La production d'embryons in vivo dans l'espèce bovine Année 2009 ...

La production d’embryons in vivo \1La production d’embryons in vivo dans l’espèce bovineAnnée 2009-2010Prof. Ch. HanzenTable des matières1. Objectifs........................................................................................................................................................22. Introduction..................................................................................................................................................33. La superovulation .........................................................................................................................................43.1. Critères de choix de la donneuse .........................................................................................................43.2. Les traitements de superovulation ......................................................................................................43.2.1. Nature des traitements hormonaux 4a. La gonadolibérine (GnRH) 4b. La Pregnant Mare Serum Gonadotrophin 4c. La Human Menopausal Gonadotrophin 5d. Les extraits hypophysaires 53.2.2. Schéma des traitements inducteurs 53.2.3. Conséquences d’un traitement de superovulation 83.3.2.1. Nombre d’embryons produits 83.3.2.2. Caractéristiques morphologiques et hormonales du follicule 93.2.4. Facteurs d’influence des résultats 103.4.2.1. Facteurs propres à l’animal 103.4.2.2. Nature du traitement de superovulation 103.4.2.3. Moment de mise en place du traitement de superovulation 103.4.2.4. Traitements d’amélioration du recrutement folliculaire 11a. Le priming 11b. L'insulin growth factor 11c. Suppression de l'effet inhibiteur du follicule dominant 114. La récolte des embryons.............................................................................................................................124.1. Matériel..............................................................................................................................................124.2. Méthodologie.....................................................................................................................................124.2.1. Méthode chirurgicale 124.2.2. Méthode non chirurgicale ou collecte transcervicale 134.2.2.1. Principes de base (sonde de Cassou à trois voies) 134.2.2.2. Quelques difficultés pratiques 134.2.2.3. Particularités de la sonde à deux voies (sonde de Han) 144.3. Facteurs d’influence des résultats......................................................................................................144.3.1. Données générales de l’enquête 144.3.2. Résultats 145. Détermination de la qualité des embryons ................................................................................................155.1. Rappels des premiers stades du développement de l’embryon ........................................................155.1.1. Premières divisions cellulaires 155.1.2. Sortie de pellucide et phase d’élongation. 155.1.3. L’implantation 165.2. Critères d’identification de la qualité des embryons .........................................................................166. Le transfert d’embryons .............................................................................................................................176.1. Synchronisation de la donneuse et des receveuses...........................................................................176.2. Le transfert d’embryons : matériel et technique ...............................................................................186.3. Facteurs d’influence des résultats......................................................................................................187. La conservation des embryons ...................................................................................................................197.1. Données générales.............................................................................................................................207.2. Nature des agents cryoprotecteurs....................................................................................................217.3. La congélation proprement dite.........................................................................................................217.4. La décongélation ................................................................................................................................227.5. Facteurs d’influence des résultats......................................................................................................22

La production d’embryons in vivo \28. Pour en savoir plus......................................................................................................................................239. Tableaux......................................................................................................................................................241. ObjectifsCe chapitre présente, sous forme chronologique, la séquence d’évènements hormonaux et zootechniquespermettant la production, le transfert et la conservation à court ou long terme d’embryons obtenus in vivo chez lavache. Chacune de ces étapes fait l’objet d’une description et d’une revue des facteurs d’influence potentiels.Objectifs spécifiquesObjectifs de connaissance• Enoncer quelques biotechnologies de l'embryon• énoncer les critères de choix d’une donneuse d’embryons• Enoncer les hormones utilisées dans un protocole de superovulation• expliquer (au besoin avec un schéma) une méthode de récolte non chirurgicale d’embryons• faire le schéma des divers stades de l'embryon entre la fécondation et le 7ème jour de gestation• énoncer les diverses manipulations possibles de l’embryon une fois sa récolte réalisée• énoncer les principes généraux de la congélation/décongélation des embryons• énoncer les critères de choix d’une receveuse d’embryons• expliquer la méthode du transfert non chirurgical d'un embryonObjectifs de compréhension• comparer les avantages et inconvénients des deux principaux traitements hormonaux permettant unesuperovulation• justifier le moment d’une récolte d’embryons au 7 ème jour de gestation• justifier le moment du transfert d’embryons au 7 ème jour de gestationObjectifs d’application• Savoir protocoler une superovulation en fonction d'une anamnèse• Savoir mettre en place un protocole de synchronisation d'une donneurse et de receveuses en fonctiond'une anamnèse

La production d’embryons in vivo \32. IntroductionLe premier essai couronné de succès de prélèvement d’un embryon suivi de son transfert dans une lapine futréalisé par Heape en 1891 (Voir Betteridge KJ An historical look at embryo transfer. J.Reprod.Fert.1981,62,1). C’esten 1951 que naquit le premier veau issu du transfert d’un embryon d’une donneuse sur une receveuse (Willett etal. 1951). Le premier veau né après trasnfert d’un embryon congelé puis décongelé naquit en 1973 (Wilmut etRowson 1973). Il portait le nom de Frosty II, Frosty I étant né suite à une fécondation réalisée au moyen de spermecongelé.On appelle biotechnologies de l'embryon l'ensemble des techniques mises au point à partir des connaissances debase acquises sur le développement de l'embryon. Leur essor est récent et encore à bien des égards modeste. Ellesse sont développées chez les mammifères domestiques à partir des années 80, d'abord dans l'espèce bovine où lareproduction des animaux était, depuis déjà trente ans, largement organisée autour de l'insémination artificielle.Aujourd’hui elles sont également de plus en plus largement appliquées dans d’autres espèces telles la brebis, lachèvre et la jument.Il est classique de distinguer trois générations de biotechnologies de l’embryon (Tableau 1). La premièregénération a permis de produire des embryons in utero après stimulation hormonale des femelles donneuses(superovulation). Ce mode de production a permis le développement de la technologie du transfert d'embryonsassociée à leur congélation. Deux facteurs en limitent cependant l’application : le nombre relativement faibled'embryons que l'on obtient après un traitement hormonal de superovulation et la variabilité de production entrefemelles traitées. En effet, aucun progrès décisif n'a été réalisé depuis plus de vingt ans dans ce domaine. Unefemelle donneuse donne en moyenne 7 a 8 embryons par traitement, mais seulement 5 à 6 d'entre eux (embryonsde qualité 1 et 2) ont de réelles chances de se développer à terme après transfert. En outre, 20 à 30 % des femellestraitées ne donnent pas d'embryons transférables, alors que 25 % produisent plus de 6 embryons ce qui limite lespossibilités de planification rigoureuse du nombre de femelles receveuses. l1 en résulte un coût technique environ2 fois plus élevé que celui de l'insémination artificielle. En effet en supposant la récolte de 5 embryons partraitement de superovulation, les frais inhérents à la technique seraient de 2500 F pour le traitement, 1000 F pourl’insémination, 5500 F pour la récolte, 2500 F par embryon supplémentaire (> 5 ) obtenu et 3000 F pour lacongélation des embryons soit un total de 14500 F c’est-à-dire 2500 F par embryon produit.Plus récemment, une deuxième génération de technologies est apparue qui s'appuie sur la production d'embryonsen culture, après maturation et fécondation in vitro d'ovocytes prélevés sur l'animal vivant ou après abattage(FIVETE : Fécondation in vitro et transfert d’embryons, OPU : Ovum Pick Up).Les progrès de nos connaissances sur la physiologie de l’embryon de mammifère permettent maintenantl'émergence d'une troisième génération de techniques. Celles-ci tirent parti de l'extraordinaire plasticité despremiers stades de l’embryogenèse et visent à modifier encore plus en avant les caractéristiques de l'embryon: letransfert nucléaire qui aboutit à la production de clones, et la transgénèse qui consiste à introduire un gèneétranger dans les cellules de l'embryon en sont les illustrations. A ces techniques viennent s’ajouter le sexage del’embryon, sa congélation ou encore l’ICSI (Intra Cytoplasmic Spermatozoa Injection).Le transfert d'embryons est utilisé en pratique dans les élevages depuis le début des années 80. Cette technologiea pu voir le jour grâce aux connaissances accumulées sur la physiologie de la reproduction des mammifèresdomestiques, notamment a partir des progrès décisifs obtenus avec le contrôle hormonal de la croissancefolliculaire et celui du moment de l'ovulation. Le transfert d'embryons, qui s'est d'abord développé partransposition des méthodes chirurgicales proposées par la recherche vétérinaire, n'est véritablement devenu unepratique d'élevage qu'avec la mise au point d'une méthode de transplantation adaptée de l'inséminationartificielle, consistant à déposer l'embryon au-delà du col de l'utérus, par voie vaginale. Le nombre detransplantations d'embryons bovins connaît ces dernières années une progression régulière en Europe et enFrance (Tableau 2,3) mais ce nombre reste très faible par rapport à celui des inséminations artificielles. Toutefois,ce n'est pas tant le nombre de transplantations effectuées qui donne aujourd'hui son importance que la placequ'elle occupe désormais dans la filière de la sélection bovine: près de 95 % des taureaux laitiers actuellement misen testage sont en effet issus d'embryons transplantés (le plus souvent congelés). Ce chiffre illustre bien l'impactde cette biotechnologie dans la conduite des programmes de sélection.La transplantation d'embryons est maintenant étroitement associée à la congélation, le plus souvent au stadeblastocyste, par des méthodes compatibles avec une décongélation réalisée juste avant la transplantation. Lacongélation a permis une réduction du coût des interventions puisque le nombre de femelles receveuses qu'il fautpréparer peut être ajusté au nombre d'embryons collectés. Elle a ouvert la voie aux échanges d'embryons entre

La production d’embryons in vivo \4élevages (de tous pays) et commence à être utilisée en complément du maintien d'animaux vivants pour conserverla diversité génétique des races domestiques.Le typage génétique des embryons avant leur transplantation peut également être réalisé en prélevant parmicromanipulation 1 à 4 cellules sur des embryons au stade morula ou jeune blastocyste (J6 et J7). Le diagnosticdu sexe peut être posé pour 95 % des embryons biopsiés et son exactitude est voisine de 100 %. Cependant,malgré l'engouement qu'a suscité en France le diagnostic de sexe appliqué ces dernières années à plus de 3 000embryons bovins, son intérêt économique reste très marginal.3. La superovulation3.1. Critères de choix de la donneuseHabituellement, l’éleveur choisit une génisse ou une vache de haute production laitière ou de bonne conformationviandeuse. Il convient d’en analyser les performances de fertilité et de fécondité. De même, il s’avèreindispensable d’identifier la présence éventuelle de lésions du tractus génital. L’animal superovulé aura autant quefaire se peut accoucher normalement, n’aura pas présenté de complications puerpérales ou du post-partum tellesqu’une rétention placentaire, une infection utérine, une fièvre vitulaire ou de l’acétonémie. Il aura accouchédepuis 60 voire 90 jours au moins et sera en phase de bilan énergétique positif. Il aura manifesté deux ou troischaleurs à intervalles réguliers. A l’exploration manuelle, le col et les cornes utérines seront de diamètre normal (

La production d’embryons in vivo \5Pie-Noire.La PMSG a une demi-vie particulièrement longue (120 heures) imputable à sa richesse en acide sialique (13 %) quila protège de la dégradation hépatique et rénale. Aussi est-il indispensable de lui adjoindre l’injection de 1800 UId’anticorps anti-PMSG (obtenus sur moutons) au moment des chaleurs. Ces anticorps ont pour objet d’inhiberl’action de la PMSG et ce faisant le développement d’une seconde vague de croissance folliculaire et d’éviter laformation de follicules kystiques.La répétition des injections de PMSG à 1 voire deux mois d’intervalle est susceptible de réduire l’efficacité dutraitement étant donné la réaction antigénique possible.b. La Human Menopausal GonadotrophinL’hMG (Human Menopausal Gonadotrophin) fournit des résultats comparables à ceux de la PMSG mais son coûtest plus élevé.c. Les extraits hypophysairesLes extraits hypophysaires (d’origine porcine le plus souvent, pFSH, mais aussi bovine, bFSH, ou ovine : la FSHbovine est moins active que la FSH porcine) sont de plus en plus largement utilisés. Possédant une demi-vie pluscourte (5 à 6 heures) que la PMSG, étant donné leur moindre richesse en acide sialique (5 %) ils doivent fairel’objet d’injections répétées. Leur concentration atteint une valeur maximale 3 heures après leur injection et nesont plus décelables 12 heures après l’injection. Leur utilisation répétée n’entraîne pas la formation d’anticorpscontrairement à la PMSG. La société Mérial (Bd Sylvain Dupuis 143 1070 Bruxelles) commercialise le Stimufol. Ceproduit contient 500 mcg de FSH porcine et 100 mcg de LH porcine. Il est fabriqué par le laboratoire de Physiologiede la Reproduction de la Faculté de Médecine Vétérinaire.Les doses sont comprises entre 32 et 50 UA (Unité Armour) administrées de manière fractionnée et décroissanteen doses bijournalières (matin et soir) pendant 4 jours, la dose de 32 UA (6 UA, 5 UA, 3 UA, 2 UA) étant le plussouvent recommandée chez la vache laitière et celle de 40 UA chez la vache viandeuse. Les doses de FSH sontexprimées en mcg Armour : une unité Armour est équivalente à 10 mcg de FSH pure. Les FSH sont présentées sousforme lyophilisées et reconditionnées avant l’emploi au moyen de sérum physiologique. Une fois les dilutionsréalisées, les flacons préparés sont congelés. La FSH décongelée se conserve sans dommage au réfrigérateur (4°C)pendant le traitement. Une fois décongelée, la solution ne peut être recongelée. Comme la BST, la FSH comptetenu de sa dégradation rapide dans l’intestin de l’homme ne présente aucun risque pour la santé humaine. La FDAaméricaine ne préconise aucun délai de retrait de lait ou d’abattage des animaux ainsi traités.3.2.2. Schéma des traitements inducteurs• Chaleur de référenceUn traitement de superovulation peut être mis en place lors du pro œstrus c’est-à-dire vers le 16 ème voire 17 èmejour du cycle. Cependant étant donné la difficulté de prévoir le moment exact de retour en chaleurs de l’animal, ilest plus aisé de mettre en place le traitement de superovulation 9 à 15 jours (voir ci-dessous facteurs d’influence)après une chaleur dite de référence, que celle-ci ait été observée par l’éleveur ou induite par un traitement dit depresynchronisation au moyen d'une ou mieux de deux prostaglandines à 14 jours d’intervalle. Une solutionalternative consiste chez les femelles non cyclées à réaliser un traitement de superovulation au cours de la phased’induction d’une chaleur au moyen d’un progestagène (spirale ou implant). Le recours à ce traitement depresynchronisation au moyen de prostaglandines serait davantage appliqué chez les animaux de race à viande quelaitière. Par ailleurs, le nombre d’embryons totaux et transférables obtenus est comparable après une chaleur deréférence dite naturelle ou induite (9.9 vs 10.4 et 5.1 vs 5.2)• Chaleur de « superovulation »Celle-ci sera le plus souvent obtenue par l’injection unique ou répétée (2 voire 3 injections) d’une prostaglandinenaturelle ou synthétique 48 heures en général après le début du traitement au moyen de PMSG ou de pFSH(Tableau 11). En général, les doses de prostaglandines sont doublées par rapport aux doses recommandées par lefabricant. En terme de résultats, il ne semble pas y avoir de différences entre les prostaglandines naturelles et desynthèse. La voie IM est la voie la plus couramment utilisée. Seule le fenprostalène est utilisée en injection souscutanée.La voie IV permet l’obtention de résultats équivalents à la voie IM. La voie intravulvaire en sous-muqueuxn’a pas été évaluée dans le cadre de la superovulation.Des injections répétées ont été préconisées pour compenser la demi-vie courte de certains analogues et optimiserla chute de la progestéronémie et donc secondairement la croissance folliculaire. Ainsi des injections répétées (2voire 3) ont-elles été conseillées en ce qui concerne le dinoprost .

La production d’embryons in vivo \6Une chaleur de superovulation peut également être obtenue par le retrait d’un corps jaune artificiel . Cestraitements sont généralement associés à une voire deux injections de prostaglandines pour permettre la lyse ducorps jaune naturel éventuellement en place ou en développement lors du traitement au moyen du progestagène.Selon ce schéma, l’implant ou la spirale peuvent être mis en place quelque soit le moment du cycleéventuellement présent. Il n’est donc pas nécessaire dans ce cas de tenir compte d’une chaleur dite de« référence ». L’implant de norgestomet est laissé en place pendant 9 à 10 jours et la spirale pendant 7 à 12 jours.Le traitement de superovulation débute entre le 4 ème et le 7 ème jour suivant le début du traitement par unprogestagène.En cas de recours à la PMSG, l’injection de PGF2a est réalisée en même temps que l’injection de PMSG soit 48heures avant le retrait du progestagène . Si le traitement de superovulation utilise de la FSH, l’injection de PGF2aest réalisée à la troisième injection ou plus souvent à la 5 ème injection de FSH soit 12 à 48 heures avant l’arrêt dutraitement par le progestagène. En cas d’injection répétée de PGF2a, les injections sont réalisées simultanément àla 5 ème et 6 ème injection ou à la 7 ème et 8 ème injection de FSH . Les doses totales de PGF2a injectées sontrespectivement de 0.5 mg à 1 mg de cloprostenol, de 22.5 mg de dinoprost ou de 15 mg de luprostiol.Une autre alternative a été plus récemment décrite. Elle consiste en un traitement dit court mis en place entre le7 ème et le 11 ème jour suivant la chaleur de « référence », et laissé pendant 5 jours. Le traitement de superovulationdébuterait 1 à 3 jours après le début du traitement au moyen du progestagène de manière à arrêter le traitementdu progestagène à la 6 ème voire 7 ème injection de FSH.Il semblerait que l’efficacité des traitements inducteurs à base de progestagènes soit plus grande quand le caséchéant, ils sont initiés entre le 6 ème et le 9 ème jour du cycle que entre le 1 er et le 3 ème ou entre le 14 ème et le 16 èmejour du cycle . L’augmentation du nombre d’injection de PGF2a ou de leur dose totale ne semblerait pas exercer uneffet déterminant sur la qualité des résultats.En ce qui concerne le timing de l’insémination, une double insémination doit être réalisée respectivement 12 et 24heures après le début de l’oestrus. Si elles sont pratiquées de manière systématique, on recommanderad’inséminer 36 et 48 heures après le retrait du progestagène si la PGF2 est injectée 48 heures avant le retrait et 48et 60 heures ou 56 et 72 heures après le retrait si l’intervalle entre le PGF2 et le retrait est de 12 heures .• Chaleur de «récolte »Après une récolte d’embryons, il est indispensable de s’assurer de la lyse des corps jaunes induits pour éviter unegestation gémellaire et induire aussi rapidement que possible le retour à une cyclicité normale. En l’absenced’injection d’une prostaglandine et de gestation, le cycle suivant a une durée comprise entre 22 et plus de 30 jours(Lucy et al. Theriogenology 1990,34,7-19). Ce délai dépend du nombre de corps jaunes présents et doncindirectement de l’importance du retrocontrôle négatif exercé sur l’hormone LH par la progestérone endogène.Deux stratégies sont possibles. La première consiste à injecter une PGF2a le jour de la récolte. La seconde est dedifférer cette injection d’une semaine ou deux. Dans l’un et l’autre cas on observe une augmentation del’intervalle entre l’injection et l’oestrus (4,3 à 8,8 jours et parfois plus de 11 jours). Ce retard est imputable à unnombre de petits follicules (< 5 mm) plus réduits lors de l’injection, phénomène résultant d’une progestéronémieélevée . Ni la dose injectée ni le nombre d’injections ne semblent influencer les résultats. Le cycle faisant suite àcette chaleur de « récolte » ayant une durée normale, il peut être utilisé pour induire un nouveau traitement desuperovulation.

La production d’embryons in vivo \7Traitement de superovulation au moyen d’une prostaglandineJour Traitement PMSG Traitement pFSH-----------------------------------------------------------------------------------------2500 à 3000 UI 32 UA (Races laitières)40 UA(Races viandeuses)-----------------------------------------------------------------------------------------J0 : chaleur de « référence »(J9 à J15)J10 Matin PMSG (une injection) FSH/LH (6 ou 8 UA)SoirFSH/LH (6 ou 8 UA)J11 Matin FSH/LH (5 ou 6 UA)SoirFSH/LH (5 ou 6 UA)J12 Matin PGF FSH/LH (3 ou 4 UA)PGFSoirFSH/LH (3 ou 4 UA)J13 Matin FSH/LH (2 UA)SoirFSH/LH (2 UA)------------------------------------------------------------------------------------------J14 (J0) Matin IA 1 IA 1Soir IA 2 IA 2Anti-PMSG(1800 UI)------------------------------------------------------------------------------------------(J7) Récolte et PGF Récolte et PGF------------------------------------------------------------------------------------------Traitement de superovulation au moyen d’un implantJour Traitement PMSG Traitement FSH------------------------------------------------------------------------------------------J0 Mise en place de l’implant Mise en place de l’implantJ7 Matin PMSG FSH/LHSoirFSH/LHJ8 Matin FSH/LHSoirFSH/LHJ9 Matin Retrait implant Retrait implant, FSH/LHPGF PGFSoirFSH/LHJ10 (J0) Matin FSH/LHSoirFSH/LH-------------------------------------------------------------------------------------------J11 (J0) Matin IA1 IA1Soir IA2 IA2Anti PMSG-------------------------------------------------------------------------------------------(J7) Récolte et PGF Récolte et PGF

La production d’embryons in vivo \8Traitement de superovulation au moyen d’une spiraleJour Traitement PMSG Traitement FSH------------------------------------------------------------------------------------------------------J0 Mise en place de la spirale Mise en place de la spiraleJ10 Matin PMSG FSH/LHSoirFSH/LHJ11 Matin FSH/LHSoirFSH/LHJ12 Matin Retrait de la spirale Retrait de la spiralePGF (ou 48 heures avant) PGF (1 ou 2 injections à la 3 ème et/ou 5 èmeou à la 5 ème et 6 ème ou à la 7 ème et 8 èmeinjection de FSH)FSH/LHSoirFSH/LHJ13 Matin FSH/LHSoirFSH/LH------------------------------------------------------------------------------------------------------J14 (J0) Matin IA1 IA1Soir IA2 IA2Anti PMSG------------------------------------------------------------------------------------------------------(J7) Récolte et PGF Récolte et PGF------------------------------------------------------------------------------------------------------Traitement dit court de superovulation au moyen d’une spirale ou implantJour Traitement FSH---------------------------------------------------------------------------------J0 : chaleur de « référence »J10 (J7 à J11) Mise en place de la spirale/implantJ11J12 Matin FSH/LHSoir FSH/LHJ13 Matin FSH/LHSoir FSH/LHJ14 Matin FSH/LHPGFSoir FSH/LHJ15 Matin Retrait de la spirale/implantMatin FSH/LHSoir FSH/LH------------------------------------------------------------------------------------J17 (J0) Matin IA1 (12 heures après debut des chaleurs)Soir IA2 (24 heures après début des chaleurs)------------------------------------------------------------------------------------(J7) Récolte et PGF Récolte et PGF------------------------------------------------------------------------------------3.2.3. Conséquences d’un traitement de superovulation3.3.2.1. Nombre d’embryons produitsL'objectif d'une stimulation ovarienne est d'obtenir un maximum d'embryons transférables. On estime d’une

La production d’embryons in vivo \9manière générale que 85 % des donneuses répondent à un traitement de superovulation c’est-à-dire présententplus de deux corps jaunes. 75 % présentent plus de 4 corps jaunes et 65 % en ont plus de 5. Le nombre de corpsjaunes peut aisément être estimé après abattage de l’animal. Par endoscopie, la corrélation est de 0.89 et de 0.6quand le diagnostic est réalisé par palpation manuelle des ovaires.On estime à 7.8 le nombre total moyen d’embryon produits après superovulation. Le nombre moyen d’embryonstransférables est de 5.6 soit 72 %, 71 % étant de qualité 1 et 29 % de qualité 2.Parmi d'autres, la réponse variable (0 à 40 ovulations) et peu prédictible des animaux à un traitement desuperovulation constitue encore à l'heure actuelle un des facteurs limitants de la méthode.. Une récolte sur 3 neproduit aucun embryon transférable et 70 % des embryons transférés proviennent de 30 % des récoltes réalisées.Semblables résultats ont été observés chez la vache laitière. Selon certains auteurs, 70 % de la variation desréponses observées peuvent être imputées à des facteurs intrinsèques liés au statut ovarien de l'animal ou à lanature et au rythme d'injection des substances utilisées.. Les causes peuvent en être trouvées d'une part dans leseffets du traitement de superovulation sur la croissance folliculaire ou d'autre part, dans le manque desynchronisme entre le début du traitement de superovulation et le statut ovarien susceptible d'interférer avec unrecrutement folliculaire optimal.Thibier et Nibert ont procédé à une évaluation des résultats de récolte et transfert d’embryons frais, congeléset/ou sexés. Selon les manipulations effectuées, le nombre de veaux obtenus varie d’un facteur 1 à 6 (Tableau 4)3.3.2.2. Caractéristiques morphologiques et hormonales du folliculeL'effet des traitements de superovulation sur la morphologie et la physiologie hormonale des follicules a fait l'objetde plusieurs recherches dans l'espèce ovine. Ainsi, chez certaines races de brebis connues pour leur prolificité(Booroola, Romanov et Finn), l'augmentation du taux d'ovulation est habituellement associée à des altérationsmorphologiques et fonctionnelles des follicules ovulatoires: la taille des follicules est diminuée de 20 à 50 %, lenombre de cellules de la granuleuse est réduit de 30 %, la concentration en oestrogènes et en inhibine desfollicules est réduite respectivement de 30 et 50 %. De même, l'administration de PMSG ou de pFSH induit uneréduction de la taille des follicules ovulatoires.• OestrusL’œstrus apparaît 35 à 48 heures après l’injection d’une prostaglandine soit environ 24 heures plus tôt quel’œstrus ainsi induit chez des animaux non superovulés. Ainsi, le début des chaleurs de superovulation est observéen moyenne 36 à 44 heures après l’injection d’une PGF suite à celle de PMSG et entre 33 et 48 heures si lasuperovulation a été induite au moyen de pFSH . Les pics de LH et d’oestradiol sont également plus précoces.Idéalement, l’intervalle entre l’injection de PMSG et l’œstrus doit être égal à 4 jours et en tout cas ne peut excéder5 jours.La connaissance du moment exact des ovulations est difficile. Des recherches endoscopiques ont néanmoinsdéterminé que les ovulations commencent 24 heures environ après le pic de LH et durent une douzaine d’heuresenviron, 75 % des ovulations s’observant au cours des 4 premières heures de la période d’ovulation (Laurincik etal. Theriogenology 1993,39,537-544).• Effets hormonauxLa sécrétion de l’hormone LH ne se trouve normalement pas modifiée par les traitements de superovulation. Le picde LH s’observe en moyenne 2 à 6 heures après le début des chaleurs. Il peut être retardé dans des conditionssubtropicales Le cas échéant cependant, une modification du profil de la LH peut entraîner l’absence d’ovulationou interférer avec la qualité des embryons. Des traitements complémentaires à base de GnRH ou d’hCG nesemblent pas être de nature à améliorer les résultats obtenus.La concentration de l’oestradiol augmente 24 heures environ après le début du traitement de superovulation.Cette augmentation s’accélère après l’injection de la prostaglandine et atteint une valeur maximale 34 à 50 heuresplus tard.On peut distinguer trois phases d’évolution de la progestérone. La première phase comprend la période situéeentre le début du traitement de superovulation et l’injection de la prostaglandine : une légère augmentation de laprogestéronémie peut être observée. Elle est imputable à l’activité LH de la PMSG ou des extraits hypophysairesinjectés . La seconde fait suite à l’injection d’un agent lutéolytique : la progestéronémie atteint 25 % de sa valeurinitiale en 12 heures et sa valeur seuil après 24 heures. Dans 10 à 36 % des cas la progestéronémie de diminue passous le seuil de 1 ng dans les 48 heures suivant l’injection de l’agent lutéolytique . La dose de prostaglandineinjectée est sans influence sur la vitesse de la lutéolyse. L’effet lutéolytique est donc comparable chez les femelles

La production d’embryons in vivo \10superovulées et non superovulées et ne dépend ni de la prostaglandine ni de la dose injectée. En phase œstraleproprement dite, la progestéronémie est supérieure à celle observée chez des animaux non superovulés. Elle n’estpas imputable à une lutéolyse incomplète mais résulte du fait que les follicules qui se sont développés en grandnombre sécrètent toujours un peu de progestérone, certains d’entre eux se sont par ailleurs en partie lutéiniséssous l’effet de la composante LH des hormones de superovulation. Une progestéronémie excessive pourrait êtreliée à des ovulations prématurées, phénomène plus souvent rencontré chez les génisses . Au cours de la troisièmephase comprise entre les chaleurs et le moment de la récolte, l’augmentation de la progestérone est plus rapideque chez les animaux non superovulés. En effet des valeurs de 4 à 9 ng sont atteintes dès le 3 ème jour suivantl’œstrus. Une augmentation plus lente de la progestéronémie peut être considérée comme anormale. En effet,leplus souvent, les animaux présentant une bonne réponse témoigne d’une progestéronémie plus élevée trois joursaprès l’insémination. Le jour de la récolte des concentrations comprises entre 16 et plus de 60 ng ont étéobservées . Elles sont corrélées avec le nombre d’ovulations.Deux types de profils anormaux de la progestéronémie ont été décrits. Le premier correspond à une lutéolyseincomplète. Elle est responsable d’anomalies de l’ovulation. L’augmentation de la dose de PGF ne permet pasd’éviter ce phénomène. Il peut également arriver que les corps jaunes induits régressent prématurément 5 à 16jours après le traitement de superovulation. Ce fait serait imputable aux quantités d’importantes d’oestrogènesrésultant de l’activité prolongée de PMSG. L’utilisation d’antisérum anti-PMSG n’est pas de nature à résoudre leproblème.3.2.4. Facteurs d’influence des résultats (IPE 25)Des réponses variables entre individus voire d’un traitement à l’autre ont été enregistrés. Divers facteurs ont étéimpliqués. Outre de la saison (effet négatif des températures élevées) ou de l’alimentation (carence en énergie), ilsrelèvent essentiellement de l’animal et des traitements de superovulation.3.4.2.1. Facteurs propres à l’animalLa qualité de la réponse va dépendre de l’importance de la réserve des follicules préantraux. Ainsi une corrélationentre le nombre de follicules de diamètre compris entre 2 et 5 mm et le nombre d’embryons récoltés a-t-elle étédémontrée par des études échographiques. De même, la présence d’un follicule dominant au moment de la miseen place du traitement de superovulation est-elle de nature à réduire la qualité de la réponse observée.L’âge de l’animal peut également constituer un facteur limitant compte tenu du fait que le nombre de follicules quiquittent la réserve diminue avec celui-ci.Des différences entre races ont également été rapportées (4.6 dans les races Holstein, Normande et Charolaise,3.9 en Blonde d’Aquitaine, 6.6 dans les races Brangus et Simmental, 3.6 en race BBB).3.4.2.2. Nature du traitement de superovulationIl a été démontré dans notre laboratoire que les préparations hypophysaires ayant un rapport LH/FSH de 20 (chezles vaches laitières) et 40 % (chez les vaches viandeuses) ainsi que les traitements s’accompagnant d’uneconcentration croissante en LH donnaient des valeurs exprimées en nombre d’embryons récoltés supérieures àdes rapports de 10 et 80 %.3.4.2.3. Moment de mise en place du traitement de superovulationClassiquement, un traitement de superovulation débute entre le 9ème et le 15ème jour du cycle. Aucunedifférence significative du taux d'ovulation n'a été observée entre les traitements mis en place au cours de cettepériode . La théorie des vagues de croissance folliculaire et le rôle inhibiteur exercé par le follicule dominant sur lacroissance folliculaire ont incité certains chercheurs a proposé des solutions alternatives visant à faire coïnciderdavantage le début du traitement avec le moment d'émergence d'une vague de croissance folliculaire. C'estpourquoi des traitements de superovulation en début de cycle ont été évalués. Le choix de ce moment dutraitement était dicté par le fait qu'il était plus facile d'identifier par rapport à l'œstrus précédent le momentd'émergence de la première vague que de la deuxième vague folliculaire, celle-ci apparaissant par ailleurs 1 à 2jours plus tôt si le cycle comportait trois vagues de croissances folliculaires.A l'exception de l'un d'entre eux, la majorité des auteurs s'accorde à observer une réduction de la réponse à untraitement de superovulation mis en place entre le 2ème et le 7ème jour du cycle. Ce schéma thérapeutiques'accompagne en effet davantage d'une augmentation du développement folliculaire que de l'augmentation dunombre d'ovulations. Cette réduction du nombre d'ovulations a été imputé à l'absence de lutéolyse. Cetteexplication ne peut cependant pas être définitive puisque certains auteurs ne l'ont pas constaté après avoir il estvrai utilisé une double injection de prostaglandines à 12 heures d'intervalle. D'autres alternatives peuvent être

La production d’embryons in vivo \11envisagées. Une étude n'a en effet pas constaté de diminution de la réponse à un traitement de superovulationmise en place la veille ou le jour de l'ovulation.3.4.2.4. Traitements d’amélioration du recrutement folliculairea. Le primingUn prétraitement au moyen de FSH au cours des premiers jours du cycle (priming) vise à augmenter le nombre defollicules recrutés susceptibles de répondre au traitement de superovulation proprement dit mis en place enmilieu de cycle. Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer les résultats contradictoires observés:positifs pour certains auteurs , absents , voire négatifs pour d'autres.Il est possible que l'intervalle entre le priming et le traitement de superovulation proprement dit ne soit pasadapté au rythme de croissance des follicules préantraux, ceux-ci requérant pratiquement deux cycles pouratteindre le stade préovulatoire. Les effets négatifs pourraient selon certains auteurs être imputés au fait que lepriming retarde l'atrésie du follicule dominant et ce faisant prolonge son effet inhibiteur sur la croissance desfollicules sélectionnés dont l'apparition est retardée. Il a également été démontré que le priming s'accompagnaitplus fréquemment de l'atrésie des follicules de taille comprise entre 5 et 9 mm. Pour d'autres, le primings'accompagnerait d'une réduction des concentrations plasmatiques en FSH résultant d'une synthèse accrue par lesfollicules sélectionnés d'oestradiol et d'inhibine. Il est par ailleurs bien connu qu'une diminution différée de laprogestéronémie après l'injection d'une prostaglandine à des animaux superovulés constitue un facteur limitant àl'obtention de résultats optimaux. Il est enfin possible de penser que le priming au moyen de préparationsinsuffisamment purifiées et dès lors également douées de propriétés LH induisent une lutéinisation précoce desfollicules et dès lors entravent la lutéolyse.b. L'insulin growth factorLe développement des follicules préantraux ne semble pas dépendre des mêmes facteurs de croissance que lesfollicules antraux. Parmi d'autres, l'IGF1 apparaît jouer un rôle clé dans la régulation de cette phase de croissance.Il a été pressenti pour être le facteur médiateur de la PMSG et de l'hormone de croissance (GH, bST).Plusieurs faits ont démontré l'implication potentielle de cette hormone dans la régulation de la croissancefolliculaire. La concentration plasmatique de cette hormone augmente au moment de la puberté chez le rat.L'immunisation de la vache contre cette hormone supprime la croissance folliculaire et retarde la puberté. Sonadministration prolongée chez la vache augmente la fréquence des accouchements gémellaires. Lesconcentrations en IGF1 du plasma et du liquide folliculaire sont plus élevées chez les vaches ayant donné naissanceà des jumeaux.c. Suppression de l'effet inhibiteur du follicule dominantL'absence d'effets ou des effets négatifs ont été rapportés à l'encontre du follicule dominant sur la réponse à untraitement de superovulation mis en place en phase dioestrale. Etant donné ces résultats contradictoiresimputables peut-être au manque de définition précise du follicule dominant identifié au début du traitement desuperovulation, différentes études ont été consacrées aux effets potentiels de traitements chirurgicaux ouhormonaux pour supprimer cette dominance et optimiser ainsi la croissance folliculaire subséquente.• Les traitements hormonauxL'administration d'agonistes de la gonadolibérine est classiquement pratiquée en médecine humaine pour recruterdes follicules au moyen de la FSH une fois disparu l'effet d'autorégulation et de régression folliculaire donts'accompagne cette injection de GnRH. Chez la vache, cette approche thérapeutique n'a été à l'heure actuellel'objet que d'une seule expérimentation au demeurant peu concluante.Les études relatives aux effets des oestrogènes sur la dynamique de la croissance folliculaire sont encore peunombreuses. Administré au début d'une phase de croissance folliculaire, le valérate d'oestradiol inhibe lacroissance du follicule dominant et accélère l'émergence d'une seconde vague de croissance folliculaire. Cet effetinhibiteur est momentané. En effet, l'apparition de la seconde vague sera différée si l'injection du valérated'oestradiol est réalisée au milieu (J3) ou à la fin (J6) de la vague de croissance folliculaire précédente. L'effetinhibiteur du valérate d'oestradiol est amplifié lorsqu'il est administré simultanément à un progestagène tel que lenorgestomet. Dans ce cas cependant, le moment d'apparition de la vague de croissance folliculaire suivante n'estpas modifiée et s'avère beaucoup moins variable.Les études des effets de la progestérone ou des progestagènes sur la croissance et la cinétique folliculaire sontrelativement récentes et encore peu nombreuses.Administrée pendant la phase de croissance du folliculedominant, la progestérone en inhibe le développement de manière dose-dépendante. Cette régression

La production d’embryons in vivo \12prématurée du follicule dominant induite par l'inhibition progestéronique de la LHest suivie d'une nouvellelibération de FSH et d'une nouvelle vague de croissance folliculaire. C'est dans le même but qu'a été évaluéel'administration d'hCG quelques jours avant le traitement de superovulation en vue de lutéiniser le folliculedominant présent . Cette méthode n'a pas eu d'effets significatifs sur le nombre d'embryons obtenus sans douteen raison de la lutéinisation des follicules dominés.• Les traitements chirurgicauxLa destruction du follicule dominant par cautérisation, par ablation chirurgicale d'un ovaire, par éclatementmanuel ou par ponction échoguidée constituent des alternatives intéressantes au vu des effets positifs dont elless'accompagnent (meilleure synchronisation des retours en chaleurs, augmentation du nombre du nombre defollicules recrutés, apparition plus rapide d'une nouvelle vague de croissance folliculaire) . Etant donné sa facilitéde réalisation et l'absence de complications locales telles que des adhérences induites par l'éclatement manuel dufollicule, la ponction échoguidée du follicule dominant réalisée 2 jours avant le traitement de superovulationdevrait dans ce contexte constituer une méthode de choix.4. La récolte des embryons4.1. MatérielIl se composera des éléments suivants :Sondes dilatatrice : d’une longueur de 60° cm, possédant une extrémité conique de 4 mm au sommet et de 7 mm àla base, elle permet de préparer le cas échéant le col à la pénétration de la sonde de récolte.Sonde de récolte : deux types sont disponibles. La première à trois voies est la sonde IMV (Cassou).INRA. Elleassure un circuit continu du milieu de collecte. Une voie permet de gonfler le ballonnet. Une autre permetd’injecter le liquide de récolte et la troisième assure la récupération du liquide injecté dans la corne. Cette sondese compose d’un corps rigide de 56 cm de long et de 6 mm de diamètre. Il est muni d’un bouchon d’étanchéitépostérieur et d’un ballonnet en caoutchouc à son extrémité antérieure. Le tuyau de récupération a une longueurde 160 cm et un diamètre de 3 mm. Il est muni à son extrémité d’une bille métallique destinée à en faciliter laprogression dans la corne utérine. Il présente à son extrémité proximale des graduations qui permettent de jugerdu degré de pénétration dans la corne utérine. Il est percé dans sa partie terminale d’orifices. La seconde sonde està deux voies (sonde de Han ; modèle allemand). Une voie permet de gonfler le ballonnet, tandis que la secondepermet d’injecter et de récupérer en alternance le liquide de récolte des embryons. La sonde a une longueur de 70cm et un diamètre de 6 à 7 mm. Elle est munie d’un mandrin interne pour la rendre plus rigide et faciliter ainsi samise en place dans l’utérus.- Seringues : l’une de 20 ml pour gonfler le ballonnet et l’autre de 50 ml pour injecter le liquide de récolte.- Liquides de récolte Il faut prévoir par récolte 1 litre environ (250 à 500 ml par corne utérine) de PBS (PhosphateBuffered Saline). Certains auteurs utilisent une solution de Bovine Serum Albumine (BSA) à 0.4 % ou du PBSadditionné de sérum de veau fœtal (FCS) à 2%. Ces liquides seront placés dans un flacon stérile et maintenu àtempérature de 37 °C.4.2. Méthodologie4.2.1. Méthode chirurgicaleInitialement, la récolte des embryons se faisait par voie chirurgicale sous anesthésie générale le plus souvent auniveau de la ligne blanche en avant du pis. Une fois l’utérus extériorisé, une incision d’un cm de long étaitpratiquée à la base de la corne utérine pour permettre l’introduction d’un cathéter à deux voies (sonde de Folley).Le ballonnet était ensuite gonflé. Le liquide de récolte était injecté au moyen d’une seringue et d’une aiguille àbout mousse au sommet de la corne utérine et récupéré par l’orifice situé à la base du ballonnet. Après récolte, leballonnet était dégonflé, l’utérus suturé et on procédait de la même manière pour l’autre corne utérine. Cettetechnique offrait l’avantage d’un taux de récupération élevé des embryons (70 à 80 %), de pouvoir juger de laréponse ovarienne au traitement de superovulation. Elle fut pratiquement abandonnée étant donnél’infrastructure de mise en place requise mais aussi la difficulté de répéter souvent l’intervention sur le mêmeanimal.

La production d’embryons in vivo \134.2.2. Méthode non chirurgicale ou collecte transcervicale4.2.2.1. Principes de base (sonde de Cassou à trois voies)- L’animal placé dans un travail de contention pour en limiter les déplacements est éventuellement prémédité aumoyen d’un tranquillisant (animaux rétifs mais risque de décubitus), d’une épidurale (3ml de xylocaïne à 2 % :manipulation plus aisée du tractus génital mais risque accru de pneumo-rectum, à éviter si l’utérus est abdominal)et d’un spasmolytique (Buscopan 20 mg en IV).- Le rectum est débarrassé des matières fécales et la région vulvaire convenablement lavée et désinfectée.- La dilatation mécanique préalable du col ne s’avère habituellement nécessaire que chez la génisse. Il convientdans un premier temps d’insérer le dilatateur dans un anneau cervical et de maintenir une pression constante maiscontrôlée. Le plus souvent, la résistance s’efface brutalement une fois le 3 ème anneau franchi.- Le flacon de récupération sera placé en contrebas de l’utérus pour favoriser la récolte du liquide de perfusion.- La sonde de récolte sera préalablement rincée au moyen de sérum physiologique. Recouverte d’une chemisesanitaire, elle est introduite dans le vagin en en longeant le plafond pour éviter le méat urinaire. Une fois arrivéeau col, la chemise sanitaire sera rompue. Le col est alors manuellement ramené vers l’arrière et vient coifferl’extrémité de la sonde. La progression de la sonde dans le col est assurée en prenant le col en avant de la sonde eten le manipulant de bas en haut et de gauche à droite. Une fois le col franchi, la sonde est alors introduite dansl’une ou l’autre corne (respecter autant que faire se peut le même choix pour éviter de perfuser deux fois la mêmecorne ...). La corne est alignée sur la sonde en la prenant par en-dessous et en la faisant progressivement glissersur la sonde.- Le ballonnet sera placé trois travers de doigts environ en avant de la bifurcation des cornes. Parce qu’elle réduitle volume mort de liquide dans le corne, une position plus antérieure du ballonnet est de nature à améliorer laqualité de la récolte. Le gonflement du ballonnet a pour but de fixer la sonde dans la lumière de la corne etd’éviter que le liquide de perfusion ne reflue vers l’arrière. Un ballonnet trop gonflé risque d’endommager lamuqueuse utérine et d’entraîner la présence de sang dans le liquide de récolte. Le volume d’aire nécessaire serade 10 à 12 cm 3 pour une génisse et de 14 à 18 cm 3 pour une vache.- Une fois le ballonnet en place, il convient de dévisser le bouchon étanche en arrière du corps de sonde pourpermettre la progression du flexible. En général, le corne utérine forme un coude juste en avant du ballonnet. Ilconviendra donc de la relever légèrement pour y faciliter la progression du flexible. Celui-ci sera introduit jusqu'àl’obtention d’une résistance signant la position de la bille terminale au niveau de la région utéro-tubaire soit après30 à 40 cm chez une génisse et 40 à 50 cm chez une vache. Une fois le flexible positionné, le bouchon proximalsera revissé.- 20 à 30 ml de liquide de perfusion seront injectés avant d’ouvrir la voie de retour. Normalement, le liquidecommence à s’écouler instantanément. L’aide ajustera le débit d’injection de manière à maintenir en permanence30 à 50 ml de liquide dans la corne. Une surpression risque de faire reculer le ballonnet ou de créer une lésion del’oviducte. Inversement, si l’injection est trop lente, la corne risque de se vider et d’aspirer la muqueuse utérinecontre les orifices du flexible. L’arrêt du retour est souvent observé lors du changement de seringue. Pendant laperfusion (200 ml par corne), l’opérateur agite et déplie la corne utérine tout en évitant de la manipuler pendantles phases de contractions du rectum.- Une fois la corne perfusée, on injectera dans la sonde un volume d’air suffisant pour en chasser le liquide et êtrece faisant sur de récupérer l’entièreté des embryons. Il faut ensuite dévisser le bouchon d’étanchéité et ramener leflexible tout en continuant de récupérer le liquide. Une fois le flexible retiré, on obture la voie de retour et ondégonfle le ballonnet. Le corps de sonde est retiré de manière à éviter le voile intercornual avant d’introduire lasonde dans l’autre corne.- L’intervention sera complété par l’instillation d’une solution d’antibiotiques dans l’utérus et l’injection d’uneprostaglandine pour éviter le développement d’une gestation multiple qui s’accompagne fréquemmentd’avortement.4.2.2.2. Quelques difficultés pratiques- Si l’utérus est trop plongeant, la surélévation du train antérieur de l’animal est de nature à faciliter lamanipulation des cornes. Le cas échéant la traction sur un fil passé au moyen d’une aiguille courbe dans l’exocolpermet de maintenir l’utérus en position plus postérieure.- Si le flexible ne sort pas du corps de sonde, c’est que la corne est peut-être insuffisamment relevée. S’il buteaprès 10 à 20 cm, c’est que l’extrémité de la corne n’est pas assez dépliée.- L’absence du retour de liquide ou un retour en goutte à goutte peut être imputé à une position trop antérieuredu flexible, à son enroulement dans la corne ou à l’obturation de ses orifices par de la fibrine ou du mucus. Le cas

La production d’embryons in vivo \14échéant, il sera débouché en injectant du liquide sous pression. Si le ballonnet est trop postérieur, du liquiderisque de refluer dans la corne contra latérale. Parfois l’absence du retour est du à l’éclatement du ballonnet.4.2.2.3. Particularités de la sonde à deux voies (sonde de Han)Plus que pour la sonde à trois voies, la mise en place de cette sonde est essentielle : il faut en effet la faireprogresser le plus loin possible tout en retirant le mandrin. Une fois le ballonnet gonflé, le mandrin estcomplètement retiré et les voies d’injection et de récupération branchées. L’injection peut se faire par simplepesanteur ou par injection de 50 ml. Les voies d’injection et de sortie seront clampées et ouvertes en alternancejusqu’au passage dans chaque corne de 350 à 400 ml. Le mandrin ne pouvant être réintroduit dans la sonde, uneseconde est nécessaire pour la perfusion de l’autre corne. Il persiste au niveau du tuyau un volume mort danslequel les embryons peuvent être aspirés et refoulés. Ceci explique peut-être la diminution relative du nombred’embryons récupérés au moyen de cette sonde.4.3. Facteurs d’influence des résultatsUne enquête récente a été conduite à partir des informations relatives à 2500 récoltes d’embryons réalisées dans376 exploitations différentes sur 1238 vaches et génisses au cours de la période de 24 mois comprise entrenovembre 1995 et novembre 1997 par une équipe de 4 vétérinaires du centre Gestion Elevage et Reproduction(GER) de Ciney.4.3.1. Données générales de l’enquêteLa majorité des récoltes (94 %) ont été effectuées sur des animaux de race Blanc Bleu Belge. Les inséminations ontété réalisées avec 299 taureaux différents, les 5 taureaux de race Blanc Bleu Belge les plus utilisés étant dansl’ordre Inexes (n=141), Ministre (n=138), Galopeur (n=134), Guliver n=110) et Breugel (n = 107).Le nombre moyen d’embryons totaux et transférables obtenus est respectivement de 6.0 et de 4.4. Il estrespectivement de 7 et de 5.1 si ne sont prises en considération que les seules récoltes ayant permis d’obtenir desembryons. Le nombre maximal d’embryons totaux et transférables a été respectivement de 34 et 23. On observeune large variation du nombre d’embryons transférables obtenus par récolte. Une fois sur cinq, elle ne permetd’obtenir aucun embryon transférable. Dans la même proportion des cas, elle permet l’obtention de 8 à 23embryons transférables (Tableau 5). Au cours de la période de 24 mois considérée, 77 % des vaches et génissesn’ont été récoltées qu’une seule (56 %) voire deux fois (21 %). Seules 2 % des vaches ont été récoltées 8 à 11 fois.Le nombre moyen de récolte par exploitation est de 6.3 soit une récolte tous les 4 mois environ. Il existe de largesvariations entre exploitations puisqu’en effet 54 , 29 et 17 % des exploitants réalisent respectivement 1 à 3, 4 à 10et 11 à 110 récoltes par 24 mois.4.3.2. RésultatsL’analyse de la distribution mensuelle du nombre moyen d’embryons transférables obtenus (4.4) en révèle pourl’ensemble de la période l’augmentation pendant le mois d’avril (5.2) et sa diminution pendant le mois d’août(3.6).Le traitement de superovulation appliqué n’est pas étranger au nombre d’embryons transférables obtenus. Ilconsiste dans 79 % des cas en l’administration de 40 UA à 40 % de FSH en 8 injections. Dans 10 % des cas cetraitement a été précédé de 3 injections de FSH (priming). Le nombre moyen d’embryons transférables a étérespectivement de 4.6 et de 3.7.Le nombre moyen de lactations des animaux récoltés a été de 2.5. 93 % des récoltes ont concerné des vachesprimipares (20 %) ou pluripares (73 %). Le nombre moyen d’embryons transférables obtenu s’est avéré supérieurpour les vaches en 2 ème (4.6) voire 3 ème lactation (4.9) que pour les génisses (4.1), primipares (4.1) ou les vachesplus âgées (3.8 à 4.8).L’intervalle moyen entre les récoltes a été de 111 jours. L’analyse de la distribution des intervalles entre récoltesfait apparaître une différence dans le nombre d’embryons transférables récoltés (Tableau 6).L’intervalle entre le vêlage et la récolte ne semble pas influencer le nombre moyen d’embryons transférablesobtenus. Il est intéressant de noter que une récolte sur cinq (20 %) et une récolte sur quatre sont réaliséerespectivement 90 à 129 jours et 130 à 209 jours post-partum.La cotation linéaire moyenne des vaches récoltées et des taureaux utilisés était respectivement de 88 et 90, 72 et56 % des animaux se situant dans l’intervalle 86 à 90. Aucun effet majeur de la valeur de la cotation linéaire sur lenombre d’embryons transférables obtenus n’a été observé.On observe une large variation (3.5 à 6.3) du nombre d’embryons transférables obtenu en fonction du taureau

La production d’embryons in vivo \15utilisé5. Détermination de la qualité des embryons5.1. Rappels des premiers stades du développement de l’embryonL’ovulation survient chez la vache une trentaine d’heures environ après le début de l’œstrus. Il en résultel’émission d’un ovocyte qui entre-temps a expulsé son premier globule polaire et se trouve bloqué au stademétaphase 2. La rapidité d’expulsion (dans les 16 à 20 heures) de ce premier globule polaire sous l’effet de la LHsemble, selon certains auteurs, déterminante pour le développement futur de l’embryon. Cette phase dematuration ovocytaire est atteinte in vitro par 85 % des ovocytes mis en culture.La chronologie du développement de l’embryon bovin est rappelée dans le tableau 75.1.1. Premières divisions cellulairesL’ovocyte est pénétré par le spermatozoïde dans les deux heures suivant l’ovulation. Cette pénétration déclenchel’expulsion du second globule polaire, la reprise de la division cellulaire et la formation de deux blastomères 24 à48 heures environ après la fécondation. In vitro, cette reprise du développement est quelque peu retardée, lapremière division cellulaire s’observant 44 heures en moyenne après la mise en contact des ovocytes avec desspermatozoïdes capacités. Cette reprise de la division cellulaire est considérée comme critique pour ledéveloppement ultérieur de l’embryon. Ainsi, les embryons qui atteignent le stade 2 cellules 36 heures après lafécondation voire le stade 4 cellules 48 heures après la fécondation ont davantage que les autres la possibilitéd’atteindre le stade blastocyste. Au stade unicellulaire, l’embryon de mammifère est une cellule relativementgrosse dont la taille est comprise entre 70 et 140 microns. Il est entouré d’une zone pellucide. Celle-ci nonseulement maintient les blastomères ensemble mais leur assure un milieu périvitellin adéquat. Les divisionscellulaires ultérieures présentent deux caractéristiques: non seulement elles sont asynchrones, certainesapparaissant plus précocement que d’autres, mais elles aboutissent à la formation de deux populations cellulaires,l’une de petite taille et l’autre de grande taille. Les premières, résultant d’une division plus précoce, donnentnaissance au bouton embryonnaire (ICM : Inner Cell Mass) et les secondes au trophectoderme, futur placenta. Ilest intéressant de noter le caractère totipotent et donc non différentié que présentent les cellules jusqu’au stade8.Au 4ème jour suivant l'insémination d'animaux super ovulés, 72 % des embryons normaux récoltés après abattagesont au stade de 8 cellules. Au 5ème et 6ème jour de gestation 78 et 81 % d'entre eux sont respectivement austade 16 et plus de 16 cellules. En général, l'embryon passe dans l'utérus vers le 5ème jour de gestation. Desrécoltes séquencées réalisées après abattage de vaches super ovulées ont permis de préciser que 4, 5 et 6 joursaprès l'insémination, respectivement 60 % des embryons sont dans l'oviducte et 80 et 91 % dans l'extrémité de lacorne utérine.Ces divisions cellulaires aboutissent à la formation d’une morula (32-64 cellules) qui va être l’objet du phénomènede la compaction. La compaction consiste en la formation de zones de contact entre les blastomères aboutissant àla formation d’une cavité blastocoelique et à l’expansion du blastocyste. Celle-ci résulte de la présence d’ungradient ionique différent entre les parties internes et externes du blastocyste ce qui a pour résultat d’induire parosmose une accumulation de liquides dans la morula. Sa formation indique que l’embryon a franchi avec succès laphase de blocage observé in vitro au stade 8-16 cellules (4 ème division cellulaire) chez la plupart des embryons demammifères à l’exception des primates et de la lapine. Ce blocage implique que soient davantage maîtrisés in vitroles facteurs qui en seraient responsables et qui encore à ce jour imparfaitement connus.C’est également au cours des premières divisions cellulaires (stade 2 dans l’espèce caprine, stade 4 dans lesespèces porcine et humaine, stade 8 dans l’espèce bovine et stade 16 dans l’espèce ovine) que le contrôle dudéveloppement embryonnaire passe du génome maternel au génome de l’embryon lui-même.5.1.2. Sortie de pellucide et phase d’élongation.Le jeune blastocyste comprend environ une centaine de cellules. Son diamètre est de 160 microns et l’épaisseur desa zone pellucide de 12 microns. L’accumulation de liquides dans le blastocyste est responsable de l’expansion dublastocyste. Celle-ci se traduit par une augmentation de 60 % de son diamètre qui passe abstraction faite del’épaisseur de la zone pellucide, d’un diamètre de 400 à 700 microns. Il en résulte également un amincissement dela pellucide ce qui explique que sa rupture peut se produire à n’importe quel endroit. L’éclosion c’est-à-dire lasortie du blastocyste hors de sa pellucide (hatching) vers le 9 ème -10 ème jour suivant la fécondation ne résulte pasd’une lyse enzymatique, des membranes pellucides intactes peuvent être retrouvées dans l’utérus, mais de la

La production d’embryons in vivo \16formation d’un point de perforation. Ce processus a une durée moyenne de 12 heures. Diverses modalités en ontété décrites : la phase d’expansion est continue et suivie de l’éclosion ; elle peut-être discontinue et êtreentrecoupée de quelques phases de contraction se terminant ou non par une éclosion normale. Cette phased’extrusion blastocytaire au travers d’une zone pellucide incomplètement perforée pourrait expliquer la formationde vrais jumeaux.Vers le 11 ème -12 ème jour de gestation, le blastocyste se compose de 1000 cellules environ 25 % d’entre ellesseulement constituant le bouton embryonnaire recouvert jusqu'à ce moment par le trophectodermeDe sphérique, le blastocyste prend progressivement un aspect ovoïde avant d’entamer vers le 12 ème -14 ème jour saphase d’élongation. Le début de cette phase varie entre espèces et entre individus, le cas le plus extrême étantcelui de la diapause présentée par le chevreuil. Elle peut également être très rapide puisque dans l’espèce porcine,le blastocyste s’allonge de 30 à 45 mm par heure entre le 12 ème et le 14 ème jour de gestation. Le trophoblastedifférencié vers le 5 ème - 6 ème jour de gestation est un tissu dont la croissance est très rapide. Constitué del’endoderme et du trophectoderme, il forme le chorion et est à l’origine des cotylédons. Il débute à ce moment saphase d’élongation jusqu’à atteindre une longueur de 2.5 cm en moyenne au 16 ème jour de gestation.D’importantes variations individuelles ont été décrites à ce stade de gestation. L’ectoderme, l’endoderme et lemésoderme sont à ce moment bien différenciés et le trophoblaste est environ 50 fois plus long que le disqueembryonnaire proprement dit.5.1.3. L’implantationLe trophoblaste différencié vers le 5 ème - 6 ème jour de gestation est un tissu dont la croissance est très rapide.Constitué de l’endoderme et du trophectoderme, il forme le chorion et est à l’origine des cotylédons. Il débute àce moment sa phase d’élongation jusqu’à atteindre une longueur de 2.5 cm en moyenne au 16 ème jour degestation. D’importantes variations individuelles ont été décrites à ce stade de gestation.. L’ectoderme,l’endoderme et le mésoderme sont à ce moment bien différenciés et le trophoblaste est environ 50 fois plus longque le disque embryonnaire proprement dit.Les premiers contacts tissulaires entre le trophoblaste et la surface utérine s’observeraient selon les auteurs entrele 11 ème jour de gestation et le 90 ème jour. Des études plus spécifiques ont confirmé qu’en fait, c’est vers le 20 ème -30 ème jour de gestation qu’un processus d’adhésion entre les structures maternelles et embryonnaires se mettraiten place.5.2. Critères d’identification de la qualité des embryonsLes embryons récoltés après superovulation ou fécondation in vitro se présentant sous des aspectsmorphologiques divers, il est important d’en apprécier la qualité avant leur transfert ou autres manipulationsbiotechnologiques éventuelles. Divers critères ont été proposés. Les uns évaluent les caractéristiquesmorphologiques de la pellucide et des blastomères et vérifient si elles sont en accord avec le stade de gestation.Des valeurs de diamètre externe de l’embryon et de l’épaisseur de la pellucide ont dans ce but été déterminées(Tableau 8) D’autres moins couramment utilisés se basent sur le nombre de cellules identifiées à un stade dedéveloppement donné, l’activité enzymatique (test à la FDA : Fluorescéine Diacétate transformé sous l’actiond’estérases présentes dans les cellules vivantes en un composé non fluorescent) ou métabolique (consommationde glucose en culture, synthèse de lactate deshydrogénase) ou encore sur le délai voire les modalités d’éclosion dublastocyste une fois sa phase d’expansion réalisée.Une fois récoltés, les embryons seront placés dans 2 à 3 ml de milieu de récolte propre et examinés auxgrossissements 10-40 pour en préciser les éléments morphologiques généraux. Les blastocystes dits normauxseront isolés des autres. Les blastocystes jugés anormaux seront ensuite examinés au grossissement 120 pour enpréciser les caractéristiques cellulaires. Ils seront à nouveau examinés après 4 à 6 heures.L’évaluation morphologique fait classiquement référence à celle proposée par Eldsen en 1978. En pratique, 8éléments d’observation peuvent être retenus. Ils concernent la membrane pellucide (1. sphéricité, 2. épaisseur, 3.aspect fissuré ou non), le blastocyste en général (4. régularité de son aspect général, 5. degré d’identification deses différentes structures à savoir le trophoblaste, le bouton embryonnaire et la cavité blastocoelique) et lescellules blastocytaires (6. aspect des contours cellulaires et degré de variation de taille entre les cellules, 7.présence de cellules détachées dans l’espace vitellin, 8. présence de vacuoles dans les cellules ou de granulations àleur surface).Morphologiquement, il est possible de distinguer les divers stades de développement de l’embryon sur base descritères suivants. Au stade morula, il est difficile de bien distinguer les différents blastomères. Le tissuembryonnaire occupe la majorité de l’espace périvitellin. Dans le cas d’une morula dite compacte, l’embryon

La production d’embryons in vivo \17occupe 60 à 70 % de l’espace périvitellin. Le jeune blastocyste est un embryon présentant un début de cavité(blastocoele) : il a un aspect de chevalière. L’embryon occupe 70 à 80 % de l’espace périvitellin. A ce stade, il estpossible de distinguer la masse embryonnaire et le trophoblaste. Au stade blastocyste, il devient très aisé dedistinguer la masse des cellules embryonnaires et le trophoblaste. La cavité blastocoelique est nettementidentifiable. L’embryon occupe pratiquement tout l’espace périvitellin. Au stade de blastocyste expansé, lediamètre de l’embryon a brutalement augmenté (x 1.2 à 1.5) tandis que l’épaisseur de la pellucide s’est réduite de2/3.Il faut néanmoins tenir compte de certaines remarques : pour un jour de récolte donné, plusieurs blastocystes audemeurant normaux peuvent se trouver à des stades de développement plus ou moins avancés. De même, il n’estpas rare de récolter des ovocytes non fécondés. Leur zone pellucide sera sphérique ou oblongue. Ils ne présententpas de contours cellulaires bien visibles. Le matériel cellulaire est dispersé dans l’espace vitellin (aspectpycnotique).Quatre voire cinq classes d’embryons sont distinguées:• - Classe 1 (excellent)Embryon au stade normal de développement au moment de l’observation : aspect symétrique, blastomèrespolygonaux formant une masse compacte au stade morula• - Classe 2 (bon)Aspect semblable aux embryons de classe 1 mais de forme asymétrique pouvant contenir des blastomères séparésde l’amas compact des cellules formant la morula. Ils peuvent également présentés un retard de développementpar rapport aux autres embryons récoltés sur la même donneuse.• - Classe 3 (Moyen)Embryons en retard de développement de 1 à 2 jours. Les blastomères sont sphériques et de taille variable austade morula. On constate la présence de vésicules dans les blastomères. L’aspect de l’embryon est plus sombreou plus clair que la normale.• - Classe 4 (mauvais)Embryon en retard de développement de 2 jours. Les limites cellulaires sont indistinctes.• - Classe 5 (dégénérés)La dégénérescence peut parfois être, à ce point évidente, qu’il n’est plus possible de reconnaître le stade dedéveloppement. L’embryon prend parfois une configuration anormale.6. Le transfert d’embryons6.1. Synchronisation de la donneuse et des receveusesUne synchronisation aussi parfaite que possible entre l’âge de l’embryon et donc la donneuse et l’étatphysiologique de l’utérus de la receveuse constitue l’élément essentiel de la réussite du transfert d’un embryon.Une étude menée en 1994 a précisé les pourcentages de gestation observées après transfert de 2478 embryonssur des receveuses qui étaient venues en chaleurs respectivement 48 h, 24 h avant la donneuse, en même tempset 24h et 48 h après la donneuse. Les pourcentages de gestation ont été respectivement de 24, 52, 58, 50 et 44 %.Un écart de 24 heures maximum entre le jour des chaleurs de la donneuse et de la receveuse sera donc accepté. Ilest vrai qu’in vitro le développement des blastocystes peut être retardé. Il est connu cependant que ceux quiatteignent le stade blastocytaire au 7 ème jour de développement sont de meilleure qualité que les autres. Aussin’est-il pas recommandé d’adopter une stratégie différente de synchronisation et donc de transfert des embryonsobtenus in vivo et in vitro.Les traitements hormonaux de synchronisation de la donneuse et des receveuses sont de nature diverse. Ilspeuvent être utilisés seuls ou en association. Leur employabilité dépend d'une part du degré de synchronisationqu'ils permettent et d'autre part de la possibilité qu'ils offrent de ne pas nécessairement détecter l'oestrus. Oninsistera néanmoins sur le fait qu'une détection de qualité autorise un transfert au meilleur moment. Par ailleurs,le résultat du transfert va également dépendre du degré d'exactitude du corps jaune éventuellement présent aumoment du transfert. Ce degré d'exactitude tiendra compte du fait qu'en moyenne 25 à 35 % des receveuses sontéliminées. Les traitements potentiels ont fait l’objet d’une description détaillée dans le chapitre relatif àl’anoestrus. Nous nous limiterons ici à rappeler des essais plus spécifiques réalisés dans le cadre du transfertd'embryons.

La production d’embryons in vivo \18injection unique au 2 ème jour du traitement de superovulation de la donneuse (4 ème injection de FSH/LH) d’uneprostaglandine F2alpha naturelle ou de synthèse en IM après avoir confirmé manuellement ou par échographie laprésence d’un corps jaune de diamètre supérieur à 2 cm.double injection d’une prostaglandine F2alpha naturelle ou de synthèse à 11 (génisses) ou 14 jours (vaches)d’intervalle, la deuxième injection ayant lieu au 2 ème jour du traitement de superovulation de la donneuse (4 èmeinjection de FSH/LH) : ce traitement offre l’avantage d’assurer un plus grand degré de synchronisation desreceveuses.retrait au 2 ème jour du traitement de superovulation de la donneuse (4 ème injection de FSH/LH) d’un implant denorgestomet ou d’une spirale de progestérone après respectivement 9 et 12 jours de mise en placeretrait au 2 ème jour du traitement de superovulation de la donneuse (4 ème injection de FSH/LH) d’un implant denorgestomet ou d’une spirale de progestérone et injection simultanée d’une prostaglandine F2alpha naturelle oude synthèse après respectivement 7 et 9 jours de mise en placeLe protocole Ovsynch : On a comparé les pourcentages de gestation obtenus après transfert d'embryons congeléssur des vaches synchronisées au moyen de PGF2alpha ou du protocole Ovsynch. Le transfert était réalisé 7 joursaprès la détection de l'oestrus ou la seconde injection de GnRH pour autant qu'un corps jaune de diamètresupérieur à 10 mm ait été détecté par palpation manuelle ou par échographie. Cette comparaison démontra uneffet favorable du protocole Ovsynch (39,1 % et 31,3 % de gestation sur respectivement 266 et 310 receveuses).D'autres études sont venues confirmé la possibilité de réaliser un transfert d'embryons sur des vaches ou génissessans qu'au préalable elles aient été vues en chaleurs. Ainsi un taux de gestation de 59,9 % a été obtenu aprèssynchronisation de 1637 receveuses au moyen d'un protocole de type Ovsynch joint à la mise en place pendant 7jours d'un implant ou d'un CIDR .6.2. Le transfert d’embryons : matériel et techniqueAu début, les transferts d’embryons furent réalisés par voie chirurgicale au niveau du flanc ipsilatéral à l’ovaireporteur du corps jaune. La peau et la tunique abdominale sont incisées au moyen d’un bistouri et les couchesmusculaires dilacérées sur une longueur de 10 cm environ au moyen des doigts. Le péritoine est ponctionné aumoyen de l’index. L’extrémité de la corne est amenée au niveau du site opératoire et l’embryon mis en place dansson tiers supérieur après ponction de la corne au moyen d’une aiguille mousse.Plus classiquement, le transfert d’embryon est réalisé à l’heure actuelle par voie transcervicale au moyen depistolet de transfert (« inovulateur de Cassou ») de diamètre de 3 mm pour les génisses ou de 4 mm plus rigidepour les vaches.6.3. Facteurs d’influence des résultats• Etat hormonal de l’animal receveurLa progestérone joue un rôle majeur sur le statut physiologique de l’utérus le jour du transfert. Une concentrationminimale est indispensable. Il est possible de s’en assurer par l’identification manuelle d’une structure lutéalenormale sur l’ovaire. Cette méthode a ses limites et le degré d’exactitude dépend et notamment de l’expériencedu clinicien (Voir chapitre relatif à la propédeutique du tractus génital). Un dosage de progestérone réalisé la veilleou un examen échographique effectué le jour même sont de nature à augmenter le degré d’exactitude de cettestructure ovarienne.• Nombre de transfertsIl a été fait état d’une réduction des chances de gestation après un second ou troisième transfert (suivis degestation) à un même animal receveur . Cet avis mériterait d’être confirmé.• Effet de la saisonLes résultats de 1124 transferts d’embryons réalisés par une équipe de 6 vétérinaires dépendant du centreGestion, Elevage et Reproduction (GER) de Ciney au cours d’une période de 24 mois comprise entre les mois denovembre 1995 et de novembre 1997 ont été analysés. Il s’avère que quelque soit l’année, le pourcentage deréussite de gestation est supérieur au mois de juin et compris entre 64 et 76 %.• Effet de la race de la receveuseLes embryons sont transférés en proportion pratiquement égale sur des receveuses de race Blanc Bleu Belge (38.5%) et Pie Noire (40 %). On observe un taux de réussite supérieur chez les receveuses de race Pie Noire (48 %) queBlanc Bleu Belge (40 %) (voir étude citée). Le choix de certaines races peut s’accompagner d’un risque accru de

La production d’embryons in vivo \19césariennes.• Effet de l’âge de la receveuseLes génisses offrent l’avantage d’avoir un risque plus faible d’infections utérines et une manipulation plus aisée dutractus génital. Par ailleurs leurs besoins sont limités à leur croissance. A l’inverse cependant, les vachesprésentent un col plus facile à cathétériser. En effet, il a été estimé que 10% des génisses présentait un col dont lefranchissement était difficile. Les pluripares doivent être préférées aux primipares.Dans l’étude citée, l’âge moyen des receveuses utilisées était de 32 mois. On peut constater une tendance à ladiminution du taux de réussite avec l’âge de l’animal au moment du transfert (Tableau 9)• Facteurs de stressIl faudra éviter de traiter préventivement (vaccinations, traitements antiparasitaires...) les animaux au cours destrois semaines précédant le transfert. De même, tout changement brutal de la ration sera évitée au cours du moisprécédant et suivant le transfert. La manipulation des animaux lors du transfert se fera de manière prudente lejour du transfert. Au besoin on aura recours à une anesthésie loco-régionale surtout si le vétérinaire responsabledu transfert n’en a pas une grande expérience.• Thérapeutiques hormonales complémentairesLes essais d’administration de progestagènes (implants, spirales vaginales, CIDR mis en place pendant 6 à 13 jours6 à 10 jours après l’insémination artificielle) n’ont pas apporté de résultats unilatéralement concluants. D’autresauteurs ont enregistré un effet favorable d’une injection de 1500 UI d’HCG 5 à 7 jours après l’insémination seraitde nature à augmenter le pourcentage de gestation. A notre connaissance aucune étude standardisée n’a étéconduite avec des animaux receveurs.La GnRH a également été évaluée chez les animaux receveurs. Son injection à la dose de 8 mcg le jour du transfertde l'embryon soit au 7ème ou 8ème jour du cycle ou 4 à 6 jours après le transfert soit entre le 11ème et le 15èmejour du cycle n'entraîne aucune différence significative dans le pourcentage de gestation obtenu. Elle estégalement dépourvue d'effet lors du transfert d'un embryon de moindre qualité ou si le taux de progestérone dela receveuse est insuffisant. Il ne semble donc pas qu'une seule injection puisse pallier au manque desynchronisme éventuel entre la donneuse et la receveuse, facteur impliqué dans les échecs observés aprèstransfert d'un embryon. Dans ce cas, des injections répétées de GnRH administrées tous les trois jours à partir du12ème jour du cycle à des receveuses asynchrones par rapport aux donneuses sont plus à même de maintenir lagestation. Ce traitement permettrait à des embryons présentant un retard de développement d'avoir le tempsnécessaire pour être capable de synthétiser leur protéine trophoblastique responsable du blocage lutéolytique etdonc du maintien de la gestation. Cette étude ne semble pas avoir été à ce jour confirmée.Les interférons sont dotés de propriétés antivirales. Ils stimulent la synthèse d’anticorps et l’activitéantimicrobienne des macrophages et neutrophiles. Synthétisés notamment par le trophectoderme dès le 12 èmejour de gestation, ils sont largement impliqués dans le mécanisme au demeurant complexe du maintien de lagestation. Quelques essais préliminaires d’utilisation d’interférons recombinés (rboIFN recombinant bovineinterféron) ont été réalisés avec succès chez la brebis. Ils sont en attente de confirmation chez la vache.D’autres méthodes ont également été envisagées : co-transfert de vésicules trophoblastiques, d’embryonshybrides (bovin x ovin) (helper embryo), d’embryons de moindres qualités dont le bouton embryonnaire aurait étédétruit par LASER ou encore d’ovocytes parthénogénomiques.7. La conservation des embryonsLa conservation des embryons récoltés sur un animal donneur ou obtenus par fécondation in vitro constitue uneétape essentielle du transfert d’embryons. Cette conservation peut s’envisager à court ou long terme.L’embryon récolté peut être stocké temporairement avant son transfert. Il a été démontré que les milieux deHam’s F-10 ou du PBS additionné de 20 % de sérum fœtal de veau (FCS) ou de BSA (Bovine Serum Albumine)convenaient parfaitement pour maintenir les embryons envie pendant un délai d’une douzaine d’heures àtempérature ambiante. Pour une conservation plus longue (> 12 heures) il semble nécessaire de remplacerrégulièrement le milieu. Il est également possible de stocker les embryons au réfrigérateur (4°C) pour une périodede 12 à 24 heures. D’une manière générale cependant, les résultats obtenus seront d’autant meilleurs quel’embryon est rapidement transféré à l’animal receveur (< 3 heures). Une remarque s’impose. Les embryons

La production d’embryons in vivo \20obtenus in vitro présentent des caractéristiques cellulaires différentes de ceux obtenus in vivo. Leur conservation àcourt terme ne peut s’envisager que pendant 24 heures à une température de 20°C.Pour une conservation à plus long terme, une congélation de l’embryon sera requise. Mise au point sur desembryons de souris, la méthode aboutit en 1973 à la naissance du premier veau né après congélation del’embryon. La méthode s’est rapidement intégrée aux programmes de superovulation étant donné les nombreuxavantages présentés tant du point de vue zootechnique (inutilité de synchronisation des donneuses), quecommercial (exportation plus aisée) ou génétique (banque d’embryons d’animaux d’élite, conservation d’espècesen voie de disparition) voire scientifique (études biochimiques et cryobiologiques fondamentales). Elle a ce faisantpermis de dissocier dans l’espace et dans le temps la production et le transfert des embryons. Elle a néanmoinsnécessité de nombreuses étapes visant à déterminer les critères de choix de l’agent cryoprotecteur ainsi que lesméthodes de congélation et de décongélation. En une vingtaine d’années, elle a été appliquée dans la plupart desespèces animales (Tableau 10).7.1. Données générales• Une petite histoire ….A 1'entrée du terrible hiver de 1942, par un froid de loup, des soldats finlandais, dans 1'isthme de Caré1ie, mirentle feu à la forêt de Raikkola, où s'était concentrée 1'artillerié soviétique - hommes, bêtes et canons. Réveillés ensursaut, entourés de clameurs, pris de panique, un millier de chevaux, derrière leurs chefs de file, coururent sejeter dans le lac Ladoga pour échapper à la fournaise. Ils essayèrent de nager vers 1'autre rive, la tête tendue horsde 1'eau, farouchement cabrés, grelottant de froid et de peur. Soudain, avec le bruit sec d'une vitre qu'on brise,1'eau qui les protégeait gela, les saisit, les emprisonna. A l’aube; à travers la forêt calcinée, les Finlandaisdécouvrirent émergeant d’une plaque d’albâtre qui s’étendait à perte de vue, des centaines et des centaines detêtes de chevaux. Le givre les avait recouvertes d’un manteau bleuté. Dans les yeux dilatés, la terreur brillaitcomme une flamme. Tout le long de l’hiver, elles demeurèrent ainsi, “ces têtes mortes à la crinière glaciale, durescomme du bois, les lèvres contractées par un hennissement désespéré”. Cette vision digne de Jérôme Bosch,chacun peut, comme à tout tableau lui donner une signification personnelle. Pour Malaparte, ces chevaux sont lesymbole de la vieille Europe chrétienne et paysanne - désemparée et suicidaire. Peut-être verrez-vous en eux lesymbole d'un mal plus permanent, qui guette tout homme et toute société : le saut d'un excès dans un autre, lemanichéisme, le renversement dialectique, le vertige du tout ou rien, du blanc et du noir.Ces chevaux qui, par crainte du mur de flammes, s'enferment jamais dans un mur de glace, ils auraient pu, entre1'enfer du brasier et 1'enfer de la banquise, se frayer une troisième voie, s'élancer à la file le long de la rive, engalopant sur la grève là ou 1'incendie ne menaçait pas, en trempant les sabots dans le lac si les flammess'avançaient. ils auraient évités à la fois d'être brûlés vifs et d'être pétrifiés. Mais le réflexe d'un être apeuré oufougueux, surtout en groupe, le pousse à bondir d'un extrême à l'autre. C'est en voulant se soustraire à la mort parle feu que les chevaux russes ont trouvé la mort par le gel.Mais pourquoi la glace a-t-elle pris tout à coup ? A première vue, un millier de chevaux brillants qui se précipitentdans un lac sur le point de geler devraient réchauffer 1'eau, donc retarder le moment où celle-ci se changera englace. Malaparte fait intervenir d'autorité, juste à ce moment-là, une bise fortuite. A 1'instant précis où letroupeau trouve refuge dans les flots, le vent du nord se lève “comme un Ange, en criant, et la terre meurtbrusquement. La mer, les lacs, les fleuves gèlent brusquement. Même 1'eau de mer s'arrête au milieu de 1'air,devient une vague de glace courbée et suspendue dans le vide”Malaparte n'aurait pas eu à faire appel au merveilleux, s'il avait connu le phénomène physique désigné sous lenom de surfusion. La thermodynamique enseigne qu'une eau très pure, comme celle des lacs glaciaires, ne gèlepas. A 0°C : elle se maintient à 1'état liquide jusqu'à dix ou vingt degrés au-dessous de zéro. Mais 1'immersionsoudaine de corps étrangers déclenche la cristallisation de 1'ensemble. L'équilibre thermique bascule en quelquessecondes. De proche en proche, toutes les molécules d'eau se transforment en cristaux de glace. Ce sont leschevaux qui provoquèrent eux-mêmes le gel du lac.Cet équilibre précaire d'une eau en surfusion évoque la fragilité invisible de la société complexe dans la quellenous baignons.In : Alain Peyrefitte, Les chevaux du lac Ladoga, Plon 1981.• La surfusionLe point de congélation d’une solution dépend de sa concentration en solutés dissous (Loi de Raoult) : ceux del’eau, d’une solution de tampon phosphate (PBS) renfermant du glycérol 1.5 M sont respectivement de 0, -0.8 et -4.5°C. La glace ne se forme le plus souvent que si le point de congélation est dépassé. Cependant, il arrive que des

La production d’embryons in vivo \21températures inférieures à celles du point de congélation puissent être atteintes sans qu’il n’y ait formation deglace. C’est l’état de surfusion. Il est particulièrement instable. Il suffit d’une vibration, d’un choc mécanique, d’uneinjection d’azote liquide ou d’une impureté pour initier le processus de cristallisation. Une fois amorcé ceprocessus de cristallisation (seeding), on constate que la température remonte jusqu'à celle correspondant aupoint de congélation de la solution utilisée. Un pic de surfusion trop important (> 2°C) est préjudiciable à la surviedes embryons.• Les effets de la congélationAu cours de la congélation, les cristaux de glace se forment d’abord dans le milieu extracellulaire : sa concentrationen solutés augmente rapidement. Il en résulte une sortie d’eau de la cellule dont le volume diminue : l’embryon sedéshydrate. L’importance de ces mouvements d’eau cellulaire dépend cependant de la vitesse de congélation Si lavitesse de refroidissement est lente, l’eau sort progressivement de la cellule. A l’inverse, si la vitesse decongélation est élevée, l’eau ne sort pas de la cellule et se congèle brutalement. Il en résulte la formation de groscristaux intracellulaires. Ces deux conséquences peuvent être atténuées en contrôlant la vitesse derefroidissement entre 0°C et -60°C d’une part et en recourant à des agents cryoprotecteurs d’autre part. De leurconcentration va dépendre en effet la quantité d’eau résiduelle intracellulaire lors du passage de l’embryon dansl’azote liquide.7.2. Nature des agents cryoprotecteursEn l’absence d’agent cryoprotecteur, les cellules de mammifères ne survivent pas à une température inférieure à -20°C. Ayant la propriété de fixer les molécules d’eau, les agents cryoprotecteurs abaissent le point de cristallisationdes cellules. Par ailleurs, ils réduisent la quantité de glace qui se forme au cours de la congélation mais contribuentégalement à en modifier la forme de ses cristaux. Ils ne sont cependant pas dépourvus d’effets délétères d’ordrebiochimique, osmotique ou cellulaire (lésions de l’acrosome dans le cas des spermatozoïdes).Il en est de trois types. Au premier groupe appartiennent ceux qui pénètrent dans la cellule (diméthylsulfoxidec’est-à-dire DMSO, glycérol, propanediol, méthanol, éthylène glycol, ce dernier étant de plus en plus courammentutilisé et semblerait garantir de meilleurs résultats. La cause pourrait en être trouvée dans son poids moléculaireplus faible et par conséquent sa perméabilité plus élevée) : ils agissent essentiellement en la déshydratant et enréduisant la taille des cristaux lors du refroidissement. Au second groupe appartient le sucrose (saccharose),galactose ou encore saccharose. Non perméables, ils augmentent la pression osmotique extracellulaire et cefaisant déshydratent la cellule sans y pénétrer. Le troisième groupe enfin comporte des substances de poidsmoléculaire plus élevé (polyvinylpirrolidone, dextran, serum, serum albumine, lipoprotéines présentes dans lejaune d’œuf) qui ne pénètrent pas dans la cellule : ils agissent essentiellement au niveau membranaire (protectionet réparation). La congélation des embryons fait essentiellement appel aux cryoprotecteurs de type pénétrant. Ledegré de pénétration de l’agent cryoprotecteur dépend de divers facteurs dont le coefficient de perméabilité del’embryon (celui-ci dépend du stade de développement de l’embryon : les morulas résistent davantage à lacongélation que les jeunes blastocystes ou les blastocystes expansés, et de l’espèce) au cryoprotecteur, le gradientexistant entre les concentrations intracellulaires et extracellulaires de l’agent cryoprotecteur et la température desurface de l’embryon. Leur addition en plusieurs ou une seule étapes pendant ce qu’il est convenu d’appeler letemps d équilibration semble donner les mêmes résultats.7.3. La congélation proprement diteLa congélation comprend une série d’étapes relativement classiques mais aussi parfois spécifiques des laboratoiresqui les utilisent. De même, l’appareillage qu’elle nécessite est-il de nature fort diverse, certains fonctionnant àl’éthanol pur ou à l’azote liquide.• Etapes classiquesLa première étape de la congélation consiste à équilibrer l’embryon dans sa solution de PBS (renfermant 10 % desérum fœtal bovin) avec une solution de glycérol 1.4 M soit 10 % pendant 20 minutes à la température ambiante(20°C). La seconde étape visera à conditionner la solution PBS-glycérol renfermant l’embryon dans une paillette de0.25 ml. Pour ce faire la solution est aspirée tout en séparant la partie renfermant l’embryon par deux bulles d’air.Lors d’une troisième étape, l’a paillette est transférée dans l’appareil à congélation et refroidie jusque –7°C à lavitesse de 1 à 3°C par minute. La paillette est alors maintenue pendant 5 à 7 minutes à cette température pour lastabiliser. La quatrième étape consistera à provoquer la cristallisation par seeding. Pour ce faire on heurtera la oules paillettes ou le liquide de refroidissement au moyen d’une pince par exemple. Lors de la cinquième étape, lapaillette est refroidie de –7°C à –35°C à raison de 0,3 à 0,6°C par minute. Cette température semble être optimale

La production d’embryons in vivo \22pour obtenir un compromis entre déshydratation et formation de glace intracellulaire. Lors de la sixième étape, lapaillette est plongée dans l’azote liquide à –196°C.• La vitrificationLa vitrification constitue une méthode alternative intéressante. Elle se base sur la concept de solidification directe.L’élévation extrême de la viscosité du milieu permet de créer un état amorphe ou vitreux sans formation de glaceintra ou extra cellulaire. La solution de vitrification renferme de très fortes concentrations d’un ou de plusieursagents cryoprotecteurs de type pénétrant (25 % de glycérol et 25 % de propanediol). La vitesse de congélation estextrêmement élevée et obtenue par immersion directe dans de l’azote liquide (250°C par minute). Compte tenu dela toxicité pour l’embryon des agents cryoprotecteurs utilisés à ces concentrations, l’équilibration constitue uneétape critique de la méthode. Enfin, l’état vitreux étant instable à des températures supérieures à -100°C, lavitesse de décongélation doit être très rapide (250°C /min) pour minimiser les risques de lésions cellulaires due à laréformation de cristaux lors de la décongélation.Récemment, une nouvelle méthode de vitrification appelée OPS (Open Pulled Straw) a été proposée. Lesminipaillettes de 0.25 ml sont traitées à la chaleur pour en réduire de moitié le diamètre externe (0.8 mm vs 1.7mm) et l’épaisseur de leur paroi (0.07 vs 0.15 mm). Les embryons sont incubés successivement dans deux solutionsde concentrations croissantes d’éthylène glycol et de DMSO et de sucrose 0.5M. puis aspirés (1 à 2 microlitres)dans la paillette par simple capillarité. Une fois conditionnées, les paillettes sont plongées dans l'azote liquide. Leurdécongélation s’opère en plongeant les paillettes dans un milieu à 37°C. Ce système s’avère applicable pourcongeler des ovocytes ou des embryons de J3 à J7 mais pas aux embryons de J1 ou J2.• La congélation ultrarapideA la différence de la vitrification, ce type de congélation induit la formation de glace intra et extracellulaire. Elleimplique le recours à un cryoprotecteur de type pénétrant (glycérol) et d'un cryoprotecteur non pénétrant(sucrose). Morula et blastocyste sont refroidis jusque – 30°C à la vitesse de 12°C par minute puis plongés dansl’azote liquide. Cette méthode n’a été à ce jour appliquée qu’aux embryons de souris, rates et lapines.7.4. La décongélationIl en existe de deux types qualifiés de décongélation lente et de décongélation rapide. Dans l’un et l’autre casl’objectif est de soustraire l’embryon à l’action de l’agent cryoprotecteur utilisé pour la congélation et de leréhydrater. Dans la décongélation lente (or multistep thawing) le contenu de la paillette est passé dans trois bains(5 minutes par bain) renfermant des concentrations décroissantes de glycérol (6.6 %, 3.3 % et 0 %) et constantesde sucrose (0.3 M), le quatrième bain ne renfermant que du PBS et assure la réhydratation de l’embryon. Cetteméthode requiert du temps (1 à 2 heures) et un minimum d’équipement de laboratoire. Elle peut requérirégalement un microscope pour observer la qualité de l’embryon décongelé. Dans la décongélation rapide(or onestepthawing) la paillette est décongelée à la température ambiante (20°C). Cette décongélation rapide impliquecependant l’utilisation lors du montage de la paillette et donc de sa congélation l’utilisation de sucrose. Pour cefaire, l’embryon est équilibré pendant une vingtaine de minutes dans une solution de glycérol 1.36 M et de sucrose0.25 M. Lors du montage de la paillette, on aspire successivement le sucrose 0.5M (4 cm), une bulle d’air, lemélange glycérol 1.36M et sucrose 0.25M renfermant l’embryon (1 cm), une bulle d’air et le sucrose 0.5M (6cm).La décongélation de la paillette assure le mélange des solutions et donc soustrait l’embryon au glycérol, laréhydratation de l’embryon étant assuré lors de sa mise en place dans l’utérus. Cette méthode offre de réelsavantages sur le terrain puisqu’elle dispense le praticien d’avoir du matériel de laboratoire, le transfertressemblant dans ce cas à une insémination classique.7.5. Facteurs d’influence des résultatsIl semble bien démontré que les embryons produits in vitro témoignent d’une plus grande sensibilité au processusde la congélation-décongélation. Certains auteurs ont établi un parallélisme avec les embryons de porcs connuspour leur sensibilité au refroidissement à des températures inférieures à 15°C. La présence dans ces embryonsd’une concentration plus élevée en gouttelettes lipidiques serait à l’origine d’une formation irrégulière de glaceintracellulaire. Des différences au niveau de la pellucide entre les embryons produits in vivo et in vitro pourraientégalement expliquer leur sensibilité différente à la congélation.La qualité morphologique de l’embryon congelé est également de nature à influencer les résultats obtenus. Ainsi, ilest bien démontré que les blastocystes expansés donnent moins souvent lieu à une gestation que les blastocystesou les morulas. Les essais de congélation d’embryons âgés de moins de 5 jours ne se sont pas accompagnés d’un

La production d’embryons in vivo \23franc succès. De même in vitro, il est essentiel que la première division cellulaire se réalise dans les 26 à 32 heuressuivant la fertilisation. Ces embryons atteignent en effet plus tôt le stade blastocyste (J7) que si cette divisionapparaît plus tard. Il en résulte une meilleure tolérance du processus congélation-décongélation.8. Pour en savoir plusGordon I. Laboratory production of cattle embryos. CAB International 1994.Niemann H Cryopreservation of ova and embryos from livestock : current status and research needs.Theriogenology, 1991,35,109-124.http://www.oie.int/fr/normes/mcode/F_00127.htm : règlementations de l’OIE en matière de récolte et transfertd’embryons

La production d’embryons in vivo \249. TableauxTableau 1: Principales étapes des biotechnologies de l'embryon1951 Identification du phénomène de capacitation Austin 19511951 Premier transfert d’embryon dans l’espèce bovine Willett et al . 19511959 Naissance du premier lapereau obtenu par fécondation in vitro Chang 19681970 Premiers essais de fécondation in vitro chez la vache Sreenan 19701970 Première réussite de fécondation in vitro d'un ovocyte bovin Niwa 19771973 Naissance du 1er veau après transfert d’un embryon congelé Wilmut et Rowson 19731981 Naissance du premier veau obtenu par fécondation in vitro d'ovocyte Brackett et al. 1982maturé in vivo1986 Naissance du premier agneau obtenu par IVM/IVF Cheng et al. 19861986 Naissance du premier porcelet obtenu par IVF Cheng et al. 19861987 Naissance du premier veau obtenu par fécondation in vitro d'ovocyte Lu et al. 1987maturé in vitro1989 Naissance du premier porcelet obtenu par IVM/IVF Mattioli et al. 19891990 Naissance du premier poulain obtenu par IVF Palmer et al. 19901992 Naissance du premier buffle obtenu par IVM/IVF Jiang et al. 19931993 Naissance du premier chevreau obtenu par IVM/IVF Crozet et al. 1993Tableau 2 : Importance de la récolte et du transfert d'embryons dans le monde en 1992 (Annon 1993: EmbryoTransfer Newsletters 1993,11:10-13.Pays Récoltes EmbryonstransférablesEmbryonstransférésMaroc, Afrique du Sud et Zimbabwe 1.837 10.660 9.707Canada et USA 34.413 126.587Argentine et Brésil 5.009 21.164 20.245Corée, Japon, Thailande, Chine, Inde 10.368 4.071 28.829Europe 22.699 109.559 96.300Nouvelle Zélande 330 2.297 986Total 74.656 147.751 282.654

La production d’embryons in vivo \25Tableau 3 : Evolution de l'activité du transfert d'embryons bovins en Europe et en France (AETE 1993-1996)1993 1994 1995 1996N femelles collectées 21.542 22.557 25.075 24.133France 6.680 5.890 6.680 6.657Belgique 1512 1420 1378 1639N d'embryons collectés 176.470 194.589 215.046 214.293France 50.270 55.249 60.298 56.797Belgique 12352 10636 11438 11403N d'embryons transplantés (a) 96.470 102.887 112.531 117.942N d'embryons congelés (b) 42.263 54.485 60.848 55.786% d'embryons congelés (c) 48 53 54 47France (a) 22.744 24.288 27.260 28.793France (b) 9.915 10.664 12.505 13.105France (c) 44 44 46 46Belgique (a) 6492 5195 5542 5591Belgique (b) 4177 3416 3484 2725Belgique (c) 64 66 63 49Tableau 4 : Résultats de transferts d’embryons(Thibier et Nibert (Theriogenology 1995,43,73-80Type d’embryon Taux de gestation Taux de mise bas N de veaux (1)Frais 60 56 3.1Congelé 50 46 2.6Frais et sexé 45 41 2,2Sexé et congelé 28 24 1,0(1) nombre moyen d’embryons produits (5.6) multiplié par le taux de mise-basTableau 5 : Distribution des récoltes en fonction du nombre d’embryons transférables obtenus (Données GER1995-1997)N embryon N récoltes %0 539 211 à 3 763 294 à 7 794 308 à 23 535 20

La production d’embryons in vivo \26Tableau 6 : distribution du nombre moyen d’embryons transférablesobtenus en fonction de l’intervalle entre les récoltesJours N récoltes % N embryons30 à 49 79 7 3.450 à 69 221 19 5.270 à 89 290 25 4.790 à 109 178 15 4.9110 à 129 113 9 4.8130 à 149 69 6 4.0150 à 169 47 4 3.5170 à 199 45 4 3.2200 à 249 46 4 3.5250 à 299 22 1 4.6300 à 730 42 4 3.3111 jours 1173 100 4.1Tableau 7 : Chronologie du développement de l’embryon bovinJour Heures Evénements Taille0 0 Début des chaleurs0 7 Libération de LH (pendant 8 à 12 heures)0 15 Insémination1 30 Ovulation 1601 35 Fécondation2 50 Stade deux cellules 1602 55 Stade 4 cellules 1603 75 Stade 8 cellules4 100 Stade 16-32 cellules5 120 Passage de l’embryon dans l’utérus6 130 Stade 30-64 cellules (morula)7 150 Stade jeune blastocyste 140-1708 200 Stade blastocyste 170-21010 Sortie de pellucide 150-35011 Début de la phase d’élongation 150 à 3 cm22 Premiers accolements entre le conceptus et l’endomètre35 Implantation40-50 Fin de l’organogénèse

La production d’embryons in vivo \27Tableau 8 : Diamètres externe (DE) (micron) et épaisseur de la pellucide (EP) (micron) d’embryons bovins enfonction du stade de développement embryonnaire (D’après Lonergan 1992)Stade de développement N DE EP2 cellules 13 148 13.74 cellules 31 149 14.18 cellules 15 149 13.4J6 morula 37 150 14.5J6 morula/jeune blastocyste 18 150 13.1J7 jeune blastocyste 18 158 11.7J7 blastocyste 30 167 9.6J8 blastocyste 46 182 7.9J 9 blastocyste 56 200 5.6J9 blastocyste sorti de sa pellucide 14 272 5.8Tableau 9 Taux de réussite du transfert d’embryon en fonction de l’âge de la receveuseAge (mois) N transferts % % de gestation10 à 15 273 16 4816 à 20 725 44 4621 à 35 244 15 4036 à 40 302 18 44> 40 124 7 40Moyenne (32) 1668 100Tableau 10 : Chronologie des premières naissances après congélation d’embryonsEspèce Année RéférenceSouris 1971 Witthingham 1971Vache 1973 Wilmut et Rowson 1973Lapine 1974 Bank et Amurer 1974Brebis 1974 Willadsen et al. 1974Rate 1975 Whittingham 1975Chèvre 1976 Bilton et Moore 1976Cheval 1982 Yamamotoet al. 1982Femme 1983 Trounson et Mohr 1983Truie 1991 Kashiwazaki et al. 1991

La production d’embryons in vivo \28Tableau 11 : Induction d’une chaleur dite de “superovulation” au moyen de prostaglandinesProstaglandineDosetotale(mg)NIntervalle(h)/FSH ouPMSGDinoprost 15 1 4822.5 1 4825 1 4830 1 4830 3 72 78 8440 2 72 8450 2 60 7250 2 48 6065 3 48 54 60Cloprosténol 0.5 1 480.5 1 600.5 1 1080.63 1 1080.75 1 480.75 1 720.75 2 48 601 2 56 721 2 60 72Fenprostalène 1 1 60Luprostiol 15 1 4822.5 1 4830 1/2 48