Macra® Lp(a) Dosage immunoenzymatique (ELISA ... - Stago BNL

Macra® Lp(a)
Dosage immunoenzymatique (ELISA)
USAGE PRÉVU
La trousse de dosage immunoenzymatique (ELISA)
Macra® Lp(a) est un instrument de diagnostic in vitro
destiné à la mesure quantitative, dans le sérum ou le
plasma humain, de la lipoprotéine (a) dans le but d’évaluer
le risque de coronaropathie parmi certaines populations
spécifiques, parallèlement à d’autres facteurs de risque.
Pour usage diagnostique in vitro.
1 Synthèse et explication du test
La lipoprotéine (a) [Lp(a)] est une particule lipidique sphérique présente principalement
selon une échelle de densités de 1,006 à 1,021 g/ml. De composition lipidique centrale
similaire aux lipoprotéines de basse densité (LDL) et présentant une apolipoprotéine de
surface B-100 (apo B), la Lp(a) diffère des LDL par une glycoprotéine supplémentaire,
l’apolipoprotéine (a) [apo(a)]. La portion apo(a) de la Lp(a) est une structure hétérogène 1-
2 résultant de la variation du nombre de domaines protéiques connus sous le nom de
kringle. On sait que l’un de ces domaines se répète de 12 à 52 fois en formant pas
moins de 40 isoformes de tailles et de poids différents. 3
De multiples études, dès les années 70, ont rapporté une association entre Lp(a) et
coronaropathies. 4-8 Depuis, une quantité considérable de littérature s’est accumulée,
insistant davantage sur l’association entre le taux élevé de Lp(a) et le risque accru de
coronaropathie et de coronaropathie précoce parmi la population blanche européenne
masculine. 9 Des études portant sur des familles et sur différentes populations ethniques
ont montré que les taux de Lp(a) sont déterminés génétiquement. 9-12 Les familles
présentant des antécédents de coronaropathies affichent fréquemment des taux de
Lp(a) supérieurs aux taux escomptés. Les taux de Lp(a) peuvent varier largement parmi
les différentes populations ethniques. Les Africains ou les personnes d’origine africaine
ont en général des taux de Lp(a) supérieurs à ceux des populations blanches
européennes ou asiatiques, tandis que les Américains natifs présentent habituellement
des taux inférieurs à ceux des populations blanches européennes. La variation des taux
de Lp(a) en fonction de la population ethnique nécessite une interprétation prudente des
résultats, interprétation qui doit être basée sur la connaissance du patient et les autres
facteurs de risque cardiaques qu’il peut présenter. 13
L’annexe I fournit des informations plus détaillées relatives à l'association entre les taux
de lipoprotéine (a) et la coronaropathie et les taux escomptés dans différentes
populations.
2 Principe de l'analyse
La trousse de dosage Macra® Lp(a) repose sur le principe du dosage
immunoenzymatique (ELISA). Ce test est un dosage sandwich ayant recours à la fois à
un anticorps monoclonal et à des anticorps polyclonaux qui se lient spécifiquement à la
fraction apolipoprotéine (a) de la Lp(a). L’anticorps monoclonal est enduit dans les puits
d’une plaque de microtitrage (figure 1) et utilisé pour « capturer » la Lp(a) de l’échantillon
pendant une incubation d’une heure à température ambiante. Après lavage des puits de
la plaque, un conjugué avec anti-Lp(a) polyclonal et peroxydase du raifort (HRP) est
ajouté de sorte à se lier aux autres sites de la molécule de Lp(a) en formant un
sandwich. Au bout de 20 minutes, la plaque est lavée une deuxième fois puis le
sandwich Lp(a)/anticorps des puits de la plaque est mis en réaction avec un substrat
pour le HRP (peroxyde d’hydrogène) et un chromogène (o-phénylènediamine),
produisant une solution colorée. Au bout de 20 minutes, la réaction est stoppée à l’aide
d'acide sulfurique: la couleur développée est directement proportionnelle à la
concentration de Lp(a) dans l'échantillon. La concentration de la masse Lp(a) (mg/dl) est
quantitativement déterminée par comparaison entre l’absorbance de l’échantillon et une
courbe d’étalonnage préparée avec des concentrations connues de Lp(a).
Conjugué anti-Lp(a)
polyclonal – HRP
Particule Lp(a)
Anti-Lp(a) monoclonal
(phase solide)
Figure 1: Puits type
3 Réactifs fournis (en quantité suffisante pour 96 puits)
Tous les matériaux fournis sont destinés à des procédures de diagnostic in vitro. Dès
leur réception, tous les réactifs doivent être conservés au réfrigérateur (2-8°C). Les
dates d’expiration des composants sont indiquées sur les étiquettes des fioles.
N’intervertissez pas les différents réactifs d’une trousse avec ceux d’une trousse d’un
autre lot. Tous les composants doivent être utilisés conformément aux indications.
1. BARRETTES DE MICROTITRAGE Lp(a): 12 barrettes (1 x 8 puits) sur un support.
Anti-Lp(a) (monoclonal) de souris immobilisé sur une barrette de microtitrage.
Conservez les barrettes inutilisées dans le sachet métallisé soigneusement refermé
avec son sachet de dessiccateur pendant le stockage.
2. ÉTALONS Lp(a): 1 x 2 ml chacun en six (6) concentrations. Fournis prêts à
l'emploi. Contiennent de la Lp(a) dans du plasma humain avec une solution
tampon, des agents de stabilisation protéique et de la Proclin. Reportez-vous à la
section « Précautions » pour de plus amples informations. Bleu de bromophénol
ajouté pour coloration.
3. CONTRÔLES Lp(a): 1 x 2 ml chacun en deux (2) concentrations. Fournis prêts à
l'emploi. Contiennent de la Lp(a) dans du plasma humain avec une solution
tampon, des agents de stabilisation protéique et de la Proclin. Reportez-vous à la
section « Précautions » pour de plus amples informations. Une fourchette est
indiquée pour chaque concentration de contrôle sur la fiche fournie avec chaque
trousse. Bleu de bromophénol ajouté pour coloration.
4. DILUANT POUR ÉCHANTILLON Lp(a): 2 x 45 ml de solution tampon contenant
du bleu de bromophénol pour la coloration, des agents de stabilisation protéique et
de la Proclin.
5. TAMPON DE LAVAGE CONCENTRÉ (20X): 1 x 50 ml de solution tampon
contenant de la Proclin.
6. CONJUGUÉ ANTI-Lp(a)-HRP: 1 x 11 ml de HRP conjugué à de l’anti-Lp(a)
(chèvre, polyclonal) dans une solution tampon avec des agents de stabilisation
protéique et de la Proclin. Bleu de bromophénol ajouté pour coloration.
7. RÉACTIF OPD: 1 x 5 tablettes, chaque tablette contient du chlorhydrate de ophénylènediamine
et des excipients. Évitez tout contact avec la peau.
8. RÉACTIF COLORIMÉTRIQUE: 1 x 50 ml de solution tampon avec peroxyde
d’hydrogène.
9. RÉACTIF D’ARRÊT: 1 x 10 ml d’acide sulfurique 2N. Évitez tout contact avec la
peau et les yeux.
4 Matériaux requis mais non fournis
1. Pipettes: - 10 µl, 100 µl
- Pipette à canaux multiples 50-100 µl
- 2 ml, 5 ml, 50 ml
2. Mélangeur: Mélangeur vortex ou équivalent.
3. Agitateur orbital: Possibilité de maintenir 120 ± 5 t/min.
REMARQUE: le diamètre orbital des agitateurs/secoueurs varie; la vitesse
recommandée s’applique à un agitateur avec une orbite de 0,75 pouces (19 mm).
Pour les agitateurs dont le diamètre orbital est différent, la vitesse devra être
adaptée en conséquence.
4. Système de lavage des plaques: Capacité de lavage d’une barrette à huit
(8) puits ou d’une plaque de 96 puits. Ajustez le
volume pour distribuer 300 µl par puits.
5. Lecteur de plaques: Spectrophotomètre pour microplaques adapté à la
mesure de l’absorbance à 492 nm (490 nm également
acceptable). Reportez-vous au manuel de
fonctionnement du fabricant pour procéder à
l’installation, au fonctionnement et à l’entretien corrects
et connaître les risques.
6. Divers - Tubes de dosage en verre ou borosilicate
- Pointes de pipette
- Réservoirs de réactifs
- Conteneur pour déchets infectieux
- Gants
- Pinces en plastique
- Une éprouvette graduée de 1 l
5 Précautions
1. Lisez entièrement la notice avant d’utiliser l’un des matériaux.
2. Les échantillons reçus pour analyse de même que les étalons et les contrôles de la
trousse contiennent du plasma ou du sérum humain et doivent être manipulés
comme des agents infectieux potentiels par exemple pour le virus de l'hépatite B
ou C ou le VIH de types 1 et 2. Reportez-vous à la publication HHS (CDC) 84-8395
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories.
3. Utilisez des gants jetables lorsque vous manipulez les échantillons.
4. Les tablettes d’OPD ne doivent pas être mises en contact avec une surface
métallique. Utilisez les pinces en plastique pour manipuler les tablettes d’OPD.
5. L’exactitude et la précision des résultats sont généralement améliorées par
l’utilisation de pipettes correctement calibrées.
6. Ne pipetez pas à la bouche.
7. Ne laissez pas les puits s’assécher après le lavage.
8. Pipetez tous les réactifs au fond des puits de microtitrage.
9. Changez les pointes de pipettes pour chaque nouvel étalon, contrôle, réactif et
échantillon.
10. N'utilisez pas les réactifs au-delà de leur date de péremption.
11. Ne mélangez pas les réactifs appartenant à des lots différents.
12. L’impact de l’utilisation de tubes en polystyrène pour le stockage de l’échantillon ou
de la dilution n’a pas été étudié pour cette procédure. En conséquence,
N’UTILISEZ PAS DE TUBES EN POLYSTYRÈNE dans ce test.
13. Les épreuves doivent comprendre au moins deux contrôles fiables pour vérifier la
performance de la trousse.
14. Il est recommandé de préparer des plasmas ou des sérums de contrôle internes et
d'établir vos propres fourchettes afin de les utiliser comme contrôle de qualité
supplémentaire.
15. Tous les étalons, les contrôles et les échantillons doivent être testés en double.
16. Retirez du support les barrettes qui ne seront pas utilisées pour le test donné;
conservez-les de manière appropriée (voir la section Réactifs fournis). Étiquetez
toutes les barrettes utilisées. Si nécessaire pour le lavage des plaques, remplacez
les barrettes retirées par d’anciennes barrettes utilisées.
17. Vous obtiendrez des résultats plus précis en retirant tout le liquide résiduel de la
plaque en retournant la plaque et en la frappant fermement contre un tampon
absorbant après le lavage. REMARQUE: assurez-vous que les barrettes sont
étiquetées pour le cas où elles se délogeraient du support.
18. Manipulez la plaque par le support pour éviter tout contact avec le fond des puits,
ce qui pourrait affecter vos résultats.
19. Lavez-vous soigneusement les mains à la fin de la procédure de test.
6 Prélèvement et conservation des échantillons
Les directives suivantes, basées sur les recommandations du Laboratory
Standardization Panel du NCEP pour les tests sur les lipides et les lipoprotéines,
permettent de minimiser les effets des facteurs pré-analytiques sur les tests de la Lp(a).
1. Le profil de lipides et de lipoprotéines du sujet ne doit être mesuré que si la
personne présente un statut métabolique régulier.
2. Les sujets doivent conserver leur régime et leur poids initiaux pendant au moins 2
semaines avant la détermination des lipides et lipoprotéines.
3. D’autres mesures doivent être réalisées dans les 2 mois qui suivent, à des
intervalles d’une semaine au moins, avant de prendre une décision médicale quant
à une action future.
4. Les sujets ne doivent pas pratiquer d’exercice physique violent dans les 24 heures
qui précèdent le test.
5. Il est possible d’utiliser des échantillons à jeun ou non pour la détection de la Lp(a).
6. Le sujet doit rester assis pendant au moins 5 minutes avant le prélèvement de
l’échantillon.
7. Les garrots ne doivent pas rester en place plus d’une minute pendant la ponction
veineuse.
8. Tous les échantillons sanguins doivent être considérés comme potentiellement
infectieux et manipulés en conséquence.
9. Ce test peut se pratiquer sur un échantillon plasmatique ou un échantillon de
sérum. L’EDTA ou l’héparine peuvent être utilisés comme anticoagulants pour le
plasma. Généralement, l’EDTA est l’anticoagulant privilégié pour le panel de
lipides/lipoprotéines car il a été démontré que l’héparine diminuait les valeurs de
triglycérides de manière artefactuelle.
10. Les échantillons Lp(a) de sérum et de plasma nécessitent une manipulation
particulière. Les échantillons peuvent être conservés au réfrigérateur (2-8°C) si
l’analyse a lieu dans les 48 heures qui suivent le prélèvement. Dans le cas
contraire, ils doivent être conservés à -80°C jusqu'à l’analyse.
11. La vitamine PP et les œstrogènes diminuent de manière prouvée les taux de
Lp(a). 14-21 L’utilisation des bêtabloquants, d’autres médicaments anti-dépresseurs,
l’alcool et le tabac, connus pour affecter les autres lipides, n’ont aucun effet sur les
taux de Lp(a).
Le sang doit être prélevé à l’aide de techniques de ponction veineuse standard soit
dans des tubes EDTA soit dans des tubes de sérum conservés sur de la glace. En
ce qui concerne le sérum, le sang doit coaguler pendant 30 à 60 minutes à 2-8°C
avant d’être séparé. Pour les échantillons EDTA, le plasma doit être séparé des
cellules par une courte étape de centrifugation réfrigérée conforme aux directives
NCEP. L’impact de l’utilisation de récipients en polystyrène pour le stockage de
l’échantillon n’a pas été étudié pour cette procédure, l’utilisation de ces récipients
n’est donc pas recommandée.
7 Préparation du réactif
1. Attendez que tous les réactifs parviennent à température ambiante (18-25°C)
avant de les utiliser. Mélangez soigneusement tous les réactifs avant usage.
2. Préparation des échantillons (1:201): diluez tous les échantillons à 1:201 avec le
diluant en mélangeant 10 µl d'échantillon avec 2 ml de diluant dans des tubes en
verre puis vortexez. Changez les pointes de pipettes pour chaque nouvel
échantillon. N’UTILISEZ PAS DE TUBES EN POLYSTYRÈNE pour la dilution des
échantillons.
3. Tampon de lavage (20X): préparez le tampon de lavage en diluant 50 ml de
concentré avec de l’eau distillée ou déminéralisée pour obtenir un volume final d’un
litre. Laissez se dissoudre tout cristal dans le concentré à température ambiante
avant de mélanger soigneusement puis de l’utiliser. Le tampon de lavage dilué
peut être conservé à température ambiante pendant 2 semaines ou à 2-8°C
pendant 3 mois. 300 ml au moins seront nécessaires pour chaque plaque.
4. Solution révélatrice: préparez suffisamment de solution révélatrice fraîche
20 minutes avant utilisation en dissolvant une tablette d’OPD dans 5 ml de réactif
colorimétrique pour 40 puits de titrage. La solution doit être transparente à jaune
pâle. Ne l’utilisez pas si elle est jaune foncé.
8 Protocole opératoire
1. Attendez que les réactifs parviennent à température ambiante (18-25°C) avant de
les utiliser. Mélangez bien tous les réactifs avant utilisation.
2. La plaque revêtue d’anticorps est conditionnée avec un sachet de dessiccateur.
Assurez-vous soigneusement que le sachet de dessiccateur n’est pas endommagé
lorsque le conditionnement est ouvert. Replacez les barrettes de microtitrage Lp(a)
inutilisées dans leur sachet d’origine avec le sachet de dessiccateur fourni et
scellez le sachet avec du ruban adhésif.
3. Positionnement des barrettes: la figure 2 montre un exemple de positionnement de
plaque typique.
Échantillon Code
Étalon 0 mg/dl S1
Étalon 5 mg/dl S2
Étalon 10 mg/dl S3
Étalon 20 mg/dl S4
Étalon 40 mg/dl S5
Étalon 80 mg/dl S6
Contrôle de concentration 1 C1
Contrôle de concentration 2 C2
Échantillon à tester 1 U1
Échantillon à tester 2 U2
Etc.
Figure 2
A S1 S1 Ul Ul U9 U9
B S2 S2 U2 U2 U10 U10
C S3 S3 U3 U3 U11 U11
D S4 S4 U4 U4 U12 U12
E S5 S5 U5 U5 U13 U13
F S6 S6 U6 U6 U14 U14
G C1 C1 U7 U7 U15 U15
H C2 C2 U8 U8 U16 U16
1 2 3 4 5 6
4. Diluez tous les échantillons de sérum/plasma à 1:201 dans des tubes en verre en
ajoutant 10 µl d’échantillon dans 2 ml de diluant. Vortexez brièvement pour
mélanger. N’UTILISEZ PAS DE TUBES EN POLYSTYRÈNE pour la dilution des
échantillons.
5. Pipetez 100 µl d'étalon et de contrôle en double au fond des puits de titrage
comme le montre la figure 2.
REMARQUE: les étalons et les contrôles sont fournis à une dilution de 1:201, il
n’est donc pas nécessaire de diluer ces réactifs avec le diluant.
6. Pipetez 100 µl d'échantillons dilués en double au fond de leurs puits respectifs.
7. Incubez pendant une heure ± 2 minutes à température ambiante contrôlée (18-
25°C) sur un agitateur orbital à 120 ± 5 t/min. Démarrez le chronométrage après
ajout du dernier échantillon.
8. Lavage:
• Lavage semi-automatique/automatique. Aspirez la plaque et lavez-la deux
fois avec un système de lavage pour microplaques.
Tournez la plaque de 180 degrés et lavez-la deux fois de plus. Inversez la
plaque et frappez-la fermement sur le tampon absorbant pour retirer tout
1-F
excès de solution de lavage.
• Lavage manuel. En utilisant une rampe de lavage à huit ou douze canaux,
aspirez et lavez chaque puits quatre fois. Inversez la plaque et frappez-la
fermement sur un tampon absorbant pour retirer tout excès de solution de
lavage.
REMARQUE. La précision sera accrue en retirant autant de liquide résiduel que
possible. L’étiquetage des barrettes de test permettra de déterminer la position des
barrettes dans le cas où elles se délogeraient du support.
9. À l’aide d’une pipette à canaux multiples, ajoutez 100 µl de conjugué anti-Lp(a)-
HRP au fond de chaque puits.
10. Incubez pendant 20 minutes ± 1 minute à température ambiante contrôlée (18-
25°C) sur un agitateur orbital à 120 ± 5 t/min.
11. Une fois l’incubation du conjugué commencée, préparez la solution révélatrice en
ajoutant une tablette d’OPD pour 5 ml de réactif colorimétrique. Cette quantité est
suffisante pour cinq barrettes. Laissez se dissoudre complètement la ou les
tablettes puis vortexez.
12. Répétez l’étape de lavage 8.
13. À l’aide d’une pipette à canaux multiples équipée de pointes propres, pipetez
100 µl de solution révélatrice dans chaque puits et incubez 20 minutes ± 1 minute
à température ambiante contrôlée (18-25°C) sur un agitateur orbital à 120 ±
5 t/min. Il est recommandé d’ajouter la solution révélatrice à intervalles
chronométrés et d’ajouter le réactif d’arrêt selon les mêmes intervalles après
l’étape de révélation de couleur.
REMARQUE: si les valeurs d’absorbance des étalons sont supérieures à la fourchette
linéaire de l’instrumentation disponible, il est possible de réduire le chronométrage de
l’étape de développement colorimétrique de vingt (20) minutes à un minimum de huit (8)
minutes sans que les performances du dosage en soient affectées. Si l’étape de
développement colorimétrique est réduite, une attention toute particulière devra être
portée au chronométrage de l’ajout de réactif d’arrêt.
14. Pipetez 50 µl de réactif d'arrêt dans chaque puits en utilisant une pipette à canaux
multiples.
15. Étalonnez le lecteur de microplaques sur un puits d’étalon 0 mg/dl. Lisez la plaque
à 492 nm (490 nm également acceptable) dans les 15 minutes qui suivent l’ajout
du réactif d’arrêt.
9 Contrôle de qualité
1. N'utilisez pas les réactifs au-delà de leur date de péremption.
2. N’intervertissez pas les réactifs de la trousse avec ceux de la trousse d’un autre
lot.
3. Les épreuves doivent comprendre au moins deux contrôles fiables pour vérifier la
performance de la trousse.
4. Nous vous recommandons de préparer des plasmas ou des sérums de contrôle
internes et d'établir vos propres fourchettes afin de les utiliser comme contrôle de
qualité supplémentaire.
5. Les données de contrôle pour les échantillons de contrôle internes doivent être
reportées sur un graphique Levey Jennings pour évaluer la tendance des résultats.
Pour de plus amples informations, lisez:
Levey S, Jennings EK The rise of control charts in the clinical laboratory. Am J Clin
Pathol 20: 1059; 1950.
6. Toutes les valeurs pour les contrôles livrés avec la trousse doivent se trouver dans
la fourchette indiquée pour valider l’épreuve et assurer un résultat précis et
acceptable pour l’échantillon du patient.
7. De nombreuses références sont disponibles pour établir des programmes de
contrôle de qualité des épreuves. Pour obtenir des exemples ou de plus amples
informations, lisez:
Westgard JO, Groth T, et al. Principles for developing improved quality control
procedures. Clin Lab Invest Suppl 172: 19-41; 1984.
Dudley RA, Edwards P, et al. Guidelines for immuno-assay data processing. Clin
Chem 31(8): 1264-1271; 1985.
Westgard 10, Stein B, Automated selection of statistical quality-control procedures
to assure meeting clinical or analytical quality requirements. Clin Chem 43(2):
400-403; 1997.
10 Résultats
REMARQUE: TOUTES LES DONNÉES PRÉSENTÉES LE SONT UNIQUEMENT
DANS UN BUT DESCRIPTIF. CES DONNÉES NE DOIVENT JAMAIS ÊTRE
SUBSTITUÉES À DES VALEURS OBTENUES À L’AIDE DE LA TROUSSE DE
DOSAGE
1. Faites la moyenne des lectures d’absorbance pour les doubles des étalons,
contrôles et échantillons à tester.f
2. Tracez une courbe de l’absorbance moyenne rapportée à la Lp(a) en mg/dl pour
chaque étalon (voir figure 3 et tableau 1). Pour ajustement de la courbe, vous
pouvez utiliser une transformation point à point, 4 paramètres ou logarithmique.
3. Déduisez les valeurs des échantillons à tester et des contrôles à partir de la courbe
d’étalonnage comme celle illustrée dans la figure 3 et le tableau 1. Assurez-vous
que les résultats de contrôle correspondent aux critères de contrôle de qualité
acceptés avant de reporter les résultats de l'échantillon.
Figure 3: Courbe d’étalonnage type
Absorbance à
492 nm
2,5
2
1,5
1
0,5
0
5 10 20 50 80
Lp(a) en mg/dl
Tableau 1
Données type
Échantillon Code Abs Abs
moyenne
ValeurLp(a)
mg/dl
%D.O.
CV
Étalon 0 mg/dl S1 0,000 0,000 - -
-0,001
Étalon 5 mg/dl S2 0,257 0,257 - 0,0
0,257
Étalon 10 mg/dl S3 0,468 0,467 - 0,4
0,465
Étalon 20 mg/dl S4 0,835 0,832 - 0,4
0,830
Étalon 40 mg/dl S5 1,396 1,391 - 0,6
1,385
Étalon 80 mg/dl S6 2,014 2,000 - 1,1
1,985
Contrôle de concentration 1 0,746 0,733 16,7 2,5
0,720
Contrôle de concentration 2 1,343 1,323 36,8 2,1
1,303
Échantillon à tester 1 0,157 0,156 3,0 1,0
0,155
Échantillon à tester 2 1,250 1,242 34,7 0,6
1,233
Etc.
REMARQUE: aucune correction n’est nécessaire pour la dilution d’échantillon à 1:201 car les étalons sont fournis sous
forme pré-diluée.
11 Limites de la procédure
1. Il n’est pas recommandé d’extrapoler, à partir de la courbe, des valeurs inférieures
à 5 mg/dl ou supérieures à 80 mg/dl. Les échantillons de plasma ou de sérum dont
les concentrations de Lp(a) sont supérieures à 80 mg/dl ou inférieures à 5 mg/dl
doivent être reportées comme telles.
2. Si vous souhaitez obtenir une valeur quantitative supérieure à 80 mg/dl pour un
échantillon, celui-ci doit être plus amplement dilué selon la fourchette de dosage
avec le diluant. La valeur obtenue doit être multipliée par ce facteur de dilution pour
obtenir la valeur de Lp(a) en mg/dl.
3. Les échantillons ne doivent pas être préservés à l’aide d'azide de sodium, car il
peut affecter le processus de développement de couleur.
4. Interférences potentielles – Les échantillons contenant les substances suivantes
aux concentrations listées n’interfèrent pas avec le test pour doser la Lp(a).
a. Triglycéride – 2500 mg/dl
b. Hémoglobine – 5 g/dl
c. Bilirubine – 2,5 mg/dl
5. Ce test peut se pratiquer sur un échantillon plasmatique ou un échantillon de
sérum. L’EDTA ou l’héparine peuvent être utilisés comme anticoagulants pour le
plasma. Généralement, l’EDTA est l’anticoagulant privilégié pour le panel de
lipides/lipoprotéines car il a été démontré que l’héparine diminuait les valeurs de
triglycérides de manière artefactuelle.
6. Les échantillons Lp(a) de sérum et de plasma nécessitent une manipulation
particulière. Les échantillons peuvent être conservés au réfrigérateur (2-8°C) si
l’analyse a lieu dans les 48 heures qui suivent le prélèvement. Dans le cas
contraire, ils doivent être conservés à -80°C jusqu'à l’analyse.
7. La vitamine PP et les œstrogènes sont connus pour diminuer les taux de Lp(a). 14-21
Le traitement ne devra pas être initié en se basant uniquement sur une valeur de
Lp(a).
12 Val eurs attendues
Les taux de lipoprotéine (a) sont influencés par des facteurs génétiques et varient selon
la population ethnique. Les valeurs suivantes attendueschez des sujets en bonne santé
sont citées pour référence uniquement. Il est recommandé à chaque laboratoire d’établir
sa propre fourchette de référence en tenant compte de la méthode de dosage utilisée.
Vous obtiendrez des indications pour définir les intervalles de référence qui
correspondent aux exigences minimum de fiabilité et d’utilité dans le document NCCLS
"C28-A How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory,
Approved Guideline 1995"
Population Taux de Lp(a) attendus en
mg/dl (Moyenne ± ET)
Références
(taille de l’échantillon
représentatif)
Blancs européens / Asiatiques 14 ± 17 9, 22, 23 (2678)
Américains d’origine mexicaine 11 ± 1,1 24, 25 (316)
Africains et descendants 28 ± 22 10, 22, 26 (4165)
Américains natifs et descendants 7 ± 14 24, 25, 27 (4500)
D’après les informations disponibles, le taux de 30 mg/dl de Lp(a) est un seuil de
différenciation de risque modéré pour les populations blanches européennes et
constitue, s’il est utilisé en association avec d’autres facteurs de risque cardiaques
documentés, un outil utile pour déterminer le risque de CHD prématuré particulièrement
chez des hommes de Causasian. 28,29 Cependant, si l’on considère la nature des
indicateurs de risque de coronaropathie pour les lipides et lipoprotéines, une surveillance
rapprochée peut être justifiée chez les patients dont les taux de Lp(a) sont supérieurs à
20 mg/dl, tout particulièrement si d’autres facteurs de risque sont présents.
Bien qu’un taux de Lp(a) supérieur à 30 mg/dl déterminé par le dosage Macra® Lp(a)
augmente la probabilité de développement d’athérosclérose ou de coronaropathie, tous
les individus avec un taux élevé de Lp(a) ne développeront pas systématiquement une
maladie significative. Chez certains individus, une valeur Lp(a) inférieure à 30 mg/dl
n’exclut pas une athérosclérose significative ou une coronaropathie. L’évaluation de ces
maladies doit être faite en tenant compte des antécédents du patient, de son ethnicité,
des informations cliniques et des autres tests cliniques de laboratoire.
D’autres données sont actuellement collectées afin de parvenir à établir des fourchettes
de valeurs attendues pour d’autres populations.
13 Caractéristiques de performance spécifiques
A. Linéarité de la dilution
Trois échantillons ont été dilués avec du diluant pour échantillon avant de déterminer le
taux de Lp(a). La valeur de récupération en pourcentage a été calculée en divisant la
valeur observée par la valeur attendue et en multipliant par 100 (REMARQUE: chaque
échantillon a été précédemment dilué à 1:201).

Valeur attendue Valeur observée %
Dilution Échantillon (mg/dl) (mg/dl) Récupération
1:1 1 68,1 68,1 100
3:4 51,1 49,2 96
1:2 34,1 36,8 108
1:4 17,0 17,9 105
1:8 8,5 8,5 100
1:1 2 40,1 40,1 100
3:4 30,0 31,8 106
1:2 20,0 21,8 109
1:4 10,0 10,7 107
1:8 5,0 4,8 96
1:1 3 29,8 29,8 100
3:4 22,4 21,8 97
1:2 14,9 15,1 101
1:4 7,5 7,8 104
1:8 3,7* 3,1 4
*En dehors de la fourchette de dosage recommandée.
B. Récupération
Une quantité connue de Lp(a) a été ajoutée à deux échantillons dilués. La récupération a
été calculée en divisant la valeur observée par la valeur attendue et en multipliant par
100.
Valeur Lp(a) Quantité Valeur attendue Valeur
%
enrichie
observée
Échantillon (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) Récupération
1 12,3 0,0 12,3 12,3 100
5,0 17,3 16,1 93
10,0 22,3 21,9 98
20,0 32,3 26,8 83
40,0 52,3 42,0 80
2 31,3 0,0 31,3 31,3 100
5,0 36,3 33,5 92
10,0 41,3 38,3 93
20,0 51,3 46,7 91
40,0 71,3 64,4 90
C. Précision
1. Variation intrasérie
Les données pour la précision intrasérie ont été obtenues à partir de cinq échantillons de
plasma humain, chaque échantillon étant répliqué quatre fois.
Moyenne %
Échantillon (mg/dl) ET C.V.
1 7,7 0,8 1,4
2 8,1 0,5 6,4
3 14,5 0,6 4,0
4 28,0 2,0 7,0
5 65,7 2,0 6,3
2. Variation interséries
Les données pour la précision interséries ont été obtenues à partir de quatre
échantillons de plasma humain dosés en doublets dans huit épreuves.
Moyenne %
Échantillon (mg/dl) ET C.V.
1 10,3 0,8 7,8
2 18,3 1,1 6,0
3 37,8 3,2 8,5
4 67,8 8,6 12,7
D. Spécificité
Les substances suivantes ont été ajoutées aux échantillons de plasma humain
comprenant des taux variés de Lp(a). Aucune réactivité croisée détectable n’a été
observée jusqu’aux taux indiqués.
Composé Concentration Réactivité croisée
Plasminogène 200 mg/dL Aucune
LDL 166 mg/dl Aucune
HDL 400 mg/dl Aucune
VLDL 200 mg/dl Aucune
E. Niveau de dépistage minimum
Le niveau de dépistage minimum du test Lp(a) a été obtenu par dosage de la courbe
d’étalonnage cinq fois, calcul de l’écart moyen et de l’écart-type pour les étalons, ajout
de deux écarts-types à l’absorbance moyenne pour l’étalon 0 mg/dl et interpolation de la
valeur Lp(a). La valeur Lp(a) obtenue a été constamment inférieure ou égale à 0,8 mg/dl.
F. Corrélation avec d’autres méthodes: voir annexe II
Annexe I – Contexte de la lipoprotéine (a), son association avec le risque de
coronaropathie et variations chez les différentes populations
La lipoprotéine (a) [Lp(a)] est une particule lipidique sphérique présente principalement
selon une échelle de densités par ultracentrifugation de 1,006 à 1,021 g/ml. De
composition lipidique centrale similaire aux lipoprotéines de basse densité (LDL) et
présentant une apolipoprotéine de surface B-100 (apo B), la Lp(a) diffère des LDL par
une glycoprotéine supplémentaire, l’apolipoprotéine (a) [apo(a)]. L’apo(a) est liée par
covalence à l’apolipoprotéine B-100 (apo B) par liaison disulfure. Les études ont montré
que la portion apo(a) de la Lp(a) est une structure hétérogène. 1-2 Cette hétérogénéité
résulte de la variation du nombre de domaines protéiques connus sous le nom de
kringle. On sait que l’un de ces domaines, kringle 4, se répète en formant de
nombreuses isoformes de tailles et poids différents. Pas moins de 40 isoformes
différentes ont été rapportées, présentant de 12 à 52 répétitions du kringle 4. 3
La séquence d’ADN c 30 et la structure immunochimique de l’apo(a) ont été observées
comme étrangement similaires aux kringles 4 et 5 du plasminogène. En raison de cette
similitude, la Lp(a) inhibe la fibrinolyse par compétition avec le plasminogène pour la
fibrine. 31,32 En outre, la Lp(a) se dépose dans les plaques d’athérome, favorisant
l’obstruction des artères. 33,34 Krempler 35 a montré que l’apo(a) est synthétisée
indépendamment des autres lipoprotéines puis se lie aux particules du plasma contenant
de l’apo B. Albers 36 a mis en évidence, en revanche, le fait que les taux plasmatiques
d’apo B ne sont pas corrélés aux taux de Lp(a). La Lp(a) a été observée pour la
première fois par Kate Berg de l’université d’Oslo en 1963. 11 De nombreuses études des
années 70 ont mis en évidence une association entre la Lp(a) et la coronaropathie. 4-8
Depuis, une quantité considérable de littérature s’est accumulée, insistant davantage sur
l’association entre une concentration élevée de Lp(a) et un risque accru de
coronaropathie.
L’association entre les taux élevés de Lp(a) et le risque d’infarctus du myocarde (IM) a
été documentée et a fait de la Lp(a) un facteur de risque indépendant pour l’IM. 37-39 Le
risque relatif d’IM chez les sujets présentant des taux de Lp(a) supérieurs à 30 mg/dl a
été considéré 1,85 fois supérieur à celui des sujets dont les taux de Lp(a) sont inférieurs
à 30 mg/dl. 33 En conséquence, le taux de 30 mg/dl a souvent été cité comme le seuil au-
delà duquel le risque est considéré comme élevé. De nombreuses études ont montré
une association entre les taux élevés de Lp(a) et les accidents vasculaires cérébraux et
les maladies vasculaires périphériques. 40-50 Ces études comprenaient des personnes
des populations blanches européennes, de la population japonaise et de la population
chinoise. Le taux élevé de Lp(a) a été considéré en conclusion comme facteur de risque
indépendant pour les coronaropathies chez les patients de la population blanche
européenne avec hypercholestérolémie familiale et troubles familiaux des lipoprotéines. 9,
28,51 Les études cliniques ont montré que les taux élevés de Lp(a) étaient associés à la
sténose 52,53 et à la resténose après angioplastie coronarienne transluminale percutanée
(ACTP). 54,55 Toujours d’après ces études, les taux de Lp(a) sont presque totalement
déterminés par des facteurs génétiques et les taux élevés de Lp(a) sont fréquemment
observés chez les patients et les familles avec coronaropathie précoce. Des études
familiales menées aux États-Unis et en Europe ont montré que la Lp(a) est héritée via un
schéma unifactoriel majeur influencé par d’autres gènes. 56 Ainsi, la Lp(a) peut être un
initiateur et un promoteur du processus athéroscléreux, tout en étant un marqueur
précoce. De nombreuses études cas-témoin rétrospectives ont été menées et ont
montré un lien entre des taux élevés de Lp(a) et les coronaropathies. 37,51,57-70
Les régimes standard de réduction des lipides se montrent insatisfaisants pour réduire
les taux de Lp(a). Les taux de Lp(a) semblent insensibles aux régimes, aux inhibiteurs
de l’HMG-CoA réductase (statines), à la résine hypocholestérolémiante et au probucol.
Un traitement à la vitamine PP à 3 grammes par jour chez les hommes et les
femmes, 14,15 les œstrogènes ou la combinaison œstrogènes/progestatif chez les femmes
post-ménopausées (principalement blanches européennes) réduisent de manière
significative les taux de Lp(a). 16-21 Ces modalités de traitement ont toutes été associées
avec une réduction de la morbidité et de la mortalité liées aux coronaropathies. C’est
pourquoi la Lp(a) doit être surveillée chez les patients souffrant de coronaropathies, les
patients avec des antécédents familiaux importants de coronaropathies et les patients
pouvant bénéficier d’un traitement pharmacologique de réduction du cholestérol LDL
conformément au protocole ATPI (Adult Treatment Panel I) du NCEP (National
Cholesterol Education Program). 71
Les taux de Lp(a) sont génétiquement déterminés et la fourchette normale de Lp(a) chez
l’homme varie en fonction de son origine ethnique. 9-12 L’étude Framingham Offspring 23
portant sur 2678 hommes et femmes de population blanche européenne (âge 20-70 ans
+ moyenne 48 ans) ne présentant aucun symptôme de maladie athéroscléreuse montre
une distribution très asymétrique de la Lp(a) (moyenne env. 14,5 mg/dl; médiane env.
7,9 mg/dl) avec 56 % de sujets présentant des valeurs entre 0 et 10 mg/dl. Le tableau I
de l’annexe présente les centiles pour les taux plasmatiques de Lp(a) dans cette étude.
Les valeurs moyenne ± ET de 14 ± 17 pour les hommes et de 15 ± 17 pour les femmes
sont tout à fait similaires et varient très peu avec l’âge. Ces résultats sont cohérents
avec d’autres études. 9,22 Certaines 10,22,26 ont montré que les Africains ou les personnes
d’origine africaine ont des taux normaux de Lp(a) deux à trois fois supérieurs à ceux des
populations blanches européennes avec une distribution moins asymétrique (moyenne
env. 28,5 mg/dl; médiane env. 22,9 mg/dl) (tableau 1). On observe 27 que les populations
natives américaines présentent des taux de Lp(a) proches de la moitié environ des taux
des populations blanches européennes, tandis que les Américains d’origine mexicaine 24
présentent des taux de Lp(a) significativement inférieurs (env. 30 %) par rapport aux
populations blanches européennes et que certaines sous-populations d’Américains
d’origine mexicaine présentent des taux de Lp(a) proches de la moitié de ceux des
populations blanches européennes. Les populations asiatiques présentent en général
des valeurs moyennes de Lp(a) similaires à celles des populations blanches
européennes. 12,72,73
Annexe, tableau 1
Répartition en centiles de la Lp(a) dans deux études de population à l’aide de la trousse de
dépistage Macra® Lp(a). Les valeurs sont en mg/dl de Lp(a)
Étude CARDIA (23 - 35 ans) Étude Framingham
Noirs (mg/dl) Blancs (mg/dl) Blancs (mg/dl)
Centile Hommes Femmes Hommes Femmes Hommes Femmes
95 67,9 72,9 52,7 51,5 49,6 52,9
90 58,1 62,1 39,1 39,9 38,0 37,5
75 37,9 42,8 19,8 20,2 21,2 22,7
50 21,5 23,9 6,1 6,4 7,6 8,2
25 9,8 12,1 2,2 2,8 2,6 3,0
10 4,4 5,5 1,0 1,3 1,0 1,1
5 2,0 2,9 0,6 0,9 0,6 0,7
N 861 1128 1011 1125 1284 1394
Moyenne ± ET 27 ± 22 30 ± 24 14 ± 17 14 ± 17 14 ± 17 15 ±17
Plusieurs études ont montré que la survenue de coronaropathies chez les hommes
blancs européens, déterminées à la fois par un infarctus du myocarde 29,63 et par
angiographie, 28,57 devient évidente dans les 70 ème à 80 ème centiles des taux de Lp(a). La
figure 1 de l’annexe fournit des données issues d’une étude cas-témoin 28 portant sur 321
hommes avec coronaropathie documentée par angiographie (déterminée par une
angiographie différée) et 901 sujets témoins de l’étude Framingham Offspring. Les
données montrent que la fréquence de cas de coronaropathies définies par angiographie
commence à surpasser celle des témoins pour des taux de Lp(a) déterminés par
Macra® entre 20 et 30 mg/dl et devient plus significative au-delà de 30 mg/dl. Dans
l’étude Framingham Offspring, pour un total de 1210 hommes sans coronaropathie, le
taux de Lp(a) entre les 75 ème et 80 ème centiles était de 21-27 mg/dl et de 27-38 mg/dl
entre les 80 ème et 90 ème centiles.
70
60
50
40
30
20
10
0
Annexe, figure 1
Étude Framingham Offspring
Cas de coronaropathies
Témoins
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Taux de LP(a) (mg/dL)
Dans cette étude, d’autres informations comparent (annexe, tableau 2) d’autres facteurs
de risque cardiaques liés aux lipides et lipoprotéines pour cette population avec la Lp(a).
L’étude 28 comprenait également l’ajustage des données pour prendre en compte les
différences de régimes et l’utilisation des bêtabloquants.
Annexe, tableau 2
Taux de lipoprotéines et apolipoprotéines chez les sujets témoins et les patients avec
Facteur de
risque
Groupe témoin
(n=901)
coronaropathie (moyenne +/- ET)
Coronaropathie (n=321)
Total P1 Après ajustement* P2
Chol T 214 ± 36 211 ± 49 0,343 224 ± 53