolubles dans l'eau et inertes
par rapport au rétinol, aux antioxydants, aux chélatants, tensioactifs et autres ingrédients
classiquement utilisés en galénique. Le rétinol y est déposé par contact physique

conventionnel après formation des particules et, de ce fait, il réside seulement dans les pores
et non dans la matrice elle-même. Ces particules sont dispersées dans la phase aqueuse d'une
émulsion qui contient aussi des antioxydants lipophiles et hydrophiles.
Bigger et coll. [Bigger, 1996] ont utilisé un système similaire pour mettre des esters
d'alpha-hydroxy-acides du rétinol en suspension dans des crèmes, lotions et autres milieux
aqueux.
On peut ainsi mettre en suspension le rétinol en milieu aqueux, propriété que la
cosmétique a su exploiter puisque l'on trouve actuellement dans le commerce ce type de
préparations à base de microsphères de rétinol ( gamme Retinol Actif Pur ® ROC ).
2.1.2.2 Microcapsules
C'est encore la cosmétique qui s'est intéressée au développement de microcapsules de
rétinol [Noda, 1992]. Celles-ci, constituées d'un fin film polymérique qui casse facilement lors
de l'étalement, sont idéales pour une application cutanée. Les microcapsules sont préparées
par une méthode complexe de coacervation impliquant une séparation de phase dans un
mélange gélatine-acacia, en phase aqueuse. Le glutaraldéhyde est utilisé comme agent de
réticulation pour rendre le polymère de gélatine insoluble en milieu aqueux. La stabilité du
rétinol ainsi préparé s'est révélée supérieure à celle du rétinol émulsifié. De plus les auteurs
ont constaté que la stabilité augmentait avec l'épaisseur du film polymérique et avec l'ajout de
polylysine. Ces deux constatations ont permis de montrer, grâce à des mesures de coefficient
de perméabilité à l'oxygène, que la matrice gélatine / polylysine diminue la perméabilité à
l'oxygène, améliorant ainsi la stabilité.
44
D'autres travaux ont montré que l'encapsulation par une enveloppe de nature variée
(gélatine, pectine, éthyl-cellulose, gommes ou amidon) aide à protéger le rétinol de l'action
des rayons ultra-violet, et de ce fait permet de diminuer la quantité d'antioxydants (tocophérol)
utilisée. Toutefois, même si cette forme de vitamine A est plus stable (3 mois), il a été montré
que l'oxydation au cours du temps a toujours lieu [Sarama, 1995].
Dans un tout autre domaine, l'encapsulation de la vitamine A a été réalisée dans le but de
diminuer sa dégradation au niveau de l'estomac, lors de l'administration par voie orale
(nourriture pour ruminants supplémentée en vitamine A). Les essais in vitro ont montré que la
meilleure protection contre la dégradation microbienne, enzymatique et hydrolytique est
obtenue avec une double enveloppe de gélatine et d'acide palmitique. Il faut noter que

l'addition d'antioxydants s'est révélée nécessaire et que les études de stabilité menées ne
concernaient que le passage du premier estomac des ruminants [Markus, 1989].
⇒ Ces essais montrent que les microsphères et les microcapsules amènent dans certains
cas une stabilité relative par un effet de protection physique et permettent surtout de suspendre
le rétinol en milieu aqueux. Toutefois les méthodes de préparation sont complexes et passent
par des phases critiques.
2.1.3 Divers
Certaines équipes ont réalisé l'association du rétinol avec des peptides amphiphiles
naturels d'origine végétale ou animale tels les oléosines ou les β-lactoglobulines. Le but
premier était de favoriser la vectorisation du rétinol à travers les couches de l'épiderme mais il
a été montré que cela permettait aussi d'incorporer le rétinol dans un support non dissociant
(non huileux et non tensio actif) c'est à dire un milieu aqueux. L'addition d'antioxydants n'a
pas été évitée [Redziniak, 1996].
D'autres travaux ont montré que par la sélection bien déterminée de certains solvants,
comme véhicule du rétinol, on pouvait obtenir des compositions anhydres destinées à une
application topique présentant une certaine stabilité dans le temps, et ceci, sans avoir recours à
des antioxydants. Ces solvants organiques, liquides à température ambiante, sont choisis
parmi plusieurs groupes parfaitement définis d'alcool gras, de diesters d'alcool isopropylique
et d'acides dicarboxyliques, et de triglycérides d'acides gras [Segot, 1995]. Les essais de
conservation réalisés ont permis de montrer, par une méthode HPLC, que par rapport à
d'autres solvants couramment utilisés comme véhicule de substance active, ceux sélectionnés
conduisaient à une amélioration de la stabilité. On retrouve ainsi, lors du dosage, 100% du
produit de départ mais seulement sur une période limitée à 2 mois.
Le détenteur du brevet, la firme L'Oréal, a ensuite cherché à améliorer son procédé par
l'addition, à ce type de solvant, d'un gélifiant particulier (comprenant au moins un alkyléther
de polysaccharide formé de motifs comportant au moins 2 cycles osidiques différents). Il s'agit
d'une gomme non-ionique, par exemple la guar éthylée. Cette composition est dite stable pour
le rétinol, l'acétate et le palmitate de rétinol mais aucun chiffre n'est avancé [Gagnebien,
1997].
45

⇒ Nous avons décrit plusieurs solutions, plus ou moins efficaces, proposées pour
améliorer les propriétés physico-chimiques du rétinol et de ses esters. Dans le même ordre
d'idée, les cyclodextrines ont été aussi beaucoup utilisées et le chapitre suivant leur sera
entièrement consacré. Après avoir décrit les différentes méthodes utilisées dans la
caractérisation physico-chimique des complexes d'inclusion cyclodextrines / molécule invitée,
nous nous intéresserons aux travaux déjà décrits concernant le rétinol et ses esters.
2.2 INCLUSION DU RETINOL DANS LES CYCLODEXTRINES
2.2.1 Méthodes de caractérisation des complexes d'inclusion
Il est important de souligner qu'une analyse complète et efficace d'un complexe
d'inclusion potentiel doit fournir des réponses concernant la réalité de l'inclusion, sa
stoechiométrie, sa constante d'association et devrait aussi proposer une structure
tridimensionelle de la supramolécule. Or, parmi les techniques d'analyse couramment
utilisées, peu peuvent répondre à ces questions. Ceci est dû le plus souvent à des limitations
techniques ou théoriques mais dans un certain nombre de situations les incohérences relevées
dans la littérature peuvent venir d'une mauvaise interprétation des données expérimentales
[Perly, 1991].
2.2.1.1 Diffractions des rayons X
Parmi les nombreuses techniques utilisées pour mettre en évidence les complexes
d'inclusion, la cristallographie est clairement la plus puissante [Perly, 1991]. Cependant, elle
est rarement utilisée car elle nécessite d'avoir des monocristaux du complexe moléculaire en
question ce qui n'est pas toujours le cas. De plus la géométrie des complexes d'inclusion et les
interactions mises en jeu peuvent être différentes à l'état solide et en solution. On peut noter
aussi que la cristallographie fait souvent appel à l'utilisation de cosolvants qui peuvent
modifier la nature du complexe. Or de nombreuses applications des cyclodextrines suppose la
mise en solution des complexes. Il est donc préférable d'avoir des techniques pouvant fournir
des informations valables en solution.
46

Cette technique permet cependant la comparaison des structures obtenues en solution et à
l'état solide et apporte de nombreuses informations sur l'influence de la maille cristalline et du
solvant sur la structure tridimensionelle du complexe d'inclusion.
2.2.1.2 Diagrammes de solubilité de phase
Cette approche, telle que développée par Higuchi et Connors [Higuchi, 1965], est très
couramment utilisée pour l'évaluation de l'utilisation potentielle des cyclodextrines afin
d'augmenter la solubilité de composés hydrophobes en milieu aqueux. Elle permet en effet
d'obtenir le profil de la courbe de solubilité de la molécule invitée en fonction de la
concentration en cyclodextrines et donc de prouver l'augmentation de la solubilité en présence
de cyclodextrines. Le principe de cette méthode consiste à ajouter le composé invité en
quantité excédentaire à des solutions de cyclodextrines de concentrations croissantes, puis à
doser la quantité de composé invité dissous. Un diagramme de solubilité de l'invité en
fonction des concentrations de cyclodextrines peut ainsi être établi. Deux types de
diagrammes sont généralement observés : types A et B.
Dans le diagramme de type A, la solubilité de l'invité augmente avec la concentration en
cyclodextrines. Il y a formation d'un ou plusieurs complexes solubles. Dans le diagramme de
type B, la solubilité du composé d'inclusion est inférieure à celle de la CD pure : la solubilité
de l'invité augmente dans la première partie de la courbe à cause de la formation du composé
d'inclusion, mais quand la limite de solubilité est atteinte, la formation accrue de composé
d'inclusion provoque sa précipitation, représentée par un plateau. Lorsque l'excès de principe
actif est consommé, on observe une décroissance qui serait liée à l'inclusion du principe actif
dissout et à sa précipitation concomitante. La mesure de la constante d'équilibre par la
méthode de solubilité de phase nécessite la connaissance de la stoechiométrie réelle du
composé d'inclusion : lorsque le diagramme est de type B, le composé peut être isolé et sa
stoechiométrie vérifiée; lorsque le diagramme est de type A, il est préférable de déterminer la
stoechiométrie par une autre méthode. En effet si plusieurs complexes coexistent ou si le
complexe n'est pas de stoechiométrie 1:1, la méthode de solubilité de phase fait appel à des
hypothèses ou à des approximations qui ne permettent pas d'obtenir des constantes d'équilibre
apparentes exactes.
47
Il faut savoir que cette technique ne donne en aucun cas une preuve directe de la réalité
de l'inclusion. En effet un procédé d'interaction autre que l'inclusion peut provoquer
l'augmentation de solubilité observée. Les stoechiométries et les constantes d'affinités
obtenues à partir du diagramme de phase peuvent amener des erreurs non négligeables car le

processus théorique de solubilisation est très simplifié dans cette approche. De plus, lors de la
détermination de la constante d'association, cette technique ne tient pas compte des éventuels
phénomènes pouvant entrer en compétition avec l'inclusion (dimérisation, "solution solide").
2.2.1.3 Techniques d'analyse de l'état solide
Deux approches sont communément utilisées pour mettre en évidence le phénomène
d'inclusion dans les cyclodextrines : l'analyse calorimétrique différentielle (Differential
Scanning Calorimetry) et la diffraction sur poudre [Frömming, 1994].
Elles reposent toutes deux sur l'observation des différences entre le mélange physique
simple des deux composés et le complexe d'inclusion potentiel. Ces deux méthodes sont
faciles à mettre en oeuvre, nécessitent de faibles quantités de composés et sont donc assez
populaires. La diffraction des rayons X permet de déterminer les propriétés structurales des
composés d'inclusion et de les comparer à celles des produits isolés. La DSC quant à elle
permet de comparer les propriétés thermiques des produits isolés et des complexes présumés.
L'observation de nouveaux pics ou la disparition d'un accident thermique de la molécule
invité donne des indices sur la présence d'un éventuel complexe, sans apporter de preuve de sa
réalité [Perly, 1991]. En effet ces méthodes ont pour but de montrer l'existence d'interactions
existant au sein de la maille cristalline et tout phénomène provoquant le passage à l'état
amorphe conduira à la modification du spectre de poudre et du thermogramme.
Par exemple le fait de lyophiliser une solution contenant deux molécules n'interagissant
pas entre elles donnera un composé amorphe. Ce composé qui est en fait une "solution-solide"
ne présentera plus les caractéristiques individuelles de chaque composé mais cela ne signifie
pas qu'il y ait des interactions spécifiques et encore moins une inclusion.
2.2.1.4 Techniques spectrophotométriques
48
Presque toutes les méthodes optiques existantes ont été utilisées pour caractériser les
phénomènes d'inclusion. Certaines comme la spectroscopie IR ne constituent pas une méthode
de choix pour la détection des complexes d'inclusion [Saenger, 1980]. La spectrophotométrie
d'absorption ou de fluorescence (lorsque la molécule le permet) et le dichroïsme circulaire
sont les plus fréquemment utilisés [Song, 1992]. L'avantage majeur est leur très haute
sensibilité intrinsèque. Cependant, les résultats obtenus peuvent conduire à des interprétations

erronées car seule la molécule invitée est observée. De plus ces techniques ne permettent pas
de distinguer clairement l'inclusion d'une autre interaction.
Le dichroïsme circulaire utilise la capacité qu'ont les molécules non symétriques
d'absorber différement des photons polarisés et nécessite des conditions particulières :
- existence d'un centre de symétrie ou centre chiral
- présence d'un chromophore (ce que n'ont pas les CD)
- absence de racémique
C'est une méthode intéressante dans l'étude des phénomènes d'inclusion car en pénétrant
dans la CD, la molécule invitée prend une conformation figée si elle vibrait lentement ou une
conformation différente de celle qu'elle présentait à l'état libre [Jourdain, 1990].
Par rapport au dichroïsme circulaire, la spectrophotométrie d'absorption ou de
fluorescence présente l'avantage d'être quantitative puisque le signal observé peut être
interprété en terme de pourcentage de complexe. De plus ces techniques sont très appréciées
pour déterminer la stoechiométrie en utilisant la méthode de Job [Job, 1928] et celle de Benesi
et Hildebrand [Hildebrand, 1949].
2.2.1.5 Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
La RMN utilise le principe de l'aimantation de certains noyaux atomiques présentant une
distribution anisotropique de charges, le spin. Placés dans un champ magnétique (B0), ils
interagissent avec lui.
Trois grands types d'interactions sont considérés entre les spins et les champs
magnétiques qui conduisent aux trois principaux paramètres de RMN (Fig. 16 ) :
- le couplage scalaire a lieu à travers les liaisons covalentes et est caractérisé par la
constante de couplage,
- le couplage dipolaire s'exprime à travers l'espace et donne des informations sur les
proximités spatiales,
- le déplacement chimique s'exprime en ppm et est caractéristique de
l'environnement de chaque noyau.
49
En effet soumis à BO, les noyaux ne perçoivent pas tous le même champ magnétique. Le
champ magnétique extérieur induit une circulation d'électrons autour du noyau considéré et en
retour, cette circulation de charges produit un champ magnétique très faible. Il en résulte que
le champ au voisinage de chaque noyau est différent. La RMN du proton permet d'identifier
une molécule d'après le déplacement chimique de ses protons. Toute modification de

l'environnement du noyau, comme par exemple l'approche d'une autre molécule provoquera
des modifications de son déplacement chimique. Ceci est particulièrement intéressant pour les
cyclodextrines pour lesquelles il est possible de repérer les variations de déplacements
chimiques des protons situés à l'intérieur de la cavité (H3, H5). Lorsqu'il y a inclusion, ceux-ci
sont les plus affectés alors que les protons situés à l'extérieur sont peu affectés [Gunther, 1993
; Duchêne, 1985].
Figure 16 . Shéma de principe des interactions magnétiques en RMN
Comparé aux techniques présentées ci-dessus, la RMN est la seule qui offre la possibilité
d'observer les deux espèces en présence simultanément en solution. C'est un facteur
décisif dans l'évaluation précise des procédés impliqués dans l'inclusion et des éventuels
phénomènes en compétition avec celle-ci. Leur absence de prise en compte dans les calculs
théoriques peut conduire à des résultats erronés tant sur le plan de la stoechiométrie que des
constantes d'association. La RMN est intrinsèquement quantitative, puisque l'aire des pics est
directement proportionnelle aux nombres de noyaux, mais elle est relativement peu sensible
comparée aux techniques spectrophotométriques. Avec l'amélioration des techniques de
détections, l'augmentation de la puissance des champs magnétiques (pour la RMN haute
résolution jusqu'à 18 T) et l'arrivée de la RMN bidimensionnelle, cet écart de sensibilité s'est
réduit mais reste significatif : la RMN travaille habituellement à des concentrations de l'ordre
de 10 -3 -10 -4 M alors que la spectroscopie UV atteint sans problème 10 -6 M et la
spectrophotométrie de fluorescence 10 -10 M.
50
La RMN, en plus d'amener une preuve de la réalité de l'inclusion, permet de déterminer
les proximités spatiales entre les protons de l'hôte et ceux de la molécule invitée, et donne
donc des informations concernant la structure tridimensionnelle du complexe [Perly, 1991].

La RMN permet de déterminer la stoechiométrie et la cinétique de l'inclusion dans tous
les cas de figure :
- complexe précipité
- complexe soluble avec cinétique d'échange rapide ou lent en utilisant la méthode de Job
et celle de Benesi et Hildebrand, bien que ces 2 méthodes, utilisables avec d'autres techniques
de caractérisation dont les techniques spectrophotométriques, ne bénéficient pas avec la RMN
de la même sensibilité.
La RMN permet de montrer les changements de conformation de la cyclodextrine dûs à
la formation du complexe, même en solution, ce que la cristallographie ne permet pas
[Djedaïni-Pilard, 1990 ; Inoue, 1989]. Réciproquement on peut mettre en évidence les
modifications chimiques ou conformationnelles de la molécule incluse [Wouessidjewe, 1989 ;
Djedaïni-Pilard, 1990]
La RMN apparaît donc comme la technique permettant la description la plus complète du
phénomène d'inclusion, lorsqu'il a lieu. C'est ce qui a motivé notre choix en tant que
principale technique de caractérisation dans notre étude.
2.2.2 Essais d'inclusion du rétinol et/ou de ses esters dans les cyclodextrines naturelles
ou modifiées
2.2.2.1 Essais de complexation avec l'αCD
Munoz-Botella et coll. [Munoz-Botella, 1996] rapportent, au cours d'une étude
impliquant plusieurs types de CD, un essai de complexation du rétinol avec l'αCD ; aucun
résultat positif n'a été obtenu.
2.2.2.2 Essais de complexation avec la γCD
La précédente étude n'a pas non plus montré de résultat positif avec la γCD.
Par contre, plus récemment, un brevet concernant des complexes de γCD et de rétinol a
été déposé [Moldenhauer, 1998]. Les auteurs y décrivent la préparation d'un éventuel
complexe par mélange à chaud (55°C) du rétinol et d'une solution aqueuse de CD (β ou γ)
sous atmosphère protégée. Puis agitation 72h, filtration et séchage. D'après les revendications
posées dans ce texte, il semble que seule la γCD se soit montrée efficace.
51

52
2.2.2.3 Essais de complexation avec la βCD
Le rétinol, l'acétate et le palmitate de rétinol sont les premiers exemples rapportés de
stabilisation de vitamines par les cyclodextrines [Schlenk, 1958].
Frömming et coll. [Fromming, 1988] ont étudié la complexation de l'acétate de rétinol
avec la βCD. La préparation se fait en mélangeant la vitamine A dans l'éthanol à une solution
aqueuse de βCD, le tout sous atmosphère azotée et à l'abri de la lumière. Cette méthode, par
co-précipitation, fut retenue par les auteurs car c'est la seule qui se soit montrée reproductible.
Les auteurs obtiennent un précipité qu'ils caractérisent par plusieurs méthodes : spectroscopie
UV et IR, 1 H-RMN, diffraction des rayons X, DSC, chromatographie liquide et couche mince
(CCM). Après lavages par l'éthanol et l'eau, pour éliminer les espèces libres, et après séchage
la spectroscopie UV (dans l'éthanol à 326 nm) donne une concentration en acétate de rétinol
qui correspondrait à une stochiométrie 5:2 (βCD: rétinol). Ce chiffre est confirmé par
l'intégration des pics du spectre RMN (dans le d6-DMSO).
La disparition des pics spécifiques de chaque espèce sur le diffractogramme montre
l'existence d'une nouvelle structure cristalline dans le précipité. En DSC, la disparition du pic
endothermique de l'acétate de rétinol dans le complexe lavé seul (et non dans le mélange
physique témoin, ni dans le complexe non lavé) semble indiquer la possibilité d'un
phénomène d'inclusion puisque la molécule est toujours présente lors du dosage (Fig. 17). De
même en CCM, les taches caractéristiques de l'acétate de rétinol disparaissent seulement dans
le cas du complexe lavé. Ce phénomène pourrait être dû à la dégradation de la vitamine A.
Mais la présence d'acétate de rétinol sous forme inchangée dans le complexe fraîchement
préparé est démontrée par spectroscopie IR et par CCM après extraction par le chloroforme.

Figure 17 . Thermogramme DSC de (a) acétate de vitamine A (b) βCD (c) mélange physique (d) complexe
d'inclusion non lavé (e) complexe d'inclusion lavé.
Les auteurs ont utilisé la spectrophotométrie UV pour déterminer la quantité de vitamine
A dégradée sur une période de plusieurs semaines. Ils affirment que la décomposition de la
vitamine A est plus rapide dans le complexe qu'à l'état pur cristallisé (Fig. 18).
Figure 18. Stabilité de l'acétate de vitamine A : ∗ acétate de vitamine A recristallisé, composé
d'inclusion βCD/acétate de vitamine A non lavé, composé d'inclusion lavé. E326/E250 représente la
proportion de produit intact.
53
Sans le démontrer, les auteurs ont pu montrer qu'il existait de fortes présomptions
concernant la formation du complexe d'inclusion.
Un autre ester de la vitamine A, le palmitate, a été étudié avec la βCD [Palmieri, 1992].
L'étude du complexe potentiel est réalisée par 2 méthodes : diagramme de solubilité de phase
et spectroscopie de fluorescence. Le diagramme de solubilité (Fig. 19) montre clairement que
la solubilité du palmitate augmente avec la concentration en βCD jusqu'à atteindre un plateau
(saturation de la cyclodextrine). Le spectre de fluorescence amène à la même conclusion en

montrant une augmentation de l'intensité du pic du palmitate avec la concentration en βCD.
En utilisant ces méthodes les auteurs décrivent une stochiométrie 2:1 (βCD:palmitate) à forte
concentration en βCD et 1:1 à faible concentration. On peut interpréter ce résultat en posant
l'hypothèse suivante: formation d'un complexe 1:1 et après complexation de toute la vitamine
A, addition d'une deuxième βCD sur chaque complexe.
βCD + Hôte → complexe 1:1
complexe 1:1 + βCD → complexe 2:1
Figure 19. Diagramme de solubilité de phase du complexe palmitate de vitamine A/βCD
Une étude a été menée par Wadstein et coll., [Wadstein, 1993] sur l'utilisation des βCD
pour améliorer la pénétration cutanée de plusieurs esters de rétinol. Dans leur brevet les
auteurs décrivent un complexe de stochiométrie 2:1 (βCD:ester) et déclarent améliorer
significativement la pénétration cutanée de ces esters en les rendant artificiellement
hydrosolubles.
2.2.2.4 Essais de complexation avec les CD chimiquement modifiées
54
Guo et coll. [Guo, 1995] ont travaillé sur la complexation du rétinol avec la per-(2,6-O-
diméthyl)-βcyclodectrine (Dimeb-CD). Cette dernière est synthétisée au sein de leur
laboratoire. Le complexe potentiel est obtenu en introduisant le rétinol et la CD dans un
mélange méthanol/eau (1/10). Les auteurs indiquent que d'après la littérature la présence de
méthanol n'influence pas la constante d'association et ils posent comme hypothèse l'existence
d'une stoechiométrie 1:1 pour calculer cette constante. Les constantes d'association calculées
pour le rétinol, le rétinal et l'acide rétinoïque sont très proches. Une structure est alors

proposée pour ce complexe : la partie terminale de la chaîne aliphatique n'est pas impliquée
dans le phénomène d'inclusion et celui-ci concerne plutôt la partie cyclique de la molécule.
Les calculs de la constante d'association reposant sur de simples hypothèses, ces conclusions
sont sujettes à caution. La caractérisation du complexe potentiel obtenu se fait par
spectroscopie UV dans l'eau et celle-ci montre que le déplacement de la bande d'absorption
caractéristique du rétinol correspond à celle observée dans la littérature dans le n-octanol et
dans des micelles. L'intensité de la bande d'absorption augmente avec la concentration en CD
indiquant une augmentation de la solubilité en milieu aqueux du rétinol en leur présence.
Okada et coll. [Okada, 1990] ont utilisé la 6-O-α-D-glucopyranosyl -β-cyclodextrine (G-
βCD) pour former un complexe avec le rétinol. Celle-ci, de par l'ajout d'une unité
glucopyranose, possède une solubilité en milieu aqueux supérieure à celle de la molécule
native et un pouvoir hémolytique plus faible. Ici les auteurs montrent bien par la construction
du diagramme d'Higuchi que la solubilité du rétinol augmente avec la concentration en G-
βCD ce qui est caractéristique d'un complexe de stoechiométrie supérieure à 1:1. Les auteurs
ont comparé, en utilisant les diagrammes de solubilité de phases, le pouvoir solubilisant de la
G-βCD avec celui de la Dimeb-CD et de la βCD. Les graphiques obtenus montrent que le
pouvoir solubilisant de la βCD est le plus faible et qu'avec la Dimeb-CD, un phénomène de
précipitation du composé formé à lieu lorsque la température augmente. Par contre avec la G-
βCD le composé formé reste soluble même à haute température. La stabilité en solution
aqueuse étudiée par HPLC indique que le rétinol se dégrade très rapidement (-50% en 4 jours)
sous l'action de la lumière et légèrement moins vite dans le noir.
Norwig et coll. [Norwig, 1988] ont utilisé la RMN du proton pour étudier la formation
d'un complexe entre la Dimeb-CD et l'acétate de rétinol. Les auteurs indiquent que le système
acétate de rétinol/Dimeb-CD présente des modifications des déplacements chimiques des
protons portés par les trois groupements méthylés du cycle de la vitamine A, ce qui indiquerait
que la partie cyclique de la vitamine A est incluse dans la CD. Mais ce spectre a été réalisé
dans un mélange D2O/d6-DMSO alors que celui de l'acétate de rétinol seul a été réalisé dans le
d6-DMSO. Ceci rend difficile l'interprétation des résultats car le fait de changer de solvant
implique toujours des variations de déplacement chimique des signaux de RMN.
Munoz-Botella et coll. [Munoz-Botella, 1996] ont étudié l'utilisation possible des
cyclodextrines pour augmenter le signal du rétinol dans les méthodes spectroscopiques
utilisant la fluorescence et l'absorption dans l'UV, à température ambiante. L'objectif est
d'augmenter la sensibilité de la méthode en améliorant la solubilité en milieu aqueux.
55

En spectroscopie UV, la bande caractéristique du rétinol dans les solvants organiques se
situe autour de 300-400 nm. Or, avec plusieurs rétinoïdes dont l'acétate de rétinol, en présence
d'HP-βCD et de βCD on obtient, en solution aqueuse, un spectre d'émission et d'exitation de
fluorescence de meilleure résolution que celui obtenu avec l'acétate dans l'éthanol ou l'hexane.
L'intensité de l'émission est même supérieure à celle obtenue seul dans l'éthanol (Fig. 20).
Considérant l'insolubilité dans l'eau de ce composé, ce résultat indique une influence de la CD
sur la solubilisation et donc sur la sensibilité de détection.
Figure 20 . Spectre d'exitation et de fluorescence de l'acétate de rétinol sous différentes conditions : 1
acetate de rétinol-βCD; 2 acetate de rétinol-HP-βCD; 3 acétate de rétinol dans l'éthanol.
Avec le rétinol par contre les auteurs ont rencontré de nombreuses difficultés pour obtenir
de bonnes intensités d'absorption et de fluorescence. L'intensité du spectre de fluorescence est
en effet plus faible que celle du rétinol en solvant organique. Les auteurs expliquent ce
phénomène par l'existence possible de liaisons hydrogènes avec les CD.
56
La stabilisation à long terme des vitamines complexées a été vérifiée : la diminution de
l'intensité du fluorescence après 20 jours n'a pas dépassé 15%. Il semblerait que les forces
mises en jeu entre CD et molécule invitée limitent les mouvements de cette dernière et donc
réduisent le phénomène d'isomérisation des rétinoïdes. Les auteurs, observant que le
comportement des composés obtenus avec le 13-cis-rétinal et le rétinal est identique,
suggèrent que la partie cyclique de la molécule est incluse dans la cavité de la CD. Même si
la réalité de l'inclusion n'a pas été démontrée, cette expérience démontre l'influence très
positive des CD pour augmenter la sensibilité de techniques de détection en milieu aqueux.
McCormack et coll. [McCormack, 1998] se sont intéressés à la formation de complexes
HP-βCD/rétinol et à leur encapsulation dans des liposomes. L'objectif étant de modifier la
pharmacocinétique, après administration intra-veineuse (IV), de complexes d'inclusion grâce

à leur encapsulation dans les liposomes. En effet, de manière générale, après injection IV les
complexes CD/principe actif sont rapidement dissociés par des phenomènes de dilution et de
compétition décrits dans la littérature [Mesens, 1993 ; Pitha, 1993]. Les CD sont totalement
excrétées en 24h avec une partie du principe actif, le reste étant fortement métabolisé.
L'inclusion du complexe dans la phase aqueuse d'un liposome permettrait d'éviter ces
inconvénients puisque le complexe d'inclusion resterait intact et que les liposomes sont
majoritairement captés par le foie et la rate [McCormack,1998]. Les auteurs ont utilisé pour
cette expérience des radiomarqueurs ( 3 H pour le rétinol et 14 C pour les CD) et une technique
de détection appropriée.
Le rétinol est solubilisé dans un mélange chloroforme/éthanol et resolubilisé dans une
solution aqueuse de CD après évaporation du solvant organique. Des mesures de
radioactivités ont mis en évidence la présence du rétinol dans le surnageant obtenu après
centrifugation, ce qui indique la formation potentielle d'un complexe d'inclusion. Le
surnageant est utilisé pour la phase d'encapsulation dans les liposomes et les mesures de
radioactivité sanguine, effectuées après injection intra-veineuse à des rats, montrent la
présence de rétinol. Ceci confirme la présence d'une interaction forte entre la CD et le rétinol
amenant l'inclusion de ce dernier dans les liposomes. Quant à l'étude pharmacocinétique
même, elle a montré que l'encapsulation augmente la durée de circulation du complexe dans
l'organisme et ralentit sa dissociation.
⇒ Ces différents exemples montrent que les complexes rétinol (ou esters de rétinol)/
cyclodextrine ont été étudiés à maintes reprises. Aucun résultat positif concernant l'αCD n'a
été décrit, mais concernant la γCD, la βCD et les βCD chimiquement modifiées une
amélioration de la solubilité a été mise en évidence et le phénomène d'inclusion est fortement
soupçonné. Ceci ouvre des perspectives intéressantes. Cependant, aucune preuve catégorique
concernant la stoechiométrie et la structure tridimensionnelle des différents composés obtenus
n'a été apportée.
Au vu des résultats exposés ci-dessus et de l'intérêt du rétinol dans les domaines
pharmaceutiques et cosmétiques, nous souhaiterions préparer des complexes d'inclusion
hydrosolubles et stables à long terme avec les cyclodextrines naturelles ou modifiées.
57
Il semble en effet que cette approche puisse non seulement apporter une solution au
problème de solubilisation du rétinol dans les milieux aqueux, mais aussi, éventuellement,
ralentir sa dégradation, ce qui serait un progrès majeur.

58
3. TRAVAUX PERSONNELS

3. TRAVAUX PERSONNELS
INTRODUCTION
Nous avons choisi de diviser ce travail de thèse en deux grands chapitres.
Le premier chapitre traite des résultats obtenus lors de l’inclusion du propionate de
vitamine A (PVA) dans des cyclodextrines conventionnelles, c’est à dire commerciales. Le
PVA est le dérivé de vitamine A que nous avons utilisé dans toutes les études car il est plus
stable que la vitamine A pure et permet une utilisation plus facile à l’échelle du laboratoire.
Nous avons tout d’abord utilisé les cyclodextrines naturelles αCD, βCD et γCD dont les
résultats concernant la formation de complexes avec le PVA, la solubilisation et/ou la
stabilisation du PVA sont présentés dans l’article n° 1. Ce premier article ne traite pas du
travail de thèse à proprement dit mais de celui effectué lors du DEA précédent la thèse.
Toutefois, ce travail étant essentiel pour aborder la suite et n’ayant pas encore été publié, il
nous a semblé important de l’incorporer dans ce manuscrit.
La solubilisation du PVA par ces 3 CD naturelles n’ayant pas été obtenue, nous nous
sommes alors tourné vers une cyclodextrines modifiée possédant une solubilité accrue : la
Rameb (heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose randomisée). La complexation du
PVA par la Rameb nous a permis d’obtenir un complexe soluble dans l’eau et stable. A partir
de là, nous nous sommes tournés vers une application biologique de ce complexe, ce qui nous
a amené à étudier la pénétration du complexe dans des échantillons de peau humaine, après
application cutanée. Ce travail a fait l’objet d’un brevet et de deux articles présentés ici :
article n° 2 et article n° 3. Dans l’article n° 2 sont décrits uniquement les résultats de dosage
du PVA, alors que l’article n° 3 contient en plus les résultats de dosage de la Rameb.
59
Une discussion reprenant l’ensemble des résultats de ce chapitre est présentée ensuite.
Le deuxième chapitre est consacré à l’utilisation de cyclodextrines synthétisées au sein de
notre laboratoire et caractérisées par le greffage, sur une et une seule fonction hydroxyle
primaire, d’une molécule de cholestérol. Ces dérivés monofonctionnalisés possèdent
d’étonnantes propriétés d’interactions avec les membranes biologiques, ce qui pourrait être un

avantage pour nous puisque nous cherchons un nouveau vecteur capable d’emmener le PVA
dans la peau.
Le premier article de ce chapitre, article n° 4, ne concerne pas directement le PVA mais
est consacré à l’étude des interactions entre un film phospholipidique modèle et de la Dimeb-
Chol qui est le dérivé obtenu en greffant un cholestérol sur la Dimeb (heptakis-(2,6-di-O-
methyl)cyclomaltoheptaose) par l’intermédiaire d’un bras espaceur. Ce dernier permet de
donner une certaine souplesse et est absolument nécessaire pour son insertion dans les
bicouches. Nous montrerons que ce composé, tout en conservant ses propriétés d’inclusion,
peut s’insérer dans un film modèle de phospholipides.
Le second article de ce chapitre, article n° 5, concerne le dérivé βChol, obtenu en
greffant un cholestérol sur la βCD, sans bras espaceur. Après une étape d’acétylation des
hydroxyles libres de la partie cyclodextrine on obtient un composé hautement hydrophobe, la
Chol-βCD acétylée ou Chol-βCD-Ac. Cette molécule possède des propriétés physico-
chimiques permettant d’obtenir, par la technique adéquate, des nanosphères ou des
nanocapsules. Nous montrerons qu’il est possible d’obtenir des nanoparticules chargées en
PVA et, de la même façon que pour le complexe Rameb/PVA, d’étudier la pénétration de ce
composé dans des échantillons de peau humaine.
Nous terminerons par une discussion générale avant de conclure.
Nous conseillons aux lecteurs qui ne seraient pas familiers avec la peau et les études de
perméabilité cutanées de se rapporter d’abord à l’annexe 1. La même réflection s’applique
pour les dosages immunoenzymatiques, que nous avons utilisés pour le dosage de la Rameb
dans les échantillons biologiques et dont le principe est rappelé dans l’annexe 2.
60

61
CHAPITRE 1

3.2Chapitre 1
3.2.2 Article n°1
62
Complexation of vitamin A propionate by natural cyclodextrins
S. Weisse, B. Perly, J-P. Dalbiez, F. Djedaïni-Pilard
Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry (soumis)
Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry

COMPLEXATION OF VITAMIN A PROPIONATE BY
NATURAL CYCLODEXTRINS
SANDRINE WEISSE, BRUNO PERLY, JEAN-PIERRE DALBIEZ, and FLORENCE
DJEDAÏNI-PILARD
Key words: cyclodextrins β and γ - vitamin A - inclusion complex - chemical
stabilization
corresponding author:
Florence Djedaïni-Pilard
Laboratoire des Glucides
Université de Picardie-Jules Verne
33, rue Saint Leu
80 039 Amiens, Cedex
France
tel/fax 00 33 (0)3 22 82 75 62
mail: florence.pilard@sc.u-picardie.fr
COMPLEXATION OF VITAMIN A PROPIONATE BY
NATURAL CYCLODEXTRINS
Sandrine Weisse a , Bruno Perly a , Jean-Pierre Dalbiez a and Florence Djedaïni-Pilard b*
a Service de Chimie Moléculaire, CEA Saclay, F-91191 Gif sur Yvette, France
b Université de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides, EA 2082, 33 rue S t Leu, F-
80039 Amiens, France
63
Abstract. Vitamin A propionate (PVA) is a highly unstable and poorly water soluble
molecule which has a real interest in therapeutic. In the presence of βCD or γCD, inclusion
complex are formed. NMR study was performed to demonstrate the reality of inclusion and
determine the stoichiometry of each complex: 1/1 for the γCD/PVA complex and 2/1 for the

βCD/PVA complex. A stability study using NMR and HPLC indicated that βCD induces an
accelerated degradation of vitamin A propionate, but on the contrary, γCD can protect it very
efficaciously for many months.
Key words: cyclodextrins β and γ - vitamin A - inclusion complex.- chemical stabilization
INTRODUCTION
In the therapeutic field, the efficiency of a drug depends partially on its physical properties.
Among those, two are essential : first, a good aqueous solubility and second, a long term
chemical stability. When a molecule does not fit those criteria, its use becomes more
complicated and thus its application are limited. Vitamin A (retinol) is an interesting example
of such molecule. Indeed, it is highly unstable in the presence of oxygen, light or heat and
shows a very low solubility in water. At the present time, vitamin A and derivatives have a
real interest in therapeutic [1] : their main indications are irritant dermatitis, superficial burns
and wounds, cornea traumas, as well as some cases of asthenia and emaciation. It is also used
in cancer therapy, for its role in cellular growth and differentiation [2] and in cosmetology to
regulate the cellular metabolism of skin and thus prevent wrinkles formation.
Therefore, despite the fact that there is already many commercial forms available, researchers
are still looking for new pharmaceutical tools to improve its stability and solubility.
64
For this purpose, many methods have been tried. Most of them deal with the use of anti-
oxidizer in solutions or emulsions of micro-particles [3-8]. Those techniques gave very few
satisfactory results in term of improvement of the stability of vitamin A and derivatives and
no results concerning the water solubility improvement. A more efficient protection could be
obtained by physically protecting the vitamin A from its environment. This could be achieved
by using bio-compatible cyclo-oligosaccharides such as cyclodextrins to form supramolecular
water soluble complexes. Indeed, some examples of attempts of inclusion of vitamin A or its
esters in cyclodextrins have already been reported [9-14] but some discrepancies are found in
the literature. For example, Munoz-Botella and coll. [14] established in their work that the
αCD cannot complex retinol or its derivatives. For γCD, a patent based on the work of
Moldenhauer and coll. [11] describes the preparation of a complex by mixing with retinol or
some of its derivatives at 55°C. The authors claimed a good stabilizing effect on the retinol or
its derivatives. The βCD has the longest history of complexation with retinoids as it was first
tried by Shlenk and coll. (1958) [9] who reported the possible formation of βCD inclusion
compounds with vitamin A alcohol, acetate and palmipate in a patent, by which they hoped to

achieve a stabilizing effect. Fromming and coll. [10], using vitamin A acetate and βCD,
obtained a precipitate that they charaterized by UV and IR spectroscopy, 1 H- NMR, DSC,
HPLC, CCM and SAXS. They clearly demonstrated that PVA remains intact in the
precipitate, along with the CD after several washings with ethanol and water. It is also
indicated a 5/2 βCD/PVA stoichiometry. Other authors [12,13] indicated a 2/1 stoichiometry.
Two main raisons can be involved to rationalize theses differences: the mode of preparation
and purification of the solid complex and the physical techniques used to derive the
stoichiometry of the inclusion complexes and the chemical integrity of the guest molecule.
We report here on the possible formation of inclusion complexes between vitamin A
propionate and natural cyclodextrins (αCD, βCD and γCD). We had to replace vitamin A
(retinol) by one of its ester since the alcohol is too unstable. The vitamin A propionate (PVA)
(Figure 1) was chosen among several retinol esters after a preliminary study assessing their
efficiency on human fibroblasts growth. For each cyclodextrin we will determine, by NMR,
HPLC and Mass spectrometry, the existence of an inclusion complex, then characterize it in
term of stoichiometry, and study its stability versus several parameters like presence or
absence of light, temperature and oxygen.
EXPERIMENTAL
Material
Vitamin A propionate (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany). β-cyclodextrins
and α,γ-cyclodextrins were gifts from Roquette (France) and Wacker (Germany), respectively.
All chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments, and deuterated
solvents were from Euriso-Top (Saclay-France).
Preparation of inclusion complexes
65
The potential for each cyclodextrin to form a complex in water with vitamin A propionate was
assayed during preliminary studies. The CD/drug mixtures were prepared by mixing
accurately weighted quantities in water, the final concentration of CDs and vitamin A
propionate being 10 and 20 mM respectively. The mixtures were stirred during a few hours
then centrifugated for 10 mn at 6000 rpm. The aqueous solutions were filtered on Millex-SG
0.22µm then freeze-dried before redissolution of 10mg in 0.4 mL of D2O for NMR
investigations. The precipitates, if present, were washed three times by centrifugation with

water and ether to eliminate the free species (host and guest), then dried slowly under a stream
of nitrogen and freeze-dried before redissolution of 10mg in 0.4mL d6-dmso.
For the long term stability studies, the complexes were prepared on a larger scale :
100 mL of a 10mM βCD and 20mM vitamin A propionate solution in water.
20 mL of a 50mM γCD and 100mM vitamin A propionate solution in water.
Once the resulting complexes were washed and freeze-dried, each one was divided in 4
batches to study the influence of light, temperature and oxygen on the vitamin A propionate
(Table I). We did the same repartition for the drug alone. Each batch was studied periodically
by 1 H-NMR and HPLC over a period of 24 months.
STORAGE
CONDITIONS
Vitamin A
propionate
Complex
βCD/PVA
Complex
γCD/PVA
25°C, natural light
alone
VA βA γA
25°C, dark VB βB γB
4°C, dark VC βC γC
4°C, dark , under
Argon
Table I. batches considered in the stability study
NMR Techniques
VD βD γD
1 H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer
using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed
at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to
external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of
the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed
and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar
correlations (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after
zero-filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlations (NOESY experiment),
the phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.
The stoichiometry of solid complexes was obtained by digital integration of the signals of the
1 H-NMR spectrum of the washed precipitates, performed in d6-dmso.
66
To determine the influence of the concentrations of the CD on the solubility of vitamin A
propionate, we prepared solutions containing a fixed amount of vitamin A propionate (2mM

for the βCD/PVA complex and 20mM for the γCD/PVA complex) and increased
concentrations of CDs up to their solubility limits (2, 5, 10 and 17mM for the of βCD and 50,
20, 100 and 200mM for the γCD). (Tables II and III)
The aqueous solutions obtained after 24h mixing were washed two times with 300µL ether to
remove free vitamin A propionate. Since neither the complex nor the CD are soluble in ether,
all the CD remains in the solution, either in free form or in complexed form. The solutions
were freeze-dried and 10mg dissolved in 0.4mL d6-dmso for 1 H-NMR study: integration of
the signals allowed to calculate [PVA]t/[CD]t where [PVA]t represents the initial
concentration of vitamin A propionate and [CD]t the initial concentration of CD. Then the
concentration of the complex which is estimate equal to that of [PVA]t as long as there is a
large excess of CD (according to Benesi-Hildebrand hypothesis [15]).
HPLC
Analytical HPLC was carried out with a Waters Delta Prep 3000 chromatograph equipped
with an LSED detector and a Nova-Pack ® C18 WATERS column, elution with methanol
(Chromasolv ® filtered on Millicup PTFE 0,5μm ) at 1ml/mn. An UV detector was used
(WATERS Lambda Max at 340 nm) in the case where the interesting peaks were overlapped
by the peak of the CD with LSED, as CDs do not appear with UV detection.
Mass Spectrometry
Electrospray mass spectrometry analysis were performed in positive mode on a Micromass
Quattro II. Samples were dissolved in a mixture of water-acetonitrile 1:1 (v:v) at a
concentration of 0.01 mg.ml -1 and infused into the electrospray ion source. The capillary
voltage was set to 4 Kv.
RESULTS AND DISCUSSION
67
First of all, the aspect of the aqueous solutions obtained after 24h mixing with αCD, βCD and
γCD respectively, is informative : the first one leads to a cloudy, homogeneous solution with a
yellow oily upper layer whereas the use of βCD and γCD lead to a white suspension with a
precipitate and a yellow oily upper layer. After centrifugation there were more precipitate in
the last two but no precipitate with αCD. This observation alone suggests that an insoluble

complex is formed with βCD and γCD. However these preliminary results and the possible
presence of a soluble complex in all supernatants have yet to be proved by the NMR studies.
Determination of the inclusion phenomena by NMR study
The first NMR experiments were dedicated to the complete assignment of the protons of pure
vitamin A propionate in d6-dmso (Figure 1). The following bidimensional experiments were
used to complete the 1 H-NMR spectrum: COSY, COSY relay and NOESY.
The 1 H-NMR spectra in d6-dmso (Figure 2) of the precipitates obtained previously indicate
that both the CD (βCD or γCD) and the vitamin A propionate are present. Comparison of the
1 H-NMR spectra of the guest alone (Fig 1) and of the precipitates (Fig 2) shows also that the
chemical integrity of vitamin A propionate is preserved. Since all the free drug has been
eliminated by ether washings, as described in experimental section, it should be assessed that
presence of vitamin A propionate was induced by inclusion process with βCD and γCD. But
to prove it, experimental evidence of the reality of inclusion must be given. This is fully
supported by the observation of the NMR spectra of the complexes in water at high dilution
(Figure 3) : larger differences are observed upon inclusion of vitamin A propionate and most
signals of the CD host are shifted upfield. Shifts are due mainly to the anisotropic effects of
the double bonds and the carbonyl group. It is noteworthy that NMR allows clear distinction
between inclusion and any other possible external interaction processes, with large effects
observed on the proton located in the hydrophobic cavity (H3 and H5), clearly proving
inclusion [16,17]. On the other hand, protons located on the outside experience no or very
small shifts.
Figure 1. 1 H-NMR spectrum of vitamin A propionate in d6-dmso at 298 K and 500 MHz
(10mM)
4
3
5
2
6
1
H7, H8, H12
7 9 11 13 15
8 10 12 14
H15
68
OCOC 2 H 5
d6-dmso
CH2
Methyls
9 13 1
Methyl 5
CH3

H11
H10 H14
69
HDO acetone
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
H4
H3H2
1 1 3 1 2
2 233
3 2 2 9

(a)
OH2 OH3
PVA PVA
PVA
PVA
OH6 H1
H3
H5
H6 H6'
betaCD
H2 H4
0.5 0.5 1.5 14 7 1 7 28 1 1 3X1.5 1 1 4.5
(b)
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm
PVA
PVA
70
gammaCD
Figure 2. 1 1 1 H-NMR 3 16 spectra 1 of 8(a) 2the 8βCD/PVA and 32 (b) the γCD/PVA 2complexes 2 33 3
in
2 2
d6-dmso
9
at 298 K and 500 MHz (10mg in 0.4cc)
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm

Figure 3. partial 1 H-NMR spectra (in D2O at 298K and 500 MHz) of (a) γCD alone (b)
γCD/PVA complex
In the case of αCD, no precipitate is formed when vitamin A propionate is added which lead
to two hypothesis : no inclusion complex is formed or there is a water soluble inclusion
complex. The aqueous solution was freeze-dried and dissolved in D2O. The 1 H-NMR
spectrum in D2O does not show any signals of the protons of vitamin A propionate, indicating
that the first assumption is correct, and in accordance with results obtained by Munoz-Botella
[14].
(a)
4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 ppm
(b)
4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 ppm
Determination of the stoichiometry
Since both complexes exhibit low solubility in water, a reliable determination cannot be
71
H3 H5 H2 H4
obtained in aqueous media using the Job’s continuous variation method [18 ] due to the low
signal-to-noise ratio. The spectra of the complexes, purified as described in the experimental
section, were therefore recorded in d6-dmso to derive the molecular ratio, since vitamin A
propionate and cyclodextrins exhibits high solubility in this solvent. It should be pointed out

that under these conditions, solvation of the cyclodextrin by dmso molecules induces
dissociation of the inclusion complexes [19]. The present spectra allow, however, a very
accurate determination of the stoichiometry in the original complex. Digital integration of
relevant lines from the vitamin A propionate (H15, H10 or H11 for example) and from the
cyclodextrin (OH2, H1 or H6) confirms the stoichiometry of the considered complex.
Integration of the signals of the 1 H-NMR spectrum in d6-dmso of βCD/PVA and γCD/PVA
complexes (Figure 2) allowed to determine easily and without any doubt the CD/PVA ratio
in the complex. The results are : 1/1 complex for γCD/PVA and 2/1 complex for βCD/PVA.
This 2/1 stoichiometry for the βCD/PVA complex has already been reported for other vitamin
A esters such as palmitate and acetate [12, 13].
These results are in adequacy with the size of the cavities of the CDs : since the βCD is
smaller it is possible that the part of the vitamin A propionate molecule that remains outside
can be included in a second βCD.
Influence of the concentration of CD on the solubility of PVA in water
In water, the formation of the complex follows this equilibrium : PVA + nCD ↔ X , where X
represents the PVA/CD complex (with a 1/n stoichiometry). Therefore the association
constant is equal to : k = [X] ([PVA] [CD] n ) -1 where [X], [PVA] and [CD] represent the
concentration of inclusion complex and free species in solution respectively. If the total
concentration of vitamin A propionate [PVA]t remains constant and always very low
compared to that of the CD, [CD]t, then we can estimate that the concentration of the
complexes is equal to the vitamin A propionate concentration as already demonstrate by
Benesi and Hildebrand [15].
[PVA]t = [X] + [PVA] and [CD]t = [X] + n [CD]
if [CD]t >> [PVA]t then [PVA]t ≡ [X]
The method described in the experimental section satisfied this condition ([CD]t >> [PVA]t)
and led to the determination of the concentration of complexes for [γCD]t/[PVA]t ratio of
2.5, 5 and 10 and [βCD]t/[PVA]t ratio of 2.5, 5 and 8.5. Several signals of the vitamin A
propionate were digitally integrated on the 1 H-NMR spectrum performed in D2O, the
calibration being made on the signal of anomeric proton (H1) of the CD for which the
concentration [CD]t is known and equal to its initial concentration. The concentration of
complexes in water is deduced to the mean value obtained from the integration of the vitamin
A propionate signals. (Tables II and III)
72

[PVA]t
[γCD]t mM [X] mM [PVA]t mM [βCD]t/
[X] mM
mM
[PVA]t
200 1,1 17 0,13
20 100 1,3 2 10 0,13
50 0,58 5 0,12
Table II and III: concentrations used to determine the influence of the concentration of CD on
the concentration of the resulting complex (X). The concentration of PVA is constant and
fixed to 2mM for the βCD/PVA complex and to 20mM for the γCD/PVA.
These results indicate that, in both case, once the [CD]t/[PVA]t ratio reaches 5, the
concentration of complexes does not increase anymore. This allowed us to determine the best
conditions to prepare the complexes. It should be noticed that the concentration of the
γCD/PVA complex is ten times higher that of the βCD/ PVA complex and reaches a
maximum of 1mM in the presence of 5 equivalents of γCD. It should be stressed here that the
solubility of PVA alone in water is absolutely null.
Stability studies
NMR and HPLC were found to be very appropriate to show any chemical modifications of the
vitamin A propionate alone and in presence of βCD and γCD. A careful NMR analysis has
been performed in d6-dmso in all cases as described in the experimental section (storage in
natural light or in the dark, both at 25°C and at 4°C) to check the molecular integrity of the
host and the guest molecules, even if desincluding solvent such as dmso was used. The main
interest of NMR in this case is that any new signal on the spectrum indicates chemical
modification of the guest. Morever, since the assignment of the molecule is clear, it is possible
to know which moiety of vitamin A propionate was affected. We performed this analysis after
10 days, 30 days, 60 days, 6 months and 24 months. Also the HPLC survey was added. This
method could complete the NMR study since each new peaks to appear stands for a molecule
with a different polarity, though giving us possible information on the number and the nature
of the degradation products.
73
We have summarized the main results in table IV.
VA VB VC VD βA βB βC βD γA γB γC γD
J+10 + - - - + + - - - - - -
J+30 ++ - - - ++ + + - -/+ - - -

J+60 ++ + - - ++ ++ + + -/+ - - -
J+180 +++ + + - +++ +++ ++ ++ -/+ -/+ -/+ -
J+730 +++ ++ + + +++ +++ +++ +++ + -/+ -/+ -/+
Table IV. Batches degradation: (-) no degradation (-/+) specific chemical modification of the
ester group, (+) light degradation, (++) intense degradation , (+++) complete degradation.
This table shows only the rate of the degradation process for each batches, but we must
underlined here that the degradation profile of vitamin A propionate in the βCD/ PVA
complex is very different from that of vitamin A propionate in the γCD/PVA complex, and
none of them matches the degradation profile of vitamin A propionate alone (for HPLC and
NMR).
For the drug alone, batch VA (25°C and light), the modifications of the 1 H-NMR spectrum
indicated that chemical modifications first appeared on the side chain and quickly gained the
complete skeleton of the molecule. After 60 days, only the terminal CH2 was preserved, and
by 6 months the degradation was complete (Figure 4 b). Batches VB, VC, and VD exhibited
no observable modifications at all until 60 days. It seems that natural light is the main factor
of degradation process of vitamin A propionate alone. For the vitamin A propionate in the
βCD/ PVA complex, the first signs of degradation appeared after 30 days on the ring and on
the terminal ester in the form of secondary signals at the basis of the signals of the protons of
vitamin A propionate. As those secondary peaks get bigger, those of vitamin A propionate are
reduced until all the specific signals of the molecule disappeared (6 months) (Figure 4 c). It
happened faster on the batches βA and βB (at 25°C) than on the batches βC and βD (at 4°C),
but the result was the same: there was no vitamin A propionate left after 6 months. For the
vitamin A propionate in the γCD/PVA complex, NMR spectra indicate that the only part of
the molecule affected by chemical modifications was the terminal ester group: secondary
signals could be seen after 30 days on batch γA and after 180 days for γB, γC and γD. The
chemical modification increased slightly (Figure 4 a) with time but no other signs of
degradation appeared, even after 24 months : the major part of the molecule remains
74
unaffected in the presence of γCD and the guest molecule must keep its biological properties.
The HPLC survey (data not shown) also shows different degradation profiles for PVA alone,
in the βCD/ PVA complex and in the γCD/PVA complex in agreement with NMR studies.
The reference chromatogram of vitamin A propionate shows a single peak with a retention

time (Tr) of 3.6 mn but the same chromatogram after 60 days storage under light and air at
25°C (batch VA) shows many new peaks induced by possible degradation products : peak
Tr 0.8 mn, peak Tr 1.45 mn, peak Tr 2,4 mn, peak Tr 6.2 mn, peak Tr 16.8 mn,
peak Tr 19.2, peak Tr 22 mn, peak Tr 24.2 mn, peak Tr 29.6mn. Some peaks (,
, ) exhibiting smaller retention times than the peak of PVA can be attributed to more polar
molecules and conversely, peaks exhibiting longer retention times (, , , , , )
correspond to less polar products. For VB (same recording and injection parameters) those
peaks are less important and they are barely present for VC and VD. By sixth months there is
no more vitamin A propionate in VA but VC and VD are well conserved. For βA, the same
peaks as those present for VA appeared after 60 days, but one of them (peak 5) is much more
higher. βB, βC and βD are absolutely similar to βA and after 6 months vitamin A propionate
disappeared from the chromatograms of the four batches indicating complete degradation of
the molecule, like previously observed with NMR. Finally for γCD/PVA, after 60 days the
four batches (γΑ, γB, γc, γD) are similar : smaller peaks and are present but the less
polar degradation products observed with VA batches are absent. After 6 months, there is no
noticeable changes on the chromatogram. Since the inclusion phenomena with βCD has a
great impact on peak 5, we attempted to determine the nature of this specific derivative. It was
isolated by semi-preparative HPLC and studied by Mass Spectrometry : the product has a high
Molecular Weight, 1121 g/Mol, which means its not a derivative of the molecule but some
kind of aggregate, the nature and structure of which remain unknown.
All those results, NMR and HPLC provide us with valuable information. First of all, when
regarding the vitamin A propionate alone, the comparison between the spectra of VA, VB,
VC, VD shows that protecting vitamin A propionate from light decreases the degradation
rates and almost stopped it. This is quite a surprise since oxygen and temperature are
supposed to play a more active role, but it must be reminded that the product we use is
commercial and contains a conservative agent (antioxidant). However, the major effect of
light on degradation is confirmed by data from the literature which states that the double
bonds rearrangements are induced by light [20, 21]. The effect of temperature is less
important but still relevant as batches at 4°C (dark) show slight amelioration compared to
those at 25°C (dark).
75
The most interesting point of this study is the effects of the inclusion in cyclodextrins. It must
be emphasized here that the degradation profile of vitamin A propionate in the βCD/ PVA
propionate is different from that of vitamin A propionate alone. Inclusion in the βCD lead to a

faster degradation which does not match the natural degradation profile of the molecule. This
phenomenon occurs in all the storage conditions, indicating it is not caused by exterior factors
but by the inclusion in βCD it-self. This was already suspected with another ester of vitamin
A like the acetate [9,10]. On the contrary, it is clear the inclusion in γCD allows to slow down
the degradation process and keep a major part of the guest unaffected for at least 6 month,
even in the presence of light or oxygen. This is in accordance with the stabilizing effect of
γCD observed by Moldenhauer et al. [11] on retinol and its derivatives.
76
Figure 4. Partial 1 H-NMR spectra of (a) γCD/PVA complex (b) vitamin A propionate (c)
βCD/PVA complex, after 6 months storage at 25°C under light ( d6-dmso, 298K , 500 MHz)

Figure 5. Estimated structure of (a) the γCD/PVA complex (b) the βCD/PVA complex
(a)
(a)
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 ppm
(b)
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 ppm
(c)
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 ppm
77

(b)
78
To explain the different behaviour of the vitamin A propionate in the 2 complexes, it should
be reminded that the stoichiometry of the βCD/PVA complex is 2/1 while that of the
γCD/PVA complex is 1/1. If a vitamin A propionate molecule is included in 2 βCD
simultaneously, we can suppose that each one comes to one of the extremity , the secondary
face looking at each other (as the inclusion must start by the secondary and larger face) (Fig
5b). Therefore, the specific and very important degradation process of the vitamin A
propionate in the βCD/PVA complex can be explained by the action of the two secondary
hydroxyl rings. Indeed, chemical modifications of the guest molecule induced by the CD have
already been described in the literature, especially for βCD. Thus, it was clearly demonstrated
in the βCD /spironolactone complex that the secondary hydroxyls of βCD lead to the thiol

analog of spiranolactone [22]. A 1/2 complex was indeed obtained with spironolactone and
βCD and it was shown by NMR that this steroid is s-desacetylated quantitatively in the
inclusion process. Evidence has been given showing that this chemical modifications is
directly related to the inclusion. Attempt to explain this phenomenon involve the possible
catalytic effect of the secondary hydroxyls of the cyclodextrins. A very strong hydrogen bond
(OH2-OH3) would explain the high acidity of OH groups of βCD [23].
In the γCD/PVA complex, it is reasonable to think that the bigger part of the molecule is
included in the CD, as the inner cavity is large enough, and so protected from exterior factors.
As the NMR spectra show that only the terminal ester is affected by degradation, we can
suppose that this part of the molecule remains outside the cavity and is not protected or is
attacked by the secondary hydroxyls of the γCD (Figure 5a).
CONCLUSION
We were able to demonstrate that vitamin A propionate can be included in both βCD and
γCD, resulting in solid complexes with 2/1 and 1/1 stoichiometriy respectively .
Then, the HPLC and NMR studies showed that inclusion in βCD not only accelerate the
degradation process of vitamin A propionate but also modify it since the derivatives obtained
are different from those that appeared in the case of vitamin A propionate alone. On the other
hand , inclusion in γCD allows to slow down the degradation process really significantly and
to keep the major part of the molecule unmodified for several months, even in the worse
storage conditions.
ACKNOWLEDGMENT
We gratefully acknowledge LVMH-GIE, Branche Parfums et Cosmetiques (C. DIOR, St Jean
de Braye, France) for the financial support and especially J. C. Archambault, P. André and
Professor P. Rollin (ICOA, Orléans, France) for helpful discussions.
REFERENCES
[1.] M. H. Zile and M. E. Cullum: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 172, 139 (1983).
79
[2.] J. G. Allen and D. P. Bolxham:” Retinoids” , Mackie R.M editor, Pergamon Press (1989).

[3.] M. Froix, S. Nacht, M. Pukshansky (Advanced Polymers Systems, Inc): European
Patent 0781551A1 (1996).
[4.] C. E. Clum and J. C. Wang (Johnson and Johnson Consumers Products, Inc): Patent WO
93/00085 (1991).
[5.] M. Froix, S. Nacht, M. Pukshansky (Advanced Polymers Systems, Inc.): European
Patent EP 0781551A1 (1996).
[6.] A. Noda, M. Aizawa, Y. Kumano, M. Yamaguchi: J.SCCJ 25, 223-231 (1992).
[7.] R. Sarama, T. Wehmeier, M. R. Sevenants, M. A. Sanders (The Procter and Gamble
Company): Patent WO 96/04243 (1995).
[8.] S. Weisse: These d’exercice n° 91/98 Faculté de Pharmacie de Chatenay-Malabry
Université de Paris XI (1999)
[9.] H. D. Schlenk , D. M. Sand, J. A. Tillotson: US patent 2827452 (1958).
[10.] K. H. Frömming, T. Gelder, W. Mehnert: Acta Pharma. Technol. 134 152-155 (1988).
[11.] J. Moldenhauer , M. Regiert, T. Wimmer (Wacker Chem GmbH): European Patent EP-
867175 (1998)
[12.] F. Palmieri , P. Wehrlé , G. Duportail , A. Stamm : Drug development and industrial
pharmacy 18 (19), 2117 (1992).
[13.] J. Wadstein , M. Samuelsson Skin care composition: Patent WO 94/21225 (1993).
[14.] S. Munoz Botella, D.A. Lerner D, B. del Castillo, M.A. Martin M.A: Analyst 121, 1557
(1996).
[15.] J. A. Hildebrand, H. A. Benesi: J. Am. Chem. Soc. 71, 2703 (1949).
[16.] F. Djedaini, S. Z. Lin, B. Perly, D. Wouessidjewe:J. Pharm. Sci. 79, 643 (1990).
[17.] F. Djedaini, B. Perly: Magn. Reson. Chem. 28, 372 (1990).
[18] P. Job: Ann. Chim. 9, 113 (1928).
[19] F. Djedaini, B. Perly: J. Pharm. Sci. 80, 1157 (1991).
[20.] R. Blomhoff: “Vitamin A in health and disease”, Ed. Blomhoff, Marcel Dekker Inc, NY,
10016 (1994).
[21.] W. Friedrich: “Vitamins”, Ed. W de Gruyter, Hawthorne, NY 10532, 1058. (1988)
[22.] D. Wouessidjewe, A. Crassous, D. Duchêne, A.W. Coleman, N. Rysaneck, G.
Tsoucaris , B. Perly, F. Djedaïni: Carbohydr. Res. 192,. 313 (1989).
80
[23.] R. Breslow, S. D. Dong : Chem. Rev. 98, 1997 (1998).

Chapitre 1
3.2.3 Brevet FR0201241
81
Utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamine A ou de ses esters, en
association avec une β-cyclodextrine diméthylée
J-C. Archambault, F. Djedaïni-Pilard, F. Ouvrard-Baraton, S. Weisse

1H19103 Cas 82 FR0
FG/187
BREVET D'INVENTION
__________________
Utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamine A ou de ses esters, en
association avec une β-cyclodextrine diméthylée.
Inventeurs :
Déposants : LVMH RECHERCHE
__________________
COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE
Jean-Christophe ARCHAMBAULT
Florence DJEDAINI-PILARD
Françoise OUVRARD-BARATON
Sandrine WEISSE
__________________
La présente invention concerne l'utilisation dans le domaine de la cosmétique
et de la dermatologie d'associations de β-cyclodextrines partiellement méthylées et
de vitamine A ou d'esters de vitamine A.
82

Depuis de nombreuses années, la vitamine A et ses esters, notamment
l’acétate et le palmitate, sont très largement utilisés en cosmétique et en
dermatologie pour améliorer l’état général de la peau. Les actions de la vitamine A
sont bien connues dans ces domaines d’application. Elle régule notamment le
métabolisme cellulaire de la peau et, de ce fait, préserve ou restaure un bon état
physiologique cutané. La vitamine A permet ainsi d’améliorer le tonus, la fermeté et
l’élasticité de la peau qui tendent à diminuer avec l’âge ou par des effets de stress.
En particulier, la vitamine A ou ses esters sont couramment utilisés pour retarder
l’apparition des rides ou pour en atténuer leur profondeur. La vitamine A est
également utilisée avantageusement pour le soin des peaux dites grasses. En
dermatologie, la vitamine A agit efficacement pour favoriser la cicatrisation de la
peau, ainsi que dans le traitement des peaux à tendance acnéique.
Cependant l’utilisation de tels composés est limitée en pratique par des
problèmes de stabilité, de solubilité en milieu aqueux mais aussi de pénétration dans
la peau. En effet, l’utilisation de la vitamine A ou de ses esters n’a d’intérêt en
cosmétique et en dermatologie que si ces actifs sont biodisponibles au niveau du
derme et/ou de l’épiderme.
Les problèmes techniques rencontrés pour réaliser leur solubilisation, leur
stabilisation et leur pénétration dans la peau ont donc fait l’objet de nombreux
développements. Des méthodes ont été décrites pour solubiliser en milieux aqueux
et stabiliser la vitamine A ou ses esters. Mais les résultats obtenus ne sont pas
satisfaisants en terme de pénétration dans les couches plus profondes de l’épiderme
réduisant d’autant la biodisponibilité des actifs incorporés dans les compositions
cosmétiques et dermatologiques antérieures.
Les cyclodextrines α, β et γ, ci-après désignées par α-CD, β-CD et γ-CD,
sont décrites depuis longtemps en tant que vecteur d’actifs de toutes sortes,
capables de piéger certaines petites molécules de nature hydrophobe. En particulier,
les cyclodextrines sont décrites pour capter et protéger les vitamines lipophiles, les
arômes.
Il est connu de l’art antérieur, dans le document WO 9421225, des
compositions cosmétiques utilisant comme agent de pénétration une ß-cyclodextrine
afin de former des complexes d’inclusion d’esters de vitamine A, en particulier de
palmitate.
83
Cependant, l’utilisation de laβ-cyclodextrine pour réaliser cette inclusion
présente un inconvénient majeur. En effet, il s’avère que la vitamine A incluse dans
la β-cyclodextrine n’est pas protégée et se dégrade même plus rapidement que la
vitamine A non incluse. Ce phénomène a été prouvé par Karl-Heinz Frömming et al.
(Acta Pharm. Technol. (1988) 34 (3) 152-155) au moyen de différentes techniques :

spectrophotométrie UV, spectroscopie RMN, etc… Ainsi l’utilisation de la β-
cyclodextrine ne semble pas pouvoir résoudre tous les problèmes techniques
évoqués ci-dessus pour une utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamine
A ou de ses esters.
Pour améliorer la stabilité de la vitamine A ou de ses esters, il a été
proposé d’utiliser la γ-cyclodextrine comme molécule hôte (US 5985296). Toutefois le
complexe d’inclusion de la vitamine A dans la γ-cyclodextrine présente une solubilité
en milieu aqueux très médiocre, ce qui en limite sérieusement son intérêt pour une
application cosmétique ou dermatologique.
Il est également connu du document EP 0649653 A1 l’utilisation de β-CD
partiellement méthylées comme promoteur d’absorption dans des compositions
pharmaceutiques pour l’administration transcutanée de principes actifs.
Ce document n’incite manifestement pas l’homme du métier à utiliser une
β-cyclodextrine partiellement méthylée comme vecteur de pénétration de principes
actifs dans la peau sans passage transcutané, en vue d’applications cosmétiques.
Par ailleurs, la demande de brevet FR 2484252 décrit un procédé de
préparation de solutions aqueuses de composés organiques biologiquement actifs
insolubles ou peu solubles dans l’eau, tels que la vitamine A (ou rétinol) et ses
esters, par inclusion dans des β-cyclodextrines partiellement méthylées, en particulier
diméthylées. Il y est précisé que ces solutions aqueuses sont stables. A titre
d’exemple, un procédé est décrit pour inclure l’acétate de vitamine A dans l’heptakis-
(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine. Toutefois le complexe d’inclusion ainsi formé est
ensuite incorporé dans une préparation pharmaceutique administrable par voie orale.
Ce document incite l’homme du métier à administrer les vitamines liposolubles
comme la vitamine A par voie orale sous forme de solutions aqueuses, le détournant
ainsi d’une utilisation topique.
D’autres auteurs ont préparé des complexes d’inclusion de différents
rétinoïdes et de leurs esters dans des cyclodextrines en particulier dans la 2,6-di-O-
méthyl-β-cyclodextrine ou « DM-β-CD », pour réaliser des études de solubilité dans
l’eau et de stabilité (S. Muňoz Botella, et al., Analyst (1996) 121, 1557-1560). Des
complexes d’inclusion avec le rétinol et le rétinyl acétate dans la DM-β-CD ont été
préparés et étudiés. Les observations par la technique de fluorescence ont montré
que ces complexes présentaient une excellente stabilité sur le long terme
84

Enfin, le document US 5484816 décrit la préparation d’une composition
pour le traitement de la peau, dans laquelle la stabilité de la vitamine A est
grandement améliorée. Cet effet positif sur la stabilité est obtenu notamment par
l’inclusion de la vitamine A ou de son ester dans différentes cyclodextrines, modifiées
ou non, en particulier dans une méthyle β-cyclodextrine.
Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert de
manière tout à fait surprenante que l'utilisation de β-cyclodextrines diméthylées et,
en particulier de produits commerciaux tels que les DIMEB ou les RAMEB définis ci-
après, en association avec de la vitamine A ou un de ses esters classiquement utilisés
en cosmétique et en dermatologie, permettait de préparer des compositions
cosmétiques ou dermatologiques dans lesquelles la vitamine A ou son ester se
trouvait sous une forme particulièrement stable et soluble, caractérisées après leur
application par une remarquable rétention de la vitamine A ou de ses esters dans la
peau, tout en évitant leur passage transdermique.
Ainsi donc, la présente invention fournit des compositions cosmétiques ou
dermatologiques à base de vitamine A ou d'un de ses esters cosmétiquement ou
dermatologiquement acceptables qui permettent une excellente rétention de cet actif
dans la peau. La constatation particulièrement surprenante de ce qu'aucun passage
transdermique de vitamine A ou de son ester n'avait lieu présente un avantage
considérable puisqu'il permet de focaliser toute l'activité biologique de la composition
sur la libération de l'agent actif au niveau de la peau qui est la zone visée selon la
présente invention.
Avant d'aborder la description proprement dite détaillée de l'invention, il
semble bon de donner un certain nombre de définitions de termes employés tout au
long de la présente description.
Les cyclodextrines (CD) sont des composés cycliques encore désignés par
cycloamyloses ou cycloglucanes constitués d'un enchaînement de motifs glucose (6
motifs glucose pour l'α-cyclodextrine, 7 pour la β-cyclodextrine et 8 pour la γ-
cyclodextrine).
85
Par "β-cyclodextrine diméthylée", au sens de l'invention, on entend les
dérivés méthylés de la β-cyclodextrine possédant un groupe méthoxy sur, en
moyenne, deux des trois positions 2, 3 et 6 de chacun des 7 motifs glucose.
Statistiquement, les « β-cyclodextrines diméthylées » selon l’invention présentent un
degré de substitution des protons des groupes hydroxy des motifs glucose par des
radicaux méthyle compris entre 10 et 16, et de préférence compris entre 11 et 15.
Dans cette famille de β-cyclodextrines diméthylées, on distinguera en
particulier le dérivé diméthylé dont tous les motifs glucose possèdent un groupe

méthoxy sur chacune des positions 2 et 6, désigné sous le nom d’heptakis-(2,6-di-O-
méthyl)-β-cyclodextrine ou encore DIMEB, qui présente donc un degré de
substitution défini ci-dessus égal à 14, et parmi les produits commerciaux existant
dans la famille des β-cyclodextrines diméthylées, le RAMEB qui est un mélange de
plusieurs β-cyclodextrines dont chaque unité glucose est statistiquement
diméthylée.Le degré de substitution moyen du RAMEB par les radicaux méthyle est
d'environ 12,6, ainsi que cela est notamment indiqué dans le document WO
0145615.
Selon l'une de ses caractéristiques essentielles, la présente invention
concerne l'utilisation d’au moins une β-cyclodextrine diméthylée dans laquelle chaque
molécule de β-cyclodextrine est substituée par 10 à 16 groupements méthyles, en
tant qu’un agent favorisant la pénétration dans l’épiderme et la rétention dans la
peau de la vitamine A ou de ses esters cosmétiquement ou dermatologiquement
acceptables, pour la préparation d’une composition cosmétique ou dermatologique
renfermant de la vitamine A ou au moins un de ses esters cosmétiquement ou
dermatologiquement acceptables.
En effet, la présente invention résulte, comme exposé précédemment du
fait que ses inventeurs ont mis en évidence, notamment comme cela ressort des
exemples qui suivent, que le recours à une β-cyclodextrine diméthylée telle que
définie précédemment permettait d'améliorer grandement l’absorption de la vitamine
A ou de ses esters par la peau tout en évitant un passage transdermique et
d'augmenter ainsi sa biodisponibilité.
Les β-cyclodextrines diméthylées utilisables selon l'invention en
combinaison avec de la vitamine A ou un de ses esters peuvent être toutes les β-
cyclodextrines diméthylées telles que définies ci-dessus.
Toutefois, on recourra de préférence à des β-cyclodextrines présentant un
degré de substitution compris entre 11 et 15, c'est-à-dire à des β-cyclodextrines
substituées par 11 à 15 radicaux méthyle.
86
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, on recourra à
l'heptakis-(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine ou DIMEB.

Selon une autre variante avantageuse de l'invention, on utilisera, à titre de
β-cyclodextrines diméthylées, des β-cyclodextrines statistiquement diméthylées sur
chaque glucose, couramment commercialisées sous le nom de RAMEBtelles que
définies ci-dessus. L'invention pourra être mise en oeuvre avec de la vitamine A
sous sa forme alcool (rétinol). Toutefois, on choisira de préférence d'utiliser ses
esters. Tous les esters de la vitamine A classiquement utilisés en cosmétique et en
dermatologie pourront être utilisés selon la présente invention. On choisira de
préférence l'acétate, le palmitate ou le propionate de vitamine A.
Comme cela est déjà connu dans la littérature, la vitamine A et ses esters
forment aisément des complexes d'inclusion avec les β-cyclodextrines, en particulier
avec les β-cyclodextrines alkylées telles que la DIMEB et la RAMEB.
Ainsi, pour préparer les complexes d'inclusion pour la mise en œuvre de
l'invention, on peut utiliser l'un des procédés décrits, en particulier celui décrit dans
le document FR 2484252. Selon ce procédé, on dissout d'une façon générale la βcyclodextrine
diméthylée dans de l'eau puis on ajoute à la solution obtenue la
vitamine A ou son ester, soit directement, soit sous forme d'une solution organique
miscible à l'eau, et on évapore ensuite le solvant, de façon à récupérer le complexe
d'inclusion sous forme solide.
Selon une autre variante, on peut également récupérer le complexe
d'inclusion en solution avant toute évaporation, ou bien le complexe d'inclusion sous
forme solide obtenu à l'étape précédente peut être solubilisé à nouveau en milieu
aqueux pour son utilisation ultérieure dans le cadre de la présente invention.
Il est également possible d'utiliser les procédés de préparation décrits par S.
Muňoz Botella, et al. (Analyst (1996) 121, 1557-1560). Par exemple, selon le principe
du premier de ces procédés on introduit dans un ballon rotatif le rétinol dissout dans
l'hexane, puis on évapore de solvant de façon à former une fine pellicule de rétinol
sur les parois du ballon. On introduit alors dans le ballon une solution aqueuse de βcyclodextrine
diméthylée, puis on agite cette solution pendant 24 à 48 heures par
des moyens magnétiques.
De tels procédés de préparation s'avèrent particulièrement intéressants
puisqu'ils permettent d'obtenir des solutions aqueuses, le cas échéant sous forme de
gels, de la vitamine A et de ses esters.
Selon un aspect de l'invention, les complexes d'inclusion définis ci-dessus
peuvent être utilisés aussi bien sous forme de solutions aqueuses, de gels aqueux ou
encore sous forme de poudre sèche pour être incorporés dans des compositions
cosmétiques ou dermatologiques.
87
Il est également apparu que la composition cosmétique ou dermatologique
préparée selon l'invention peut être préparée sous différentes formes, en particulier
sous forme de gel aqueux, de lotion, d'émulsion et de poudre. Il s'agira en particulier

de produits cosmétiques de soin ou de maquillage traitant, destinés en particulier à
lutter contre l'apparition des effets du vieillissement actinique ou chronologique, tels
que les rides, la perte de l'élasticité et de la tonicité de la peau, ou encore destinés
au soin des peaux grasses. Il s'agira également de préparations dermatologiques,
notamment destinés à favoriser la cicatrisation cutanée ou au traitement des peaux à
tendance acnéique.
Selon une autre de ses caractéristiques essentielles, la présente invention
concerne un procédé de soin cosmétique destiné à améliorer la pénétration dans
l’épiderme et la rétention dans la peau de la vitamine A ou de ses esters
cosmétiquement acceptables, caractérisé en ce qu’il comprend l’application sur la
peau d’une composition cosmétique contenant une association de β-cyclodextrines
diméthylées et de vitamine A ou d’au moins un de ses esters cosmétiquement
acceptables, les composants de ladite association étant tels que définis
précédemment.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation d'un gel aqueux contenant un complexe
d'inclusion du propionate de vitamine A dans la RAMEB (ou diméthyl β-
cyclodextrine commerciale):
désigné par PVA
L'ester de vitamine A utilisé est le propionate de vitamine A, ci-après
A 10 ml d'une solution 50 mM de RAMEB, on ajoute 200 μl d’une solution
acétonique 1M de PVA, pour obtenir une concentration finale 20 mM en PVA.
On laisse sous hotte ventilée et sous agitation pendant 24 heures.
On centrifuge ensuite pendant 6 minutes à 6000 tours/minutes les
solutions obtenues. La solution obtenue après cette opération est limpide, de couleur
jaune pâle et ne contient pas de précipité.
lyophilisée.
La phase aqueuse est filtrée sur Millex-SG 0,22 μm, congelée et
On obtient ainsi une poudre. Celle-ci peut être utilisée sous cette forme
dans la préparation d'une composition cosmétique ou dermatologique, ou bien, selon
les besoins, être facilement remise en solution en milieu aqueux.
88
Le milieu aqueux précité peut être un gel aqueux, comme par exemple un
gel d'hydroxyéthylcellulose (Natrosol ® , Hercules Inc. Etats-Unis) à 1,8% dans l'eau.

Selon le présent exemple, on ajoute à 10 g (75%) de gel aqueux
d'hydroxyéthylcellulose défini ci-dessus, 3,3 g (25%) de solution aqueuse du
complexe d'inclusion préparé ci-dessus sous forme de poudre, soit une quantité de
24 mg de PVA (soit environ 0,72% de PVA final).
Exemple 2 : Pénétration du PVA dans l’épiderme
Le but de cette étude est de comparer la pénétration et la répartition du
PVA dans de l'épiderme humain frais, selon qu'il se présente sous forme d'un
complexe d'inclusion avec une diméthyl β-cyclodextrine ou avec une γ-cyclodextrine,
ainsi qu'incorposé dans un gel en l'absence de toute cyclodextrine.
1. Préparation des gels
On prépare les gels suivants.
a) Gel de base
Ce gel est constitué d'hydroxyéthylcellulose (Natrosol ® , Hercules Inc.
Etats-Unis) à 1,8% en poids dans l'eau..
b) Gel selon l'invention à base de RAMEB et de PVA (gel RAMEB)
Le gel RAMEB est le gel préparé à l'exemple 1 ci-dessus.
c) Gel comparatif à base de PVA et de γ-cyclodextrine (gel gamma)
Le gel gamma est constitué à partir de 10 g (75 %) de gel base auxquels on
ajoute 3 ml (25 %) d’une suspension aqueuse à 32 mg/ml de complexe d’inclusion γ-
CD/PVA préparé suivant le même procédé que celui exposé à l'exemple 1 ci-dessus
soit 24 mg de PVA théorique (soit environ 0,72 % de PVA final).
d) Gel témoin
Le gel témoin est constitué de 25 g de gel base (75 %) auxquels on
ajoute d'abord un mélange de 60 mg de PVA (soit environ 0,72 % de PVA final) et de
0,83 g de Tween 60 (polyéthylène (20) sorbitan monostéarate : Uniqema) (soit
2,5 % de Tween 60 final) et ensuite 7,5 g d’eau.
L’étude de pénétration dans l'épiderme s’effectue à l’aide de cellules de
Frantz modifiées d’une surface de 2 cm 2 et d’un volume de 4,2 ml. Le liquide
récepteur est constitué de tampon phosphate du commerce (Sigma) (10 nM, NaCl
120 mM, KCI 2,7 mM, pH 7,4), d’azoture de sodium 0,1 % du commerce (Sigma)
d’éthanol à 20 % et de solubilisant LRI (polyoxyéthylène polyoxypropylène butyl
éther, huile de ricin hydrogénée polyéthylénée, eau purifiée : Wackherr colorants) à
4 %.
Au cours d’une même expérience, les 3 gels (RAMEB, gamma et témoin)
sont appliqués respectivement sur 5 fragments de peau (cellules de Frantz modifiée)
de façon occlusive.
89

Après 24 heures de contact, l’excédent de gel à la surface cutanée est lavé
à l’aide de coton-tiges. Les coton-tiges ainsi que la partie supérieure de la cellule
sont immergés dans 10 ml d’isopropanol et soumis aux ultrasons pendant 15 min
puis agités durant 2 heures. Les solutions sont diluées au 1/10 et filtrées sur 0,2 μm
avant dosage. Le stratum corneum est recueilli par 7 strippings (D’Squam, Eviderm
corporation, Dallas) successifs (pression 300 g.cm -2 , durée 12 s). Le PVA est extrait
par solubilisation dans 2 ml de méthanol pendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heures
et enfin filtration sur filtre de 0,2μm avant dosage. Le PVA est extrait de l’épiderme
par solubilisation de ce dernier dans 1 ml de méthanol pendant 1 nuit à 4°C puis
agitation 2 heures et enfin filtration 0,2 μm avant dosage. Les dosages du PVA sont
effectués par HPLC. Les chromatogrammes sont réalisés sur un chromatographe
BECKMAN système Gold avec une colonne Lichrosher 125-4 RP18 (5μM) de chez
MERCK. On utilise un détecteur à barrettes d’iode BECKMAN. La phase mobile utilisée
est acétonitrile/eau 90/10 avec un débit de 1ml.min -1 .
Les résultats de dosage en PVA dans les différents compartiments de la
peau, obtenus avec les trois gels décrits dans l’exemple 3, sont regroupés sur la
figure 3.
On constate que le pourcentage de PVA ayant pénétré la peau est
beaucoup plus élevé pour le gel de RAMEB/PVA et, ce, quelque soit le compartiment
considéré. Le gel obtenu à partir du complexe γ-CD/PVA est moins efficace que le gel
témoin. Pour le gel de RAMEB/PVA, on constate également que le pourcentage de
PVA dans l’épiderme est du même ordre de grandeur que celui dans le stratum
corneum, ce qui traduit une grande efficacité en terme de pénétration. Par contre,
pour les deux autres gels le pourcentage de PVA dans l’épiderme est beaucoup plus
faible.
Exemple 3 : Influence du témoin
Une étude, identique à celle décrite dans l’exemple 5, est effectuée avec
le gel RAMEB/PVA, tel que décrit dans l’exemple 4, et le PVA seul en milieu huileux.
Le milieu huileux est une huile de carnation (Witco-Rewo) contenant 0,75 % de PVA.
Les résultats de dosage en PVA dans les différents compartiments de la peau
montrent que l’on dose dix fois plus de PVA dans le liquide récepteur lorsque celui-ci
est sous forme de complexe d’inclusion RAMEB/PVA. On peut donc en conclure que
le gel de RAMEB/PVA permet une excellente pénétration du PVA dans l’épiderme
comparativement au PVA seul, quelque soit la formulation de ce dernier.
90
Exemple 4 : Pénétration du PVA dans la peau humaine : passage transdermique

Cette étude, réalisée sur peau humaine fraîche, est destinée à comparer la
pénétration et la répartition du PVA au travers du revêtement cutané humain
(stratum corneum, épiderme et derme) et en fonction du gel.
dans l’exemple 4.
Les gels utilisés sont le gel témoin et le gel de RAMEB/PVA tels décrits
L’étude s’effectue à l’aide de cellules de Frantz modifiées d’une surface de
2 cm 2 et d’un volume de 4,2 ml.
Le liquide récepteur est constitué de tampon phosphate 10mM, NaCl 120
mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4 (Sigma), d’azoture de sodium 0,1 % (Sigma), d’éthanol à
20 % et de LRI (polyoxyéthylène polyoxypropylène butyl éther, huile de ricin
hydrogénée polyéthylénée, eau purifiée : Wackherr colorants) à 4%.
Au cours d’une même expérience, les 2 gels sont appliqués
respectivement sur 8 fragments de peau (cellules de Frantz modifiée) de façon
occlusive.
Après 24 heures de contact, l’excédent de gel à la surface cutanée est lavé
à l’aide de coton-tiges.
Les coton-tiges ainsi que la partie supérieure de la cellule sont immergés
dans 10 ml d’isopropanol et soumis aux ultrasons pendant 15 minutes puis agités
durant 2 heures.
dosage.
Les solutions sont diluées au 1/10 et filtrées sur filtre de 0,2 μm avant
Le stratum corneum est recueilli par 7 strippings successifs (pression
300 g.cm -2 , durée 12 s). Le PVA est extrait par solubilisation dans 2 ml de méthanol
pendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heures et enfin filtration sur filtre de 0,2 μm
avant dosage.
l’aide d’un scalpel.
Une fois le stratum corneum retiré, on sépare l’épiderme du derme à
Le PVA est extrait de l’épiderme par solubilisation de ce dernier dans 1 ml
de méthanol pendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heures et enfin filtration sur filtre
de 0,2 μm avant dosage.
Les dosages du PVA sont effectués par HPLC. Les chromatogrammes sont
réalisés sur un chromatographe BECKMAN système Gold avec une colonne Lichrosher
125-4 RP18 (5 μM) de chez Merck. On utilise un détecteur à barrettes d’iode
BECKMAN. La phase mobile utilisée est acétonitrile/eau 90/10 avec un débit de
1ml.min -1 .
91

Les dosages en PVA dans les différents compartiments de la peau ont été
effectués. Aucune trace de PVA n’a été détectée dans le liquide récepteur
contrairement aux résultats obtenus dans l’exemple 5.
On peut donc conclure que la présence du derme inhibe le passage du
PVA dans le liquide récepteur.
Le gel RAMEB/PVA ne favorise pas le passage transdermique du PVA.
REVENDICATIONS
1. Utilisation de dérivés méthylés de la β-cyclodextrine dits β-
cyclodextrines diméthylées, possédant un groupe méthoxy sur, en moyenne, deux
des trois positions 2, 3 et 6 de chacun des 7 motifs glucose et présentant
statistiquement un degré de substitution des protons des groupes hydroxy des motifs
glucose par des radicaux méthyle compris entre 10 et 16, et de préférence compris
entre 11 et 15, en tant qu’agent favorisant la pénétration et la rétention de la
vitamine A ou de ses esters cosmétiquement ou dermatologiquement acceptables
dans la peau.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites β-
cyclodextrines diméthylées sont essentiellement constituées d’heptakis-(2,6-di-O-
méthyl)-β-cyclodextrine, encore connue sous le nom de DIMEB.
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites β-
cyclodextrines diméthylées comprennent essentiellement des β-cyclodextrines
statistiquement diméthylées sur chaque motif glucose, communément dénommées
RAMEB, ayant un degré de substitution de l’ordre de 12,6.
4. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que
la vitamine A ou au moins l'un de ses esters et la β-cyclodextrine diméthylée sont
introduits dans la composition cosmétique ou dermatologique sous la forme de
complexes d’inclusion de ladite vitamine A ou de son ester avec lesdites β-
cyclodextrines diméthylées, telles que décrites dans l'une des revendications 1 à 3.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que
la composition contient à titre d’agent actif de la vitamine A et/ou au moins un ester
de vitamine A, ledit agent actif étant au moins partiellement inclus dans une β-
cyclodextrine diméthylée telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3.
6. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que
la composition est sous la forme d’un gel, d’une lotion, d’une émulsion ou d’une
poudre.
92

7. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que
la composition est une composition cosmétique contenant de … à … % en poids de
vitamine A ou d’ester de vitamine A par rapport au poids total de ladite composition.
8. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que
la composition est une composition dermatologique contenant de … à … UI de
vitamine A pour 100 g de ladite composition.
9. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que
ledit ester de vitamine A est choisi dans le groupe constitué de l’acétate, du
propionate et du palmitate de vitamine A.
10. Composition cosmétique ou dermatologique destinée à une application
topique sur la peau, caractérisée en ce qu’elle est sous la forme d’un gel, d’une
lotion, d’une émulsion ou d’une poudre et en ce qu’elle contient à titre d’agent actif
une association de β-cyclodextrines diméthylées et de vitamine A ou d’au moins un
de ses esters cosmétiquement ou dermatologiquement acceptables, les composants
de ladite association étant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 4.
11. Procédé de soin cosmétique, notamment destiné à réguler le
métabolisme cellulaire de la peau et/ou à préserver ou restaurer un bon état
physiologique cutané et/ou à améliorer le tonus, la fermeté et l’élasticité de la peau
et/ou à retarder l’apparition des rides ou en atténuer la profondeur et/ou à réaliser le
soin des peaux grasses, , caractérisé en ce qu’il comprend l’application sur la peau
d’une composition cosmétique contenant une association de β-cyclodextrines
diméthylées et de vitamine A ou d’au moins un de ses esters cosmétiquement
acceptables, les composants de ladite association étant tels que définis dans l’une
des revendications 1 à 4.
93
Utilisation d’une association de vitamine A ou d’au moins un de ses esters
dermatologiquement acceptables et d’une β-cyclodextrine diméthylée, les
composants de ladite association étant tels que définis dans l’une des revendications
1 à 4, pour la fabrication d’une composition dermatologique à activité cicatrisante ou
pour le traitement des peaux à tendance acnéique.

Chapitre 1
3.2.4 Article n° 2
94
New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusion complex
S. Weisse, B. Perly, J-P. Dalbiez, F. Ouvrard-Baraton
J-C. Archambault, P. André, P. Rollin, F. Djedaïni-Pilard .
Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry
Special Issue 11 th International Symposium on Cyclodextrins (sous presse)

Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry
Special issue
New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusion complex
Key Words : Rameb-CD, vitamin A propionate, skin absorption.
Corresponding author :
WEISSE Sandrine
Bat 125 SCM/DRECAM
CEA SACLAY
91191 Gif sur Yvette
France
tel 00 (0)1 69 08 32 70
95
fax 00 (0)1 69 08 98 06
mail : weisse@scm.saclay.cea.fr
New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusion
complex
S. Weisse *1 , B. Perly 1 , J-P. Dalbiez 1 , F. Ouvrard-Baraton 3 ,
J-C. Archambault 3 , P. André 3 , P. Rollin 4 , F. Djedaïni-Pilard 2 .
* corresponding author : weisse @scm.saclay.cea.fr tel 00 33 (0)1 69 08 32 70 fax - 98 06

1 Service de Chimie Moléculaire, Bat 125, CEA Saclay, F-91191
Gif sur Yvette Cedex, France
2 University of Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides,
33 rue S t Leu, F-80039 Amiens, France
3 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et Cosmétiques,
45800 St jean de Braye, France
4 ICOA – University of Orléans, 45065 Orléans, France
ABSTRACT: Rameb (randomized dimethyl β-cyclodextrin ) was mixed up with vitamin A
propionate (PVA) (molar ratio 10/1 in water) and a water soluble complex was formed and
studied by HPLC and NMR (structure, concentration and stability of PVA). Then solution
was used to form an aqueous gel. The skin absorption of PVA through stratum corneum,
epidermis and dermis of human skin (on modified Franz cells) was assayed by HPLC and was
compared to that of a reference gel (or oil) without cyclodextrin. The solution obtained
contain a maximum of 10mg/mL PVA (if saturated with Rameb) and the PVA can remain
stable up to 90 days in solution, and up to 1 year if freeze-dried (storage at 4°C, in the dark).
The results of the different experiences of skin distribution were statistically analyzed and
show that when complexed with Rameb, the amount of PVA that penetrate each skin layers
is significantly higher compared to pure PVA. The results also show that PVA can not pass
through the dermis and reach the circulation.
KEY WORDS: Rameb, cyclodextrin, vitamin A propionate, skin absorption.
INTRODUCTION
Retinol (vitamin A) has important functions related to vision, reproduction, growth and
epithelium proliferation [1] and therefore represents a high interest for pharmaceutical and
cosmetic industries, but it is not water soluble and very unstable in the presence of light and
oxygen, which limit its use.
We propose here to use cyclodextrins and in this case randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)
cyclomaltoheptaose (Rameb) to improve the stability, the aqueous solubility and the dermal
bioavailability of an ester of vitamin A and form an aqueous gel containing vitamin A
propionate (PVA) to be tested on human skin.
EXPERIMENTAL
Materials
96

Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany) and
randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb) from WACKER
(Germany). It is randomized dimethyl-β-cyclodextrin, but for the NMR experiments we used
highly purified homogeneous randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose [2]
in order to visualize precisely the different protons of the CD. All chemicals were purchased
from Fluka and used without further treatments. Deuterated solvents were purchased from
Euriso-Top (Saclay-France).
Preparation of inclusion complexes
The CD/drug mixtures were prepared by mixing accurately weighted quantities in water. The
mixtures were stirred during a few hours then centrifugated for 10 min. at 6000 rpm. The
aqueous solutions were filtered on Millex-SG 0.22 µm then freeze-dried before redissolution
of 10 mg in 0.4 mL D2O for NMR study. The precipitates, if present, were washed many times
by centrifugation with water and ether to eliminate the free species, then dried slowly under a
stream of nitrogen and freeze-dried before redissolution of 10 mg in 0.4 mL d6-dmso.
NMR Studies
1 H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer
using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed
at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to
external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of
the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed
and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar
correlation (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after zero-
filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlation (ROESY experiment), the
phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.
HPLC
97

For the stability study of the Rameb/PVA solution, analytical HPLC was carried out with a
Waters Delta Prep 3000 chromatograph equipped with an LSED detector and a Nova-Pack ®
C18 WATERS column, by elution of methanol (Chromasolv ® filtered on Millicup PTFE
0,5μm ) at 1mL/mn. An UV detector was used (WATERS Lambda Max at 340 nm) in the
case where the interesting peaks were covered by those of the CD with LSED (since CD is not
detectable by UV). For the assays following the skin absorption experiments, we used a
BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM)
column and a Beckman led array detector, mobile phase was acetonitrile/water 90/10 v/v at
1mL/mn -1 .
Mass Spectrometry
The integrity of molecular structure was confirmed by Mass Spectrometry (MS) using
electrospray infusion mode performed in positive mode on a Q-TOF Spectrometer(Micromass
UK).
Preparation of aqueous gels
We prepared an aqueous solution of the complex, with initial concentrations of PVA and
Rameb being respectively 40 mM and 400 mM, then 1.8% w/w Natrosol ®
(hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was added to form the gel. A reference aqueous
gel without CD was prepared with water, Natrosol ® (1.8 % w/w) , PVA and polysorbate 60
(2.5% w/w). The final concentration of PVA and Rameb in both gels was determined
precisely for each experiment (Table I). In one case (S5) we used as reference an oil (carnation
oil, Witco-Rewo) containing 0.75% PVA. In one case (S7) we used all the skin layers
including the dermis, to check if the CD or the PVA can pass in the blood.
%PVA w/w
% Rameb w/w
Rameb/PVA gel
% PVA w/w
% Rameb w/w
reference
S2 S4 S5 S7 S8
0.72 0.76 0.96 0.86 0.45
47.3
0.72
no
aqueous gel
50
0.72
no
aqueous gel
53.3
0.75
no
oil
48
0.81
no
aqueous gel
Table I: composition of the batches for each skin penetration experiment
Skin penetration study
98
25
0.45
30
aqueous gel

This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main barrier
function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny layer
made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller scale, by
the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore we chose to remove the
hypodermis (fat) and dermis because those thick layers would stored the PVA and prevent us
from having detectable amount in the receptor liquid. The purpose of this study must
determine the amount of vitamin A propionate which penetrate into the different layers of the
skin, from our CD made aqueous gel and a reference gel or oil. We used a device containing
15 Franz-type cells (surface 2 cm 2 , receptor liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic
bath. For each experiment a different skin batch was used. The receptor liquid contains
phosphate buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1%
w/w, ethanol (20% v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether,
polyethylated hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each
cell, exactly 1g of gel was deposited (always 8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the
reference) and covered with Parafilm ® . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess
gel on the surface was removed and the skins were treated as follows: the stratum corneum
was collected by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm 2 , time 12 sec.,
D’Squam ® , Eviderm corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL
methanol and after 2 hours stirring, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the
epidermis, the PVA was extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours
stirring, filtered ( 0.22 µm) then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly
by HPLC. The gels were submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL
were sampled and sonicated in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix,
then filtered on 0.22µm filter. A sample of each gel was kept to be assayed in time and
determine long term stability of PVA in the gels. The percentage of initial amount of PVA
that has penetrated is calculated from the concentration found in each layer. The results of the
PVA assays were statistically analyzed using the StatAdvisor Software. This procedure uses a
multifactor analysis of variance. The F-Test in the Anova table allows to identify the
significant factors and for each one, the Multiple Range Test determine which means are
significantly different from which other and which Confidence Interval must be applied to this
conclusion.
RESULTS AND DISCUSSION
99

Determination of the inclusion phenomena by NMR study
The solution obtained after 24h mixing is clear, yellow and no precipitate can be seen. After
centrifugation there is no change. Therefore two assumptions can be proposed : there is no
inclusion complex, or there is a water soluble inclusion complex. The 1 H-NMR study of the
aqueous phase in D2O (after filtration and freeze-drying) shows that vitamin A propionate,
like Rameb is present in the aqueous phase. When comparing this spectrum with that of
Rameb alone, registered in the same conditions, we noticed that the inner protons of the CD
(H3 and H5) experience a chemical shift (0.04 ppm) which is significant of the inclusion
phenomenon [3] (data not shown).
100
The Rameb/PVA complex being water soluble, it is possible to perform a bidimensional
NMR experiment (T-Roesy) to identify the protons of the vitamin A propionate molecule
which are implicated in the inclusion phenomenon i.e those who show cross-peaks with the
inner protons of the CD. Indeed, the cross-peaks indicate a spatial proximity (

Figure I: T-Roesy (spin lock 300ms, attenuation 22dB) of the Rameb/PVA complex in D2O at
500 MHz (20mM)
We also noticed that the 1 H-NMR spectrum of vitamin A propionate in the complex (in D2O)
is different from that of vitamin A propionate alone (in d6-dmso). The different solvents and
the interactions with the CD explain those differences (chemical shift, shape) at some point
but not entirely. First of all, it is necessary to check that vitamin A propionate does not
experience any major chemical modification due to its inclusion in the CD. In order to do so
we performed a HPLC analysis : the chromatogram confirmed the chemical integrity of the
molecule in the complex.
Then, the following assumption can be made: the complexation process follow the equation :
[Rameb] + [PVA] ↔ [C] with binding constant K = [C]/([PVA] [Rameb] n ) -1
where [Rameb] et [PVA] represent the concentrations of the free forms and [C] the
concentration of the complex. In solution there is always a part of free vitamin A propionate,
the amount of which depends on the initial concentrations of [PVA]t and [Rameb]t. And this
free vitamin A propionate is not protected by the cavity of the CD and therefore experiences a
quick degradation process in aqueous solution, which might explain the differences on the 1 H-
NMR spectrum. So it is important to determine the optimized conditions for the preparation
of the complex i.e the [Rameb]t/[PVA]t ratio where the amount of free [PVA] is as small as
possible. As the result, information is provided about batches studied previously and whether
or not they contain a certain amount of free PVA that would be unstable and would explain
the difference between the NMR spectra of free PVA and complexed PVA. Therefore, the
influence of the concentration of Rameb on the final concentration of complex was studied.
Determination of the influence of the concentration of Rameb
When K is known or can be estimated, it is possible, for any mixing with known initial
concentrations, to determine [C], and then the free amount of [PVA] and [Rameb] in solution
by resolving the following:
K = [C]/([PVA] [Rameb] n ) -1 with [PVA] = [PVA]t - [C] and [Rameb] = [Rameb]t - [C]
The solution is written : [C] = (D - (D 2 - 4.K 2 .[PVA]t.[Rameb]t) 0,5 ).2K -1
with D = K.[PVA]t + K.[Rameb]t + 1
Based on previous studies concerning water soluble complexes poorly stable in solution, it is
possible to estimate that: 500

For [Rameb]t = [PVA]t = 20 mM and K = 500, we have in solution 27% free vitamin A
propionate, which then experienced oxidation in the aqueous middle and as a consequence
signs of degradation appear on the 1 H-NMR spectrum. On the other side when [Rameb]t > 10
[PVA]t, only less than 1% free Vitamin A propionate are found, whatever value we use for K.
The complexes which correspond to the following concentrations have been prepared and
studied by HPLC and 1 H-NMR: [PVA]t = 0.02M and [Rameb]t = 0.02M, 0.05M, 0.1M, 0.2M,
0.3M, 0.4M. The results (data not shown) clearly show that for [Rameb]t = [PVA]t = 20mM
the complex is highly degraded whereas it is not for [Rameb]t = 10 [PVA]t : we can conclude
that the whole vitamin A propionate is, at any given time, protected in the inclusion complex.
In those conditions, using a solution saturated with Rameb, the maximal solubility reached for
PVA is 10mg/mL.
Determination of the stoichiometry
The determination of the stoichiometry in the case of a water soluble complex can be done
using the method of Job [6] which is based on the measurement of the chemical shifts of the
protons of the CD and those of the guest molecule for a ratio r = [Rameb]/([Rameb]+[PVA])
going from 0 to 1. In our case, this method cannot be used because it is necessary to maintain
r close to 1 to obtain a stable complex. Hence, two other methods were used : Mass
Spectrometry and the Higuchi and Connors method [7].
Mass Spectrometry was carried out in Electrospray mode (ESI-MS), because it is the most
accurate technique for non covalent associations. This technique detects complexes according
to their molecular weight which allows the stoichiometry to be found simultaneously. The
sample we used for this analysis is the same as the one used for the 1 H-NMR in D20. The 1/1
stoichiomietry of the complex is clearly established by the presence of peaks m/z = 1665 for
[Rameb + PVA + Na] + and m/z = 845 for [Rameb + PVA + 2Na] 2 (data not shown). The
Higuchi and Connors method uses solubility phase diagrams and in this case we can see that
the concentration of solubilized vitamin A propionate grow almost with a linear way (water
soluble complex) with a slope close to 1 (0.98 for the last three points) which indicates a 1/1
stoichiometry. This results are in accordance with those obtained by Mass Spectrometry and
with the geometry of the complex described by the T-Roesy experiment.
We have established in a previous paper [9] that βCD form a 2/1 (βCD/PVA) complex with
PVA.
102

The result obtained for the Rameb/PVA complex can be justified by the larger cavity of the
Rameb, due to its methyl groups on each face, which allow a bigger part of the vitamin A
propionate to be included. Furthermore, it has been showed that in a 2/1 inclusion complex
with βCD, the dimer were most of the time stabilized by hydrogen bonds between the
secondary hydroxyls, which is no longer possible with Rameb.
Stability Study
We have previously demonstrated that the mass action law requires the presence of 10
equivalents of Rameb as initial concentration to obtain a stable complex. Once this is
established, all complexes were prepared according to this law and the influence of the
environment (light, heat, oxygen) was studied on several batches by HPLC and 1 H-NMR.
The results show that in aqueous solution the vitamin A propionate remains stable for 60 days
if protected from light and at 4°C, but only 15 days if kept at 25°C under natural light. We
also studied the complex in its freeze-dried form : the vitamin A propionate can remain stable
6 months even without any protection (kept at 25°C under natural light) and more than a year
when protected from light, at 4°C (Figure II). As post freeze-drying solubilization is very easy,
this results can provide a new way for vitamin A propionate storage. It should be noted that
the vitamin A propionate alone is stable less than 10 days at 25°C under natural light.
The results of PVA assays in the different gels show a loss of 10 to 20% in 2 months and over
80% in six months in the Rameb/PVA gel. The homogeneity of the gel stays unchanged. In
the reference gel, there is a phase separation and complete degradation of the PVA in less than
15 days.
Rameb/pva D2O 298k
To
103
pva
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm
T+7 months
Figure II: 1 H-NMR spectra (500MHz, 298K, D2O) of the Rameb/PVA complex (20mM) in
solution at T0 and after 7 months (freeze-dried form stored at 4°C in the dark).
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm

Skin penetration study
The results of PVA assays for each experiment are presented in Table II .
It must be emphasized here that the different experiments can not be compared directly since
each concerns a different skin batch and the diversity of human skin precludes comparison.
So, the later can only be made within the results of one experiment.
Experiment Stratum Corneum Epidermis Receptor Liquid
S2 Reference mean
0.378 0.139
0
S2 Rameb/PVA
S4 Reference
S4 Rameb/PVA
S5 Reference
S5 Rameb/PVA
S7 Reference
S7 Rameb/PVA
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
0.086
0.612
0.427
0.618
0.41
0.864
0.317
0.034
0.037
0.36
0.224
0.174
0.189
0.221
0.118
0.154
0.516
0.374
0.051
0.025
0.145
0.181
0.113
0.151
0.132
0.235
0.112
0.052
0.062
0.044
0
0.003
0.004
0.017
0.032
0.066
0.08
0.003
0.009
0.019
0.022
0
Table II: Amount of PVA found in the stratum corneum, the epidermis and the receptor phase
(as % of initial amount of PVA and using 8 values for the Rameb/PVA gel and 7 values for
the reference gel for each experiment)
104
Some fairly outstanding observations can be made from those results. A statistical
multifactors analysis of variance was performed on each experiments (all cells) and shows
0
0
0

that in each case, except the S7 experiment, the amount of vitamin A propionate that
penetrates in the skin (all layers considered) is significantly higher when the molecule is
included in the Rameb/PVA complex (Confidence Interval 95%). If the different
compartments are analyzed individually the 95% Confidence Interval cannot always be
maintained and sometimes drops to 86 % (for significant difference between the reference and
the Rameb/PVA gel) as the number of data is smaller and therefore the Confidence Interval is
higher. However, there is no doubt concerning the effects on inclusion in the Rameb : it leads
to higher skin penetration.
In the case of the S7 experiment, no meaningful difference was noticed between the reference
gel and the Rameb/PVA gel in term of quantitative penetration of vitamin A propionate. The
reason is we kept the dermis but could not find a way to extract the PVA from this very thick
layer. Therefore the dermis was not assayed and the only conclusion that can be drawn is that
the PVA do not penetrate farther than dermis, since no PVA was recovered in the receptor
liquid. Most of the PVA is probably stuck in the dermis where, like in epidermis, it is
converted in active retinoids i.e the form that will bind with the cellular receptor [8]. The
important point of this experiment is that PVA cannot reach the circulation after topical
application of the gel.
CONCLUSION
A very stable and soluble complex can be formed between Rameb-CD and the vitamin A
propionate. An aqueous gel based on this solution significantly improves the amount of
vitamin A that penetrates the different layers of human skin and it was proven not to reach the
circulation.
References
105
[1] M. H. Zile and M. E. Cullum: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 172, 139 (1983).
[2] C.M. Spencer, J.F. Stoddart, R. Zarzycki: J Chem. Soc. Perkin Trans II, 1323-1330 (1987).

[3] F. Djedaïni-Pilard and B. Perly: New trends in cyclodextrins and derivatives, Ed. D.
Duchêne, Paris (1991) p.215
[4] Q-X. Guo, T. Ren, Y-P. Fang, Y-C. Liu: J. Incl. Phenom. Mol. Recognit. Chem 22, 251
(1995).
[5] K.A Connors: Chem. Rev. 97, 1325-1357 (1997).
[6] P. Job: Ann. Chim. 9, 113 (1928).
106
[7] T. Higuchi, K.A. Connors: Adv. Anal. Chem. Instr. 4, 117-211 (1965).
[8] G.J. Fisher and J.J. Voorhees: The FASEB J. 10,1004 (1996)
[9] S. Weisse, B.Perly, J-P. Dalbiez, F. Djedaïni-Pilard: J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem.

Chapitre 1
3.2.5 Article n° 3
107
Comparative assay of Rameb-CD and vitamin A propionate in skin layers following
topical application of the Rameb/PVA inclusion complex
S. Weisse, F. Djedaïni-Pilard, F. Ouvrard-Baraton, B. Perly and C. Créminon
STP Pharma (soumis)

Comparative assay of Rameb-CD and vitamin A propionate in skin layers following
topical application of the inclusion complex
S. Weisse 1 , F. Djedaïni-Pilard 2 , F. Ouvrard-Baraton 3 , B. Perly 1 and C. Créminon 4
1 Service de Chimie Moléculaire, DSM/DRECAM, CEA Saclay, F-91191
Gif sur Yvette Cedex, France
2 Université de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides, EA 2082
33 rue S t Leu, F-80039 Amiens, France
3 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et
Cosmétiques, 45800 St Jean de Braye, France
4 Service de Pharmacologie et d’Immunologie, DSV/DRM, CEA Saclay, F-91191
Gif sur Yvette Cedex, France
INTRODUCTION
Retinol or vitamin A is a molecule of vital importance for the human body since it is
required in many physiological functions [1-3]. Vitamin A plays a key role in cellular
differentiation and therefore influences many processes like reproduction (for the growth of
the embryo as well as the development of placenta and sexual cells), immunity (for the
differentiation of white cells) and also epitheliums development. Vitamin A is also required to
form retinal pigments which are essential to night vision. Its role in cellular differentiation
also gives vitamin A a great importance in oncology [4-5] as it has been shown that it can be
used to inhibit carcinogenesis, and in dermatology (against acne, photo-aging, psoriasis,
melanoma…).
108
As such, this molecule represents a high interest for pharmaceutical and cosmetic
industries, but there are drawbacks : it is not water soluble and very unstable in the presence
of light and oxygen, which limit its use. We described in previous papers [6-7] the use of
randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (also named per-(2,6-O-dimethyl)-
β-cyclodextrin or Rameb) to form a water soluble 1/1 complex with vitamin A propionate
(vitamin A alcohol or retinol is to unstable to be used here) and therefore improve the
stability, the aqueous solubility and the dermal bioavailability of this ester of vitamin A.
We report here on further experiments and especially on the Rameb enzyme
immunoassay used to investigate the penetration of this CD in the different layers of the skin
using the same biological samples as for the HPLC assay of the ester of vitamin A. This

comparative assay of both vitamin A and Rameb will hopefully bring new data for a better
understanding the behaviour of this type of complex following cutaneous application.
EXPERIMENTAL
Material
Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany)
and randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb) from WACKER
(Germany). All chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments.
Purification of acetylcholinesterase (AchE), for the enzyme immunoassay, from electric
organs of the electric eel Electrotrophorus electricus, preparation of the G4 form used, and
measurements of its activity were performed as previously described [8-9]. Solid-phase EIA
was performed on 96-well microtiter plates (Immunoplate Maxisorp, Nunc, Denmark) using
automatic Titertek microtitration equipment (washer, dispenser, and reader) from Labsystems
(Les Ulis, France). All reagents used for immunoassays were diluted in the following buffer
(EIA buffer): 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.9% NaCl, 1 mM
EDTA, 0.1% bovine serum albumine (BSA) and 0.01% sodium azide. A 10mM phosphate
buffer containing 0.05% Tween 20 was used for all washing steps.
Fig 1. Vitamin A propionate
109
OCOC 2 H 5

3
O H
7
Fig 2. heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb)
Preparation of inclusion complexes
The CD/drug mixtures were prepared by mixing accurately weighted quantities in
water. As already described [6], the mixtures were stirred during a few hours then
centrifugated for 10 min. at 6000 rpm. The aqueous solutions were filtered on Millex-SG 0.22
µm. The initial ratio of [CD] to [PVA] in the solution (before filtration) is always equal to 10
to ensure good long term stability of the complex,
Preparation of aqueous gels
We prepared an aqueous solution of the complex, with initial concentrations being 40
mM and 400 mM for PVA and Rameb respectively, then 1.8% w/w Natrosol ®
(hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was added to form the gel. A reference aqueous
gel without CD was prepared with water, Natrosol ® (1.8 % w/w) , PVA and polysorbate 60
(2.5% w/w). The final concentration of PVA in both gels was determined precisely for each
experiment (Table I). A total of 6 experiment are presented here under the name S2, S4, S5,
S6, S7 and S8. Rameb was only assayed for 3 experiments (S5, S6, S7) due to time
restriction. In one case (S5) we used an oil as reference (carnation oil, Witco-Rewo)
containing 0.75% PVA. In one case (S8) we used a physical mixture of PVA and Rameb in an
aqueous gel (no complex) as reference.
Gel
Rameb/PVA
6
β - C D
2
( O M e )
7
( O M e )
7
% PVA w/w
% Rameb w/w
S2 S4 S5 S6 S7 S8
0.72 0.76 0.96 0.70 0.86 0.45
47.3
110
50
53.3
45.45
48
25

eference
gel (or oil)
% PVA w/w
% Rameb w/w
form
0.72
no
aqueous
gel
0.72
no
aqueous
gel
0.75
no
oil
0
46.87
aqueous
Table I : composition of the batches for each skin penetration experiment
Skin penetration study
111
gel
0.81
no
aqueous
This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main
barrier function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny
layer made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller
scale, by the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore, as described in
the litterature [10] we chose to remove the hypodermis (fat) and dermis because those thick
layers would stored the PVA and prevent us from having detectable amount in the receptor
liquid. The purpose of this work is to determine the amount of vitamin A propionate and
Rameb which penetrates into the different layers of the skin, from our CD made aqueous gel
and a reference gel or oil. In one case (S7) we used all the skin layers including the dermis, to
check whether the CD or the PVA can pass in the blood. We used a device containing 15
Franz-type cells (surface 2 cm 2 , receptor liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic bath.
For each experiment a different skin batch was used. The receptor liquid contains phosphate
buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1% w/w, ethanol
(20% v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether, polyethylated
hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each cell, exactly 1g
of gel was deposited (always 8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the reference) and
covered with Parafilm ® . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess gel on the
surface was removed and the skins were treated as follows: the stratum corneum was collected
by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm 2 , time 12 sec., D’Squam ® , Eviderm
corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2
hours stirring, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the epidermis, the PVA was
extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours stirring, filtered ( 0.22 µm)
then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly by HPLC. The gels were
submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL were sampled and sonicated
in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix, then filtered on 0.22µm filter.
A sample of each gel was kept to be assayed in time and determine long term stability of PVA
gel
0.45
30
aqueous
gel

in the gels. The percentage of initial amount of PVA that has penetrated is calculated from the
concentration found in each layer. The results of the PVA assays were statistically analyzed
using the StatAdvisor Software. This procedure uses a multifactor analysis of variance. The
F-Test in the Anova table allows to identify the significant factors and for each one, the
Multiple Range Test determine which means are significantly different from which other and
which Confidence Interval must be applied to this conclusion.
HPLC
For the vitamin A propionate assays following the skin absorption experiments, we
used a BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM)
column and a Beckman led array detector, mobile phase was acetonitrile/water 90/10 v/v at
1mL/mn -1 . Detection of PVA at 325 nm, retention time is 9 mn.
Competitive enzyme immunoassays (EIA)
βCD and γCD enzyme immunoassays have been previously described [11-12]. The
protocol for heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Dimeb) is the same. For the
production of antibodies, heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-amino-6-deoxy-
cyclomaltoheptaose (Dimeb mono-amine, see [13]) was covalently linked to bovine serum
albumine (BSA) using a glutaraldehyde as linker, as previously described [11].
For the preparation of the enzymatic tracer, heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-
methyl)6-mono-amino-6-deoxycyclomaltoheptaose was covalently coupled to AchE using the
heterobifunctional reagent N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-
carboxylate (SMCC) as previously described [11]. This method involved the reaction of the
thiol groups previously introduced into heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-
amino-6deoxy cyclomaltoheptaose (by reaction of its primary amino group with N-
succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA) in alkaline medium) with maleimido groups
incorporated into the enzyme.
112
Competitive EIA was performed as described elsewhere for various molecules [14-15].
Microtiter plates were coated with mouse monoclonal anti-rabbit IgG antibodies in order to
ensure separation of bound and free moieties of the enzymatic tracer during the
immunological reaction. Before use, the plates were washed with 0.01 M phosphate buffer
(pH 7.4) containing 0.05% Tween 20. The total volume of immunological reaction was
150µL, each component (enzymatic tracer, diluted rabbit polyclonal antisera and CD
standards) being added in a 50 µL volume diluted in EIA buffer. Dimeb mono-amine-AchE

enzyme conjugates was used at a concentration of 1 Ellman units/mL (for Ellman unit
definition see [12]). The working dilution for the rabbit antiserum was determined by
performing serial dilution experiments. After 18h incubation at 4°C, the plates were washed
and the enzyme activity of the bound immunological complex was revealed by addition of
200µL/well of Ellman reagent. After 2h of gentle shaking in the dark at room temperature, the
absorbance at 414 nm in each plate was measured automatically. Results are given in terms of
(B/B0)*100 as a function of the dose (logarithmic scale), B and B0 representing the bound
enzyme activity in the presence or absence of competitor, respectively. A linear log-logit
transformation was used to fit the standard curve [16]. All experiments were done in duplicate
and quadruplicate for B0. The limit of detection for the Rameb was established at 0.1ng/mL.
The EIA was performed on the same biological samples as used for PVA assays so that
comparison of the results would be possible.
RESULTS AND DISCUSSION
As preliminary study, we performed a skin penetration study comparing the
penetration of PVA in different aqueous gels : one containing the Rameb/PVA complex,
another containing the γCD/PVA complex (not soluble in water see [17]) and one with the
PVA alone. The results (Fig. 3) indicate that the concentration of PVA in the skin layers
increases in the order Rameb/PVA >PVA alone > γCD/PVA. It indicates that the inclusion in
the Rameb enhances the penetration of PVA in the skin but that the γCD decrease this
phenomenon. These preliminary results, lead us to focus the skin penetration study on the
Rameb/PVA complex, since the assays on guest and host could be performed by HPLC and
immunoassays respectively.
113
Fig 3 . Amount of PVA found in the stratum corneum, the epidermis and the receptor
liquid (as % of initial amount of PVA and using 5 values for the Rameb/PVA gel, 5 values for
the γCD/PVA gel and 5 values for the reference gel without CD)

% of PVA
1,200%
1,000%
0,800%
0,600%
0,400%
0,200%
0,000%
Before presenting the results, one point must be clarified. Heptakis-(2,6-di-O-methyl)
cyclomaltoheptaose or Dimeb is a very pure compound whereas the randomized form, Rameb,
is a mixture of several compounds exhibiting different degrees of methylation (between 11
and 16) as demonstrated by Mass spectrometry studies [18, 19]. (Fig 4)
Electrospray ionisation of RAMEB (infusion at 5 μl.min -1 of a 0.01 mg.ml -1 solution in
water/acetonitrile 50:50 containing 0.1 % trifluoroacetic acid) with positive ion detection
leads to a series of protonated molecules, [M+H] + , at m/z values depending on the number of
methyl groups in each of the individual sugar unit of the β-cyclodextrin. The mass spectra
reflect the average distribution of the methyl groups in all of the individual sugar unit of the
RAMEB molecule and consequently if the components having 9 (m/z 1261) to 14 (m/z 1331)
methoxy groups (0-Me) are included in the calculation (the relative intensities of components
outside this group are too low to be reliable) the degree of substitution per sugar unit (DS) can
be calculated [18, 19].
114
DISTRIBUTION OF PVA AFTER 24H CONTACT
reference Rameb Gamma
strat.corneum
epidermis
receptor liquid
total skin

100 %
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1247
11 O-Me
1261
1276
1283
1289
1297
115
1220 1240 1260 1280 1300 1320 1340 1360 m/z
1303
12 0-Me
1311
1317
13 0-Me
Fig 4 . Electrospray (ESI) ionisation mass spectra of RAMEB
1331
1345
([M+H] + ions region)
It has already been proven during the settings of the first CD immunoassays that no
cross reaction occured between the different CD [11]. The specific immunoassay we used
here was developed for Dimeb, using heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-
amino-6deoxy cyclomaltoheptaose to create the hapten. Therefore, we had to check the
hability of the antiDimeb-antibodies to recognize Rameb as well. We used series of known
concentrations of Rameb and Dimeb and compared the results and sensibility of the assay. Fig
5 shows the calibration curves obtained for Rameb and Dimeb It appeared the antiDimeb-
antibodies also recognized Rameb. However, the 100*B/B0= f(C) curve indicated that the
assay is 10 times less sensitive with Rameb than with Dimeb (B/B0 50%, which represents the
zone where the assay gives maximum precision is 1.5ng/mL for Rameb and 0.15ng/mL for

Dimeb). The limit of detection was established at 0.1ng/mL for Rameb. The cause of this loss
of sensibility is the heterogeneous composition of Rameb, which only contains a small
amount of pure Dimeb, mixed up with many other under or over methylated species. Those
methylated species are not recognized by the antiDimeb-antibodies with the same sensibility
as Dimeb and therefore, the sensibility towards Rameb is the mean of all the sensibility
towards those different methylated species.
B/B0 (%)
80
60
40
20
0
0.01 0.1 1 10 100
Fig 5 . Calibration curve for Rameb and Dimeb (2-Me-β-CD) – B/B0 = 50% indicates
Skin penetration study
the zone of maximum precision
The results of PVA assays performed by HPLC for each experiment are presented in
Table II. They are expressed as percentage recovered from the initial amount of PVA
deposited on the cell (since we know the exact amount of PVA in each gel).
It must be emphasized here that the different experiments can not be compared directly
since each concerns a different skin batch and the diversity of human skin precludes
comparison. So, the later can only be made within the results of one experiment. We will first
discuss the results of the PVA assays.
116
100 RAM EB
Competitor (ng/ml)
2-M e -β -CD
Some fairly outstanding observations can be made from those results. A statistical
multifactors analysis of variance was performed on each experiments (all cells) and shows

that in each case, except the S7 experiment, the amount of vitamin A propionate that
penetrates in the skin (all layers considered) is significantly higher when the molecule is
included in the Rameb/PVA complex (Confidence Interval 95%). If the different
compartments are analyzed individually the 95% Confidence Interval cannot always be
maintained and sometimes drops to 86 % (for significant difference between the reference and
the Rameb/PVA gel) as the number of data is smaller and therefore the Confidence Interval is
higher. However, there is no doubt concerning the effects on inclusion in the Rameb : it leads
to higher skin penetration.
Experiment Stratum Corneum Epidermis Receptor Liquid
S2 Reference mean
0.378 0.139
0
S2 Rameb/PVA
S4 Reference
S4 Rameb/PVA
S5 Reference
S5 Rameb/PVA
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
117
0.086
0.612
0.427
0.618
0.41
0.864
0.317
0.034
0.037
0.36
0.224
0.154
0.516
0.374
0.051
0.025
0.145
0.181
0.113
0.151
0.132
0.235
0
0.003
0.004
0.017
0.032
0.066
0.08
0.003
0.009
0.019
0.022

S7 Reference
S7 Rameb/PVA
S8 Rameb +PVA
S8 Rameb/PVA
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
0.174
0.189
0.221
0.118
0.34
0.28
1.01
0.95
0.112
0.052
0.062
0.044
0.134
0.11
0.36
0.46
0
0
0
0
0.006
0.01
0.034
0.051
Table II . percentage of initial amount of PVA recovered in each skin layer for
experiments S2, S4, S5, S7, S8.
118
In the case of the S7 experiment - PVA alone versus Rameb/PVA on epidermis and
dermis - no meaningful difference was noticed between the reference PVA gel and the
Rameb/PVA gel in term of quantitative penetration of vitamin A propionate. The reason is
that we kept the dermis but could not find a way to extract efficiently the PVA from this very
thick layer. Therefore the dermis was not assayed and the only conclusion that can be drawn is
that the PVA do not penetrate farther than dermis, since no PVA was recovered in the receptor
liquid. Most of the PVA is probably stored in the dermis where, like in epidermis, it is
converted in active retinoids i.e the form that will bind with the cellular receptor [20]. The
important point of this experiment is that PVA doesn’t reach the circulation after topical
application of the gel, at least after 24h. This doesn’t mean that PVA can not pass in the
circulation since some small blood vessels are present in the dermis. But the dermis acts as a
reservoir by keeping the PVA and it is very likely that the majority of the drug will be
metabolized before reaching the small vessels. Furthermore, we have no indication concerning
the ability of PVA to pass through the vessels membranes.
In experiment S8 we compared the results of the Rameb/PVA complex with those of a
physical mixture containing the same amount of Rameb and PVA, but both in the free forms.
These results suggest that the total amount of PVA recovered in the stratum corneum,
epidermis and receptor liquid is greater when the 2 compounds are in the form of inclusion
complex. This result is important because it gives us some clue about the role of the
cyclodextrin. As seen in the literature, the CD are often use, in topical application, as a
penetration enhancer [21-24]. First, it was believed that this property was due to their ability
to complex cholesterol and lipids and therefore disorganize biological membranes. But since a

few years, researchers have established, using pretreatment of skin with CD, that in order to
have an increasing effect on the amount of drug penetrating the skin, the CD must be used as
an inclusion complex with the drug. The results of experiment S8 corroborate this
conclusion : the physical mixture of CD and PVA gives statistically significantly lower
penetration in the skin, in comparison with the CD/PVA complex. The mechanism of
penetration enhancing of the CD as been studied by Loftsson et al. [22] : the CD act as true
carriers by keeping lipophilic drugs, such as PVA, in aqueous solution and then deliver them
to the skin surface where they partition from the CD cavity into the skin. This can be
explained by the classical model of double diffusion membrane i.e aqueous then lipophilic.
So, the penetration enhancer effect of the CD comes from its ability to solubilise the drug and
make it available at the surface of the skin. This explains why we did not observed such an
effect in the preliminary study, with the γ-CD/PVA complex which is absolutely not soluble in
water. It also would means that the penetration of the PVA probably occurs after its release
from the cyclodextrin.
But we can now wonder what happens to the CD?
The main results of the Rameb immunoassays are presented in Table III and Fig 6.
S5 Rameb/PVA mean
S6 Reference
S6 Rameb/PVA
standard deviation
mean
standard deviation
mean
standard deviation
S7 Rameb/PVA mean
standard deviation
119
Stratum Corneum Epidermis Receptor Liquid
0.262 0.349 0.053
0.186
0.302
0.08
0.236
0.132
0.096
0.068
0.758
0.1
0.055
0.035
0.02
0.02
0.014
0.037
0.061
0.116
0.033
0.071
0.001
0.001
Table III : Amount of Rameb found in the stratum corneum, the epidermis and the
receptor liquid (as % of initial amount of PVA and using 8 values for the Rameb/PVA gel and
7 values for the reference gel for each experiment). In the S6 experiment, Rameb is present
both in the reference gel and the Rameb/PVA gel.

0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Fig 6 . Graphical representation of the amount of Rameb found in the stratum
corneum, the epidermis and the receptor liquid (as % of initial amount of PVA and using 8
values for the Rameb/PVA gel and 7 values for the reference gel for each experiment). In the
S6 experiment, Rameb is present both in the reference gel and the Rameb/PVA gel.
These results shows us that, like vitamin A propionate, a significant amount of Rameb
penetrates in every skin layers and reach the receptor liquid (S5, S6, S7). However, in the S7
experiment, the amount of Rameb recovered is obviously much lower than in the two other
experiments and even though a real comparison cannot be made between the batches because
of human variability, it is clear that the presence of the dermis (S7) induced a loss in all
compartments. Since it was not possible to extract correctly the CD from the dermis, this layer
was not assayed but from the results of the other compartments, we can suppose that the
majority of the CD is stored in the dermis. This experiment also teaches us that a very small
amount of Rameb can diffuse in the dermis and reach the blood within 24h, as shown by the
presence of Rameb in the receptor liquid. This is in accordance with previous published
results [25] indicating that Dimeb is capable of transdermal absorption in small quantities, and
rapidly excreted by urine.
120
Distribution of RAMEB in skin layers
Percentages recovered (%)
Receptor Liquid
um
Epidermis
Total skin
S6 RAMEB S6 RAMEB/PVA S5 S7

121
With the S6 experiment, using a gel containing Rameb only as reference, we have the
opportunity to compare the influence of the complexation with PVA on the penetration of the
Rameb: a statistical multifactors analysis of variance was performed and demonstrated that
there is no significant difference between the results of the Rameb gel and the results of the
Rameb/PVA gel (Confidence interval 91%), when regarding all skin layers together. This
result supports the theory that the CD is a vehicule used to take the drug from the aqueous
phase to the lipophilic barrier where it should release it. However, it should be reminded that
the ratio Rameb/PVA in the complx is 10 and a large majority of CD is under free state.
Hence, this study indicates that both PVA and Dimeb can penetrate in the skin. The
amount is significant but only represents a small part of the amount applied. The important
point is that in this case, Rameb acts as a penetration enhancer by significantly increasing the
amount of PVA penetrating the different layers of skin. The question that arises is whether or
not the PVA and Dimeb penetrate as a inclusion complex and if not, when does the separation
happens. To try to answer this question we calculated the ratio [Rameb]/[PVA] for each layers
(after 24h contact) and for the three experiments where Rameb was assayed. Since this ratio is
initially equal to 10 in the solution and in the gel, any significant variation of the ratio in the
skin layers would indicate that one species penetrates more rapidly and that the complex is
therefore separated. Of course, since the Rameb is present in the gel in the free form for 9/10
and in the complexed form for 1/10, this assumption can only be made if the behaviour of
Rameb in the skin is the same whether its free or complexed. This was proven with the results
of the S6 experiment. The values we obtained for the [CD]/[PVA] ratio in the different
experiment shows very important variations (data not shown), ranging from 5 to 50.
Unfortunately, no major tendency can be obtained from those data that would indicate where
the separation happens and which species permeates more quickly. We can only conclude that
the complex is broken in the skin, probably in the stratum corneum since this is the layer
where the ratio is closer to 10. This supports the previous hypothesis about the role of the
cyclodextrin : it acts as a carrier to facilitate the permeation from the aqueous media on the
skin to the stratum corneum, which is responsible for the barrier function of the skin. Once in
the epidermis, the complex is in a medium containing alternate lipophilic and hydrophilic
layers, and it is very likely that the complex is broken and the PVA diffuses according to its
partition coefficient. The dermis which contains cells, fibers and nerves in an aqueous
mucopolysaccharidic medium, is an ideal environment for the diffusion of the very
hydrophilic Rameb, but not for the highly lipophilic PVA which might explain why no traces

of PVA were found beyond the dermis whereas a small amount of Rameb can pass in the
blood.
CONCLUSION
This work demonstrated that complexation of vitamin A propionate with Dimeb
enhances its penetration through the different compartments of skin and should allow to
decrease the quantity of PVA in the final formulation. The other advantage of this form is that
the complex is stable in aqueous media. It shows also that the Rameb, which act as a
penetration enhancer, penetrate in the skin as well and, for a very small amount, reach the
blood vessels. It appeared from those results that PVA and CD are separated at some level in
the skin, however no conclusion could be made regarding the location of the dissociation.
Acknowledgments
The expert technical assistance of M.-C. Nevers on immunoassays trough out this
work was essential and particularly appreciated.
References
1- Blomhoff, R. (1994). Vitamin A in health and disease, Marcel Dekker, Inc., New York.
2- Lehninger, A. L., Nelson, D. C. & Cox, M. M. (1994). Principles of biochemistry,
Flammarion Médecine Science, Paris.
3- Sporn, M. B., Roberts, A. B. & Roche, N. (1986). Mechanism of action of retinoids. J. Am.
Acad. Dermatol. 15, 756-63.
4- Niles, R. M. (2000). Recent advances in the use of vitamin A (retinoids) in the prevention
of cancer. Nutrition 16(11), 1100.
122

5- Dabal, R., Boyer, C. M. & al., A. B. e. (1995). Annual Meeting of American Association
for Cancer Research.
6- Weisse, S., Perly, B., Dalbiez, J.-P., Baraton-Ouvrard, F., Archambault, J.-C., André, P.,
Rollin, P. & Djedaïni-Pilard, F. (2002a). New aqueous gel based on soluble
cyclodextrin/vitamin A inclusion complex. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic
Chemistry(special issue Int. Symp. Cyclodextrins. 2002).
7- Weisse, S., Archambault, J.-C., Ouvrard-Baraton, F. & Djedaïni-Pilard, F. (2002b).
Utilisation cosmétique de la vitamine A ou de ses esters, en association avec une b-
cyclodextrine diméthylée. FR 02.01241.
8- Massoulié, J. & Bon, S. (1976). Affinity chromatography of acethylcholinesterase : the
importance of hydrophobic interactions. Eur. J. Biochem 68, 531-539.
9- Ellman, G., Courtney, K., Andres, V. & Featherstone, R. (1961). A new and rapid
colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95.
10- Schaefer, H., Zesch, A. & Stüttgen, G. (1982). Skin permeability.
11-Créminon, C., Pilard, F., Grassi, J., Perly, B. & Pradelles, P. (1994). A sensitive and
specific enzyme immunoassay for cyclomaltoheptaose and some derivatives. Carbohydr. Res.
258, 179-186.
12- Créminon, C., Djédaïni-Pilard, F., Vienet, R., Péan, C., Grognet, J. M., Grassi, J., Perly,
B. & Pradelles, P. (1999). A new and specific enzyme immunoassay allowing an efficient
pharmacokinetic evaluation of g-cyclodextrin after intraveinous administration to rats.
Pharmaceutical research 16(9), 1407-1411.
13- Auzely-Velty, R., Djedaini-Pilard, F., Désert, S., Perly, B. & Zemb, T. (2000).
Micellization of hydrophobically modified cyclodextrins. 1.Micellar structure. Langmuir 45.
14- McLaughlin, L. L., Wei, Y., Stockman, P. T., Leahy, K. M., Needleman, P., Grassi, J. &
Pradelles, P. (1987). Development, validation and application of an enzyme immunoassay
(EIA) of atriopeptin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 144, 469-476.
15- Grassi, J., Robert, Y., Pradelles, P., Chercuitte, D., Gruaz, D., Dayer, J. M. & Poubelle, P.
(1989). Production of monoclonal antibodies against interleukin-1a and-1b; Development of
two enzyme immunoassays of atriopeptin. J. Immunol. Methods 123, 193-210.
16- Rodnard, D. & Lewald, J. (1970). Computer analysis of radioligand assay and
radioimmunoassay data. Acta Endocrinol. 64, 79-103.
17- Weisse, S., Perly, B., Dalbiez, J.-P. & Djedaïni-Pilard, F. (submitted). Complexation of
vitamin A propionate by natural cyclodextrins. Journal of Inclusion Phenomena and
Macrocyclic Chemistry.
123

18- Pilard, S., Meudal, S., Poisson, X., Petit, A., Pluvy, F., Besnard, N. & Luijten, W. (1999).
16e Journées Françaises de Spectrométrie de Masse, Nancy.
19- Mercier, J. P., Debrun, J. L., Dreux, M., Elfakir, C. & Hakim, B. (2000). . In Rapid
Commun. Mass Spectrom., Vol. 14, pp. 68-70.
20- Fisher, G. J. & Voorhees, J. J. (1996). Molecular mechanisms of retinoid actions in skin.
The FASEB journal 10, 1002-1013.
21- Loftsson, T., Masson, M., Sigurdsson, H. H., Magnusson, P. & Goffic, F. L. (1998a).
Cyclodextrins as co-enhancers in dermal and transdermal drug delivery. Pharmazie 53, 137.
22- Màsson, M., Loftsson, T., Màsson, G. & Stefànsson, E. (1999). Cyclodextrins as
permeation enhancer: some theoretical evaluations and in vitro testing. Journal of controlled
release 59, 107-118.
23- Marttin, E., Verhoef, J. C., Romeijn, S. G. & Merkus, F. W. H. M. (1996). Eighth
International Symposium on Cyclodextrins.
24- Vollmer, U., Müller, B. W., Peeters, J., Mesens, J., Wilfert, B. & Peters, T. (1994). A
study of the percutaneous absorption-enhancing effects of cyclodextrin derivatives in rats. J.
Pharm. Pharmacol. 46, 19-22.
124
25- Gerlocsy, A., Antal, S. & Szejtli, J. (1988). Int. Symp. on cyclodextrins, Munich.
3.1.5 DISCUSSION

3.2.6 DISCUSSION
Nous allons reprendre au cours de cette discussion, l’ensemble des informations
recueillies dans les articles de ce premier chapitre.
Commençons tout d’abord par les études de complexation du propionate de vitamine A
par les cyclodextrines. Le but était de trouver un moyen de stabiliser et solubiliser le PVA
dans les formes pharmaceutiques, et à cet égard, seule la Rameb s’est montrée efficace. En
effet, l’αCD ne forme aucun complexe, comme cela a été prouvé par la comparaison des
spectres RMN 1 H dans D2O de l’αCD seule et en présence de PVA. En revanche, βCD et γCD
donnent un complexe insoluble dans l’eau, mis en évidence par l’analyse RMN 1 H dans le d6-
dmso du solide obtenu après centrifugation du mélange aqueux CD/PVA. Ces deux
complexes, bien que d’apparence similaire, sont en fait très différents. L’intégration des
signaux RMN de la CD et du PVA montre que le complexe γCD/PVA est de stoechiométrie
1/1 alors que le complexe βCD /PVA est de stoechiométrie 2/1.
Cette différence de structure a des conséquences sur la stabilité des 2 complexes. En
effet, on observe, par RMN et par HPLC, une dégradation très rapide du PVA dans le
complexe βCD /PVA. Le phénomène est plus rapide que dans le cas du PVA seul et ne touche
pas les mêmes sites de la molécule. A l’opposé, le PVA dans le complexe γCD/PVA reste
stable à très long terme. Ceci s’explique par le fait que la géométrie du complexe 2/1 de
βCD/PVA est très différente de celle du complexe 1/1 de γCD/PVA. Les 2 βCD qui
complexent le PVA sont vraisemblablement situées à chaque extrémités en se faisant face par
le coté des hydroxyles secondaires (car l’inclusion se fait en général par la face secondaire) et
ce grand nombre de fonctions hydroxyle crée une zone de haute réactivité chimique qui
pourrait être responsable d’une dégradation accélérée du PVA. La CD jouerait le rôle d’une
enzyme.
125
Devant l’échec de l’utilisation des 3 CD naturelles pour améliorer la solubilité du PVA,
nous nous sommes tournés vers des CD fonctionnalisées possédant une plus grande solubilité
aqueuse. Notre choix s’est porté sur la per-(2,6-O-dimethyl)-β-cyclodextrin (Dimeb) dont la
solubilité est plus de 25 fois supérieure à celle de la CD parente, soit 400 mM et qui possède
l’avantage d’exister dans le commerce (sous forme d’un mélange contenant de nombreux sous
produits plus ou moins méthylés, la Rameb). De plus, nous possédons une méthode de dosage

sensible de la Dimeb (dosage immunoenzymatique par compétition), ce qui nous permet
d’envisager des dosages après absorption dans les milieux biologiques.
Avec la Dimeb, il se forme un complexe 1/1 parfaitement soluble dans l’eau et stable à
long terme. Ces résultats très positifs nous ont permis de préparer un gel aqueux contenant le
complexe Rameb/PVA et d’étudier la pénétration cutanée des 2 espèces et l’influence de la
complexation (on utilise la Rameb pour ces études car elles demandent une grande quantité de
CD et la Dimeb, composé pur, est très difficile à obtenir). Ceci est possible grâce au « double
outil » de dosage dont nous disposons, HPLC et dosage immunoenzymatique.
Après avoir vérifié la stabilité du PVA après la mise en gel, nous avons mené une série
d’études au cours desquelles le gel est déposé sur des échantillons de peau, disposées sur des
cellules de Franz. Comme cela a été décrit dans la littérature [voir Annexe1 ou Schaefer,
1982] on peut utiliser dans les études in vitro de diffusion à travers la peau, une ou plusieurs
ou l’ensemble des couches cutanées (stratum cornéum ou couche cornée, épiderme, derme).
Etant donné que le rôle de barrière de la peau est assuré principalement par le stratum
cornéum (couche la plus superficielle de l’épiderme) et à moindre mesure par l’épiderme,
nous avons choisi, en règle générale, de ne tenir compte que de ces 2 couches et de retirer le
derme, couche très épaisse, afin d’être sur d’avoir des quantités mesurables dans le liquide
recepteur. Après 24 heures de contact, on dose le PVA (HPLC) et la CD (dosage
immunoenzymatique) dans le stratum cornéum, l’épiderme et le liquide récepteur situé sous la
peau dans la cellule de Franz.
126
La première étude, décisive pour la suite des opérations, comparait 3 gels aqueux : le
premier contenant le complexe γCD/PVA (stable mais insoluble dans l’eau et solubilisé par
du Tween 80), le second contenant le complexe Rameb/PVA et le troisième le PVA seul,
solubilisé par du Tween 80. Le dosage du PVA dans le stratum cornéum, l’épiderme et le
liquide récepteur a montré que la complexation par la Rameb provoquait une augmentation
très significative de la quantité de PVA dans la peau alors que la complexation par la γCD n’a
pas cet effet. Ces résultats s’accordent avec l’hypothèse émise par l’équipe de T. Loftsson
[Màsson, 1999] dans leurs efforts pour expliquer le rôle de promoteur d’absorption des CD, et
qui montre la CD comme un vecteur qui agit en solubilisant les principes actifs lipophiles et
permet leur diffusion du milieu aqueux extérieur vers la couche cornée puis l’épiderme. Avec
le complexe γCD/PVA, insoluble dans l’eau, on n’observe pas d’effet promoteur d’absorption
de la CD. Toutes les études suivantes ont été réalisées avec le gel de Rameb/PVA et un gel de
référence (PVA sans CD). Dans un souci de variété nous avons aussi testé une solution

huileuse de PVA comme référence. Les résultats ont confirmé une nette augmentation de la
pénétration du PVA avec le gel contenant le complexe Rameb/PVA par rapport au PVA libre,
qu’il soit sous forme de gel aqueux ou de solution huileuse.
Dans une expérience, et une seule, nous avons utilisé les 3 couches cutanées c’est à dire
stratum cornéum, épiderme et derme. Les résultats ont montré alors qu’après 24 heures
aucune trace de PVA n’est retrouvé dans le liquide récepteur. Cela ne signifie pas que celui-ci
ne pourrait pas éventuellement passer dans le sang puisqu’in vivo le derme est traversé par de
très petits vaisseaux sanguins. Cela signifie que le PVA ayant atteint le derme y est stocké ou
y diffuse très lentement. Théoriquement donc le PVA pourrait se trouver en contact avec ces
petits vaisseaux sanguins, mais là encore il reste à prouver qu’il pourrait passer la membrane
constituant les vaisseaux.
127
Nous avons aussi pu en apprendre plus sur le comportement de la cyclodextrine dans la
peau. Tout d’abord la CD pénètre en quantité très significative, mais faible par rapport à la
quantité initiale déposée car, comme le PVA, elle est confrontée à la barrière du stratum
cornéum. Les résultats de dosage d’une étude comparant le gel Rameb/PVA à un gel
contenant la CD seule indiquent que celle-ci a le même comportement qu’elle soit appliquée
sous forme complexée ou sous forme libre. En effet, les quantités retrouvées dans la peau ne
sont pas significativement différentes. Ceci signifie soit que le complexe a les mêmes
propriétés physico-chimiques que la CD seule, ou bien que le complexe se dissocie très tôt,
dans les premières couches de l’épiderme. Pour comprendre de quelle façon la CD influence
la pénétration du PVA, nous avons réalisé une étude opposant le gel contenant le complexe
Rameb/PVA à un gel contenant un mélange physique de Rameb et PVA, sous formes libres. Il
en résulte une pénétration significativement plus importante avec le complexe. La
solubilisation du PVA par la CD est donc essentielle pour améliorer l’absorption du PVA. Ce
résultat était attendu puisque l’on sait déjà qu’un complexe insoluble n’est pas efficace.
Il a longtemps été décrit que le pouvoir de promoteur d’absorption des CD était dû, tout
comme leur pouvoir hémolytique, à leur aptitude à capter le cholestérol des membranes
biologiques. Ceci est vrai mais ne concerne que les CD vides et non les complexes.
Toutefois si la constante d’association du complexe est plus faible que l’affinité du
cholestérol pour la cavité de la cyclodextrine, alors il y aura dissociation du complexe, et la
CD et le principe actif diffusent dans la peau en fonction de leur propriétés respectives. Afin
de déterminer plus précisément à quel stade se fait la dissociation du complexe, nous avons
utilisé le rapport [Rameb]/[PVA], [Rameb] et [PVA] correspondant aux concentrations

molaires, calculé pour les 3 expériences où la CD est dosée. Ce rapport est initialement de 10
dans la solution et donc dans le gel, puisque l’obtention d’un complexe stable nécessite la
présence de 10 équivalents de Rameb pour un équivalent de PVA. En solution il y a un
échange rapide entre la PVA libre et complexé, mais après la mise en gel ce n’est plus le cas
et donc 9/10 de la CD se trouve sous forme libre. Si l’on admet que la CD a le même
comportement dans la peau qu’elle soit sous forme libre ou complexée au PVA, ce qui a été
démontré en comparant la pénétration de la Rameb après application du complexe et d’un gel
de CD libres, alors toute variation du rapport [Rameb]/[PVA] dans la peau indique que l’une
des deux espèces passe plus vite et donc qu’il y a eu dissociation. Ce rapport reste proche de
10 dans le stratum corneum mais subit d’importantes variations dans l’épiderme et le liquide
récepteur.
Malheureusement, les chiffres dans les 3 expériences sont très disparates, leurs écart-
types importants et aucune tendance majeure ne ressort. On ne peut donc pas savoir quelle
espèce pénètre plus rapidement. La seule vraie conclusion qui en ressort est que le complexe a
effectivement été dissocié. Dans l’étude de pénétration sur peau totale, c’est à dire en présence
du derme, aucune trace de PVA n’est retrouvé dans le liquide récepteur, alors qu’une faible
fraction de la quantité de CD passe le derme et est donc susceptible d’atteindre les vaisseaux
sanguins. Le derme est constitué d’un ensemble de cellules, nerfs, fibres noyés dans une phase
mucopolysaccharidique aqueuse. La Rameb, hydrosoluble et amphiphile, peut donc
facilement diffuser au travers alors que le PVA, lipophile, ne traverse pas cette couche épaisse
et y est stocké comme dans un réservoir ou métabolisé.
L’ensemble de ces résultats n’amène pas une preuve formelle de la dissociation du
complexe dans la peau mais fournit assez de raisons pour le soupçonner fortement. La limite
nous est imposée par les techniques disponibles à l’heure actuelle. En effet, il n’existe pas de
technique de dosage permettant de différencier la forme libre de la CD du complexe.
L’immunologie ne nous permet que de doser la CD libre car la liaison de l’anticorps sur la CD
provoque la dissociation du complexe. En effet les constantes de complexation (de l’ordre de
10 3 ) sont largement inférieures aux constantes d’association anticorps-antigène (jusqu’à 10 12 ).
[Créminon, 1994]
128
En regardant le comportement de la Rameb dans la peau et son influence sur la
pénétration du PVA, on peut se demander ce que l’on observerait avec une CD encore plus
amphiphile et donc ayant plus d’affinité pour les membranes biologiques. Notre choix s’est
porté sur un dérivé de cholestéryl-cyclodextrine (une CD monofonctionnalisée par une

molécule de cholestérol). En effet il a été montré que les cholestéryl-cyclodextrines (CD-chol)
possédaient de remarquables propriétés d’interaction avec les membranes biologiques. Nous
espérons, en utilisant une βCD-cholestéryl modifiée de façon à augmenter son hydrophobicité,
pouvoir préparer des nanoparticules capables d’être chargées en PVA, et étudier leur
pénétration dans la peau.
129

130
CHAPITRE 2

3.3 CHAPITRE 2
INTRODUCTION
Un grand nombre de CD chimiquement modifiées ont été synthétisés afin d’améliorer
ou modifier certaines propriétés de ces molécules hôtes [Wenz, 1994].
Notre attention s’est portée sur les CD amphiphiles, qui sont obtenues en ajoutant un
ou plusieurs groupements hydrophobes. De tels composés peuvent s’insérer dans des systèmes
lipidiques tels que les membranes naturelles ou artificielles grâce à leur partie hydrophobe.
Les CD modifiées appelées « bouquets » (Fig. 21a), portant plusieurs chaînes polyoxyéthylène
ou polyméthylène sur la face primaire et la face secondaire de la CD, ont montré qu’elles
s’incorporaient en grande quantité dans différents types de vésicules lipidiques de DMPC ou
de lécithine d’œuf. Il apparaît que leur mode d’incorporation dans les bicouches n’est pas
unique et rassemble différentes positions allant de transmembranaire à hémimembranaire
[Jullien, 1993]. De nombreux exemples d’auto organisation de CD amphiphiles portant des
chaînes hydrophobes sur une ou deux faces ont été rapportés, que ce soit une organisation en
multicouches ou monocouches stables à l’interface air/eau ou des films de Langmuir-Blodgett
[Parrot-Lopez, 1992 ; Tchoreloff, 1995].
131
a b c
Figure 21. Représentation shématique de a) CD « bouquet » b) CD « bilboquet »
c) insertion de la βChol dans une bicouche lipidique
Kawabata et coll. [Kawabata, 1988] ont utilisé la per(6-dodecylamino-6-deoxy)-βCD
et la per(6-alkylsulfonyl-6-deoxy)-βCD pour former des films de Langmuir-Blodgett stables.

Ils ont montré que la couronne de la cyclodextrine se place parallèlement au film alors que les
chaines alkyles lui sont perpendiculaires. Les auteurs se sont ensuite intéressés à la formation
de ces mêmes films avec des complexes d’inclusion composés de la per(6-dodecylamino-6-
deoxy)-βCD et d’azobenzène (hôte). Ils ont rapporté des observations corroborant le fait que
l’azobenzène retrouvé dans le film de Langmuir-Blodgett est inclus dans la cavité de la CD et
peut même dans ces conditions subir une isomérisation cis-trans parfaitement réversible, ce
qui n’est pas le cas lorsque la molécule s’insère seule dans le film [Tanaka, 1987 ; Yabe,
1988]. Dans le même esprit, Taneva et coll. [Taneva, 1988] ont utilisé les dérivés (6-déoxy-6-
hexadecylamino) de l’αCD, la βCD et la γCD et étudié leur association avec le cholestérol
lors de la formation de monocouches mixtes (à l’interface air/eau) montrant que dans un cas,
le dérivé γCD, le cholestérol entrait dans la cavité de la CD alors qu’avec les dérivés βCD et
αCD le cholestérol ne s’inclue pas et se place, dans la monocouche, entre les chaînes alkyles
greffées sur la CD.
Plus récemment, il a été démontré que l’incorporation dans les membranes peut se
faire aussi avec des dérivés amphiphiles monosubstitués. Les molécules « cup and ball » ou
« bilboquet » (Fig. 21b) obtenues par substitution nucléophile, sur la face primaire de la βCD,
avec une diamine alcane N-protégée par un groupement volumineux (tert-butyloxycarbonyl) à
l’extrémité, pour éviter l’auto-inclusion de la chaîne, peuvent s’incorporer dans des systèmes
organisés tels des vésicules phospholipidiques et garder leur propriétés d’inclusion [Lin,
1998]
132

D’un autre côté, la substitution linéaire par un cholestérol donne des molécules
possédant de très bonnes propriétés d’incorporation dans les membranes phopholipidiques.
Ceci a été obtenu avec le dérivé 6-(cholest-5-en-3β-ylamido)succinyl-amino-6-
deoxycyclomaltoheptaose, ou Chol-βCD (Fig. 22b), et pour lequel la présence du bras
espaceur (succinyl) entre la CD et le cholestérol est essentielle pour donner de la souplesse au
composé et éviter la désagrégation de la membrane. L’incorporation des Chol-βCD dans une
membrane modèle de DMPC se fait préférentiellement les unes près des autres créant ainsi
deux phases séparées et thermodynamiquement stables au sein de la bicouche (Fig. 21c). Par
la suite, la méthylation en position 2 et 6 de la partie cyclodextrine de ces composés a permis
d’obtenir des dérivés solubles dans l’eau (Chol-Dimeb, Fig. 22a) car ils ont la propriété de
s’auto-organiser spontanément en milieu aqueux pour donner des micelles composés de 24
unités. Ces micelles parfaitement sphériques, sont tapissés à la surface par les CD et
conservent les propriétés d’inclusion de la cavité de la CD. [Auzély-Velty, 1999 ;2000 ;2001]
Me
a) Me
CHM e2 b)
C ONH
NHCO
O
HO
O M e
MeO O O
HO
MeO
O
6
c)
HO
133
NHCOO
O
OH
HO O O
HO
HO
O
6
Figure 22. Structures de a) Chol-Dimeb b) Chol-βCD “avec bras”
Me
Me
c) Chol-βCD “sans bras”
C ON
H
N HC
O
O
H O
O H
HO O O
H O
HO
O
6
CHMe2
Me
Me
C H M e2

Par la suite, de nombreuses études ont montré que des cyclodextrines amphiphiles
pouvaient former des nanoparticules (nanosphères et nanoparticules) stables. Ainsi, les CD
appelées “CD à jupes” (ou “skirt-shaped CD”) sont préparées à partir d’αCD, de βCD et de
γCD en greffant sur les hydroxyles de la face secondaire des chaines carbonées de longueurs
variables (C2-C14). Insolubles dans l’eau, elles possèdent des propriétés de tensio-actifs et
peuvent facilement donner naissance à des nanoparticules, comme cela a été montré avec la
βCD-C6, la βCD-C12, la βCD-C14 et la γCD-C6 par Skiba et coll. [Skiba,1993 ; Skiba,
1996 ; Duchêne, 1996]. En fonction de la technique de préparation, on peut obtenir au choix
des nanosphères ou des nanoparticules. Pour les nanosphères on utilise le plus souvent la
nanoprécipitation qui consiste à dissoudre la CD dans un solvant miscible à l’eau (éthanol,
acétone), à injecter la solution dans l’eau puis à retirer le solvant par évaporation sous vide, ce
qui donne spontanément des agrégats. Dans ces conditions, on obtient avec les 3 CD citées
précédemment des nanosphères dites blanches (car non chargées en principe actif)
parfaitement stables et donc ne nécessitant pas l’ajout d’un tensioactif supplémentaire
(stabilisant). Notons que l’on utilise une technique légèrement différente lorsque l’on est
obligé d’utiliser un solvant non miscible à l’eau pour dissoudre la CD, comme ce fut le cas
avec la γCD-C6. La méthode reste la même mais, dans ce cas précis, il n’a pas été possible de
se passer de tensioactif (Pluronic ® F68) pour obtenir des nanosphères stables. Dans le cas des
nanocapsules, la phase lipophile constituée de la CD amphiphile et d’une huile (Myglyol 812
ou benzyl benzoate) est dissoute dans l’acétone et ajoutée sous agitation à la phase aqueuse.
Les nanocapsules se forment spontanément et l’acétone est retirée par évaporation sous vide.
Il est possible de charger ces nanoparticules en principe actif (p.a), qu’il soit lipophile
ou hydrophile en le dissolvant dans la phase organique ou aqueuse, respectivement. Dans le
cas des nanosphères, le p.a peut se situer dans la matrice de CD, adsorbé en surface ou encore
dans la cavité de la CD. Pour les nanocapsules, la CD joue le rôle de barrière extérieure et le
p.a est dissout dans l’huile contenue à l’intérieur. Ainsi, plusieurs p.a, hydrophiles ou
lipophiles, ont été encapsulés avec succès dans les CD-jupes : dans des nanosphères, la
doxorubicine (chlorydrate hydrophile), jusqu’à 40% w/w en présence d’un tensioactif [Lechat-
Leroy,1995] et la progestérone (lipophile) jusqu’à 80% w/w en présence de Pluronic ® F68
[Lemos-Senna, 1998b]. Dans des nanocapsules, en présence de Pluronic ® F68,
l’indométhacine, la progestérone et l’amphotéricine B ont été encapsulés avec à l’arrivée un
contenu en principe actif de 21.6 % w/w, 7.5 % w/w et 11 % w/w respectivement [Skiba,
1996].
134

Citons aussi les travaux de Ravoo, Darcy et Mazzaglia concernant des βCD
substituées par des groupements aminos et carboxyméthyls sur les faces primaires et
secondaires respectivement (donc une charge positive sur la face primaire et une charge
négative sur la face secondaire) et aboutissant à la formation d’agrégats supramoléculaire dans
l’eau, d’un diamètre inférieur à 300nm et d’environ 20µm de long [Ravoo, 2001].
Nous allons tout d’abord présenter, dans ce deuxième chapitre, de nouveaux résultats
obtenus avec la Chol-Dimeb (Fig. 22a) et concernant son inclusion dans des membranes
modèles de films noirs. Nous avons en effet préparé des films mixtes phopholipides/CD
amphiphiles afin d’étudier leur structure par la technique de réflectivité des rayons X. Ce
travail, basé sur la technique des films noirs [Bélorgey, 1991 ; Benattar, 1992], a été effectué
en collaboration avec le Dr Jean-Jacques Bennatar et son équipe au Service de Physique de
l’Etat Condensé du CEA Saclay.
Les films noirs sont des bicouches particulières puisque les têtes polaires des
phospholipides ou tensio-actifs qui le constituent sont face à face, séparées par une mince
couche d’eau. Ces films sont formés en remontant lentement un cadre métallique plongé dans
une solution de tensio-actifs. Le film se forme entre les extrémités du cadre et s’amincit au fur
et à mesure que l’eau présente à l’intérieur s’écoule (Fig. 23). En dessous de 500 Å, le film est
dit « noir », bien que tout à fait transparent, car il ne réfléchit plus la lumière. La technique de
réflectivité des rayons X consiste à mesurer l’intensité du faisceau de rayon X réfléchie par le
film en fonction de l’angle d’incidence du faisceau par rapport au film, et permet de
déterminer pour chaque constituant du film la densité électronique, l’épaisseur et la rugosité
interfaciale. Grâce à cette technique, nous avons montré qu’il est possible de former un film
noir de Chol-Dimeb. Ce film est très peu stable mais en ajoutant un phospholipide (DMPC) à
la solution nous avons obtenu un film très stable et dont l’épaisseur est maximale pour un
rapport DMPC/CD de 3. Nous avons montré que la Chol-Dimeb conserve ses propriétés
d’inclusion dans le film et permet de rendre celui-ci accessible à un principe actif. On obtient
donc un film modèle pouvant inclure des molécules hydrophobes et mimant une interaction
possible des CD avec des membranes.
135

Figure 23. Formation d’un film noir
136
écoulement de l ’eau
Le second article de ce chapitre est consacré aux dérivés acétylés et donc insolubles
dans l’eau, de la Chol-βCD “sans bras” (Fig. 22c), que nous avons synthétisés dans le but
espéré de former des nanoparticules capables d’être chargées en vitamine A. Pour cela, nous
sommes partis d’une Chol-βCD ne possédant pas de bras espaceur entre le cholestérol et la
cyclodextrine et donc plus rigide. Cette Chol-βCD « sans bras », insoluble dans l’eau et les
solvants organiques, a été décrite par Auzely-Velty et coll. et provoque une désorganisation
des bicouches lipidiques. L’acétylation de ces composés permet de les rendre solubles dans les
solvants organiques. Tout d’abord nous présenterons succinctement la synthèse de ces
composés acétylés et la préparation des nanoparticules recherchées. Nous présenterons les
caractéristiques physico-chimiques de ces nanoparticules, seules puis en présence de vitamine
A. Enfin, seront présentés les premiers résultats d’étude de pénétration sur peau obtenus par
application cutanée d’un gel contenant des nanoparticules chargées en PVA.
C
H 3
C
H 3
C O O
C O O
O
O P
O -
O
+
N (C3 ) 3H
Dimyristoyl
phosphatidyl
choline
(DMPC)

Chapitre 2
3.3.1 Article n°4
137
Direct investigation of the vectorisation of amphiphilic cyclodextrins in
phospholipidic films
I. Javierre, M. Nedyalkov, V. Petrova, J.J Benattar,
S. Weisse, R. Auzély-Velty, F. Djedaïni-Pilard, B. Perly.
J. Colloids and Interface Science (sous presse)

Direct investigation of the vectorisation properties of amphiphilic
cyclodextrins in phospholipid films
Isabelle Javierre, Mickael Nedyalkov 0 , Vera Petkova and Jean-Jacques Benattar 0
CEA/Saclay, DSM/DRECAM, Service de Physique de l'Etat Condensé, F-91191 Gif sur Yvette Cedex, France
Sandrine Weisse, Rachel Auzély-Velty 0 , Florence Djedaïni-Pilard 0 and Bruno Perly
CEA/Saclay, DSM/DRECAM, Service de Chimie Moléculaire, F-91191 Gif sur Yvette Cedex, France
Abstract
Recently, new cyclodextrin derivatives have been synthesized and were shown to
exhibit strong amphiphilic properties. In this paper, we study the action of these new
amphiphilic cyclodextrins on phospholipids. Mixed phospholipids / cyclodextrin derivatives
films were prepared and studied using X-ray reflectivity for various phospholipids /
cyclodextrins ratios. A molar ratio of 3 provides a highly stable film which molecular
structure has been investigated in detail. The cholesterol tail of the cyclodextrin molecule was
found to be anchored into the phospholipid film. The cyclodextrin moieties exposed to the
aqueous medium are prone to the addition of the guest molecule Dosulepin, making them of
high interest for drug delivery. For this purpose and as an example of potential application,
this cyclodextrin molecular carrier property is also addressed to this complex film
architecture.
Key Words: black films; X-ray reflectivity; cyclodextrins; phospholipids; drug delivery
0 Permanent address: Department of Physical Chemistry of the University of Sofia, 1, bull. "James
Bourchier", 1126 Sofia, Bulgaria.
0 Author to whom correspondence should be addressed. Fax : (33) 169 088 786 Phone : (33) 169 087
516 Email : benattar@drecam.saclay.cea.fr
0 Present address: Centre de Recherche sur les Macromolécules Végétales, BP53, 38041 Grenoble
Cedex 9, France.
138
0 t Present address: Université de Picardie-Jules Verne, Laboratoire des Glucides, 33, rue S Leu, F-80039
Amiens, France.
Running title: Black films of phospholipids and cyclodextrins

Introduction
Newton Black Films (NBF) consist of two walls of surfactant molecules surrounding
an hydration water core. In contrast to the biological membrane structure, the hydrophilic part
of the molecules face in the center of the film. Since this structure was determined by X-ray
reflectivity 1 , many experiments have been made with different types of molecules 2, 3, 4, 5, 6, 7
The NBF is an appropriate model system for studying the interactions between different
molecules and to build more and more complex mixed structures. With biological compounds
one can successfully model liposome/liposome interaction, inter-membrane interactions and
more specific processes. The present experimental approach uses NBF stabilized by
phospholipids as an artificial target to simulate the action of modified amphiphilic
cyclodextrins.
Recently, using X-ray reflectivity, the internal substructure of various phospholipids
black films has been elucidated with a molecular scale resolution 8 : the density profile and the
thickness of the zone occupied either by the aliphatic chains or by the hydrophilic groups were
determined. In particularly, DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine) or DOPC
(dioleoylphosphatidylcholine) were found to form very stable films whose lifetime was more
than two days with a well-defined structure.
One challenging problem was then to be able to obtain stable mixed film including a
host biological molecule, i.e. a protein, and to understand its structure. Recently, mixed stable
protein/surfactant (BSA 9 , bovine serum albumin and C12E6, hexaethylene glycol
monodecylether) films were obtained. A general insertion process was found to form a single
protein layer embedded in the free-standing surfactant bilayers by adjusting the protein
chemical potential in bulk. The use of DMPC instead of C12E6 and Lysozyme instead of BSA
led to the same result, but with a larger variety of behaviors 10 . In this case, the complexity of
the film structure is magnified by the use of biological molecules for both the film and the
host. Nevertheless, the complexity of these mixed films is now controlled and quite well
understood.
139
Within the context of this study, we use a DMPC free-standing film as a target for a
cyclodextrin molecule. This cyclodextrin is new and is hydrophobically modified 11 : namely 6 I -
(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6 I -deoxy-per(2,6-di-O-methyl)-cyclomaltoheptaose
(chol-DIMEB). An analysis 12 of its behavior in aqueous solution using surface tension
measurements and light, small-angle X-ray, and neutron scattering techniques proved that it
self-assembles into monodisperse spherical micelles with an average aggregation number of

24. These highly water -soluble micelles have been shown to be two-shell objects, the
cyclodextrin moieties being exposed towards the aqueous medium making them prone to the
inclusion of guest molecules in the cavities.
The association of guest molecules in the aggregates of chol-DIMEB has also been
investigated for different water-soluble molecules 13 . NMR (Nuclear Overhauser Effect
pumping) demonstrated the binding and spatial proximity for these different guests. Using
small angle X-ray and neutron scattering (SAXS and SANS, respectively) the microstructure
at the supramolecular scale of the modified cyclodextrin (chol-DIMEB) micelle – i.e.
aggregation number, charge and volume- in the presence of guest molecules could be defined.
One of the guests, i.e. the neurotropic molecule Dosulepin, is known to interact
with chol-DIMEB micelles13. This molecule forms inclusion complexes with the native 14 and
modified 15 β-cyclodextrin and is extensively used as a guest model. The selective interaction
of Dosulepin with cyclodextrin cavities of chol-DIMEB micelles has been clearly evidenced
by Diffusion-assisted NOE-pumping experiments. It has been shown that the aggregation
number of the micelle does not change noticeably upon inclusion of this guest. These results
imply that the packing of the chol-DIMEB into spherical micelles is exceptionally robust.
These studies have clearly demonstrated that the inclusion properties of the CD cavities of
chol-DIMEB aggregated into micelles objects are retained. The stability and specificity of the
mixed micelle involving target molecules, such as Dosulepin, make these hydrophobically
modified cyclodextrins good candidates for molecular carriers. Chol-DIMEB can therefore be
of high interest for the targeting of biologically important molecules and especially for the
delivery of drugs.
Up to now, the mixed cyclodextrin/DMPC system has only been investigated on a
macroscopic scale11, using small-angle X-ray scattering, differential scanning calorimetry and
31 P nuclear magnetic resonance. The mixed system obtained was a lamellar phase, stable and
monophasic only for specific cyclodextrin/DMPC ratios. There is no model membrane
incorporating native cyclodextrin.
In this study, we have used the freestanding film technique to mimic the cyclodextrin
action on a phospholipid bilayer target. Initially, our aim was to check the feasibility of the
formation of a stable mixed cyclodextrin/DMPC film and to determine its structure at a
molecular scale: namely how cyclodextrin is incorporated into the film and what is the
prevalent interaction. Then we took advantage of the cyclodextrin carrier molecule property
to follow in situ the behavior of an active guest molecule, Dosulepin, trapped in the
cyclodextrin cavities.
140

Materials and methods
Materials
141
Chol-DIMEB (Fig. 1a) has been synthesized in the laboratory as described
previously12. This molecule is composed of a hydrophobic cholesterol tail grafted onto a
methylated cyclodextrin through a succinyl spacer arm. It looks like a white amorphous
powder, is highly water-soluble, and has a critical micelle concentration12 of (5±2)×10 -6 M.
The chol-DIMEB concentration was 0.438 mg/ml. BASF Pharma (Valenciennes, France)
kindly provided Dosulepin (Fig. 1b), a water-soluble neurotropic substance. It is a tricyclic
molecule with a positively charged aliphatic tail.
The DMPC lipid, whose chemical formula is given in Fig. 1c, has a zwitterionnic
phosphatidylcholine head and 14 carbons hydrophobic tails. It was purchased from SIGMA
and used without further purification. DMPC dispersions in ultra pure water (Millipore Alpha-
Q) were obtained by sonication with ultrasound (VibraCell 72412, Bioblock Scientific) for 15
minutes at 30°C, which is a higher temperature than the transition temperature of DMPC 16
(23°C). From the literature 17 , it is known that such a procedure leads to suspensions of small
unilamellar vesicles (SUV). In all experiments reported here, the concentration of DMPC in
the film forming solution was 0.5 mg/ml. The suspension was stored at 25 °C and used as
soon as possible (maximum conservation time: 3 days). For the mixed solutions, the DMPC
suspension was poured on the appropriate weighted amount of cyclodextrins and stirred for 30
minutes. For the experiments with Dosulepin, we use the same procedure. A large excess of
guest molecule (0.3mg/ml) was used in order to be sure all the cyclodextrin cavities are
occupied by one Dosulepin molecule 0 . All the experiments were performed at 25±1°C.
The formation of stable films requires dense packed monolayers of amphiphiles at the
film surfaces 18 . Phospholipids have very low solubility and the kinetics of monolayer
formation is very slow. In order to estimate the time necessary to form a dense molecule
monolayer, surface tension measurements were performed for pure DMPC and pure chol-
DIMEB solutions, and for DMPC/chol-DIMEB mixtures. Surface tension was measured at
0 The DIMEB/Dosulepin complex formation constant is Kc=4610M -1 . If [DIMEB]=1mM and
[Dosulepin]=5mM then [DIMEB/Dosulepin complex]=0.94mM. 94% of the cyclodextrin
cavities should theoretically contain one Dosulepin molecule. See Djedaïni, F., Zhao Lin S.,
Perly, B., Wouessidjewe, D., J. Pharm. Sci., 79, 643 (1990).

25°C using the Wilhelmy plate method with a Cahn 1000 balance (Ankersmit, U.S.A.). As
shown in Fig. 2, the surface of the solution is saturated with amphiphilic molecules after
approximately 15 h for dispersions of DMPC and 25 h for chol-DIMEB solutions. Then,
surface tension reaches a constant value, 40 mN/m for chol-DIMEB and 30 mN/m for DMPC.
These values are in agreement with previous reports12 , 19 . For the DMPC/chol-DIMEB
mixture, we observe two steps in the adsorption process. After 15h, a first plateau occurs at 30
mN/m, then the surface tension continues to decrease to a second constant value, 24 mN/m,
which is reached after 25h saturation. However, whereas the value of the first plateau of this
curve corresponds to the value obtained for pure DMPC, the kinetics strongly differs during
the first 6 hours: with pure DMPC, the initial value of surface tension is 60 mN/m when with
the mixture, this initial value is equal to that for pure chol-DIMEB. This change could be
linked to the higher hydrophobicity of the cyclodextrins: at the beginning of the experiment,
the cyclodextrins will partially diffuse to the surface first, then DMPC molecules, which are
more hydrophilic, will reach the surface. The lower value obtained for the surface tension of
the mixed solution indicates that the monolayer is mixed ,i.e., DMPC/chol-DIMEB
monolayer.
Because of the long saturation times, all the experiments were undertaken inside a
sealed box to maintain water vapour saturation. First, we study the pure DMPC and pure chol-
DIMEB films separately, and then mixed films with various DMPC/chol-DIMEB molar
ratios. The (3 : 1) molar ratio of DMPC/chol-DIMEB film experiments will be described in
detail.
X-ray reflectivity technique
The macroscopic vertical films are withdrawn from the cyclodextrin/DMPC mixtures
by lifting a rectangular metallic frame at a slow constant rate. The geometry of the frame is
described elsewhere6 and enables reflectivity measurements to be made at extreme grazing
incidence in the range 7-60 mrad. The minimum incident angle (7 mrad) is only limited by the
size of the meniscus.
142
The experiments were performed using a high-resolution diffractometer (Nonius,
Optix) described elsewhere 20, 21 . A copper tube is used as an X-ray source (λ = 1.5405 Å,
(CuKα1 line)). A reflectivity experiment enabled us to measure the ratio R(θ) = Ι(θ)/I0 at

various incidence angles θ, between the intensity I0 of the incident beam 0 and that Ι(θ)
reflected by the film.
The specular reflectivity is recorded and provides access to the electron density
profile1 along the film normal. As described elsewhere 22 and because it is not possible to
directly invert the reflectivity data, we consider the film as a succession of homogeneous
chemical slabs and fit the data with a least-square procedure. Each slab corresponds to a
specific part of the film8 assuming that the molecules stay side-by-side and form a bilayer. For
example, two external slabs would represent the hydrophobic tails, two other slabs would
stand for the polar heads and a fifth slab would correspond to the hydration central layer. Each
slab is characterized by its specific thickness and electron density (noted δ hereafter). In the
real film, the discontinuities between the different part of the bilayer are not so abrupt but are
smoothed using another parameter, the interfacial roughness (variable but identical for each
interface). This roughness accounts for the thermal fluctuations but it is not likely to exclude
the possible influence of additional intrinsic molecular disorder. As it is not easy to
distinguish the two possibilities, a good approximation is to consider the roughness identical
for each interface.
For each slab, the interfacial film roughness, the thickness and density can be derived
from the experimental reflectivity profile through the use of an optical formalism 23 . The fits of
the experimental reflectivity curves are made using “Parratt 32” software 0 .
It should be point out that the accuracy of the reconstructed density profile strongly
depends on the homogeneity of the film and on the agreement between the slab model and the
chemical structure of the film. In the present case, it is not be possible to obtain perfect fits
since all the reflectivity profiles are slightly modified by a weak thickness distortion.
We attempt to describe the mixed film using the symmetrical five-slab model.
However, when the experimental accuracy is lower (i.e. short lifetime of the film or disorder
in the film), we use a simpler model, 1- or 3- box model.
NMR Techniques
143
1 H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500
spectrometer with a 5 mm reverse broad-band z-axis gradient probe. In all cases, the sample
(10mM of DIMEB and Dosulepin) was prepared in deuterium oxide and measurements were
0 I0 is measured by placing the detector directly at zero incidence, in absence of the frame. A
calibrated aluminum absorber intercalated in the beam path protects the detector.
0 ©1997-2001 Christian Braun, Hahn-Meitner-Institut

performed at 25 °C under careful temperature regulation. NMR spectra were collected using
16 K data points. Chemical shifts are given relative to external tetramethylsilane (TMS = 0
ppm) and calibration was performed using the signal of the residual protons of the solvent as a
secondary reference. 2D experiments were obtained using modified pulse programs available
from the Bruker library. These experiments were run using 2K data points and 512 time
increments. The phase-sensitive (TTPI) sequence was used and processing resulted in a
1K*1K (real-real) matrix. All NMR data was further processed and plotted using the
XWINNMR program (Bruker Analytische Messtechnik) on an INDY workstation (Silicon
graphics).
Results
Pure DMPC films
A DMPC Newton Black Film was formed after one night surface saturation and was
stable for over two days. The reflectivity curve was recorded when the film reached its
equilibrium thickness. As described in a previous paper8, the data were analyzed using a least-
squares fitting procedure with a five-layer model: this model was partly imposed by the shape
of the curve and also took into account the chemical constraint of the DMPC molecule. The
calculated density profile, shown in the inset of Fig. 3, presents large contrasts between the
different part of the film, and originates in the specific DMPC interference fringes. The
overall thickness of the film is 58 ± 1 Å. Similarly as obtained in ref. 8, the first slab whose
thickness is 13.1 Å (δ=2.3×10 -6 ) is allocated to the hydrophobic tails. The intermediate layer
corresponding to the hydrophilic part of the molecules has an extension of 11.5 Å
(δ=3.8×10 -6 ). The thickness of the central core is 8.8 Å (δ=2.7×10 -6 ). The high value of the
electron density of intermediate layers evidences the presence of water hydration molecules
whereas the low value of δ in the central core indicates that only the choline group occupies it.
The value of the interface roughness between these sublayers is 3 Å.
Pure chol-DIMEB films
144
In spite of the chol-DIMEB amphiphile properties, it was extremely difficult to
form stable film made of these molecules, even if the concentration in the bulk (0.438 mg/ml)
was fifty times the cmc. After 25 hours waiting time for surface saturation, the chol-DIMEB
film drainage is instantaneous and the film reaches its equilibrium thickness. The lifetime of

the film was unfortunately less than 1 h. The low accuracy of the reflectivity data recorded for
this film (see Fig. 4) does not allow any detailed structural information. Nevertheless, the
position of the first minimum of the reflectivity curve enables us to determine the wide
thickness of the film (solid line in Fig. 4) through the use of a 1-layer model. The total
thickness is 54 ± 1 Å. In this film, the interface roughness is 3.6 Å.
Mixed DMPC/chol-DIMEB films
Mixed DMPC/chol-DIMEB films were studied with various DMPC/chol-DIMEB
molar ratios R varying from R=∞ to R=0 (R=∞: pure DMPC dispersion, R=0: pure chol-
DIMEB solution). The different thickness of the film extracted from the reflectivity curves
collected for various ratios are reported on Fig. 5. This curve has a bell shape and exhibits a
maximum of thickness (75 ± 1 Å) for the molar ratio 3. From R=∞ (pure DMPC film) up to
R=3, the thickness film rises from 58 ± 1 Å to 75 ± 1 Å as the chol-DIMEB proportion in the
film increases. This rise coincides also with a high stability of the mixed film (more than two
days). If we continue to add chol-DIMEB (from R=3 to R=0), the thickness decreases to 56 ±
1 Å and the film becomes more and more unstable. For the different ratios (R3)
(results not shown in this paper), the shape of the reflectivity curves are quite similar with the
same level of intensity. In contrast, for R=3, the reflectivity curve exhibits a maximum of
intensity and a specific modulation of the Kiessig fringes. This clearly indicates that for this
particular ratio, there are some molecular rearrangements within the film that yields a specific
film structure.
145
The solid line in Fig. 6 represents the best fit obtained for the film of maximum
swelling. As for DMPC data, a five-layer model was used to fit the experimental data. The
validity of this model will be discussed in the next section. We found an overall thickness of
75 ± 1 Å. A highly modulated electron density within the film (inset of Fig. 6) could be
detected, with, in particular, a very low electron density (δ=2×10 -6 ) in the central core, which
may evidence the absence of any water molecule in this layer of the film. In comparison with
a pure DMPC film, the 15 Å thickness increase observed should therefore be only due to the
mixed structure of the film. A thickness of 13.4 Å was measured for the external layer and of
11.4 Å for the intermediate layer. The central core is 25.5 Å thick. However, the low value of
roughness (3 Å) may support the hypothesis of a homogeneous structure.
Mixed DMPC/chol-DIMEB films including Dosulepin guest molecule

Another component (Dosulepin) was added to the previous mixed DMPC/chol-
DIMEB film (ratio R=3). After at least 30h surface saturation, a black film was formed and it
remained stable over 1 day. Fig. 7 shows the corresponding reflectivity profiles of mixed films
with and without Dosulepin. The spectacular shift of the position of the first minimum
towards small angle wave vectors indicates that Dosulepin is included into the film since the
film thickness is changed and thus its internal structure is modified. It was difficult to interpret
the reflectivity data in terms of layer model, because of the film inhomogeneity as well as the
complexity of the system. However, using a single-layer model, the overall thickness of the
film could be obtained: 100 ± 1 Å. To verify that the thickening observed was only due to
Dosulepin/chol-DIMEB complex formation, a test experiment was carried out. A mixed
Dosulepin/DMPC film was formed with the concentrations 0.3 mg.ml -1 / 0.5 mg.ml -1 vs/vs
Dosulepin/DMPC keeping constant the molar ratio (R = 3). The reflectivity curve is presented
in the inset of Fig. 7. The position of its first minimum coincides with the first minimum of
the pure DMPC curve. Consequently, the Dosulepin molecule should not disturb the DMPC
bilayer arrangement. This qualitatively confirms that the thickening of the DMPC/chol-
DIMEB/Dosulepin mixed film mainly originates in Dosulepin/chol-DIMEB interactions
which probably lead to complexes formation.
Discussion
146
For the pure chol-DIMEB black film, only one order of the Kiessig fringe is visible in
the reflectivity curve. We were not able to obtain the film structure from the electron density
profile extracted from the low quality reflectivity profile. However, using the knowledge of
the chemical structure of the film-forming molecules and bearing in mind the surfactant
properties of this molecule12, a molecular bilayer arrangement within the film can be
logically suggested (see Fig. 8). The chol-DIMEB molecules have their cavities facing each
other in a central layer of the film whereas the cholesterol moieties are oriented towards the
air. Moreover, the whole thickness found for the inverted black film (54 Å) is in agreement
with the radius of the chol-DIMEB direct micelle (25 Å) observed by Auzély-Velty et al.12
Because of the rather low accuracy of the reflectivity data, it is difficult to estimate a number
of water hydration molecules per chol-DIMEB head group.

147
In another respect, it should be pointed out that a β-cyclodextrin derivative film
structure has already been investigated 24 for β-cyclodextrins deposited on silicon wafers. The
β-cyclodextrins film exhibited poor in-plane ordering, mostly due to the corona 7-fold
symmetry, which created holes within the whole surface. Even if, in our case, the β-
cyclodextrin molecule is oppositely grafted and chemically modified, the 7-fold symmetry
molecule remains. Therefore, the presence of intrinsic holes within the bilayer could be
expected and could explain the poor stability of the film over a long period of time.
However, we observed that the stability is considerably increased by addition of
DMPC molecules to the chol-DIMEB film, particularly when the film is composed of 3
DMPC molecules for 1 chol-DIMEB molecule. Furthermore, the thickness of the film is
maximum for this ratio. This striking stability should be linked to a specific molecular
arrangement within the film interfaces. To reproduce the experimental reflectivity data of the
mixed film, a symmetrical five-box model was necessary and, as for the DMPC experiments8,
was imposed by the shape of the curve. The third fringe of the reflectivity curve is intensively
reduced compared with the second fringe (see Fig. 6) but their widths and intensities are
strongly correlated, as demonstrated during the fitting tests. Parameters combining very low
electron density for the central layer and rather high density for the intermediate layers gave
better agreement between the experimental recording and fitting curves. For pure DMPC, the
use of the five-layer model8 was one of the best way to account for the specific shape of the
DMPC reflectivity curve, and in particular the strong reduction of the intensity of the second
fringe. To fit the mixed film, we first supposed that the structure of the DMPC film was only
partially perturbed by the presence of cyclodextrins and we started the fitting procedure with a
five-layer model. (We also tested 1- and 3-box models, but they did not correspond to the
observed data: the simulated reflectivity curves are too regular.) However, the main difficulty
was to reproduce both the very low intensity of the third fringe and the high intensity of the
first fringe. During the fitting process, we attempted to use different five-layer models or even
a seven-layer model in order to correlate the chemically possible constraint of this mixed film
with the experimental reflective intensity. The fitting curve presented in Fig. 6 does not
perfectly reproduce the experimental data. Nevertheless, it corresponds to the best
compromise between a fit which correctly describes the third fringe correlated with the two
first ones (see Fig. 6) and a fit which correctly describes the two first fringes but not the third.
The unique differences between these two fitting curves were not in the thickness of the
different slabs but in the density values of the third layer. This fit quality is reduced due to
weak thickness inhomogeneity over the whole film: the two surfaces of the film are not

strictly parallel. This should affect the structure of the film so that it seems likely that no
plausible model could account for this disagreement. Nevertheless, in the microscopic scale,
the structure of the film could quite self-reliantly be determined. The electron density value of
2×10 -6 evaluated for the central layer of the mixed DMPC/chol-DIMEB film is in the same
range as that extracted from the pure cyclodextrin film. The central thickness (25.5 Å) is
comparable to the size of the cyclodextrin cavity ( 2 × 11 Å)13. Hence, in the mixed film, the
central core should consist of the cyclodextrin cavities facing each other (see Fig. 9). We keep
for the intermediate and external layers a structure similar to that of DMPC : the electron
density profile acquired for the mixed film has the same shape and is in the same range as that
obtained for the pure DMPC. Moreover, the ratio of the electron density of the intermediate
layer to that of the external layer is quite similar in each case (respectively 1.35 for the mixed
film and 1.43 for the pure DMPC). In the mixed case, the values may be lower because we
have to take into account the steric arrangement of 6 DMPC tails (3 DMPC molecules) around
the grafted cholesterol and the covalent succinyl bond. The surface12 covered by 1
cyclodextrin cavity ring (295 Å 2 ) roughly corresponds to the additional surface of a
cholesterol tail (120 Å 2 ) and 3 DMPC molecules (55 Å 2 /molecule). Additional experiments 0
show that the presence of a cholesterol molecule in pure DMPC film, in the same molar ratio,
did not provoke significant changes in the film thickness or in the density profile. Therefore,
in the mixed film the head of chol-DIMEB provides a specific molecular architecture
responsible of the very high stability. Indeed, owing to the film structure shown in Fig. 9
derived from the electron density profile, it appears the chol-DIMEB insertion process in the
DMPC bilayers can be reduced to a DMPC/cholesterol interaction. The condensing effects of
cholesterol on the physical properties of lipid bilayers have been studied extensively by a
variety of experimental methods 25, 26, 27 . The cholesterol is known to be a regulator of
membrane ordering 28 and to increase the rigidity of lipid bilayers 29 . However, up to now, what
remains unexplained is the specific molar ratio that leads to the stability in our film. As
previously observed11 : a DMPC/chol-DIMEB lamellar phase was found to be stable for a
molar ratio of 3.6, which remains in the same range as those observed with our black film.
0 Reflectivity curves of pure DMPC and of DMPC/cholesterol mixture were recorded in the
same conditions as for the other experiments. The position of first minimum is the same for
both curves; this suggests that the cholesterol molecule does not significantly disturb the
DMPC film structure.
148

Even if the mixed film structure described above seems to correctly reproduce the real
molecular arrangement within the film, one may wonder if the hydrophobic DMPC tail could
not be short enough to penetrate the hydrophobic cyclodextrin cavity. On the basis of an NMR
analysis upon α-cyclodextrin(α-CD)/phospholipids complexes, it was shown 30 that the main
factor governing any interaction between α-CD and lipids was the electrostatic properties of
the lipid headgroup. Fortunately, the interaction was less efficient for the PC headgroup and
the chain inclusion was mostly favored in the bulk phase (aqueous lipid suspension) than in
planar bilayer geometry. One may suppose that these properties remain valid in our case (i.e.
the chain inclusion should be sterically unfavorable). Moreover, it has been already
demonstrated that formation of inclusion complexes between cyclodextrins and phospholipids
can occur 31 .
The evolution of the reflectivity data (see Fig. 7) upon addition of an active drug
(Dosulepin) suggests another specific molecular arrangement within the film, mostly through
Dosulepin/chol-DIMEB complexes formation as previously mentioned in the Results section.
Assuming the above described mixed DMPC/chol-DIMEB film structure (Fig. 9) is reliable,
we can imagine this four-component-film schematically as being formed by a central layer
gathering the cyclodextrin cavities, each of them holding a Dosulepin molecule, embedded
between two external walls composed of cholesterol/DMPC mixtures, standing for the
“biological” membrane 0 . Hence, the overall thickness increase should be mostly related to
partial Dosulepin inclusion inside the cyclodextrin hydrophobic cavity. The charged aliphatic
chain remains outside the cavity.
149
In order to better understand the behavior of the model guest towards the chol-DIMEB
in the mixed DMPC/chol-DIMEB film, we have investigated by 1 H-NMR the conformation of
the inclusion of the Dosulepin in DIMEB in aqueous solution. Inclusion in DIMEB is
evidenced by modification of the spectrum of the host molecule as already described13 but no
conformational analysis of Dosulepin/DIMEB inclusion complex has been reported. Further
NMR experiments were performed to investigate the geometry in solution of this inclusion
complex. The T-ROESY sequence is used to prove the interaction of protons of the host and
guest molecules 32 . As found in many other situations regarding inclusion complexes in water,
0 The DIMEB/Dosulepin complex formation constant is Kc=4610M -1 . If [DIMEB]=1mM and
[Dosulepin]=5mM then [DIMEB/Dosulepin complex]=0.94mM. 94% of the cyclodextrin
cavities should theoretically contain one Dosulepin molecule. See Djedaïni, F., Zhao Lin S.,
Perly, B., Wouessidjewe, D., J. Pharm. Sci., 79, 643 (1990).

a 300ms spin lock was selected. All non-diagonal peaks are indicative of spatial proximity
between protons. Complex formation was demonstrated by the presence of strong dipolar
cross peaks between protons located in the cavity (H3 and H5) of DIMEB and aromatic
protons of Dosulepin. No other cross peak was observed between protons of Dosulepin and
DIMEB, thus precluding interaction of aliphatic chain with the DIMEB cavity.
Nevertheless, this peculiar Dosulepin/chol-DIMEB complexion is not able to explain
the 25 Å thickness increase (the largest theoretical 0 size of the molecule is not more than 9 Å).
The presence of charged molecules and counter-ions in black films modifies the electrostatic
double-layer and entropy confinement forces which results in an increase of the aqueous
interstitial core thickness. Dosulepin is a charged molecule and its presence within the film
could entail this increase. Moreover, this electrostatic repulsion combined with a steric
interaction could be involved in the thickness increase. Besides, neither a five-box model nor
a seven box-model was able to correctly reproduce the experimental reflectivity profile since
very complex interactions could occur in the center of the film.
Conclusion
The present study emphasizes that the X-ray reflectivity technique is sensitive enough
to detect slight molecular changes in Newton Black Film. The effect promoted by inclusion of
cyclodextrins in a DMPC biological membrane model does not entail homogeneous mixed
films at a macroscopic scale but results in a well-defined and organized structure at a
microscopic scale, which remains a five-layer model. The cyclodextrins are anchored in the
membrane through the cholesterol arm making the cavity available for the inclusion of
Dosulepin. Even if some effort is still needed to elucidate the structure of the analogue film
with Dosulepin, the molecular carrier cyclodextrin property is clearly evidenced at molecular
scale. The strategy developed herein should now be extended so as to be able to control the
selective release of the active guest through the aqueous medium.
Acknowledgements: The authors would like to thank C. Braun for the fitting procedure and
Roquette-Frères (Lestrem, France) for the kind gift of the cyclodextrin.
0 The theoretical lengths of the molecule were calculated using chem3D.pro software
simulations.
150

References
151

Figures Captions
152
152
Fig. 1 Chemical formulae of the different molecules studied by X-ray reflectivity a:
chol-DIMEB (6 I -(cholest-5-en-3α-ylamido) succinylamido-6 I -deoxy-per (2,6-di-o-methyl)cyclomaltoheptaose).
The cavity is hydrophobic and may trap non-soluble guest molecules. b
: Dosulepin, neurotropic commercial drug c: DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine)
phospholipid composed of two aliphatic chains of 14 carbons and a zwitterionic head.
Fig. 2 Surface tension measurement at 25°C for various solutions () 0.5mg/ml
DMPC () 0.438mg/ml chol-DIMEB (ο) 0.5mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB,
versus time.
Fig. 3 X-ray reflectivity intensity collected for DMPC films. In inset, we present the
electron density profile normalized to the electron density of the water, extracted from the
data analysis, versus the film thickness. The high electron density gradient within the film and
at the air/film interface implies an important modulation of the reflected intensity with, in
particular, the weak intensity of the second fringe characteristic of the structure of these
lipids8.
Fig. 4 X-ray reflectivity intensity collected from a pure chol-DIMEB film. The lack of
accuracy of these experimental data originates from the short lifetime of this film.
Nevertheless the overall thickness could be determined without ambiguity. In inset, we
present the electron density profile normalized to the electron density of the water, extracted
from the data analysis, versus the thickness of the film. There is no modulation as we use a 1box
model.
Fig. 5 Thickness extracted from experimental reflectivity curves of mixed
DMPC/chol-DIMEB film at various molar ratios R (R=DMPC/chol-DIMEB) versus this
molar ratio R. The bell shape evidences a swelling when more and more cyclodextrin
penetrate the DMPC bilayer with a maximum swelling for R=3.
Fig. 6 Five-layer model fit to the experimental X-ray reflectivity data from a
DMPC/chol-DIMEB mixed film (R=3). In inset, we present the electron density profile
normalized to the electron density of the water, extracted from the data analysis, versus the
thickness of the film. The peculiar modulation of the electron density observed is specific to
the structure of the film.
Fig. 7 Qualitative effect of Dosulepin on the mixed DMPC/chol-DIMEB film (R=3)
measured by X-ray reflectivity : (—) 0.5 mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB + 0.3
mg/ml Dosulepin (----) 0.5 mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB. The swelling of the
film is obvious and is mainly ascribed to the Dosulepin/chol-DIMEB complexes occurrence
as Dosulepin alone does not perturb the DMPC bilayer thickness : in inset are presented
reflectivity curves obtained for a pure DMPC film (0.5 mg/ml) and for a DMPC/Dosulepin
film (0.5 mg/ml DMPC and 0.3 mg/ml Dosulepin); the position of the first minimum of these
two curves is rather the same.
Fig. 8 Scheme of a pure amphiphilic cyclodextrin film according to the electron
density profile extracted from reflectivity experiments. The hydrophilic cyclodextrin cavities
occupy the central core of the film with the cholesterol moieties facing the air.
Fig. 9 Proposed structure of a mixed DMPC/chol-DIMEB film with a molar ratio of 3.
The cyclodextrin cavities are embedded between two biological membrane-like walls
composed of cholesterol and DMPC.

153
153

154
154
Fig. 1
I. Javierre et al.

155
155
Fig. 2
I. Javierre et al.

156
156
Fig. 3
I. Javierre et al.

R e f l e c t i v i t y ( I / I 0 )
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
- 7
- 8
157
157
w a t e r
E l e c t r o n d e n s i t y ρ / ρ
1 0
0 . 0 5 0 . 1 0 . 1 5 0 . 2 0 . 2 5 0 . 3
S c a t t e r i n g w a v e v e c t o r Q z ( Å - 1 )
Fig. 4
I. Javierre et al.
0 . 4
0 . 3 5
0 . 3
0 . 2 5
0 . 2
0 . 1 5
0 . 1
0 . 0 5
0
0 2 0 4 0 6 0
z ( Å )
B

Thickness (Å)
80
75
70
65
60
55
50
158
158
0 2 4 6 8 10
Molar ratio R=DMPC/Chol-DIMEB
Fig. 5
I. Javierre et al.

Reflectivity (I/I 0 )
10 -1
10 -2
10 -3
10 -4
10 -5
10 -6
10 -7
159
159
Electron density ρ/ρ water
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
Scattering wave vector Q z (Å -1 )
Fig. 6
I. Javierre et al.
0
-20 0 20 40 60 80 100
z (Å)

-2
10 0.5 m g/ml DMPC + 0.438 m g/ml Chol- DIMEB
10 -3 0.5 m g/ml DMPC + 0.438 m g/ml Chol- 10-3 DIMEB+ 0. 3 mg/ml Dosulepin
-4
-510-4 pure DMPC
10
10-610
10 -5
10-7
10-8 0DMPC 0.10.2 + D 0.3 osulepi 0.40. n 5
10 -6
10 -7
0 0.1 Scate 0.2 ring wave 0. vecto 3r Q(Å 0.4 -1) 0.5
z
Ref lectivity (I/I0)
160
160
Fig. 7
I. Javierre et al.

electron density
(ρ/ρwater )
0.4
0.2
0
161
161
0 10 20 30 40 50 60
Fig. 8
I. Javierre et al.
Z (Å)

electron density
(ρ/ρwater) 0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
162
162
10 20 30 40 50 60 70 80
Fig. 9
I. Javierre et al.
Z (Å)

Chapitre 2
3.3.2 Article n° 5
163
163
Investigations on vitamin A -loaded amphiphilic cyclodextrin nanocapsules :
characterization and topical application
S. Weisse, M. Skiba, F. Djedaïni-Pilard, B. Perly
International Journal of Pharmaceutics (soumis)

Investigations on vitamin A-loaded amphiphilic cyclodextrin
nanocapsules :
characterization and topical application
S. Weisse 1 , M. Skiba 2 , P. André 4 , B. Perly 1 , F. Djedaïni-Pilard 3
1 Service de Chimie Moléculaire, DSM/DRECAM, CEA Saclay, 91191
Gif sur Yvette Cedex, France
2 Université de Rouen, UFR médecine-pharmacie, Lab. de pharmacie galénique, 22 bvd
Gambetta, 76000 Rouen, France
3 Université de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides,
33 rue S t Leu, F-80039 Amiens, France
4 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et Cosmétiques
45800 St Jean de Braye, France.
INTRODUCTION
Since a number of years, a special attention has been paid to the preparation of amphiphilic
cyclodextrins (CD) in order to use them as new compounds for the preparation of carriers
(like nanoparticles [1]) or to insert them in a preformed lipidic matrix such as liposomes.
Among these, the cholesteryl-CD (obtained by grafting a single cholesterol on a CD) have
already proven their interest : it has been shown that cholesteryl-βCD induces a high disorder
into phopholipid bilayers and that cholesteryl-Dimeb forms highly soluble micelles in water,
and still retains its inclusion properties [2,3,4]. We focus here on a new cholesteryl-CD
derivative designed to obtain nanoparticles to be loaded with a lipophilic drug i.e vitamin A
propionate (PVA). The vitamin A loaded particles are then to be used to form a aqueous gel
and study the penetration of the vitamin A propionate after topical application on human skin.
EXPERIMENTAL
Materials
164
164

Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany) and
randomized per-(2,6-O-dimethyl)-β-cyclodextrin (Rameb) from WACKER (Germany). All
chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments. Deuterated
solvents were purchased from Euriso-Top (Saclay-France). Pluronic ® PEF68, a poly(ethylene
oxide)-poly(propylene oxide) block copolymer was chosen as nonionic surfactant.
Synthesis of Heptakis (2,3-di-O-acetyl)-hexakis (6-o-acetyl)-6 I -5cholest-5-en-3β-
yloxycarbonyl) amino-6 I -deoxycyclomaltoheptaose (Chol-βCD-Ac) (Fig 1)
Synthetic pathway to final compound of Chol-βCD-Ac involved the preparation of 6I-
(cholest-5-en-3b-yloxycarbonyl) amino-6I-deoxy cyclomaltoheptaose () synthetized in four
steps from the parent cyclodextrin as described in [2].
The reaction of 80 equivalents of acetic anhydride in pyridine under standard conditions
offered Chol-βCD-Ac quantitatively : acetic anhydride (985µL, 80 eq.) was added to a
solution of freeze-dried (243.6 mg, 0.157 mmol) in dry pyridine (5 mL). The reaction
mixture was stirred for the dedicated time at room temperature under nitrogen. The reaction
was stopped by addition of methanol (2 mL). The reaction mixture was washed with HCl 1N
(2*20 mL), satured aqueous solution of Na2CO3 (2*20 mL) and water (2*5 mL). After
evaporation of most of the solvant, the crude residual sirup was precipitated by addition of
water. The crude product was isolated by filtration, washed with water and dried.
The chemical structure of Chol-βCD-Ac was assessed using high resolution 1 H-NMR and
Mass spectrometry.
Fig 1. Chemical structure of Chol-βCD-Ac
165
165

Fig 2. Chemical structure of vitamin A propionate
NMR study
H 3 COCO
NHCOO
O
H 3 COCO O
O
H 3 COCO
Me
166
166
OCOCH 3
O
Me
OCOCH 3
6
OCOC 2 H 5
CHMe2

1 H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer
using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed
at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to
external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of
the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed
and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar
correlation (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after zero-
filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlation (ROESY experiment), the
phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.
HPLC measurement
For all PVA assays we used a BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck
Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM) column and a Beckman led array detector, mobile phase was
acetonitrile/water 90/10 v/v at 1mL/mn -1 . Detection of PVA at 325 nm, retention time is 9
min.
Mass Spectrometry study
High Resolution Mass Spectrometry was performed at the CRMPO at University of Rennes,
France, on a ZabSpec TOF (MicroMass). Electrospray ionisation of Chol-βCD-Ac (infusion
at 5µL/min of a 0.01 mg/mL solution in water-acetonitril 1/1 (v/v)) with positive ion detection
leads to a series of protonated molecules, [M+H] + , at m/z values depending on the number of
acetyl groups in each of the individual sugar unit of the β-cyclodextrin derivative.
Microscopy
Transmission electronic microscopy was performed with a Philips CM2000 with 80kV
tension.
Preparation of the nanoparticles
167
167
Nanospheres and nanocapsules of Chol-βCD-Ac were prepared according to the method
developped by Skiba et al [5,6]. Briefly, to obtain nanocapsules loaded with PVA, a lipophilic
phase, constituted by vitamin A propionate and Chol-βCD-Ac is dissolved in acetone and
added under mechanical stirring to an aqeous phase with surfactant (Pluronic ® PEF 68). The
nanocapsules are formed immediatly, and acetone is removed by evaporation under vacuum

together with part of the water to obtain a suspension of the desired concentration. Unloaded
nanospheres can be obtained exactly in the same way by using a lipophilic phase containing
only the CD dissolved in acetone.
Particles size distribution
The mean nanoparticle size and size distribution were determined by photon correlation
spectroscopy using a Nanosizer instrument N4MD (Beckman Coultronics, Roissy, France)
which analyses the fluctuation in scattered light intensity generated by diffusion of the
nanoparticles in suspension. Experimental conditions were : temperature, 25°C ; reference
index 90° ; viscosity, 0.899 10 -3 Pa ; refractive index, 1.33.
Long-term stability study
Fifteen mL aliquots of the nanocapsules suspension prepared as described above were
transferred into ampules which were sealed and stored at 4, 25 and 40°C. Every week, an
ampule was opened and the sample pipetted, diluted to the appropriate concentration with
water and the mean size and size distribution were determined.
Zeta potential
The charge of nanocapsules were obtained from the measurement of electrophoretic mobility
by laser Doppler velocimetry with a Coulter Zetameter Delsa 440 SX. The operating principle
is based on the Doppler shift induced by the movement of particles across interference fringes
which are produced by the intersection of two laser beam. The nanocapsules were suspended
in 10 -3 M KCl and measurements were made at 25°C.
Vitamin A content
The vitamin A content of the nanocapsules was analyzed using HPLC as described above,
after dissolution of the nanoparticles in acetonitrile. Encapsulation efficiency (percent) was
estimated from the drug content found in the nanocapsules and the initial drug content added
in the formulations.
Preparation of aqueous gels
168
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For the Rameb/PVA gel, we prepared an aqueous solution of the Rameb/PVA complex as
previously described [7], with initial concentrations of 40 mM and 400 mM for PVA and
Rameb respectively, reaching up to 9 mg/mL PVA. The solution was then diluted to obtain

1mg/mL PVA and 1.8% w/w Natrosol ® (hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was
added to form the gel. For the nanocapsules gel, 1.8% w/w Natrosol ® was added to a solution
containing 0.97 mg/mL PVA.
Skin penetration study
169
169
This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main barrier
function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny layer,
made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller scale, by
the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore, as described in the
litterature we chose to remove the hypodermis (fat) and dermis because those thick layers
would stored the PVA and prevent us from having detectable amount in the receptor liquid.
The purpose of this work is to determine the amount of vitamin A propionate which
penetrates into the different layers of the skin, from our PVA-loaded nanospheres aqueous gel
and a reference gel. We used a device containing 15 Franz-type cells (surface 2 cm 2 , receptor
liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic bath. The receptor liquid contains phosphate
buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1% w/w, ethanol
(20%v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether, polyethylated
hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each cell, exactly 1g
of gel was deposited (8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the nanocapsules gel) and
covered with Parafilm ® . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess gel on the
surface was removed and the skins were treated as such: the stratum corneum was collected
by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm 2 , time 12 sec., D’Squam ® , Eviderm
corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2
hours agitation, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the epidermis, the PVA was
extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours agitation, filtered ( 0.22 µm)
then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly by HPLC. The gels were
submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL were sampled and sonicated
in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix, then filtered on 0.22µm filter.
A sample of each gel was kept to be assayed in time and determine long term stability of PVA
in the gels. The percentage of initial amount of PVA that has passed is calculated from the
concentration found in each layer. The results of the PVA assays were statistically analyzed
using the StatAdvisor Software. This procedure uses a multifactor analysis of variance. The
F-Test in the Anova table allows to identify the significant factors and for each one, the

Multiple Range Test determine which means are significantly different from which other and
which Confidence Interval must be applied to this conclusion.
Results and discussion
Characterization of Chol-βCD-Ac
During the development of the synthesis of Chol-βCD-Ac, it was noticed that the percentage
of acetylation depends on the duration time of the acetylation reaction. Since each
cyclodextrin contains 20 hydroxyls (one is taken by the liaison with cholesterol) susceptible to
be acetylated, Mass Spectrometry can indicate exactly how many acetyls are present on each
species and the percentage of each species in the mixture (Fig. 3). The mass spectra reflect the
average distribution of the acetyl groups in all individual units of the Chol-βCD-Ac molecule.
With a reaction time of 8 h, no peracylated compound is formed and the three major
compound are the 14, 15 and 16 acetyls compounds. With 24 h reaction time, a few
peracetylated compounds is formed and the three major compounds are the 16, 17 and 18
acetyls compounds. Finally, with a reaction time of 72 h, the majority of the species formed
are peracetylated (72 %), 19-acetylaed (18%) and 18-acetylated (9%). The different batches
were used to determine the feasibility of nanoparticles. In all cases it was possible to form
blank nanospheres without surfactant. The nanospheres obtained showed a large distribution
of size (50-500nm).Their stability seemed to depend upon the percentage of acetylation and
the presence of some free hydroxyls seemed to be required to stabilize the nanoparticles. This
phenomenon has already been observed with “skirt-shaped” cyclodextrins [8,9]. The more
rapid sedimentation was observed when peracetylated Chol-βCD-Ac was used. Therefore it
was
170
170

a)
Fig 3. Mass spectrograms of acetylated species obtained by acetylation of Chol-βCD
after a) 8h reactin time b) 72 h reaction time.
decided that all following experiments would use only batches containing no peracetylated
species i.e with acetylation time reaction of 8 h.
NMR analysis was performed in d6-dmso since Chol-βCD-Ac is insoluble in water and
demonstrated that the purified final samples were free of any included by-product of reagent.
The monosubstitution by cholesteryl derivative and the yield of acetylation have been
confirmed by digital integration of the NMR spectra arising from cholesterol, cyclodextrin and
acetyl moieties. The identification of most of the proton signal was derivated from
comparison of the proton signals of , already characterized [2]
Chol-βCD-Ac is highly soluble in acetone, dmso, ether but completely insoluble in water.
Loaded nanocapsules
The general preparation procedure described above allowed us to produce nanoparticles with
high reproducibility from batch to batch. Before choosing the more suitable formulation for
the loaded nanocapsules, many were tested, regarding the size of the formed particles. A few
examples are presented in Table I.
171
171
Formulation surfactant (mg) Chol-βCD-Ac
PVA size (nm)
A 10
(mg)
0 7.5 146 ± 78
b)

B 10 15 0 105 ± 34
C 10 15 7.5 117 ± 43
D 10 15 30 145 ± 55
E 10 30 30 121 ± 33
F 10 30 26.25 131 ± 41
G 15 15 7.5 131 ± 34
H 15 15 15 121 ± 59
I 15 15 30 131 ± 39
Table I : composition and size measurement of preliminary formulations
Since the determination of the feasibility of nanoparticles with Chol-βCD-Ac proved that
nanoparticles without surfactants exhibit a poor stability, 10 or 15 mg surfactants were used
for the preparation of loaded nanocapsules. With the stabilizing effect of the surfactant, we
were able to form 100 nm diameter nanocapsules with low degree of polydispersity. A-D
formulations showed rapid sedimentation (inf. 4 days) and size increased due to the
aggregation of the particles. Formulations E-I exhibited a mean diameter of around 130 nm, a
low degree of polydispersity and a spherical shape of nanocapsules visualized by transmission
electronic microscopy. We chose to use formulations similar to G, H and I (15 mg CD and 15
mg surfactant) to investigate the drug loading ability of our carrier. Results are presented in
Table II.
Formulation Initial drug
content* (mg)
Chol-βCD-
Ac content
(mg)
172
172
drug loading
(µg/mg CD)
encapsulation
%
mean
diameter
(nm) ± SD
F0 7.33 0 2.45 132 ± 36
F1 7.33 15 150 30 102 ± 37
F2 14.66 15 168 17 107 ± 42
F3 18.3 15 270 22 112 ± 27
F4 22 15 306 20.8 159 ± 83
F5 25.6 15 300 17.5 109 ± 23
F6 29.3 15 480 24.5 124 ± 49
F7 33 15 564 25.6 129 ± 56
F8 36.6 15 600 24.6 141 ± 61

*always for 15 mg surfactant
Table II : Chol-βCD-Ac nanocapsules loaded with vitamin A propionate
Table II shows the influence of the initial content of PVA added in the organic phase. As the
initial amount of PVA increases, the drug loading increase as well, indicating high loading
possibilities for this type of carrier. However, the encapsulation efficiency of the cyclodextrin
does not increase with the concentration of PVA. This phenomenon has already been observed
for nanospheres [10]. The authors indicated that the encapsulation efficiency increase with the
concentration of the drug , reaches a maximum then decreases. In the case of PVA the
maximum encapsulation is obtained with a small quantity, 7.5 mg, and further increase in the
concentration of PVA With respect to particle size measured by the photon correlation
spectroscopy, no significant differences were observed for the above mentioned formulations.
The mean diameter of around 130 nm, the low degree of polydispersity and the spherical
shape of the cyclodextrins nanocapsules were also visualized by transmission electron
microscopy (Fig. 4). The mean diameter of the nanocapsules is very close for all formulations
and therefore independent of the concentration of PVA.
Fig 4. Electron microscopy of a water dropplet containing PVA-loaded nanocapsules
of βCholAc.
173
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These results suggest that the external layer of Chol-βCD-Ac is very rigid and do not allow
any swelling of the PVA core. This is probably a consequence of the rigidity of the Chol-
βCD-Ac which was synthetized without a spacer between the cholesterol and the CD.
In the F0 formulation, no CD was used and the nanoparticles formed are made only of PVA
and surfactant. The formation of nanoparticles of PVA alone can also be achieved very easily,
but the nanoparticles tend to aggregates and a water/oil phase separation rapidly occurs. When
using surfactant, the stability of the suspension can be improved by the formation of mixed
micelles but the chemical stability of the PVA is rapidly lost and degradation is caused by
light and oxydation.
The chemical integrity of the PVA in the nanocapsules could not be followed by 1 H NMR
since the signals of the PVA are mostly covered by those of the cyclodextrin. Hence, we used
HPLC, and chromatograms obtain by dilution of 7 days old nanocapsules in acetonitril
showed the same peaks as the chromatogram of fresh PVA alone in acetonitril. Some smaller
peaks precede that of PVA and represent vitamin A alcohol and by-products present in the
commercial form we used (data not shown).
The zeta potential is related to the charge on the surface of the particles, and so influences the
properties of the particles, like aggregation or distribution in biological media. The zeta
potential of the nanocapsules without surfactant approches zero. Such dispersions are not
electronically stable and tend to aggregate, as reported above. All loaded nanocapsules
formulations, containing the same concentration of surfactant, exhibit quite the same zeta
potential (- 25 ± 5 mV) indicating that it is most probably located at the surface of the
nanocapsule and must interact with the CD molecules. The negative charge at the surface of
the nanocapsules results in strong repulsion one to another and therefore a stable suspension is
obtained.
Since the cholesterol moiety is the more hydrophobic part of the Chol-βCD-Ac, it is probably
oriented towards the oil that constitutes the inner part of the nanocapsules, while the CD
moiety interacted with the external aqueous phase. The Chol-βCD-Ac molecules must
constitute a single layer around the oil dropplet, like a wall, since no swelling of the
nanocapsules was observed when the concentration of CD was increased.
Stability
174
174
Long term stability study indicated that nanocapsules could be conserved for 4 months at 25
and 37°C without any change in their diameter or polydispersity index.

Skin penetration studies
We described in previous papers [7,11] the use of the Rameb/PVA complex to form an
aqueous gel and the resulting concentration of PVA and Rameb in the skin following 24h
contact. Since we know the Rameb/PVA gel allow higher penetration of PVA in the skin,
compared to a reference aqueous gel of PVA alone, we choose to use it as reference in this
particular experiment. Batch F8 was chosen to form an aqueous gel because of its high drug
loading. The concentration of PVA in the F8 solution being 0.97 mg/mL, and that of the
Rameb/PVA solution being 9 mg/mL, the latter was diluted to obtain the same concentration
of PVA in the two gels.
Results of the PVA assays in stratum corneum, epidermis and receptor liquid are presented in
Table III, and expressed as % of initial amount of PVA recovered in each layer.
cell number SC Epiderme LR
1 0,278 ND 0,007
3 1,222 0,091 0,051
5 0,407 0,022 0,006
Rameb/PVA 7 0,356 0,028 0,007
gel 9 0,333 0,026 0,079
11 0,444 0,063 ND
13 0,422 0,036 0,047
15 0,444 0,089 0,009
mean 0,488 0,051 0,029
deviation 0,302 0,030 0,029
2 0,240 0,130 0,021
4 0,560 0,130 ND
nanocapsule 6 0,234 0,098 0,021
gel 8 0,204 0,085 0,029
10 0,270 0,090 0,055
12 0,200 0,070 0,034
14 0,190 0,066 0,025
ND = not determined
175
175
mean 0,271 0,096 0,031
deviation 0,130 0,026 0,013
Table III : Results of the PVA assays in stratum corneum, epidermis and receptor expressed
as % of initial amount of PVA recovered in each layer.

The results, after statistical analysis indicate that there is no meaningful difference between
the two gels, when regarding all compartments together. However, statistically different
results appear when regarding the stratum corneum alone and the epidermis alone. In the
stratum corneum (upper layer), the amount of PVA is significantly higher when using the
Rameb/PVA gel whereas in the epidermis the amount of PVA is significantly higher when
using the PVA-loaded nanocapsules. As a consequence, and based on one experiment only, it
is not possible to determine if one gel induce a greater penetration. But, since we found
different amount of PVA in different layers after 24 h, we can suppose that the difference in
the nature itself of the interaction between PVA and cyclodextrins in the two gels induce a
different rate of permeation in the skin. Indeed, in the Rameb /PVA complex, we are dealing
with direct inclusion and a molecular carrier but in the case of the nanocapsules, the PVA is
stored in the core of the nanocapsules wich represents a particle-like carrier.
Conclusion
Chol-βCD-Ac were proved suitable for the manufacture of nanospheres and nanocapsules.
The oily nature of vitamin A propionate leads to the formation of nanocapsules where PVA
represents the core and Chol-βCD-Ac is located at the surface of the dropplet and represents
an external monolayer which interacts with the surfactant to improve the stability of the
nanocapsules. A reproductible size distribution was obtained, along with long term stability.
The aqueous suspension can be used to form a gel which allow to achieve good penetration, in
the skin, of the PVA encapsulated. Since we know CD in general are able to penetrate in the
skin, investigations should be performed regarding the amount of Chol-βCD-Ac that reach
the different skin layers. Production of specific antibodies directed against this particular
cyclodextrin is presently underways and will allow us to perform enzymatic immunoassays on
skin samples.
176
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References
177
177
1- Duchêne, D., Ponchel, G. & Wouessidjewe, D. (1999). Cyclodextrins in targeting -
Application to nanoparticles. Advanced Drug Delivery Reviews 36, 29-40.
2- Auzely-Velty, R., Perly, B., O.Taché, Zemb, T., Jéan, P., Guénot, P., Dalbiez, J.-P.
& Djedainï-Pilard, F. (1999). Cholesteryl-cyclodextrins: synthesis and insertion into
membranes. Carbohydrates Research 318, 82-90.
3- Auzely-Velty, R., Djedaini-Pilard, F., Désert, S., Perly, B. & Zemb, T. (2000).
Micellization of hydrophobically modified cyclodextrins. 1.Micellar structure. Langmuir 45.
4- Auzely-Velty, R., Péan, C., Djedainï-Pilard, F., Zemb, T. & Perly, B. (2001).
Micellization of hydrophobically modified cyclodextrins. 2. Inclusion of guest molecules.
Langmuir 17, 504-510.
5- Skiba, M., Wouessidjewe, D., Coleman, A., Fessi, H., Devissaguet, J.-P., Duchêne,
D. & Puisieux, F. (1993). Préparation et utilisation de nouveaux systèmes colloîdaux
dispersibles à base de cyclodextrine, sous formes de nanosphères. FR-93/00594.
6- Skiba, M., Nemati, F., Puisieux, F., Duchêne, D. & Wouessidjewe, D. (1996b).
Spontaneous formation of drug-containing amphiphilic b-cyclodextrin nanocapsules. Int. J.
Pharm. 145, 241-245.
7- Weisse, S., Perly, B., Dalbiez, J.-P., Baraton-Ouvrard, F., Archambault, J.-C.,
André, P., Rollin, P. & Djedaïni-Pilard, F. (2002a). New aqueous gel based on soluble
cyclodextrin/vitamin A inclusion complex. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic
Chemistry(special issue Int. Symp. Cyclodextrins. 2002).
8- Zhang, P., Parrot-Lopez, H., Tchoreloff, P., Bazkin, A., Ling, C. C., deRango, C. &
Coleman, A. W. (1992). Self organizing systems based on amphiphic cyclodextrin diesters. J.
Phys. Org. Chem. 5, 518-528.
9- Wouessidjewe, D., Skiba, M., Leroy-Lechat, F., Lemos-Senna, E., Puisieux, F. &
Duchêne, D. (1996). A new concept in drug delivery based on "skirt-shaped cyclodextrin
aggregates"
Present states and future prospects. STP Pharma 6(1), 21-28.
10- Lemos-Senna, E., Wouessidjewe, D., Lesieur, S., Puisieux, F., Couarraze, G. &
Duchêne, D. (1998b). Evaluation of the hydrophobic drug loading characteristics in
nanoprecipitated amphiphilic nanospheres. Pharm. Dev. Technol. 3, 85-94.
11- Weisse, S., Archambault, J.-C., Ouvrard-Baraton, F. & Djedaïni-Pilard, F.
(2002b). Utilisation cosmétique de la vitamine A ou de ses esters, en association avec une bcyclodextrine
diméthylée. FR 02.01241.

178
178
3.2.3 DISCUSSION

3.3.3 DISCUSSION
179
179
Il semble nécessaire de resituer le premier article de ce chapitre par rapport à la ligne
directrice de ce travail de thèse. Le travail effectué avec la Chol-Dimeb s’intègre dans une
démarche plus fondamentale visant à mieux comprendre les mécanismes d’interactions des
cholestéryl-CD avec des membranes biologiques modèles à l’aide de méthodes physiques.
Cette étude nous a paru nécessaire afin d’essayer de mieux comprendre les différentes
interactions impliquant le trio hôte/invité/membrane. Même si les résultats obtenus sont
encore préliminaires, ils nous permettent de mieux appréhender la structure chimique des CD
capables de s’insérer dans des systèmes organisés (en particulier du point de vue de la balance
hydrophile/hydrophibe). Le travail effectué en utilisant les films noirs nous apprend qu’une
cyclodextrine particulière, la Chol-Dimeb, peut s’insérer dans des films phopholipidiques par
sa partie cholestérol. Cette propriété doit être reliée à la présence du bras espaceur succinique
entre le cholestérol et la Dimeb. En effet, il en résulte une certaine souplesse de la molécule
qui permet d’adapter la position du cholestérol (rotation, fermeture ou ouverture de l’angle de
liaison) à son environnement. Dans ce cas précis, on note que l’épaisseur d’un film de DMPC
augmente avec l’ajout de Chol-Dimeb, en passant par un maximum pour un rapport
DMPC/Chol-Dimeb de 3. Cela signifie qu’il y a réarrangement moléculaire au fur et à mesure
de l’ajout de Chol-Dimeb. Les molécules de DMPC s’arrangent autour du cholestérol de
façon différente en fonction de la quantité de Chol-Dimeb et profitent donc de la souplesse de
ce dernier. La partie cyclodextrine de la Chol-Dimeb est exposée au milieu aqueux, d’abord
dans la solution puis dans le film noir, et reste ouverte à l’inclusion d’une molécule hôte. Le
PVA n’a pas été utilisé dans ces essais car son inclusion dans la Chol-Dimeb n’a pu être
démontré, à cause de son insolubilité dans l’eau.
Ces résultats ne sont bien sur pas transposables à la Chol-βCD-Ac dont les propriétés
physico-chimiques sont très différentes. Toutefois ils permettent de supposer que la partie CD
de la molécule gardera une préférence pour le milieux aqueux et qu’à l’interface phase
hydrophile/phase hydrophobe ces molécules s’orienteront de manière à présenter le
cholestérol à la phase hydrophe. Il s’agit d’un résultat bien connu avec les CD amphiphiles

mais que l’on peut effectivement visualiser et mettre à profit dans le cas des films noirs de
Chol-Dimeb.
180
180
La Chol-βCD-Ac est une molécule rigide, car ne possédant pas de bras espaceur, et
absolument insoluble dans l’eau. Comme beaucoup de molécules possédant une partie
hydrophobe et une partie hydrophile, elle s’est révélée parfaitement apte à former des
nanosphères et des nanocapsules. Ces agrégats sont toutefois peu stables en solution et
sédimentent rapidement. Cela est du au fait qu’ils ont une charge de surface quasiment nulle
et ne provoquent donc pas de répulsion électrostatique. Il a donc été nécessaire d’ajouter un
tensioactif afin d’obtenir une bonne stabilité en solution. Par la suite, c’est la nature huileuse
du PVA qui a imposé le choix du vecteur à utiliser. En effet, les premiers essais ont révélé
qu’il était impossible de former des nanosphères chargées en PVA. Par contre, des
nanocapsules remplies de PVA sont obtenues facilement et présentent un diamètre moyen
d’environ 130 nm avec une faible polydispersité. Connaissant les affinités respectives de la
partie cyclodextrine et de la partie cholestérol, il semble raisonnable de penser que la Chol-
βCD-Ac se situe à l’interface eau/huile avec les têtes-cholestérol dirigées à l’intérieur de la
gouttelette d’huile. Le tensio-actif se situe aussi à l’interface eau/huile, comme indiqué par la
chute de potentiel zéta qu’il provoque. Grâce à la formation de ces nanocapsules chargées, on
obtient une suspension aqueuse de PVA dont la concentration peut atteindre 1mg/mL. Ce
chiffre est inférieur à la quantité de PVA que l’on peut solubiliser avec le complexe
Rameb/PVA, mais il est possible que nous n’ayons pas encore atteint la limite en terme de
formulation des nanosphères et une concentration de 1mg/mL permet néanmoins de passer à
l’application biologique. En effet, la limite de détection du dosage par HPLC du PVA (0.1
ppm) impose de faire des essais avec une concentration initiale suffisante. Le dosage du PVA
dans les couches cutanées, après application d’un gel aqueux contenant la suspension de
nanocapsules, démontre que ce vecteur est au moins aussi efficace que le gel à base de
Rameb/PVA pour améliorer la pénétration du PVA dans la peau. Ces deux vecteurs sont
pourtant fondamentalement différents quant à leur nature puisque l’un présente le PVA sous
une forme moléculaire alors que le second amène le PVA sous forme particulaire. Bien
qu’une seule expérience de pénétration sur peau aie été effectuée avec les nanocapsules et ne
nous permette pas d’être catégorique, il semble que ces 2 vecteurs aient néanmoins des
cinétiques de pénétration différentes. En effet, bien que la quantité de PVA totale retrouvée
dans la peau ne soit pas significativement différente dans les 2 cas, il existe des différences
significatives lorsque l’on regarde chaque compartiment séparément. La nature du vecteur
influe donc sur la pénétration du PVA, probablement à la fois sur la vitesse de diffusion dans

la couche aqueuse de surface, et au niveau du passage des couches lipophiles et hydrophiles
alternées de l’épiderme.
Un certain nombre d’investigations restent à mener sur ces nanocapsules chargées en
PVA. Tout d’abord concernant la reproductibilité des résultats de pénétration sur peau
obtenus, d’autres expériences sont nécessaires afin de déterminer clairement les différences de
cinétique pouvant exister par rapport au complexe Rameb/PVA et afin d’établir le profil de
pénétration du PVA.
La stabilité à long terme et l’intégrité chimique du PVA dans les nanocapsules doivent
être confirmées, soit en séparant par chromatographie liquide le PVA de la Rameb avant
analyse RMN pour pouvoir visualiser les signaux du PVA, soit par spectrométrie de masse.
Le dosage des Chol-βCD-Ac dans les échantillons biologiques, dont le principe sera plus
longuement détaillé dans la conclusion, permettrait de connaître le comportement de ce
vecteur par rapport aux membranes biologiques. D’autres principes actifs doivent aussi être
testés pour évaluer l’intérêt général des nanoparticules de Chol-βCD-Ac dans le domaine de la
vectorisation.
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CONCLUSION GENERALE

CONCLUSION GENERALE
Au cours de cette étude, de nombreuses techniques ont été utilisées, de nouvelles formes
galéniques de vitamine A mises au point, de nouvelles molécules créées et certaines questions
ont pu trouver leur réponse.
L’objectif de ce travail était de se servir des cyclodextrines, molécules cages dont les
propriétés ne se limitent pas à l’inclusion de molécules hôtes, afin de :
- stabiliser la vitamine A vis à vis de la dégradation par l'oxygène, la température et
surtout la lumière.
- de former un composé hydrosoluble permettant de disposer de nouvelles formulations.
- de s’assurer que le principe actif soit dirigé et reste dans les strates de la peau où
son action sera optimale.
En ce sens, nous pouvons affirmer que l’objectif principal a été atteint.
Après avoir essayer les cyclodextrines naturelles sans obtenir d’augmentation de la
solubilité aqueuse du PVA, l’utilisation de la Rameb nous a permis d’obtenir un complexe
hydrosoluble, de stoechiométrie 1/1 et parfaitement caractérisé par RMN et HPLC. En
déterminant les conditions optimales de préparation, nous avons pu obtenir une solution
aqueuse contenant jusqu’à 9 mg/mL de propionate de vitamine A. La stabilité du PVA dans
cette formulation a été établie sous forme aqueuse et lyophilisée et si elle n’atteint que 15
jours dans le premier cas, elle peut atteindre 6 mois dans le second et ceci dans les pires
conditions de stockage (à la lumière, à 25 °C).
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L’obtention de cette solution de propionate de vitamine A a permis de développer un
gel aqueux contenant en moyenne 0.8% de PVA et 50% de Rameb. Ce pourcentage de PVA
semble ridiculement faible par rapport à celui de la Rameb mais c’est dans cette zone de
concentration que la vitamine A est thérapeutiquement active au niveau cutané. Afin de
déterminer si cette nouvelle formulation aqueuse pouvait améliorer la pénétration du PVA
dans la peau, nous avons testé notre gel contre des formulations de référence sur des
échantillons de peau, en utilisant des cellules de Franz.
Les résultats ont montré que la formulation contenant le PVA sous forme de complexe
permettait une augmentation significative de la quantité de PVA retrouvée dans la peau par

apport aux formulations de référence. La peau étant l’organe cible, nous avons donc amélioré
la biodisponibilité du PVA, et ceci grâce à un procédé de préparation simple et économique.
Mais le PVA n’est pas la seule espèce dont nous avons pu suivre le cheminement au
travers de la peau. Grâce à des anticorps dirigés spécifiquement contre la Dimeb, nous avons
pu déterminer la quantité de Rameb dans les différentes couches cutanées par dosage
immuno-enzymatique. Les études de pénétration sur peau présentent donc un double intérêt
puisque le comportement des CD dans la peau est encore loin d’être parfaitement décrit et
expliqué. On savait déjà que les CD pénétraient de façon non négligeable dans la peau, malgré
leur haut poids moléculaire. Pour certaines CD cela se fait grâce à leur propriété à inclure
certains constituants des membranes phospholipidiques et pour d’autres c’est leur nature
amphiphile qui favorise la pénétration.
De nombreux éléments recueillis au cours de cette étude nous permettent de penser
que le complexe d’inclusion formé permet de faciliter la diffusion du PVA dans la couche
aqueuse en surface de la peau et d’amener une plus grande quantité en contact avec les
couches superficielles de l’épiderme. En effet, nous avons montré que l’effet promoteur
d’absorption de la Rameb n’existe que si le complexe se forme avec le PVA et n’est pas du à
la seule présence de la Rameb dans la forme galénique. De plus, il faut impérativement que le
complexe soit soluble. Une fois dans les couches superficielles de l’épiderme, il semblerait
que la Rameb et le PVA se séparent. En effet, le rapport des concentrations de Rameb et de
PVA, fixe dans le gel, subit d’importantes variations dans l’épiderme et les couches plus
profondes. La Rameb semble ensuite diffuser facilement dans le derme, couche hydrophile, et
au-delà, alors que celui-ci représente un organe de stockage et de métabolisation pour le PVA.
Malheureusement, les outils nous manquent à l’heure actuelle pour déterminer plus
précisément le comportement exact du complexe dans la peau. Cela nécessiterait en effet de
trouver une méthode de dosage différenciant le complexe entier de la Rameb, une fois dans la
peau.
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Dans le but d’explorer d’autres propriétés des cyclodextrines en général, nous avons
synthétisé un dérivé de cholestéryl-cyclodextrine, la Chol-βCD-Ac, aux propriétés très
différentes de celles de la Rameb, et à partir duquel il est possible de former des
nanoparticules. L’incorporation de PVA dans des nanocapsules à base de Chol-βCD-Ac s’est
avérée efficace grâce à la nature huileuse du PVA et a ensuite permis de préparer une
suspension aqueuse pouvant contenir jusqu’à 1 mg/mL de PVA. L’étude de la stabilité de la

suspension ne montre aucun signe de sédimentation après 4 mois à température ambiante. Il
est à noter que la présence de quelques hydroxyles libres semble favoriser la stabilité de la
suspension suggérant de possibles interactions des têtes cyclodextrines entre elles.
Nous avons alors pu formuler un gel aqueux à partir de cette suspension de nanocapsules et
tester son efficacité en terme de pénétration de PVA, par rapport au gel contenant le complexe
Rameb/PVA.
Deux objectifs étaient attachés à cette étude.
Tout d’abord évaluer l’intérêt des nanocapsules de Chol-βCD-Ac par rapport au complexe
Rameb/PVA. A ce niveau, une seule expérience n’offre aucune réponse définitive mais nous
permet d’observer que si la quantité totale de PVA retrouvée est très proche, la cinétique de
pénétration impliquée est probablement différente.
Le second objectif était de déterminer le comportement de la Chol-βCD-Ac dans la peau. En
effet, elle possède des propriétés différentes de celles de la Rameb et il est intéressant de
savoir si ses possibles interactions avec les membranes lui confèrent un passage transcutané
différent.
Toutefois, les outils nécessaires pour doser la Chol-βCD-Ac dans nos échantillons
biologiques n’existent pas encore. En effet, les anticorps anti-Chol-βCD-Ac sont actuellement
en cours de production au Service de Pharmacologie et d’Immunologie au CEA Saclay. Pour
cela, nous avons synthétisé et caractérisé l’haptène destiné à être injecté chez le lapin pour
produire la synthèse des anticorps. Cet haptène est l’heptakis(2,3-O-diacétyl)hexakis(6-O-
acétyl)6-monoamino-6-desoxycyclomaltoheptaose.
La suite de ce travail consiste donc à répéter les études de pénétration sur peau effectuées avec
les nanoparticules de Chol-βCD-Ac chargées en PVA afin de doser la Chol-βCD-Ac dans les
échantillons biologiques et d ‘établir le rôle de la modification chimique de la cyclodextrine et
de la forme particulaire sur le comportement de la Chol-βCD-Ac dans la peau.
Par la suite, nous pouvons envisager d’appliquer les résultats obtenus à l’amélioration de
l’utilisation par voie topique d’autres principes actifs à visée thérapeutique cutanée.
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ANNEXES

ANNEXE 1 : LA PEAU
La peau, organe complexe, le plus étendu (2 m 2 ) du corps humain et le plus important en
contact avec le milieu extérieur, est une enveloppe de recouvrement qui protège l’individu et
permet sa survie. Anatomiquement, elle est constituée de différentes couches superposées les
unes sur les autres, l’épiderme et le derme reposant sur une couche graisseuse, l’hypoderme.
Les recherches effectuées durant les 20 dernières années dans les domaines de la dermatologie
et de la biologie cutanée ont profondément enrichi les connaissances sur ses mécanismes
physiologiques et modifié la perception de cet organe. La peau est la première ligne de
défense vis-à-vis du monde extérieur mais permet en même temps d’entretenir des relations
avec celui-ci. Son intégrité est nécessaire à la vie tant pour son incidence sur la santé de
l’individu que pour son bien-être. Outre sa fonction barrière, la peau est aussi le siège du
toucher et possède un rôle de synthèse (vitamine D2), d’élimination (principalement fer et
cholestérol par la sueur, le sébum, les poils et les cellules desquamantes) et d’échanges
thermiques et gazeux.
La fonction barrière de la peau est assurée par l’épiderme, continu, souple, fin mais
imperméable et plus particulièrement par la couche cornée ou stratum cornéum qui est la
couche la plus externe. Cette dernière est un « parapluie » qui limite l’entrée des agents
extérieurs tout en participant à l’homéostasie générale de l’organisme en régulant la perte en
eau. C’est aussi une « ombrelle » protégeant du soleil et se modifiant à son contact. Cette
barrière toutefois n’est pas absolue, elle est perméable à pratiquement toutes les substances,
seul le degré de perméabilité varie. Il est lié à l’état physiologique de la peau et aux propriétés
physico-chimique du composé qu’elle est censée restreindre. Notons que la peau protège aussi
contre les traumatismes, mais dans cette fonction « bouclier » l’épiderme intervient peu. En
revanche, l’hypoderme amortit les chocs grâce à l’élasticité de son tissu graisseux et le derme
assure la solidité grâce à ses fibres.
Formation de la peau pendant la grossesse
L’œuf, dès sa fécondation évolue très vite. Rapidement le fœtus est constitué de trois
couches – ou feuillets – plus ou moins concentriques : l’ectoderme qui donnera l’épiderme et
le système nerveux ; le mésoderme qui formera le derme, l’hypoderme et tout le tissu
conjonctif, les os, les articulations, les muscles et la plupart des viscères ; et l’endoderme,
futur tube digestif.
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L’épiderme n’est constitué au début que d’une couche de cellules mais très vite d’autres
surviennent qui forment autant de strates. Par ailleurs, sur sa face profonde des bourgeons
apparaissent ; ils s’enfoncent dans la profondeur dermique et sont à l’origine des glandes
sudorales, des poils, des cheveux ainsi que des glandes sébacées et des ongles. Le derme se
développe sous l’épiderme avec l’apparition de nombreuses cellules, fibres, vaisseaux et nerfs
qui lui donneront ses caractéristiques ultérieures. L’hypoderme se constitue au-dessous ; il est
surtout formé de cellules adipeuses
1. Structure de la peau
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Figure 24 : représentation d’une coupe de peau

Figure 25 : coupe histologique de la peau humaine (coloration hématoxyline éosine)
(×200)
1.1 L’épiderme
L’épiderme ne comporte pas de vaisseaux, éventuellement quelques petites fibres
nerveuses, mais il est essentiellement constitué de cellules qui sont de trois natures
principales : les kératinocytes, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Son épaisseur
varie largement en fonction du site anatomique ; la moyenne est de 40-50 µm mais elle
augmente jusqu’à 80µm sur le poignet et le dos de la main et jusqu’à 400µm au bout des
doigts.
1.1.1 Les kératinocytes
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Les kératinocytes représente 90% des cellules de l’épiderme. Ils existent dans toutes les
couches superposées de l’épiderme mais selon les strates sont sensiblement différents. Dans la
couche inférieure, dite assise basale ou stratum basale, ils ont un grand axe vertical. C’est
dans cette couche, et dans cette couche seulement à l’état normal, qu’ils se divisent. Le
nombre de cellules dans cette couche s’accroissant, certaines sont expulsées vers la couche
supérieure comme peut l’être le noyau d’une cerise pressée entre les doigts. Mais lorsqu’une
cellule monte d’un cran, une autre doit être expulsée vers la troisième couche, etc. Ainsi
progressivement les cellules montent vers la surface et au fur et à mesure de leur progression
elles se modifient. De verticales, elles tendent à devenir horizontales et leur constitution
change fortement : une protéine apparaît progressivement ; d’abord amorphe et appelée
kératohyaline, elle devient rapidement fibreuse et forme donc des brins allongés. Ceux-ci
passent d’une cellule à l’autre : c’est la kératine – ici kératine molle - protéine qui est très
riche en acides aminés soufrés (cystine, cystéine, méthionine). Mais parallèlement le noyau
des cellules s’altère puis disparaît. Les strates supérieures, ou couche cornée ou stratum
corneum, sont donc constituées de cellules mortes, entièrement kératinisées et dénuées de
noyaux, séparées les unes des autres par des lipides : les membranes cellulaires. De ce fait, on
compare souvent la structure de la couche cornée à celle d’un mur dont les briques sont
séparées par le mortier. Plus en surface encore les cellules perdent leur adhérence les unes aux
autres ; elles deviennent ainsi écailleuses puis se séparent et tombent à l’extérieur : c’est la
desquamation. Ces couches desquamantes superficielles joue évidemment un rôle moins
important dans la fonction barrière.
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Nous allons nous attarder plus longuement sur la couche cornée ou stratum cornéum
(SC) car son rôle de barrière mais aussi de réservoir est essentiel.
Le mur de brique, cette représentation shématique et statique de la couche cornée, bien
que toujours pertinente, a été quelque peu enrichie. En effet, Rawling [Rawling, 1994] et ses
collaborateurs ont proposé l’existence de molécules actives du point de vue osmotique au
niveau des cornéocytes (kératinocytes de la couche cornée), permettant aux « briques » d’agir
en fait comme des éponges et de gonfler. La structure apparaîtrait donc plus souple, moins
figée. Comme nous le verrons ensuite, le stratum corneum fonctionne aussi comme un
réservoir vis à vis des molécules qui traversent la peau. Morphologiquement, il comprend un
nombre variable de couches en fonction des individus et du site anatomique. Par exemple, on
trouve environ 15 couches au niveau du dos et de l’abdomen (soit environ 10µm d’épaisseur)
mais presque une centaine au niveau du talon de la plante des pieds. Le fait que le SC soit
constitué de multiples couches est un facteur fondamental en ce qui concerne l’inhibition de

la pénétration de la plupart des substances. En effet, ces couches multiples sont
alternativement lipophiles (membranes et kératine sèche) et hydrophiles (contenu des cellules
i.e « natural moisturizing factors », acides aminés et sucres).
La composition biochimique du SC est très hétérogène avec environ 40% de protéines,
15 à 20%, 20 à 25% de substances hydrosolubles et environ 5 à 10% d’eau.
les protéines : les cornéocytes contiennent une quantité importante de kératines
organisées de façon à donner une structure stable extrêmement résistante et relativement
élastique à la cellule. L’ensemble des kératines constitue 80% de la masse totale sèche des
cornéocytes. De nombreuses autres protéines ont été identifiées comme formant une
enveloppe cornifiée très résistante chimiquement et mécaniquement autour des cornéocytes
(filaggrine, involucrine, cornifine, locirine). Le SC comprend également de nombreuses
enzymes catalytiques responsables des nombreuses modifications biochimique de cette
couche épidermique.
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les lipides : il existe au moins deux systèmes lipidiques différents dans le SC. Le
premier est responsable de la cohésion et constitué principalement d’acylglycosylcéramides
rattachés aux protéines de la membrane cornifiée des cornéocytes. Le second est responsable
de la fonction barrière et constitue l’espace intercellulaire du SC, i.e un domaine continu ou
baignent les cornéocytes. Cet espace est composé principalement d’un mélange équimolaire
d’acides gras libres, de céramides et de cholestérol organisés en feuillet parallèle à la surface.
Cette composition peut varier avec les individus, l’âge, l’alimentation, les saisons de l’année
et les paramètres de l’environnement. La quantité lipidique intercellulaire varie également en
fonction de la profondeur ; le volume des cornéocytes occupant de moins en moins d’espace
en migrant vers la surface, la surface lipidique devient plus importante mais aussi plus
désordonnée. Le cholestérol qui représente environ 30% des lipides du SC humain pourrait
créer des liaisons covalentes avec l’enveloppe des cornéocytes et induire une certaine
cohésion intercellulaire ; cependant son activité reste très controversée.
l’eau : le SC contient en moyenne 15 à 35% d’eau par rapport à sa masse totale.
Celle-ci serait présente sous forme libre ou plus ou moins liée à des groupements chimiques
pouvant participer à des ponts hydrogènes et donc, logiquement, les propriétés de rétention de
l’eau varie en fonction du type de lipide. Cette eau n’est pas répartie de façon homogène
puisqu’il existe un gradient de concentration de part et d’autre du SC, tant que l’humidité
relative de l’air est inférieure à 100%. L’hydratation des couches cellulaire est plus importante

dans les couches profondes qu’en surface et si le SC contient moins de 10% d’eau, le terme de
déshydratation est employé pour désigner la barrière.
les « natural moisturizing factors » (NMF) : ils représentent 10% du poids sec des
cornéocytes et sont en partie responsables du phénomène complexe et facilement perturbable
qui permet la rétention de l’eau. Le rôle des NMF provient des propriétés physico-chimiques
de ces constituants qui sont hygroscopiques (ac. aminés et dérivés, ac. lactique, urée, sels et
une protéine, la profilaggrine). Ils peuvent donc absorber l’eau atmosphérique et la solubiliser
dans les cornéocytes en jouant le rôle d’humectant. Ainsi ce système permet au SC de
maintenir un niveau d’eau constant au sein des cellules même lorsque les couches
superficielles sont exposées à un environnement sec.
1.1.2 Les mélanocytes
Les mélanocytes sont situés seulement dans la couche basale. Elles sont
particulièrement abondantes sur le visage et les régions génitales mais diminuent avec l’âge
(environ 10% tout les 10 ans). Ces cellules ont une forme étoilée grâce à des prolongements -
les dendrites – qui sont dirigés vers les kératinocytes environnants. Elles fabriquent un
pigment brun ou roux : la mélanine. Ce pigment est à l’état de petits grains – les mélanosomes
– qui se déplacent vers l’extrémité des prolongements cellulaires. Or ces prolongements ont
tendance à pénétrer dans les kératinocytes, et effectivement leur extrémité est absorbée avec
son contenu par les kératinocytes. Ainsi les mélanocytes et les kératinocytes qui lui sont liés –
en général 36 – constituent un ensemble fonctionnel : l’unité épidermique de mélanisation.
1.1.3 Les cellules de Langerhans
Les cellules de Langerhans ont une origine différente : elles proviennent en effet de la
moelle osseuse. Décrites initialement par Langerhans, qui les avait parfaitement dessinées au
siècle dernier, elles sont très difficiles à voir. Leur existence fut donc contestée et même niée
jusqu’à ce qu’elles soient retrouvées de façon indiscutable au microscope électronique dans
les années 1950. Ces cellules constituent environ 7 % des cellules de l’épiderme et sont
situées à tous les niveaux, particulièrement sous la couche cornée, et sont anastomosées entre
elles par des prolongement, d’où leur aspect étoilé. Elles forment donc un réseau situé dans
toute l’épaisseur de l’épiderme et ont la capacité de capter une substance étrangère qui aurait
pénétré : elles sont donc placées aux aguets pour attendre leur proie.
1.2 Le derme et l’hypoderme
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1.2.1 Le derme
Il est placé sous l’épiderme. Sa surface, à la jonction de l’épiderme, est hérissée de
saillies fibreuses, vasculaires et nerveuses en forme de cône à sommet arrondi : les papilles
dermiques. Entre elles, dans les dépressions, l’épiderme envoie des projections qui
s’engrènent au derme. Noyés dans une phase aqueuse amorphe de mucopolysaccharides, le
derme contient divers constituants : fibres, cellules et nerfs.
les fibres : très entremêlées, elles sont bien visibles dans les cuirs animaux mais
donnent aussi sa solidité à la peau humaine. Les plus nombreuses, les fibres collagènes, sont
regroupées en faisceaux onduleux, allongés en tout sens et entrecroisés. D’autres, les fibres
élastiques, sont sinueuses et anastamosées entre elles, constituant ainsi un réseau d’orientation
verticale.
les cellules : elles peuvent être très diverses mais les fibroblastes ou cellules
conjonctives sont presque les seules que l’on retrouve dans le derme normal. Ils ont une forme
étoilée grâce à des prolongements qui les réunissent et servent à laisser sortir leurs sécrétions :
les fibres. Les histiocytes, cellules mobiles, participent quant à eux à la défense de
l’organisme.
les vaisseaux : nombreux mais de petit diamètre, artères, veines et lymphatiques sont
situés sur toute la hauteur du derme mais ne pénètrent pas dans l’épiderme.
les nerfs : ils comportent des filets sensitifs qui sont à l’origine des sensations
provenant de la peau, et des filets sympathiques qui jouent un rôle vasomoteur.
1.2.2 L’hypoderme
L’hypoderme est une couche graisseuse plus ou moins découpée en petits amas, les
lobules graisseux, entre lesquels cheminent les vaisseaux et les nerfs. Elle est destinée à
séparer la peau du muscle
1.3 Les annexes épidermiques
Les annexes épidermiques proviennent de prolongement de l’épiderme qui se sont
enfoncés dans le derme, parfois même dans l’hypoderme.
1.3.1 Les glandes sudoripares
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On distingue 2 types de glandes sudorales : eccrines et apocrines. Les glandes sudorales
eccrines, de beaucoup les plus nombreuses, se trouvent sur l’ensemble du tégument et sont
beaucoup plus abondantes aux paumes, aux plantes, aux aisselles et à la poitrine. Elles

forment un tube dont la paroi est constituée de cellules épithéliales et qui s’enfonce jusque
dans l’hypoderme. Là, il se recroqueville pour former un peloton qui est la zone sécrétrice de
la sueur. Les glandes sudorales apocrines siègent dans des territoires plus restreints (périnée,
régions inguinales, axillaires et mamellonaires). Leur diamètre est beaucoup plus grand que
celui des glandes eccrines et surtout elles n’atteignent pas la surface mais se jettent dans le
follicule pileux, juste au dessus du canal drainant les glandes sébacées dans l’espace situé
autour du poil.
1.3.2 Les follicules pilo-sébacés
Ils comportent les follicules pileux proprement dits, qui fabriquent les poils, et les
glandes sébacées, qui forment le sébum. Au niveau de la racine du poil, celui-ci est adhérent
au follicule alors que plus en surface, le poil tend à s‘isoler et se libère de ses attaches ; un
espace est crée entre lui et la paroi du follicule - l’espace péripilaire – dans lequel se jettent les
canaux excréteurs des glandes sébacées et apocrines. Le poil lui-même est constitué de
kératine, mais une kératine dure - différente de celle de la couche cornée – car sans graisse.
Les glandes sébacées sont placées au milieu du derme et ne comporte aucun canal : il n’y
existe en effet que des cellules qui fabriquent de la graisse dont elles se bourrent en se
déplaçant vers le canal excréteur qui les emmène dans l’espace péripilaire. Ce sont les cellules
sébacées elles même qui sont excrétées et pas seulement leur contenu.
2. Méthodes de mesure de l’absorption cutanée
Définitions préalables
Absorption : prise de substances par un organisme, au sens large.
Pénétration : entrée d’une substance dans un organe ou une couche précise.
Perméation : pénétration à travers une couche et vers une autre couche
différente fonctionnellement et structurellement.
La voie cutanée est très largement utilisée pour l’administration de médicaments. En
effet, elle offre la possibilité de pouvoir cibler les différentes couches de la peau
(administration percutanée) ou bien la voie sanguine pour une administration systémique du
principe actif (voie transcutanée). Le devenir du principe actif dans la peau dépend des
propriétés de celle-ci mais aussi des caractéristiques physico-chimiques du principe actif, de la
forme galénique choisie et des excipients. Il est donc essentiel de pouvoir étudier le devenir
d’une molécule après son application sur la peau. Il existe pour cela plusieurs approches :
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- méthode in vivo chez l’homme
- méthode in vitro chez l’homme
- méthode in vivo chez l’animal
- méthode in vitro chez l’animal
Bien sur, l’approche la plus attractive consiste à faire des expériences in vivo chez
l’homme. Mais le coût, le facteur temps, les connaissances parfois limitées du produit et
surtout les considérations éthiques rendent cette approche très rare. Les études in vitro chez
l’homme sont aussi difficiles à conduire du fait de la rareté de la peau humaine et des
différences que l’on peut observer entre genre, race, âge, site, etc.. Chez l’animal les
expériences in vivo sont tout aussi coûteuses et longues que chez l’homme, ce qui explique
que, au final, la grande majorité des études de perméation sont faîtes in vitro chez l’animal.
Toutefois, les variations de structure et de pilosité de la peau animale, quel que soit l ‘espèce,
font que l’on ne peut espérer les même résultats, en terme de perméabilité, que ceux obtenus
sur peau humaine. Ainsi, aucune conclusion quant à la perméabilité de la peau humaine ne
peut être déduite des résultats obtenus en laboratoire sur l’animal. Bien sur chez certaines
espèces la différence est moins grande et l’on pourra observer des similarités en terme
d’absorption pour certaines substances mais des différences pour d’autres. Avant d’être utilisé
un modèle animal doit donc être validé pour la substance précise à doser.
Une autre voie s’offre aux chercheurs depuis peu : celle des membranes artificielles.
Leur utilisation pour comprendre les aspects mécaniques du processus de capture par la peau
se développe et on retrouve par exemple dans la littérature : Silastic ® (polydimethyl siloxane),
cellulose acétate et polyuréthane. Mais la peau est un organe complexe, multicouches et
hétérogène et les membranes synthétiques utilisées jusqu’à maintenant sont des systèmes
homogènes monocouche. De ce fait toute comparaison doit être prise avec prudence. Une des
utilisations intéressante des membranes artificielles est de différencier les paramètres physico-
chimiques influants la perméation des paramètres biologiques qui eux dépendent de la peau.
Par exemple on peut étudier l’influence de la solubilité du p.a, du coefficient de partition, du
pH…
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Dans la suite de ce chapitre nous nous concentrerons sur les méthodes de mesure pour
les expériences in vitro sur peau humaine, puisque c’est la technique que nous avons
utilisée pour nos gels à base de vitamine A. Le shéma des cellules de Franz, telles que nous
les avons utilisées est présenté à la fin de ce chapitre (Fig. 26).
Les études sur la peau excisée peuvent être conduites pour n’importe quelle substance
pour déterminer sa pénétration, à partir du moment où la méthode de dosage utilisée est assez

sensible. Précisons qu’à ce jour, aucune substance chimiquement définissable ne s’est
montrée absolument incapable de pénétrer dans la peau. Les résultats obtenus sont des
concentrations dans telle ou telle couche mais en aucun cas ne donnent d’information sur la
perméabilité. L’un des grands avantages de cette technique utilisant des morceaux de peau
excisés est que plusieurs expériences peuvent être faite sur le même spécimen (donc même
espèce, genre, âge et site anatomique) et ainsi permettre une comparaison fiable. Ces
expériences sont particulièrement indiquées pour la mesure des paramètres secondaires telle
que l’influence de la forme galénique, de la température, de l’humidité…
Lorsque l’on souhaite étudier la pénétration d’une substance par une technique in vitro,
on peut choisir de mesurer sa concentration dans la peau ou bien la différence entre la
concentration initiale déposée avant et après l’expérience. Toutefois cette dernière approche
concerne de très faibles différences de concentration puisque la peau n’absorbe que de faibles
quantités. La sensibilité de la méthode de dosage doit donc être particulièrement haute ce qui
signifie que la mesure de radioactivité est la méthode de choix pour ces études. La solution la
plus utilisée reste donc de mesurer la concentration dans la peau. La question se pose alors de
choisir sur quelle « peau » faire l’expérience : peau totale (couche cornée + épiderme +
derme), couche cornée seule , couche cornée + épiderme, etc…Il est en effet possible de
séparer chaque couche et d’adapter le support aux résultats attendus. Comme nous l’avons vu
précédemment, c’est l’épiderme qui représente la barrière importante de la peau, tout d’abord
grâce à la barrière que représente la couche cornée et grâce à l’alternance de zones hydrophiles
et lipophiles.
3. Les compartiments de la peau
196
196
Les principes de base de pharmacocinétique furent élaborés par Dost et ses collègues
dans les années 1970. Une tentative a été faite pour appliquer certains de ses principes à la
perméabilité cutanée bien que cela soit très difficile de par la nature complexe de la peau. Le
transport de chaleur, le stockage d’énergie, les fonctions nerveuses, etc. sont autant de
fonctions de la peau qui ne sont pas directement liées à la pénétration de molécules étrangères.
Le cheminement d’un principe actif, appliqué à la surface de la peau, jusqu’à la circulation
sanguine puis son excrétion finale peut être décrit comme un système à plus de 10

compartiments, qui est autrement plus compliqué que celui gérant l’absorption intestinale.
Toutefois, toutes les couches n’ont pas la même importance dans ce processus.
La surface de la peau, ainsi que la substance qui y est appliquée représente le premier
compartiment. Si le principe actif est appliqué seul plutôt que dans un véhicule, alors au
moins une petite partie sera dissoute dans l’eau ou le gras de la peau. Le transfert vers les
couches suivantes, à partir de cette forme solide est un phénomène physico-chimique
mesurable, avec des constantes d’équilibration mesurables et un flux opposé constant. Le
second compartiment représente l’effet de premier passage, caractérisé par l’altération de la
majeure partie du principe actif allant ou sortant de la couche cornée, que ce soit par
décomposition chimique ou par réaction enzymatique ou microbiologique.
La couche cornée, le troisième compartiment, est à la fois une membrane par sa
fonction barrière et un volume par sa fonction réservoir. Dans la peau saine, les constantes de
transfert à partir de ce compartiment (vers l’épiderme, la surface, les glandes sudoripares et les
follicules pileux) sont décisives pour la perméabilité totale. En comparaison, les transferts à
partir de l’épiderme sont rapides. La vitesse de libération à partir du véhicule est souvent bien
plus rapide que la perméation de la couche cornée vers l’épiderme, qui représente donc le
facteur limitant.
Toutes les autres étapes, de l’épiderme vers le derme puis le sang ou l’hypoderme et
finalement les urines se font plus rapidement et toujours avec un flux opposé simultané. A
partie de l’épiderme il y a aussi métabolisation (radiolyse, décomposition chimique ou
microbienne, métabolisme actif ou passif) et liaison dans la peau. Par exemple, pour les
substances lipophiles, le gras de l’hypoderme et des glandes sébacées constitue un large
volume de stockage.
4. Aspects qualitatifs et quantitatifs de l’absorption cutanée
La couche cornée, faite de cornéocytes non-vivants fermement lié et de voies de
transport non perceptibles telles les glandes sébacées et sudoripares, peut être envisagée
comme une membrane passive. La plupart des substances la traverseront proportionnellement
au gradient de concentration entre le coté supérieur et inférieur de la membrane. Ainsi on peut
appliquer la loi de Fick, du moins tant que la concentration en surface est grande et la
concentration dans l’épiderme faible. D’après certains auteurs [Garcia, 2001] les relations
concernant la diffusion à travers la couche cornée peuvent être décrites par la formule
simplifiée : J = (Dm*Km)/Th
197
197

où J est la quantité de substance pénétrant dans la couche cornée
Dm est la vitesse de diffusion à travers la couche cornée
Km est le coefficient de solubilité véhicule-membrane
Th est l’épaisseur de la couche cornée
La plupart des substances peuvent pénétrer très rapidement dans la couche cornée. La
distribution dans cette couche suit une ligne droite sur une courbe semi-logarithmique
exprimant la concentration en fonction de la profondeur, ce qui signifie qu’initialement de
faibles quantités atteignent les couches profondes, alors qu’un excès considérable reste à la
surface et dans les feuillets les plus externes. Il existe donc un gradient de concentration dans
la couche cornée. On considère qu’il existe un réservoir de principe actif tant que la quantité
de principe actif sur ou dans les couches superficielles et intermédiaires du stratum corneum
est supérieure à celle qui est déjà dans les couches profondes du stratum corneum ou dans
l’épiderme. Il faut savoir que la plus grande partie de ce qui a été appliqué sur la peau ne
pénètre pas dans les cellules vivantes de la peau (75% à 99.5%), mais ce surplus est nécessaire
au gradient de concentration.
Pour parvenir à l’épiderme vivant, c’est à dire traverser le SC, une molécule a trois
possibilités. Elle peut diffuser entre les cellules, à travers les cellules ou à travers les follicules
pilo-sébacés ou les glandes sudoripares. L’importance relative de chacune des voies paraît être
influencée par les caractéristiques du produit appliqué et celles de la surface cutanée.
diffusion intracellulaire : autrefois considérée comme la voie majeur, désormais
controversée
diffusion intercellulaire (espaces lipidiques) : voie préférentielle pour de
nombreuses molécules, même polaires comme l’eau. Les modalités de pénétration
restent encore obscures
diffusion à travers les annexes cutanées : bien que la surface couverte par les annexes
cutanées soit inférieur à 1% de la surface cutanée, l’absence de barrière cornée au niveau de
ces annexes favorise l’absorption des molécules. Cette voie interviendrait au cours des
premières minutes de diffusion des molécules plus ou moins polaires. En fait, elle bénéficie
surtout aux molécules de grande taille et de faible polarité pour lesquelles elle est la seule
issue possible.
198
198
Dans l’épiderme, le principe actif se retrouve dans un volume de distribution 10 fois
plus grand (que la couche cornée) dans lequel on ne trouve plus cette alternance de zones
hydrophiles et lipophiles étroitement collées. La résistance à la perméation y est largement
plus faible car le principe actif peut être transporté par les fluides intercellulaires. L’état

d’équilibre est atteint très rapidement. La pénétration plus en profondeur vers le derme est
souvent un phénomène continu car il n’a pas de « barrière » à l’interface épiderme-derme. A
ce niveau, les flux sanguin et lymphatique doit jouer un rôle important sur le transport des
substances, puis qu’ils passent dans le derme.
Figure 26. Représentation shématique
des cellules de Franz utilisées
dans ce travail de thèse.
199
199

200
200

ANNEXE 2 : DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES
1. Le système immunitaire : présentation des anticorps.
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour protéger un
organisme des agressions extérieures comme l’intrusion d’organismes pathogènes par
exemple. Ces molécules sont produites par les lymphocytes B en réponse à l’intrusion d’une
molécule étrangère à l’organisme hôte. Ces substances étrangères capables de déclencher une
réponse immunitaire sont dénommées antigènes, et ce sont en générale des composés
possédant des molécules de masse supérieure à 5000 Da. Les molécules plus petites (M

Figure 27. Représentation schématique d'un anticorps (ici, une molécule
d’immunoglobuline G, encore notée IgG).
202
202
Du point de vue structural, les anticorps sont des glycoprotéines constituées d’un
arrangement quaternaire de plusieurs sous-unités peptidiques. On distingue quatre chaînes
protéiques : deux chaînes dites lourdes (nommées VH, H pour Heavy, et dont la masse est
proche de 50 kDa), et deux chaînes légères (nommées VL, L pour Light, de masse moléculaire
environ 25 kDa). Ces quatre polypeptides sont arrangés de manière symétrique, chacune des
chaînes légères étant associée à une chaîne lourde, et l’assemblage global étant assuré par
plusieurs ponts disulfures intra- et inter-catennaires.
On distingue dans les immunoglobulines deux grandes régions : une partie est dite
constante, et l’autre variable. Ce sont les parties constantes, constituées par les parties C-
terminales des polypeptides qui permettent de distinguer les différentes classes
d’immunoglobulines. Ainsi, il existe 5 classes d’immunoglobulines chez les mammifères,
dénommées IgA, IgD, IgE, IgG et IgM, qui se distinguent chacune par la partie constante de
leurs chaînes lourdes, α, β, ε, γ, et µ, respectivement. Ce sont les IgG les plus fréquentes, et ce
sont elles que nous avons utilisées pour les expériences de reconnaissance immunologique.
Les parties variables sont, elles, responsables de la reconnaissance pour un antigène
donné. Elles sont constituées d’une partie des chaînes lourdes, et d’une partie des chaînes

légères (les extrémités N-terminales) qui créent ainsi 2 sites de liaisons par anticorps (voir
schéma de l’IgG). On distingue dans ces parties variables un sous-motif qualifié
«d’hypervariable», et qui est directement impliqué dans l’interaction avec l’antigène. Ces
régions hypervariables sont constituées d’un arrangement conformationel et fonctionnel (le
paratope) spécifique à la liaison avec une partie de l’antigène (l’épitope). Le phénomène pur
de reconnaissance ne met cependant en jeu que quelques uns des acides aminés de ces régions
hypervariables.
2. Obtention des anticorps.
Nous décrirons ici une méthode générale d’obtention d’anticorps dirigés contre des
haptènes, en étudiant plus particulièrement la production d’anticorps anti-cyclodextrines.
Les haptènes sont de petites molécules (M < 5000Da) qui ne suffisent pas à elles seules
à induire une réponse immunitaire chez un mammifère. On fabrique donc un immunogène en
greffant de façon covalente l’haptène sur une protéine étrangère à l’hôte auquel on veut faire
produire des anticorps (typiquement, un lapin). Le système immunitaire va produire des
anticorps dirigés contre l’ensemble des épitopes portés par cette protéine étrangère (KLH +
haptène ou BSA + haptène), et dans cet ensemble d’anticorps, certains seront dirigés contre
l’haptène préalablement greffé.
Pour les cyclodextrines, on utilise les dérivés mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrines
(CD-NH2). Cet haptène est couplé de façon covalente à la Sérum Albumine Bovine (BSA),
protéine étrangère à l’organisme du lapin, en utilisant le glutaraldéhyde comme bras espaceur
(la façon dont le glutaraldéhyde lie les deux molécules n’est pas bien connue, mais le
glutaraldéhyde réagit probablement sous sa forme polymérique). L'agent de couplage réagit en
créant des fonctions imines à partir des fonctions amines primaires de la CD et de la BSA.
NH2
CD +
BSA
203
203
OHC CHO
CD
H 2
Figure 28: Préparation de l'immunogène.
N N
IMMUNOGENE
CH 3
BSA

Pour réaliser ceci, 900 nmol d'haptène et 30 mg de BSA sont dissouts dans 2 ml de
tampon phosphate (0.1 M, pH 7.4). On ajoute à cette solution 8 µL de solution aqueuse de
glutaraldéhyde (25 % (v/v)). La solution est agitée durant 16 H à Tamb, puis dialysée contre
deux litres de tampon phosphate 10 -1 M. L'immunogène est stocké à - 30 °C jusqu'à
utilisation. Les lapins sont immunisés par injection intradermique de l’immunogène. Afin
d’accroître la réponse immunitaire du lapin, l’immunogène est émulsionné dans de l’adjuvant
de Freund complet [Hoogenraad, 1986]. 1 mg d’immunogène est injecté au lapin. Six
semaines après la première injection, les animaux reçoivent une injection de rappel. Cette
opération est ensuite répétée tous les mois, tandis que l’on vérifie la présence et le titre des
anticorps spécifiques dans les saignées effectuées avant et après chaque rappel.
Ce sont ces protéines générées par le système immunitaire qui sont la base des dosages
immunologiques.
3. Les dosages immunologiques
3.1 Principe
Sous le terme de dosages immunologiques sont regroupées différentes méthodes
d’analyse qui on toutes en commun d’utiliser à la fois des anticorps (Ac) et des molécules
marquées. Les anticorps ont la propriété de former des complexes spécifiques de haute affinité
avec les antigènes (Ag) contre lesquels ils ont été produits. Les dosages immunologiques
exploitent les propriétés de base de l’interaction Ag-Ac. Dans sa forme la plus simple, celle-ci
peut être décrite par l’équilibre suivant :
Ag + Ac → AgAc
Il est admis que cet équilibre obéit à la loi d’action de masse et donc que les
concentrations de ces constituants sont reliées entre elles par la relation :
Kd = [Ag] [Ac] × [AgAc] –1 où Kd est la constante de dissociation du complexe Ag-Ac
De cet équilibre on peut déduire que la concentration des complexes AgAc formés
dépend des concentrations en Ag et en Ac introduites dans la réaction. Si l’on suppose
constante la concentration totale en Ac, on peut montrer qu’il existe une relation
mathématique simple reliant [Ag] à [Ag-Ac]. Cette relation va permettre de mesurer la
concentration en Ag si l’on est capable de mesurer la concentration du complexe formé.
204
204
On pourrait alors penser qu’il est possible de mesurer la concentration d’un Ag au
moyen d’un seul équilibre réalisé avec une quantité connue d‘Ac. Ceci serait possible si on

pouvait connaître avec précision la concentration totale en Ac, le Kd et la concentration du
complexe formé. En pratique, ces trois conditions ne sont jamais réalisées en même temps et
tous les dosages immunologiques sont, en fait, des méthodes d’analyses relatives faisant appel
à des courbes d’étalonnage. Celles-ci sont établies en réalisant plusieurs équilibres avec des
concentrations connues et variables d’Ag. En mesurant pour chaque équilibre la quantité de
complexe formé, on va établir une relation expérimentale entre la concentration de l’Ag et
celle du complexe AgAc. C’est à partir de cette relation que l’on va mesurer la concentration
de l’Ag dans un échantillon inconnu traité dans les mêmes conditions expérimentales que les
solutions étalons. Dans ces conditions, il n’est pas nécessaire de travailler dans des conditions
d’équilibre.
Pour effectuer un dosage immunologique, il faut donc pouvoir mesurer la concentration
du complexe AgAc formé. C’est pour rendre plus facile cette mesure que l’on a recours à
l’utilisation de molécules marquées. Il s’agit d’Ag ou d’Ac auxquels on associe un signal les
rendant facilement mesurables au moyen d’une méthode physico-chimique quelconque. De
très nombreux marqueurs ont été décrits mais les plus utilisés sont les marqueurs radioactifs
(dosage radioimmunologiques), les marqueurs fluorescents (dosages fluoroimmunologiques)
et les enzymes (dosages immunoenzymatiques). Nous nous concentrerons sur ce dernier cas
qui est la méthode que nous avons utilisée.
Pour permettre des dosages sensibles, un bon traceur doit pouvoir être détecté à des
concentrations très faibles, c’est à dira posséder une activité spécifique la plus élevée possible.
Il faut aussi que l’opération de marquage respecte les structures essentielles de l’Ac afin que
la stabilité du complexe ne soit pas affectée.
Les enzymes les plus utilisées restent la phosphatase alcaline et la peroxydase de
Raifort. Au laboratoire, nous utilisons plutôt l’acétylcholinesterase ou AchE (E.C 3.1.1.7) en
raison de sa très grande activité catalytique qui confère aux traceurs synthétisés à partir de
cette enzyme des activités spécifiques très élevées souvent comparables à celles des traceurs
radioactifs. La fonction principale de cette enzyme est l’hydrolyse de l’acétylcholine dans la
synapse cholinergique. Pour détecter cette enzyme on utilise le réactif d’Ellman [Ellman,
1961] (Fig.3) qui est un mélange d’acétylthiocholine, un pseudo-substrat de l’AchE, et le
DTNB. L’hydrolyse de l’ acétylthiocholine aboutit à la production de thiocholine qui réagit
avec le DTNB ox., réactif classiquement utilisé pour mesurer les groupements thiols, et
entraîne la formation de DTNB réduit. Ce dernier est un chromophore (λmax 414 nm, εM
13600cm -1 .M -1 ) qui absorbe fortement dans le visible en produisant une couleur jaune.
205
205

CH3COS-CH2CH2N(CH3)3 + + H2O
Acétylthiocholine
- S-CH2 -CH 2 -N + (CH 3 ) 3 +
O 2 N
-OOC
S
DTNB
206
206
AChE
S NO 2
CH3COO - + - S-CH2CH2N(CH3)3 + + 2H +
Thiocholine
COO-
COO- HS NO2 C
H 3
C
H 3
Figure 29. Principe de la méthode colorimétrique d’Ellman.
N +
CH3 +
S
DTNB
Réduit (coloré)
COO-
S NO 2
Il est courant d’exprimer les concentrations d’AchE en fonction des mesures effectuées
avec la méthode d’Ellman. Une unité Ellman correspond à la quantité d’enzyme produisant un
accroissement d’absorbance d’une unité à 414 nm pendant une minute, dans un volume de 1
mL de milieu Ellman, pour 1 cm de trajet optique à 25°C.
Dans certains cas, la formation de complexe s’accompagne d’une modification du signal
porté par le traceur. Les dosages de ce type sont appelés homogène car la mesure est effectuée
directement sur l’ensemble des constituants de l’équilibre immunologique. A l’opposé on
distingue les dosages hétérogènes, pour lesquels la formation des complexes Ag-Ac ne
modifie pas le signal porté par le traceur. Dans ce cas, pour accéder à la mesure des complexe
Ag-Ac, il faut procéder à une séparation des différents constituants de l’équilibre et
notamment séparer le traceur non complexé de celui engagé dans les complexes Ag-Ac. Cette
séparation, qui doit être effectuée avant la mesure finale, fait presque toujours appel à une
séparation de phase (liquide/solide). Dans la suite de cet exposé nous envisagerons seulement
le cas des dosages hétérogènes que nous avons utilisé.
Nous venons d’examiner les principes de base sur lesquels reposent les dosages
immunologiques et nous avons vu comment la formation de complexes Ag-Ac et l’utilisation
de molécules marquées permettait de mesurer des concentrations d’Ag ou d’Ac. Ces principes
ne sont pas propres aux dosages immunologiques et on pourrait les appliquer, par exemple,
aux dosages faisant intervenir des récepteurs. Si les dosages immunologiques ont connu un
développement si spectaculaire ces trente dernières années, c’est parce qu’ils sont dotés
d’autres propriétés remarquables. Ce sont d’abord des méthodes très générales dans la mesure
où il est possible d’obtenir des Ac contre à peu près n’importe quelle molécule. Le succès des
dosages immunologiques est aussi dû à deux propriétés essentielles de l’interaction Ag-Ac :
spécificité et affinité. C’est grâce à la spécificité des Ac, c’est à dire à leur aptitude à ne
former des complexes qu’avec le seul Ag contre lequel ils ont été produit, que les dosages

immunologiques pourront être effectués dans des milieux biologiques complexes (plasma,
urines, extraits de tissus) sans purification préalable. Et c’est grâce à la grande stabilité des
complexes que les dosages immunologiques pourront être très sensibles. Or ces complexes ne
se formeront de façon mesurable, à de très faibles concentrations, que si la constante de
dissociation de ces complexes le permet. Avec des Kd de l’ordre de 10 -9 M et pouvant aller
jusqu’à 10 -12 M, les Ac permettent de mesurer de très faibles concentrations d’Ag. Ainsi, que
ce soit en termes de spécificité ou d’affinité, les Ac sont les réactifs les plus performants
actuellement accessibles aux biologistes avec les sondes nucléotides.
Il ne saurait être question ici de décrire les très nombreuses méthodes faisant intervenir
la relation Ag-Ac. Nous nous bornerons à décrire succinctement le type de dosage hétérogène
que nous avons utilisé : le dosage par compétition.
3.2 Dosage par compétition
Les dosages par compétition mettent en jeu 3 composants: un anticorps (poly ou
monoclonal), un antigène marqué (le traceur) et le même antigène non marqué. Le fait
d’utiliser comme traceur l’antigène marqué est l’une des caractéristiques essentielles des
dosages par compétition. Le traceur (Ag * ) et l’antigène (Ag) non marqué sont aptes à se lier
tous les deux aux mêmes anticorps (Ac), et de ce fait, à établir une compétition si la
concentration des sites anticorps est limitante. Le principe de compétition met donc en œuvre
deux équilibres :
Ag * + Ac Ag * Ac Kd * = [Ac][Ag * ]/[Ag * Ac]
Ag + Ac AgAc Kd= [Ac][Ag]/[AgAc]
On peut montrer que si la concentration en anticorps et en traceurs est constante, la
concentration en complexe Ag * Ac diminue quand la concentration d’antigènes non marqués
introduite dans l’équilibre augmente, et ceci pour toutes valeurs de Kd et Kd * .
207
207
3.2.1 Préparation du traceur pour le dosage par compétition.
Comme indiqué précédemment, un traceur pour dosage par compétition est obtenu en
couplant de façon covalente l’haptène étudié à l’acétylcholinestérase. Il existe de nombreuses

façons de coupler l’haptène sur l’enzyme. La méthode employée dépend uniquement des
fonctions chimiques réactives disponibles sur l’haptène. Dans le cas des cyclodextrines, le
traceur est préparé en exploitant la fonction amine du dérivé mono-6-désoxy-6-amino-
cyclodextrines (CD-NH2), en utilisant le protocole précédemment décrit pour les haptènes
[McLaughlin, 1987] ou pour les protéines [Grassi, 1989].
CD
A C
h E
NH 2
NH 2
SMCC
SATA
NH 2 OH
A C
h E
O
NH
CD
AChE-G4-SMCC
NHCOCH 2 SH
A C
h E
O
NH
Traceur CD-G4
Figure 30. Synthèse du traceur enzymatique CD-AChE-G4.
N
O
O
Le dérivé mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrine (CD-NH2) est d’abord thiolé en faisant
réagir le groupe amine de la CD-NH2 avec le N-succinimidyl-S-acétylthioacétate (SATA) en
milieu alcalin. A une solution de CD-NH2 (1µmol) en tampon borate (1 ml de tampon borate
0.1 M, pH 8.5) on ajoute 50 µl d'une solution de SATA dans le DMF anhydre (2.13 mg, 9.2
µmol). La réaction a lieu à température ambiante durant 30 mn avant purification de la CD-
SATA sur cartouche de SEP-PAK C18. Le dérivé thiolé est élué avec du méthanol, lyophilisé
et repris dans 1.6 ml de tampon phosphate préalablement dégazé (tampon phosphate 0.1 M,
pH 6). On ajoute alors 400 µL d'une solution de chlorure d'hydroxylamine (pH 7). Après 30
mn de réaction, le nombre de fonctions thiols est estimé par colorimétrie, en faisant réagir le
milieu réactionnel avec 0.5 mM de 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoique acide) (DTNB) selon la
procédure décrite par Ellman [Ellman, 1959].
L'acétylcholinestérase (sous sa forme globulaire G4, préalablement extraite à partir des
organes électriques de Gymnote et purifiée par chromatographie d'affinité [Massoulié, 1976])
est de son côté fonctionnalisée par réaction avec le N-succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)
cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, un agent bifonctionnel), puis purifiée comme
précédement décrit [Grassi, 1989]. Le couplage de la cyclodextrine thiolée (3 nmol) avec
l'AChE fonctionnalisée (0.3 nmol AChE-G4-SMCC) est réalisé en milieu tampon phosphate
(0.1 M, pH 6, 275 µL) durant 3 h à 30°C. Le traceur CD-AChE est alors purifié par filtration
sur gel de sépharose (Biogel A, colonne de 90 x 1.5 cm, éluant tampon EIA).
208
208
N
O
O
S
O
NH
CD

3.2.2 Mise en œuvre; interprétations.
209
209
La mise en œuvre d’un dosage immunoenzymatique par compétition nécessite la
préparation d'un traceur (antigène étudié lié de façon covalente à l’acétylcholinestérase), et
d’avoir à notre disposition un anticorps spécifique de l’antigène étudié (voir le chapitre
concernant la préparation de l’immunogène à partir d’un haptène).
Les dosages immunologiques sont réalisés dans des plaques de microtitration
comprenant 96 puits. Un prétraitement nécessaire à la bonne réalisation du dosage (schéma 1,
fig 30), consiste à recouvrir les puits avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la
partie constante des immunoglobulines de lapin. La première étape du dosage consiste à
mélanger dans un même puits, une quantité constante de ces anticorps spécifiques de lapin
avec une quantité constante de traceur (antigène-AChE), et une quantité variable de l’antigène
étudié (schéma 2, fig 30). Après l’étape de réaction immunologique (typiquement 18 h à 4 °C)
et après une étape de lavage soigné, on se retrouve dans la situation du schéma 3, où certains
sites sont occupés par une molécule de traceur, ou bien, par une molécule d’antigène,
l’excédant ayant été éliminé par l’étape de lavage.
Figure 31. Principe du dosage immunoenzymatique par compétition.
La quantité d’AChE fixée sur la phase solide est alors détectée par la méthode
colorimétrique d’Ellman en ajoutant dans chacun des puits un mélange d’acétylthiocholine et

de DTNB (schéma 4, fig 30). Après une à deux heures de réaction enzymatique, l’absorbance
(λ= 414 nm) de chaque puits est mesurée à l’aide d’un lecteur approprié.
La réalisation de ces mesures sur une gamme de concentration de l’antigène étudié
conduit à l’obtention de courbe de type B = f([concentration]), B étant l’absorbance du milieu
à 414 nm, pour une concentration donnée d’antigène. Il est cependant plus pratique de
représenter ces courbes sous une forme semi-logarithmique, en traçant 100*B/B0 = f
([concentration]), B0 étant l’absorbance mesurée en absence d’antigène non marqué (figure
31).
Figure 32. Courbe dose-réponse obtenue lors d'un dosage immunologique par
compétition.
210
210
Il est à noter que des mesures de liaison non spécifique (absorbance mesurée en absence
d’anticorps spécifiques) sont effectuées à chaque dosage.
On peut estimer grossièrement la sensibilité d’un dosage par la valeur de la
concentration en antigène qui correspond à une valeur de B*100/B0 de 50 % de B0. Cette
valeur caractérise la zone de concentration dans laquelle le dosage présente la précision
maximale. Lors du dosage, on doit donc trouver les dilutions de l’échantillons permettant
d’obtenir des valeurs de concentration compris dans cette zone. (La sensibilité d’un dosage
par compétition est définie de façon plus rigoureuse par la « concentration minimale
détectable », c’est à dire la plus petite concentration d’antigène capable d’induire une

diminution statistiquement significative de la valeur de B0. Expérimentalement, elle est
déterminée en calculant la concentration d’antigène correspondant à B0-3σ, σ étant l’écart
type estimé sur la mesure de B0).
La spécificité d’un dosage peut être évaluée en réalisant des courbes d’étalonnage avec
des substances structuralement et fonctionnellement apparentées. On définit alors le
pourcentage de réaction croisée RC (%) (critère d’Abraham, Abraham, 1974):
RC (%) =
[Ag]50%
[analogue]
50%
Figure 33. Formule du critère d'Abraham (Abraham, 1974).
x 100
[Ag]50% et [analogue]50% représentant respectivement les concentrations d’antigène et
d’analogue qui engendrent un signal de 50 % de B0. La comparaison des valeurs de B/B0 à
50% mesurées pour une série de produits testés dans les mêmes conditions permet d’estimer
l’affinité relative de chacun de ces produits pour les anticorps étudiés.
Dans le cas du dosage de la Rameb, notre limite de détection est de 0.1 ng/mL et le
B/B0 50% correspond à environ 1.5 ng/mL.
La sensibilité d’un dosage dépend de nombreux paramètres et notamment de la
concentration du traceur et de l’Ac. La règle générale est que le dosage sera d’autant plus
sensible que l’anticorps et le traceur sont plus dilués. Cette règle découle du principe de la
compétition, celle-ci s’exerçant plus facilement à l’avantage de l’antigène non marqué, si le
traceur est peu concentré et si la concentration en Ac est limitante. En conséquence, si l’on
veut utiliser un traceur à de très faibles concentrations, il faut que celui-ci possède une activité
spécifique telle qu’à ces concentrations il fournisse encore un signal mesurable. C’est le cas
de l’AchE dont la limite théorique de détection, dans les conditions d’utilisation habituelles
(200µL d’Ellman, trajet optique de 0.44 cm, 1 heure de réaction) est de 1.85 10 -18 mole.
211
211
Avec des traceurs aussi performants, c’est presque toujours la stabilité du complexe qui
limite les dilutions que l’on peut faire subir à l’Ac. Même s’il est possible dans certains cas
d’influencer la réponse immunitaire, il faut considérer que l’affinité des Ac produits par un
animal échappe en grande partie à l’expérimentateur. Bien entendu, il n’est pas possible de
diluer indéfiniment traceurs et anticorps et il existe, en théorie pour chaque dosage (un traceur
et un Ac donné) une combinaison idéale qu’il conviendrait de déterminer à chaque fois. En
pratique, on opère souvent de façon plus empirique en fixant arbitrairement la concentration

du traceur et en déterminant ensuite par dilutions successives, la concentration minimale
d’anticorps utilisable. C’est la technique que nous avons utilisée.
Pour chaque échantillon, nous avons évalué la qualité du dosage grâce au critère de
répétabilité ou précision intra-essai, qui exprime la variation des résultats au cours d’une
même analyse et est évaluée en dosant systématiquement sur une même plaque chaque
échantillon à 4 concentrations différentes. Pour être pris en compte les résultats doivent bien
sur se situer dans la zone proche du B/B0 50% (généralement 30% < B/B0 < 70%).
212
212

213
213
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

214
214
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
A
Abraham, G. (1974). Acta Andocrinol. 183, 1.
Amdidouche, D., Montassier, P., Poelman, M.-C. & Duchêne, D. (1994). Evaluation by laser
Doppler velocimetry of the attenuation of tretinoin-induced skin irritation by β-cyclodextrin
complexation. Int. J. Pharm. 111, 111-116.
Arima, H., Adachi, H., Irie, T. & Uekama, K. (1990). Improved drug delivery through the skin
by hydrophilic β-cyclodextrins, Enhancement of anti-inflammatory effect of 4-biphenylacetic
acid in rats. Drug. Invest 2, 155-161.
Atwood, J. L., Davies, J. E. D., MacNicol, D. D., Vögtle, F. & Lehn, J., Eds. (1996). Physical
Methods in Supramolecular Chemistry, Comprehensive Supramolecular Chemistry,. Vol. 3, 8.
Oxford: Pergamon, Elsevier science.
Auzely-Velty, R., Perly, B., O.Taché, Zemb, T., Jéan, P., Guénot, P., Dalbiez, J.-P. &
Djedainï-Pilard, F. (1999). Cholesteryl-cyclodextrins: synthesis and insertion into membranes.
Carbohydrates Research 318, 82-90.
Auzely-Velty, R., Djedaini-Pilard, F., Désert, S., Perly, B. & Zemb, T. (2000). Micellization
of hydrophobically modified cyclodextrins. 1.Micellar structure. Langmuir 45.
Auzely-Velty, R., Péan, C., Djedainï-Pilard, F., Zemb, T. & Perly, B. (2001). Micellization of
hydrophobically modified cyclodextrins. 2. Inclusion of guest molecules. Langmuir 17, 504-
510.
B
Batourina, E., Gim, S., Bello, N., Shy, M., Clagett-Dame, M., Srinivas, S., Constantini, F. &
Mendelsohn, C. (2001). Vitamin A controls epithelial/mesenchymal interactions through
retinol. Nat. Genet 27(1), 74-78.
Benattar, J.-J., Schlachli, A. & Bélorgey, O. (1992). Phys. I. France 2(6), 955.
Bélorgey, O. & Beanattar, J.-J. (1991). Investigation on Newton black films. Phys. Rev. Lett.
66, 313.
Bigger, T. J. & Nacht, S. (1996). Retinyl esters of α-hydroxy acids for topical improvement of
skin function and appearance. WO-97/20812.
Blomhoff, R. (1994). Vitamin A in health and disease, Marcel Dekker, Inc., New York.
Breslow, R. & Chang, B. (1992). Very fast hydrolysis by a cyclodextrin dimer with a catalytic
linking group. J. Am. Chem. Soc. 114, 5882-5883.
Breslow, R. & Dong, S. D. (1998). Biomimetic reactions catalysed by cyclodextrins and their
derivatives. Chem. Rev. 98, 1997-2012.
C
Chemical Review. (1998). cyclodextrin special issue, 98.
Clum, C. E. & Wang, J. C. (1991). Stabilized retinoid-containing skin care compositions.
WO-93/00085.

Connors, K. A. (1997). The stability of cyclodextrins complexes in solution. Chem. Rev. 97,
1325-1357.
Cordero, A. (1983). La vitamina A acia en el piel senil. Actua Ter Dermatol 6, 49-54.
Couval, E., Peyrot, N., Jammes, H., Clairand, V. & Firmino, N. (1994). Composition
containing retinal. FR-2717686.
Cramer, C. (1954). Einschlussverbindungen, Springer, Berlin.
Créminon, C., Pilard, F., Grassi, J., Perly, B. & Pradelles, P. (1994). A sensitive and specific
enzyme immunoassay for cyclomaltoheptaose and some derivatives. Carbohydr. Res. 258,
179-186.
Créminon, C., Djédaïni-Pilard, F., Vienet, R., Péan, C., Grognet, J. M., Grassi, J., Perly, B. &
Pradelles, P. (1999). A new and specific enzyme immunoassay allowing an efficient
pharmacokinetic evaluation of g-cyclodextrin after intraveinous administration to rats.
Pharmaceutical research 16(9), 1407-1411.
D
Dabal, R., Boyer, C. M. & al., A. B. e. (1995). Annual Meeting of American Association for
Cancer Research.
Deluca, L. M. (1978). vitamin A. In Handbook of lipid research (H.F, D. L., ed.), pp. 1-67,
New York: Plenum.
Djedaïni-Pilard, F., Lin, S. Z., Perly, B. & Wouessidjewe, D. (1990). High field techniques for
investigation of a beta-cyclodextrin-indomethacine inclusion complex. J. Pharm. Sci. 79, 643-
646.
Djedaïni-Pilard, F., Perly, B., Dupas, S., Miocque, M. & Galons, H. (1993). Specific
interactions and stabilisation between host and guest : complexation of ellipticine in a
nucleobase functionalized cyclodextrin. Tetrahedron Letters 34, 1145-1148.
Duchêne, D., Vaution, C. & Glomot, F. (1985). La biodisponibilité des principes actifs par
inclusion dans les cyclodextrines. STP Pharma 1(4), 323-332.
Duchêne, D. (1987). Cyclodextrins and their industrial use (Duchêne, E. D., Ed.), Edition de
santé, Paris.
Duchêne, D., Ed. (1991). New trends in cyclodextrins derivatives. Paris: Edition de le santé.
Duchêne, D., Wouessidjewe, D. & Poelman, M. C. (1996a). Les cyclodextrines dans les
préparations pour usage dermique. In Formes pharmaceutiques pour application locale
(Lavoisier, ed.), pp. 482-499, Paris.
Duchêne, D. & Wouessidjewe, D. (1996b). Eighth International Symposium on
Cyclodextrins.
Duchêne, D., Ponchel, G. & Wouessidjewe, D. (1999). Cyclodextrins in targeting -
Application to nanoparticles. Advanced Drug Delivery Reviews 36, 29-40.
E
Ellman, G. L. (1959). Tissue sulfhydryl group. Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77.
Ellman, G., Courtney, K., Andres, V. & Featherstone, R. (1961). A new and rapid
colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95.
F
215
215

216
216
Felty-Lanny, G. (1975). Stabilized tretinoin cream emulsion. US-3906108.
Fisher, G. J. & Voorhees, J. J. (1996). Molecular mechanisms of retinoid actions in skin. The
FASEB journal 10, 1002-1013.
Freudenberg, K. & Meyer-Delius, M. (1938). Ber. Deutsch. Chem. Ges. 71, 1596-1600.
Freudenberg, K. & Cramer, F. (1948). Z. Naturforsch 3b, 464.
Freudenberg, K., Cramer, F. & Plieninger, H. (1953). 895769.
Froix, M. & Nacht, S. (1996). Retinoids formulations in porous microspheres for reduced
irritation and enhanced stability. EP-0781551A1.
Fromming, K. H., Gelder, T. & Mehnert, W. (1988). Inclusion compound of b-cyclodextrin
and vitamin A acetate. Acta Pharma Technol. 34(3), 152-155.
Frömming, K. H. & Szejtli, J. (1994). Cyclodextrins in pharmacy. Topics in inclusion science
(Davies, J. E. D., Ed.), 5, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht.
G
Gagnebien, D. & Simon, P. (1997). Composition stable gélifiée contenant un principe actif
lipophilique sensible à l'oxygene et/ou l'eau. FR-2746011.
Garcia, N. (2001). Caractérisation de la fonction barrière d'un type d'épiderme humain
reconstruit, Paris XI.
Gendimenico, G. & Mezick, J. A. (1993). Pharmacological effects of retinoids on skin cells.
Skin Pharmacol. 6, 24-34.
Gerlocsy, A., Antal, S. & Szejtli, J. (1988). Int. Symp. on cyclodextrins, Munich.
Gosnat, M. (2000). Relations entre paramètres thermodynamiques et géométriques dans la
résolution chirale par des cyclodextrines modifiées, Paris XII.
Grassi, J., Robert, Y., Pradelles, P., Chercuitte, D., Gruaz, D., Dayer, J. M. & Poubelle, P.
(1989). Production of monoclonal antibodies against interleukin-1a and-1b; Development of
two enzyme immunoassays of atriopeptin. J. Immunol. Methods 123, 193-210.
Gulik, A., Delacroix, H., Wouessidjewe, D. & Skiba, M. (1998). Structural properties of
several amphiphile cyclodextrins and some related nanospheres. An X-ray scattering and
freeze-fracture electron microscopy study. Langmuir(14), 1050-1057.
Gunther, H. (1993). La spectroscopie de RMN, Masson, Paris.
Guo, Q. X., Ren, T., Fang, Y. P. & Liu, Y. C. (1995). Binding of vitamin A by b-cyclodextrin
and heptakis-(2,6-O-dimethyl)-bcyclodextrin. J. Incl. Phenom. Mol. Recogni. Chem 22, 251.
H
Head, K. A. (1999). Natural therapies for ocular disorder Part one : disease of retina.
Alternative medicine review 4(5).
Hedges, A. R. (1998). Industrial applications of cyclodextrins. Chem. Rev 98, 2035-2044.
Higuchi, T. & Connors, K. A. (1965). Phase solubility techniques. Adv. Anal. Chem. Instr. 4,
117-121.
Hildebrand, J. A. & Benesi, H. A. (1949). A graphical method for the determination of
binding constants. J. Am. Chem. Soc. 71, 2703-2710.
Hoffman, C. & Eicheie, C. (1994). Retinoids in development. In The Retinoids : biology,
chemistry and medicine 2nd edit. (Spurn MB, R. A., Goodman DE, ed.), pp. 387-442, New
York.

217
217
Hoogenraad, N. J. & Wraight, C. J. (1986). Immunological techniques (part I: Hybridoma
technology and monoclonal antibodies). Methods in immunology 121, 375-381.
Hunter, D. J. & Willet, W. (1994). Vitamin A and cancer. In Vitamin A in health and diseases
(Blomhoff, R., ed.), pp. 561. Marcel Dekker, Inc., New York.
I
Inoue, Y., Kanda, Y., Yamamoto, Y., Chujô, R. & Kobayashi, S. (1989). Elucidation of
host/guest geometrical relationship in a cylomaltohexaose inclusion complex by measurement
of the intermolecular nuclear Overhauser effects in the rotating frame. Carbohydrate
Research 194, c8-c13.
J
Job, P. (1928). Recherche sur la formation de complexe mineraux en solution et sur leur
stabilité. Ann. Chim. 9, 113-125.
Jourdain, C. (1990). Intérêt des cyclodextrines dans les formes pharmaceutiques topiques,
Paris XI.
Jullien, L., Lazrak, T., Canceill, J., Lacombe, L. & Lehn, J.-M. (1993). An approach to
channel-type molecular structures. Part 3. J. Chem. Soc.; Perkin Trans 2, 1011-1020.
K
Kawabata, Y., Matsumoto, M., Nakamura, T., Tanaka, M. & Manda, E. (1988). Langmuir-
Blodgett film of amphiphilic cyclodextrins. Thin solid films, 353-358.
Kligman, A., Fulton, J. E. & Plewig, G. (1969). Topical vitamin A acid in acne vulgaris.
Arch. Dermatol. 99, 469-476.
Köhler, G. & Milstein, C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefined specificity. Nature 256, 495-497.
L
Lampen, A., Meyer, S., Arnhold, T. & Nau, H. (2000). Metabolism of vitamin A and its active
metabolite all trans retinoic acid in small intestin enterocytes. J. Pharm. Exp. Therapeutic 295
(3), 979-85.
Lechat-Leroy, F. (1995). Investigation de la cytotoxicité et de la capacité de transporteur d'un
nouveau système colloïdal à base de cyclodextrines amphiphiles, Paris XI.
LeGrusse, J. & Watier, B. (1993). Les vitamines : données biochimiques, nutritionnelles et
cliniques, Lab. Roche Nicolas S.A.
Lehninger, A. L., Nelson, D. C. & Cox, M. M. (1994). Principles of biochemistry,
Flammarion Médecine Science, Paris.
Lemos-Senna, E., Wouessidjewe, D., Duchêne, D. & Lesieur, S. (1998a). Amphiphilic
cyclodextrin nanospheres: solubilization and reconstitution by the action of a non-ionic
detergent. Colloids and surfaces B(10), 291-301.
Lemos-Senna, E., Wouessidjewe, D., Lesieur, S., Puisieux, F., Couarraze, G. & Duchêne, D.
(1998b). Evaluation of the hydrophobic drug loading characteristics in nanoprecipitated
amphiphilic nanospheres. Pharm. Dev. Technol. 3, 85-94.

218
218
Lin, J., Créminon, C., Perly, B. & Djedaïni-Pilard, F. (1998). New amphiphilic derivatives of
cyclodextrins for the purpose of insertion in biological membranes: the "cup and ball"
molecules. J. Chem. Soc.; Perkin Trans 2, 2639-2646.
Lippman, S. M., Benner, S. E. & Benner, W. K. (1994). Cancer chemoprevention. J. Clin.
Oncol. 12, 851-873.
Liu, J. C., Wang, J. C. T., Yusuf, M., Yamamoto, N., Kazama, S., Stahl, C. R. & Mather, K.
(1996). Topical compositions comprising an oil-in-water emulsion and a retinoid. WO-
97/31620.
Loftsonn, T. (1998b). Cyclodextrins in pharmaceutical formulations. Nordic Industrial
fund.Report.
Loftsson, T., Masson, M., Sigurdsson, H. H., Magnusson, P. & Goffic, F. L. (1998a).
Cyclodextrins as co-enhancers in dermal and transdermal drug delivery. Pharmazie 53, 137.
Lotan, R. (1980). Effects of vitamin A and its analogs (retinoids) on normal and neoplastic
cells. Biochim. Biophys. Acta 605, 33-92.
Lotan, R. (1996). Retinoids in cancer chemoprevention. FASEB J 10, 1031-39.
M
Markus, A. & Pelah, Z. (1989). Encapsulation of vitamin A. J. Microencapsulation 6(3), 389-
394.
Marttin, E., Verhoef, J. C., Romeijn, S. G. & Merkus, F. W. H. M. (1996). Eighth
International Symposium on Cyclodextrins.
Massoulié, J. & Bon, S. (1976). Affinity chromatography of acethylcholinesterase : the
importance of hydrophobic interactions. Eur. J. Biochem 68, 531-539.
Màsson, M., Loftsson, T., Màsson, G. & Stefànsson, E. (1999). Cyclodextrins as permeation
enhancer: some theoretical evaluations and in vitro testing. Journal of controlled release 59,
107-118.
McCormack, B. & Gregoriadis, G. (1998). Drugs in cyclodextrins in liposomes. Int. J. Pharm
169, 59-69.
McLaughlin, L. L., Wei, Y., Stockman, P. T., Leahy, K. M., Needleman, P., Grassi, J. &
Pradelles, P. (1987). Development, validation and application of an enzyme immunoassay
(EIA) of atriopeptin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 144, 469-476.
Mercier, J. P., Debrun, J. L., Dreux, M., Elfakir, C. & Hakim, B. (2000). . In Rapid Commun.
Mass Spectrom., Vol. 14, pp. 68-70.
Mesens, J. L. & Putteman, P. (1993). Pharmacological application of 2-hydroxypropyl-bcyclodextrin.
In New trends in cyclodextrins and derivatives (Duchêne, D., ed.), pp. 369-407.
Edition de santé, Paris.
Moldenhauer, J. P. (1998). Komplexe aus gamma-cyclodextrn und retinol. EP-0867175A1.
Montassier, P. (1996). Inclusion de la tretinoine dans les cyclodextrines, Paris XI.
Munoz-Botella, S., Lerner, D. A., DelCastillo, B. & Martin, M. A. (1996). Analytical
application of retinoid-cyclodextrin inclusion complexes. Analyst 121, 1557-1560.
N
Niles, R. M. (2000). Recent advances in the use of vitamin A (retinoids) in the prevention of
cancer. Nutrition 16(11), 1100.

219
219
Noda, A., Aizawa, M., Kumano, Y. & Yamaguchi, M. (1992). Development and application
of microcapsules for cosmetics. J.SCCJ 25(4), 223-231.
Noh, S.-K. & Chung, D. W. (1998). WO-KR9800304.
Norwig, J., Gelder, T., Kraus, C., Mehnert, W., Rehse, K. & Fromming, K. H. (1988). Some
interesting aspects in proton NMR spectroscopy by cyclodextrin complexation. In
Proceedings of the 4th International Symposium on cyclodextrins, pp. 205-208. Kluwer,
Dordrecht, Neth.
O
Okada, Y., Michiko, T. & Koizumi, K. (1990). Solubilization of lipid-soluble vitamins by
complexation with glucosyl-b-cyclodextrin. Chem. Pharm. Bull. 38(7), 2047-2049.
Ollivon, M., Eidelman, O., Blumenthal, R. & Walter, A. (1988). Micelle-vesicles transition of
egg phosphatidylcholine and octyl glucoside. Biochemistry(27), 1695-1703.
Orfanos, C. E., Zouboulis, C. C., Almond-Roesler, B. & Geilen, C. C. (1997). Current use and
futur potential role of retinoids in dermatology. Drugs 53(3), 358-388.
P
Palmieri, F., Wehrlé, P., Duportail, G. & Stamm, A. (1992). Inclusion complexation of
vitamin A palmitate with b-cyclodextrin in aqueous solution. Drug development and
industrial pharmacy 18(19), 2117-2121.
Parrot-Lopez, H., Ling, C.-C., Zang, P., Baszkin, A., Albrecht, G., deRango, C. & Coleman,
A. W. (1992). Self-assembling systems of the amphiphilic cationic per-6-amino-bcyclodextrin
2,3-di-O-alkyls ethers. J. Am. Chem. Soc. 114, 5479-5480.
Perly, B. & Djedaïni-Pilard, F. (1991). Nuclear magnetic resonance of cyclodextrins,
derivatives and inclusion complexes. In New trends in cyclodextrins (Duchêne, D., ed.), pp.
215-246. Edition de santé, Paris.
Péan, C. (1998). Synthèse, analyse conformationnelle et évaluation des propriétés biologiques
de vecteurs à base de cyclodextrines portant une antenne peptidique. These de chimie
organique, Paris Sud.
Pilard, S., Meudal, S., Poisson, X., Petit, A., Pluvy, F., Besnard, N. & Luijten, W. (1999). 16e
Journées Françaises de Spectrométrie de Masse, Nancy.
Pitha, J. (1993). Pharmacological rôle of hydroxypropyl-b-cyclodextrin. In New trends in
cyclodextrins and derivatives (Duchêne, D., ed.), Vol. 351-367. Edition de santé, Paris.
Prigsheim, H. (1932). . In Chemistry of the saccharides, pp. 280. McGraw-Hill, New-York.
R
Ravoo, B. J., Darcy, R., Mazzaglia, A., Nolan, D. & Gaffney, K. (2001). Supramolecular tapes
formed by catanionic cyclodextrin in water. Chem. Comm., 827-828.
Rawlings, A. V., Scott, I. R., Harding, C. R. & Bowser, P. A. (1994). Stratum Corneum :
moisturization at the molecular level. Dermatoly Foundation 103, 731-740.
Raz, Y. & Kelley, M. W. (1999). Retinoic acid signaling is necessary for the developpement
of the organ of corti. Dev. Biol. 213(1), 180-193.

220
220
Redziniak, G. (1996). Carotenoid or retinoid combined with natural amphiphilic polypeptid.
WO-96/06431.
Rodnard, D. & Lewald, J. (1970). Computer analysis of radioligand assay and
radioimmunoassay data. Acta Endocrinol. 64, 79-103.
Roessler, B., Kreuter, J. & Ross, G. (1994). Effect of collagen microparticles on the stability
of retinol and its application into hairless mouse skin in vitro. Pharmazie 49(2), 275-279.
Runge, F. E. & Heger, R. (2000). Use of microcalorimetry in monitoring stabilitiy studies :
vitamin A esters. J. Agric. Food Chem. 48, 47-55.
S
Saenger, W. (1980). Cyclodextrin inclusion compounds in research and industry. Angew.
Chem-Int. Ed. Eng. 19, 344-362.
Saenger, W. (1984). . In Inclusion compounds (Atwood, J. L., Davies, J. E. D. & MacNichol,
D. D., eds.), Vol. 2, pp. 231-259. Academic. Press, London.
Sarama, R., Wehmeier, T., Sevenants, M. R. & Sanders, M. A. (1995). Stable vitamin A. WO
96/04243.
Schaefer, H., Zesch, A. & Stüttgen, G. (1982). Skin permeability.
Schardinger, F. (1904). Wien. Klin. Wochschr 17, 207.
Schardinger, F. (1905). Zentralbl. Bakteriol. Parasintenkd 14, 772.
Schlenk, H. D., Sand, D. M. & Tillotson, J. A. (1958). US62827452.
Segot, E. & Laurier, J. P. (1995). Composition pharmaceutique ou cosmétique anhydre
contenant du retinol. FR-2710841.
Shkunkova, Y. & Krasko, I. A. (1973). Stabilization of vitamin and fat compounds in mixed
feed with some antioxydants. In Vitamin Pitan (M.F., T., ed.), Moscow.
Skiba, M., Wouessidjewe, D., Coleman, A., Fessi, H., Devissaguet, J.-P., Duchêne, D. &
Puisieux, F. (1993). Préparation et utilisation de nouveaux systèmes colloîdaux dispersibles à
base de cyclodextrine, sous formes de nanosphères. FR-93/00594.
Skiba, M., Duchêne, D., Puisieux, F. & Wouessidjewe, D. (1996a). Development of a new
colloidal drug carrier from chemically modified cyclodextrins: nanospheres and influence of
physicochemical and technological factors on particle size. Int. J. Pharm 129, 113-121.
Skiba, M., Nemati, F., Puisieux, F., Duchêne, D. & Wouessidjewe, D. (1996b). Spontaneous
formation of drug-containing amphiphilic b-cyclodextrin nanocapsules. Int. J. Pharm. 145,
241-245.
Smith, M. A., Parkinson, D. R. & Cheson, B. D. (1992). Retinoids in cancer therapy. J. Clin.
Oncol. 10, 839-864.
Song, L. & Purdy, W. C. (1992). Circular dichroism, ultrviolet and proton NMR spectroscopic
studies of the chiral recognition mechanism of b-cyclodextrin. Anal. Chem 64, 1405-1412.
Sporn, M. B., Roberts, A. B. & Roche, N. (1986). Mechanism of action of retinoids. J. Am.
Acad. Dermatol. 15, 756-63.
Stüttgen, G. & Krause, J. (1959). Der nachweis von trikummarkietten vitamin A in den
schihten der haut nach lokalen applikation. Hautarzt 10, 504-506.
Szente, L. (1996). Analytical methods for cyclodextrins, cyclodextrin derivatives, and
cyclodextrin complex. In Comprehensive supramolecular chemistry (Atwood, J. L., Davies, J.
E. D., MacNicol, D. D., Vögtle, F. & Lehn, J., eds.), Vol. 3, pp. 253-278. Pergamon, Elsevier
science, Oxford.

221
221
Szjetli, J. (1988). Cyclodextrin Technology, Kluwer, Dordrecht.
T
Tagliaferri, E. (1989). Risques de dégradation de la vitamine A. 80(1), 77-86.
Takahashi, K. (1998). Organic reactions mediated by cyclodextrins. Chem. Rev. 98, 2013-
2034.
Tanaka, M., Ishizuka, Y., Matsumoto, M., Nakamura, T., Yabe, A., Nakanishi, H., Kawabata,
Y., Takahashi, H., Tamura, S., Tagaki, W., Nakahara, H. & Fukuda, K. (1987). Host-guest
complexes of amphiphilic cyclodextrin and azobenzene derivatives in Langmuir-Blodgett
films. Chemistry letters1307-1310.
Taneva, S., Ariga, K. & Okahata, Y. (1989). Association between amphiphilic cyclodextrins
and cholesterol in mixed insoluble monolayers at the air/water interface. Langmuir 5, 111-
113.
Tchoreloff, P. C., Boissonnade, M. M., Coleman, A. W. & Baszkin, A. (1995). Amphiphilic
monolayers of insoluble cyclodextrins at the water/air interface. Langmuir(11), 191-196.
Torras, H. (1996). Retinoids in aging. Clinics in Dermatology 14, 207-215.
U
Uekama, K., Irie, T., Sunada, M., Otagiri, M., Arimatsu, Y. & Nomura, S. (1982). Alleviation
of porchlorperazine-induced primary irritation of skin by cyclodextrin complexation. Chem.
Pharm. Bull 30, 3860-3862.
Uekama, K., Hirayama, F. & Irie, T. (1998). Cyclodextrin drug carrier system. Chem. Rev. 98,
2045-2075.
V
Villiers, A. (1891). Sur la fermentation de la fécule par l'action du ferment butyrique. C. R.
Acad. Sci. 112, 536.
Vollmer, U., Stoppie, P., Mesens, J., Wilffert, B. & Peters, T. (1992). 6th International
Symposium on Cyclodextrins.
Vollmer, U., Müller, B. W., Peeters, J., Mesens, J., Wilfert, B. & Peters, T. (1994). A study of
the percutaneous absorption-enhancing effects of cyclodextrin derivatives in rats. J. Pharm.
Pharmacol. 46, 19-22.
W
Wadstein, J. & Samuelsson, M. (1993). Skin care composition. WO-94/21225.
Weisse, S., Perly, B., Dalbiez, J.-P., Baraton-Ouvrard, F., Archambault, J.-C., André, P.,
Rollin, P. & Djedaïni-Pilard, F. (2002a). New aqueous gel based on soluble
cyclodextrin/vitamin A inclusion complex. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic
Chemistry(special issue Int. Symp. Cyclodextrins. 2002).
Weisse, S., Archambault, J.-C., Ouvrard-Baraton, F. & Djedaïni-Pilard, F. (2002b). Utilisation
cosmétique de la vitamine A ou de ses esters, en association avec une b-cyclodextrine
diméthylée. FR 02.01241.
Weisse, S., Perly, B., Dalbiez, J.-P. & Djedaïni-Pilard, F. (submitted). Complexation of
vitamin A propionate by natural cyclodextrins. Journal of Inclusion Phenomena and
Macrocyclic Chemistry.

Wenz, G. (1994). Cyclodextrins as building blocks for supramolecular structures and
functional units. Angew. Chem. Int. Ed. Engl 33, 803-822.
Wilmott, J. M. & Znaiden, A. P. (1989). Composition and method for reducing wrinkles. US-
4826828.
Wouessidjewe, D., Crassous, A., Duchêne, D., Coleman, A. W., Rysaneck, N., Tsoucaris, G.,
Perly, B. & Djedaïni, F. (1989). Inclusion of spironolactone in cyclomaltoheptaose, a guest
affected by the hospitality of the host. Carbohydrate Research 192, 313-322.
Wouessidjewe, D., Skiba, M., Leroy-Lechat, F., Lemos-Senna, E., Puisieux, F. & Duchêne, D.
(1996). A new concept in drug delivery based on "skirt-shaped cyclodextrin aggregates"
Present states and future prospects. STP Pharma 6(1), 21-28.
Y
Yabe, A., Kawabata, Y., Nino, H., Tanaka, M., Ouchi, A., Takahashi, H., Tamura, S., Tagaki,
W., Nakahara, H. & Fukuda, K. (1988). Cis-trans isomerization of the azobenzenes included
as guests in Langmuir-Blodgett films of amphiphilic beta-cyclodextrin. Chemistry letters, 1-4.
Z
Zile, M. H. & Cullum, M. E. (1983). Proc.Soc.Exp.Biol.Med.
Zhang, P., Parrot-Lopez, H., Tchoreloff, P., Bazkin, A., Ling, C. C., deRango, C. & Coleman,
A. W. (1992). Self organizing systems based on amphiphic cyclodextrin diesters. J. Phys.
Org. Chem. 5, 518-528.
222
222

1 Bélorgey, O., Benattar, J-J., Phys. Rev. Lett. 66, 313 (1991).
2 Benattar, J-J., Schalchli, A., Bélorgey, O. J., Phys. I France 2 (6), 955 (1992).
3 Benattar, J-J., Schlachli, A., Sentenac, D., Rieutord, F., Progr. Colloid Polym. Sci. 105, 113
(1997).
4 Sentenac, D., Benattar, J-J., Phys. Rev. Lett. 81 (1), 160 (1998).
5 Exerowa, D., Kruglykov, P. M., in “Foam and foam films, Theory, Experiment, Application”
Elsevier , Amsterdam, 1998.
6 Guenoun, P., Schlachli, A., Sentenac, D., Mays, J. W., Benattar, J-J., Phys. Rev. Lett. 74 (18),
3628 (1995).
7 Millet, F., Benattar, J-J., Perrin, P., Phys. Rev. E 60, 2045 (1999).
8 Cuvillier, N, Millet, F., Petkova,V., Nedyalkov, M., Benattar, J-J., Langmuir 16 (11), 5029
(2000).
9 Benattar, J-J., Nedyalkov, M., Prost, J., Verger, R., Tiss, A., Guibert, C., Phys. Rev. Lett. 82, 5097
(1999).
10 Petkova, V., Nedyalkov, M., Benattar, J-J, to be published in Biophysical Journal vol 82, (2002).
11 Auzély-Velty, R., Perly, B., Taché, O., Zemb, Th., Jéhan, P., Guenot, P., Dalbiez, J. P., Djedaïni-
Pilard, F., Carbohydr. Res. 318, 82 (1999).
12 Auzély-Velty, R., Djedaïni-Pilard, F., Désert, S., Perly, B., Zemb, Th., Langmuir 16 (8), 3727
(2000).
13 Auzély-Velty, R., Péan, C., Djedaïni-Pilard, F., Zemb, Th., Perly, B., Langmuir 17, 504 (2001).
14 Djedaïni-Pilard, F., Désalos, J., Perly, B., Tetrahedron Lett. 34, 2457 (1993).
15 Gosnat, M., Djedaïni-Pilard, F., Perly, B., J. Chem. Phys. 92, 1777 (1995).
16 Yamanaka, T., Hayashi, M., Matuura, R., J. Colloid Interface Sci. 88, 458 (1982).
17 Nikolova, A., Koynova, R., Tenchov, B., Exerowa, D., Chem. Phys. Lipids 83(2) 111 (1996).
18 Exerowa, D., Zacharieva, M., Cohen, R., Platikanov, D., Colloid Polym. Sci. 257, 1089 (1979).
19 Toca-Herrera, J. L., Müller, H.-J., Kruster, R., Exerowa, D., Möhwald, H., Colloids Surf. A 144,
319 (1998).
20 Schalchli, A., Sentenac, D., Benattar, J-J., J. Chem. Soc. Faraday Trans. 92, 553 (1996).
21 Benattar, J-J., Schalchli, A., Sentenac, D., Rieutord, F., Prog. Colloid Polym. Sci. 105, 113
(1997).
22 Born, F., Wolf, E., in “Principles of optics”, 6th ed., p.51, Pergamon , London, 1984.
23 Parrat, L. G., Phys. Rev. E.,95, 359 (1954).
24 Schalchli, A., Benattar, J-J., Tchoreloff, P., Zhang, P., Coleman, A. W., Langmuir 9 (8),1968
(1993).

25 Deinum, G., van Langen, H., van Ginkel, G., Levine, Y. K., Biochemistry 27, 852 (1988).
26 Mc Mullen, T. P. W., Lewis, A. H., McElhaney, R. N., Biochemistry 32, 516 (1993).
27 Mc Mullen, T. P. W., McElhaney, R. N., Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1, 83 (1996).
28 Yeagle, P., L., Biochim. Biophys. Acta 822, 267 (1985).
29 Trouard, T., P., Nevzorov, A. A., Alam, T. M., Job, C., Zajicek, J, Brown, M. J., Chem. Phys. 110
(17), 8802 (1999).
30 Debouzy, J. C., Fauvelle, F., Crouzy, S., Girault, L., Chapron, Y., Göschl, M., Gadelle, A., J.
Pharm. Sci. 87 (1), 59 (1998).
31 Lin, J., Djedaïni-Pilard, F., Guénot, P., Perly, B., Supramolecular Chemistry 7, 175 (1996).
32 Péan, C., Créminon, C., Wijkhuisen, A., Perly, B., Djedaïni-Pilard, F., J. Chem. Phys. 96, 1486
(1999).