Evaluation de la qualité de la semence fraîche des boucs d ...

Evaluation de la qualité de la semence fraîche des boucs d’insémination Hollandais :
critères, méthodes, conservation et fertilité.
K. PETERSON (1), M.A.P.M. KAPPEN (2),B.M. GADELLA (1,3), B. COLENBRANDER (1)
(1) Department of Farm Animal Health, Utrecht University, P.O. Box 80151, NL-3508 TD Utrecht, The Netherlands
(2) Cryolab, Dijk 30, 5521 AZ Eersel, The Netherlands
(3) Department Biochemistry and Cell Biology, Utrecht University, P.O. Box 80176, NL-3508 TD Utrecht The Netherlands
RESUME - La collaboration entre les partenaires intéressés par l’insémination Artificielle (I.A.) aux Pays-Bas a été stimulée
par les résultats du projet européen CRAFT AI/AITECH puisque les résultats de fertilité obtenu après I.A. en semences
congelées aux Pays-Bas étaient similaires à ceux obtenus en France. Les caractéristiques de la semence en fonction des
différentes conditions de conservation ont été examinés, en utilisant des techniques spécifiques de coloration, par analyse
microscopique et cytométrie de flux. Toutes les expérimentations ont été faites sur semence fraîche. Les résultats montrent que
les caractéristiques de la semence après conservation à court terme à 4°C ou 18°C ne diffèrent pas significativement. Le glycérol
utilisé comme cryo-protecteur peut avoir un effet variable (spermatotoxique) sur la semence de boucs pris individuellement. En
complément, puisque le glycérol est utilisé pour la cryoconcervation, son effet sur la qualité de la semence a été évalué. La
cytométrie de flux permet une évaluation légèrement meilleure. Les mesures en cytométrie de flux du nombre d’acrosomes
intacts (Coloration FITC-PNA/PI) et du % de vivants/morts (Coloration SYBR-14/PI) donne des résultats conséquents.
Fresh Semen quality assessment of Dutch AI-bucks: criteria, methods, storage and
fertility.
K. PETERSON (1), M.A.P.M. KAPPEN (2),B.M. GADELLA (1,3), B. COLENBRANDER (1)
(1) Department of Farm Animal Health, Utrecht University, P.O. Box 80151, NL-3508 TD Utrecht, The Netherlands
SUMMARY - Collaboration between the partners involved in AI in goats in the Netherlands has been stimulated by the results
from the CRAFT AI/AITECH as pregnancy results obtained after AI with frozen semen in The Netherlands were similar to those
in France. Semen characteristics following different preservation conditions were examined, using specific staining techniques,
by microscopical analysis as well as by flow cytometry. All experiments were performed on fresh semen. The results show that
sperm characteristics after short term preservation at 4°C or 18°C does not differ significantly. The cryoprotectant glycerol can
have a various (spermatotoxic) effects on the semen of individual bucks. In addition, as glycerol is used for cryopreservation,
the effect of this CPA on sperm quality is evaluated. Flow cytometry shows a slightly higher evaluation. Flow cytometric
measurements of live acrosome intact (FITC-PNA/PI staining) and % live/dead (SYBR-14/PI staining) show consistent results.
INTRODUCTION
L’I.A. n’est pas encore très utilisée pour la reproduction
caprine aux Pays-Bas. Ces deux dernières années, l’intérêt
pour l’insémination artificielle comme facteur d’amélioration
génétique des caractères de production a augmenté. Avec
cette méthode, les semences de haut niveau génétique
peuvent être diffusées dans une population croissante de
chèvres laitières. Il n’est alors plus nécessaire d’introduire
des mâles d’autres troupeaux pour améliorer et renouveler le
potentiel génétique. L’I.A. n’est pas seulement un moyen de
diffusion génétique mais également un outil pratique pour la
reproduction à contre-saison. Le principal intérêt de la
reproduction à contre-saison est d’augmenter la production
de lait d’hiver, pour produire tout au long de l’année, et de
planifier le travail. Actuellement, aux Pays-Bas, des
semences congelées de boucs d’insémination français et
hollandais sont disponibles. L’organisation caprine
d’insémination hollandaise (Geiten KI Nederland : GKN)
utilise des semences fraîches et congelées de boucs
sélectionnés. En collaboration avec Cryolab et l’Université
d’Utrecht, des recherches sont en cours sur la semence
caprine concernant les méthodes d’évaluation de la
semence, les critères de qualité et les techniques de
conservation. Dans cet article nous décrivons les critères
d’évaluation et comparons les méthodes traditionnelles aux
méthodes plus récentes.
1. MATERIEL ET METHODES
1.1. PREPATION DES ECHANTILLONS
POUR UNE CONSERVATION A 4°C, 18°C
OU UNE CRYCONSERVATION
Les éjaculats ont été collectés sur 8 mâles Saanen
sélectionnés par GKN. La semence était soit immédiatement
diluée dans du tris-buffer (187,8 mM tris (hydroxymethyl)
aminomethan, 60,8 mM citric acid, 52,1 mM fructose,
700 mM glycerol ; 18,9 % egg yolk, Penicillin 50 000 IU,
Streptomycin 50 mg), soit diluée dans un diluant à base de
lait écrémé (poudre de lait écrémé 10 gr ± 0,1, D-glucose
0,19 gr ± 0,02, Benzyl Penicilin Natrium 0,03 gr ± 0,01,
Dihydrostreptomycin 0,05 gr ± 0,01, Aqua dest 100 cc ± 2).
Après dilution, la semence était stockée sur un isolant en
coton dans une boîte en polystyrène et progressivement
refroidie à la température ambiante. Les tubes étaient ensuite
placés soit au réfrigérateur (4°C) pendant au moins 2 h , soit
dans une étuve à 18°C. Pour la cryconservation, la semence
était conditionnée en pailletes pré-imprimées et congelées
dans un Kryo 10 series II freezer (Planer Products Ltd.,
Sunbury-on-Thames, UK).
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1.2. MESURE DE CONCENTRATION, MOTILITE
ET VIABILITE
Les échantillons étaient pesés pour déterminer le volume.
Pour estimer la concentration, 25 µl de semence étaient
dilués dans 5 ml de tri-Sodium citrate dehydrate 28,5 g/l
(C6H5Na3O7.2H2O ; Merck, VWR International BV,
Amsterdam, the Netherlands) et mélangés avec un vortex,
puis 2 ml étaient placés dans un photomètre ACCUELL
(IMV technologies, L’Aigle, France) pour mesurer la
concentration. La concentration obtenue multipliée par le
volume initial nous donnait le nombre total de cellules dans
l’éjaculat. La mobilité était évaluée après dilution de 10 µl
de semence dans 1 ml de tris-buffer et 10 µl de ce milieu
étaient déposés sur une lame chauffée (37°C) et recouverts
d’une lamelle chauffée, puis observés au microscope à
contraste de phase (100-200x). La note de viabilité était
attribuée par coloration à l’eosine-anilineblue (Aniline ;
Gurr BDH 34003 ; eosine gelblich ; Merck 15935) et
observation au microscope standard.
1.3. ANALYSE EN CYTOMETRIE DE FLUX DU %
DE SPERMATOZOÏDES VIVANT/MORT AVEC
COLORATION SYBR-14/PI
Le Kit LIVE/DEAD, combinant Sybergreen (Sybr-14), un
colorant permanent d’acide nucléique de membrane, avec du
Propidium Iodide (PI) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR,
USA), a été utilisé pour évaluer la viabilité de la semence
comme décrit par le fabricant. Les échantillons de semence
ont été dilués (1:10) dans du PBS-0 (Phosphate Buffered
Saline, pH 7,2, sans Calcium Chloride et Magnesium
Chloride ; Gibco, UK) avec 0,1% de PVE (Polyvinyl
Alcohol, Sigma, ST Lois, USA) ajouté au travers d’un filtre
en conditions stériles. Les cellules ont ensuite été analysées
en fluorescence verte et rouge par cytométrie de flux en
utlisant un FACScan équipé d’un laser à l’argon (Becton
Dickinson, San Jose, CA). Les capteurs de fluorescence
(FL 1= 580-605 nM and FL 3= 480-580 nM) ont été réglés
pour distinguer les cellules colorées en vert des cellules
colorées en rouge. Au total, 10 000 spermatozoïdes par
échantillon ont été analysés.
1.4. ANALYSE PAR CYTOMETRIE DE FLUX
DE L’INTEGRITE DES MEMBRANES
ET DES ACROSOMES DES SPERMATOZOÏDES
PAR COLORATION FITC-PNA/PI
Le Propidium Iodide (PI) (Molecular Probes, Inc., Eugene,
OR, USA) a été dilué (1:100) dans du PBS-0 (Phosphate
Buffered Saline, pH 7,2, sans Calcium Chloride et
Magnesium Chloride ; Gibco, UK) à une concentration
finale de 50 µg/ml. Cette solution-PI a ensuite été ajoutée
(4:1) à un Fluorescein Isothiocyanate conjugué à une
solution de peanut agglutinin (FITC-PNA) (EY
Laboratories, Inc., San Mateo, LA, USA) (100 µg/ml).
Après mélange, 25 µl de la solution FITC-PNA/PI a été
ajouté à 1 ml de semence diluée (1100 avec PBS-0 avec
0,1% PVE). Les cellules fluorescentes vertes et rouges ont
ensuite été analysées par cytométrie de flux comme décrit
précédemment.
1.5. FERTILITE
Les résultats de fertilité moyenne après insémination en
élevage ont été collectés pour les éjaculats de chaque bouc.
Ils étaient répartis dans 8 à 16 élevages différents. Le
nombre d’insémination par mâle variait de 70 à 200 I.A.
Toutes les inséminations ont été réalisées en semence
fraîche.
1.6. ANALYSE STATISTIQUE
Les résultats ont été analysés avec Excel (Microsoft) et
SPSS (SPSS Inc., USA ; version 8.0.). Les données de la
cytométrie de flux ont été stockées pour analyse ultérieure
avec Cell Quest software (Becton Dickinson, San Jose, CA)
et WinMDI (Windows Multiple Document Interface
pour cytométrie de flux, version 2.8 ;
http://facs.scripps.edu/software.html).
2. RESULTATS
2.1. CRITERES DE QUALITE ET CONSERVATION
2.1.1. Température de conservation de la semence
fraîche
La mobilité de la semence en fonction de la température de
conservation de la semence fraîche à 4°C ou 18°C ne montre
qu’une légère baisse dans les premières 24 h. Après 24 h la
baisse est significative et la semence conservée à 18°C se
détériore plus vite que la semence conservée à 4°C
(figure 1).
Figure 1
Mobilité de la semence caprine, conservation à 4°C et 18°C ;
analyse microscopique
26 Symposium satellite caprin - 8 décembre 2004 - Paris, France

2.1.2. Conservation de semence fraîche et influence
du glycérol
L’effet du glycerol, un cryo-protecteur utilisé pour les
milieux de conservation de semence congelée, sur la
semence des boucs considérés individuellement, est
variable. Cet effet peut être directement observable, comme
le montre le bouc D (après 1h). Son effet toxique est plus
visible après 24h à 18 °C. La mobilité de la semence des
boucs A, B, D et G est nulle à ce stade (figure 2).
Figure 2
Mobilité de la semence caprine avant et après 24h
de conservation à 18 °C ; analyse microscopique Cryolab
2.2. MESURE DE LA MOTILITE ET
DE LA VIABILITE PAR LE % DE
SPERMATOZOÏDES VIVANT/MORT
AVEC COLORATION SYBR-14/PI
Cytométrie de flux vs analyse microscopique
L’évaluation de la mobilité de la semence fraîche après 24h
de conservation, ne montre pas de différence par rapport à
l’évaluation du % de spermatozoïdes vivant/mort mesuré par
microscope ou cytométrie de flux (figure 3).
Figure 3
Evaluation de la semence après 24 de conservation
à 4°C et 18°C : % spermatozoïdes vivant/mort
par analyse cytométrique (coloration Sybr14/PI)
et mobilité par analyse microscopique
2.3. ANALYSE CYTOMETRIQUE DE L’INTEGRITE
DE LA MEMBRANE PLASMIQUE ET
DE L’ACROSOME DES SPERMATOZOÏDES
APRES COLORATION FITC-PNA/PI
Le % d’acrosomes intacts des spermatozoïdes vivants de
chaque bouc ne diffère pas significativement du % de
cellules mobiles ou du % de spermatozoïdes vivants.
Figure 4
Acrosomes intacts, spermatozoïdes vivants
par analyse cytométrique sur coloration PNA/PI
2.4. FERTILITE
Pour 6 des 8 boucs évalués, la fertilité moyenne provisoire
après I.A. en semences fraîches sur la période 2003/2004
varie de 49 % à 73 % (figure 5). Ces données ont été
obtenues par GKN. Le bouc A est mort et le bouc E ne
présentait pas une qualité de semence suffisante pour être
utilisée en insémination artificielle.
Figure 5
Evaluation de la semence après 24h de conservation
à 4°C et 18°C ; % Vivant/Mort par cytométrie de flux
(coloration Sybr14/PI) et mobilité par analyse microscopique
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3. DISCUSSION
Puisque l’utilisation de la semence fraîche donne des
résultats prometteurs, la question de la température de
conservation de la semence est importante. Différents
protocoles ont été utilisés en élevage. La figure 1 montre
clairement que pendant les premières 24h, il y a peu de
différence de mobilité entre une conservation à 4°C et 18°C.
Il faut noter que la variation de température au cours de la
conservation a un effet négatif sur la qualité de la semence.
La variation des réactions à la conservation en présence de
glycérol cryo-protecteur indique que la semence des boucs
d’insémination devrait être évaluée après congélation/
décongélation. De plus, la semence diluée dans un milieu
contenant du glycérol devrait être congelée dès que possible
après équilibrage thermique.
Actuellement, afin d’évaluer les paramètres de qualité et les
méthodes de conservation, nous comparons les méthodes
d’évaluation traditionnelles (évaluation microscopique de la
mobilité) aux méthodes plus récentes (% de spz vivants par
cytométrie de flux). Le pourcentage de spermatozoïdes
vivants après 24 heures de conservation semble plus élevé
lorsqu’il est mesuré par analyse cytométrique que lors des
mesures par méthode conventionnelle.
Le % d’acrosomes intacts sur spermatozoïdes vivants
(coloration FITC-PNA/PI) et le % de spermatozoïdes
vivants (coloration SYBR-14/PI) est conforme à ce que l’on
pouvait espérer. Les résultats d’analyse de la semence
permettent de prédire partiellement le pouvoir fécondant des
boucs. Cependant d’autres facteurs ont un effet sur la
fertilité. Pour l’instant l’effet femelle n’a pas été pris en
compte. Puisque les éleveurs hollandais ne suivent pas
précisément les recommandations des partenaires français
de ce projet pour le choix des femelles, l’effet femelle peut
être très important. L’effet élevage ne doit pas jouer un rôle
important puisque les semences de chaque bouc ont été
mises en place dans au moins 8 élevages (maximum
10 élevages). La différence du nombre d’insémination mises
en place pour chaque mâle n’a probablement pas un effet
important puisque au moins 70 I.A. par mâle (maximum
200) ont été réalisées.
CONCLUSION
La température de conservation de la semence fraîche ne
semble pas avoir une grande influence puisque les résultats
obtenus avec les semences conservées à 4°C ne diffèrent pas
significativement de ceux obtenus avec les semences
conservées à 18°C.
L’effet toxique du glycérol sur la qualité de la semence
diffère significativement entre les boucs. Dans tous les cas la
semence destinée à la congélation devrait être congelée tout
de suite après l’équilibrage thermique. Les méthodes
conventionnelles et plus récentes sont de bons prédicateurs
du pouvoir fécondant des échantillons de semence.
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