1. aktin citoszkeleton a vékony filamentum rendszer - Biofizikai Intézet

1. AKTIN CITOSZKELETON
A VÉKONY FILAMENTUM RENDSZER
Citoszkeletális aktin HEp-2 sejtekben - rodamin-falloidin jelölés
Forrás: Nyitrai Miklós, Grama László, PTE ÁOK, Biofizikai Intézet
CITOSZKELETON - SEJTVÁZ
az eukarióta sejtek citoplazmájában található dinamikus fehérjehálózat
a sejt szerkezeti és dinamikai tulajdonságainak meghatározása
AKTIN CITOSZKELETON
VÉKONY FILAMENTUM RENDSZER
CITOSZKELETON
2010. 02. 16.
MIKROTUBULUSOK INTERMEDIER FILAMENTUMOK
Forrás: Vic Small http://cellix.imba.oeaw.ac.at/

AKTIN FEHÉRJE – IN VIVO
Fluoreszcencia mikroszkópia - GFP-jelölt aktin (green fluorescent protein)
Fibroblaszt
AKTIN FEHÉRJE – IN VITRO
Forrás: Vic Small http://cellix.imba.oeaw.ac.at/
Teljes belső visszaverődésen alapuló fluoreszcencia mikroszkópia – Alexa488 SE-jelölt aktin
[Mg 2+ -ATP -G-aktin] = 1.2 μM
Egység: 10 μm
v = 12.7 alegység/s
Forrás: Barkó Sz. Bugyi B. és mtsai JBC 2010.

EUKARIÓTA
IZOM SEJTEK
izomösszehúzódás szabályozása
NÖVÉNYEK
organellum-, vezikula transzport
exo-, endocitózis
sejtciklus szabályozása
AZ AKTIN FUNKCIONÁLIS SOKSZÍNŰSÉGE
1887. W.D. Halliburton
NEM-IZOM SEJTEK
polaritás
sejtmozgás
LP
LM
SF
intarcelluláris
pathogének mozgása
Arc
FA
FC
?
SEJTMAG
transzkripció
kromatin remodelling
jelátvitel
PROKARIÓTA
FP
ParM, MreB aktin homológ fehérjék
sejtalak
plazmid szegregáció
alak, mechanikai stabilitás
AZ AKTIN KUTATÁS MÉRFÖLDKÖVEI
1942. Straub F. Brúnó
Szent-Györgyi Albert kutatócsoportja,
Szegedi Tudományegyetem
1953. Abercrombie M.
1954. Huxley AF.
1974. Lazarides E., Weber K.
1978. Taylor DL., Wang YL.
1989–1996. Kron J., Spudich JA.
1990. Kabsch, W. Holmes KC.
1992 - 1998.
2001. Jones LJ., van den Ent F.
1999. Carlier MF.
első kísérleti megfigyelés
fehérje, mely jelenlétében a miozin koagulál
aktin monomer 3D röntgendiffrakciós szerkezete
az aktin filamentum 3D modellje
prokarióta citoszkeleton felfedezése
ParM, MreB aktin-homológ fehérjék
az aktin alapú mozgás in vitro rekonstrukciója
fagocitózis
endocitózis
endoszómák mozgása
motorfehérjék vizsgálata in vitro motilitás esszével
sejtosztódás
kontraktilis gyűrű
kromoszóma transzport
az akto-miozin komplex felfedezése és leírása izom sejtekben
a komplexben megnövekedett a miozin viszkozitása és
kontraktilitása ACTIvatiNg
nem-izom sejtek sejtmozgáshoz kapcsolódó aktin struktúráinak
vizsgálata, a sejtmozgás mechanizmusa
izomkontrakció mechanizmusa (sliding filament modell)
aktin filamentumok megjelenítése nem-izom sejtekben
immunofluoreszcencia - stressz szálak
mikroinjektált fluoreszcens jelölővel ellátott aktin - dinamika

első
domén
szubdomén 4
szubdomén 3
hegyes (-) vég
*
szöges (+) vég
AKTIN MONOMER…
C
szubdomén 2
N
szubdomén 1
külső
domén
… és FILAMENTUM
hegyes (-) vég
szöges (+) vég
alegység (monomer):
globuláris (G) aktin
MW: 42.3 kDa
375 aminosav
6.7 x 4 x 3 nm
domén szerkezet
* nagy affinitású kötőhely
1 : 1 adenozin nukleotid (ATP/ADP)
lassú ATPáz aktivitás: k = 0.6 h -1
1 : 1 kétértékű kation
Ca 2+
Mg 2+ (in vivo)
filamentum: filamentális (F) aktin
sz: 7-10 nm, h: μm
szerkezeti polaritás: szöges/hegyes vég
helikális szerkezet:
jobbmenetes nagy/balmenetes kis
menetemelkedésű hélix
(37 nm / 2.75 nm )
megnövekedett ATPáz aktivitás
k hidrolízis = 0.02 s -1 –10 s -1
k Pi kibocsátás = 0.006 s -1
koncentráció:
in vivo: 100 – 200 μM
in vitro: 1 – 10 μM
5.5 nm
37 nm
166 o

G: monomer
POLIMER MENNYISÉG
FILAMENTUM KÉPZŐDÉS - POLIMERIZÁCIÓ
1. NUKLEÁCIÓ - LAG FÁZIS 2. ELONGÁCIÓ
G + G ↔ G2
dimer
G2 + G ↔ G3
trimer / nukleusz
3. STEADY STATE / DINAMIKUS EGYENSÚLY
hegyes vég
1: lag fázis
F-aktin
L = állandó
G-aktin:=
szöges vég
G3 + G ↔ F
filamentum
kritikus koncentráció
…
F N + G ↔ F N+1
A monomerek a filamentum mindkét végén
beépülnek (asszociáció) illetve leválnak
(disszociáció)
A filamentum hossza nem változik
Kritikus koncentráció: az a szabad G-aktin
koncentráció, amely alatt a filamentum képződés
folyamata nem indul meg
in vitro
in vivo
A POLIMERIZÁCIÓ KINETIKÁJA
3: G-aktin : F-aktin = állandó
2: dF/dt = állandó
IDŐ
kritikus koncentráció
0.1 – 0.6 μM
~2 μM
1. A nukleáció energetikailag kedvezőtlen folyamat az
aktin dimerek/trimerek instabilitása miatt LAG
fázis
2. A filamentumok növekedési sebessége:
elongációs sebesség
dF
= k+
Nc − k−N
dt
dF szöges hegyes
szöges
= ( k+
+ k+
) Nc − ( k−
+ k−
dt
k + : asszociációs sebességi állandó
k - : disszociációs sebességi állandó
N : filamentum végek koncentrációja
3. Egyensúlyban G-aktin : F-aktin = állandó
[G-aktin] = kritikus koncentráció
hegyes
c : polimerizálható G-aktin koncentrációja
c = c összes -c c
asszociáció disszociáció
) N
szöges, hegyes : az F-aktin egyes végeire utal

*
*nukleotid kötő zseb
ATP + H 2O ↔ ADP + Pi + H -
AZ AKTIN ATPáz AKTIVITÁSA …
Standard szabad energia változás: ΔG 0’ = -7.3 kcal / mol
ATP ADP
Pi
hidrolízis
foszfát (Pi) kibocsátás
G-aktin:
ATPáz aktivitás
sebességi állandó
0.6 h -1
hidrolízis = 0.02 – 10 s-1 Pi kibocsátás = 0.006 s-1 • Az aktin ATPáz aktivitása nem esszenciális a filamentum képződéshez F-aktin:
• A filamentumban az ATPáz aktivitás jelentősen megnövekszik
• A filamentumban az ATP hidrolízis/Pi kibocsátás a irreverzibilis és a filamentum destabilizációjához vezet
… ÉS KÖVETKEZMÉNYE: TAPOSÓMALOM EGYENSÚLY
ATP
ADP-Pi
ADP
F-aktin: kinetikai polaritás, disszipatív polimer
TAPOSÓMALOM EGYENSÚLY - TREADMILLING : Wegner 1976.
F-aktin, μM
Idő, min
hidrolizált ATP, μM

…ÉS KÖVETKEZMÉNYE: TAPOSÓMALOM EGYENSÚLY
ATP
ADP-Pi
ADP
F-aktin: kinetikai polaritás, disszipatív polimer
TREADMILLING – TAPOSÓMALOM EGYENSÚLY: Wegner 1976.
k
k
hegyes vég
hegyes
+
hegyes
−
= 2.
9 μM
−1
= 5.
4 s
monomerek
disszociációja
DEPOLIMERIZÁCIÓ
s
−1
−1
ATP ADP
Pi
D T
nukleotid csere
k
k
in vitro
in vivo
szöges vég
szöges
+
szöges
−
= 11.
6 μM
= 1.
4 s
−1
monomerek
asszociációja
POLIMERIZÁCIÓ
filamentum turnover
1 μm / 30 min
1 μm / 20 s
…ÉS KÖVETKEZMÉNYE: TAPOSÓMALOM EGYENSÚLY
szöges
dF
= k
dt
hegyes
dF
= k
dt
dF
= k+
Nc − k−N
= 0
dt
k Nc = k N
c
+
egyensúly
dF
dt
dF
dt
−
k
=
k
> 0 : c
< 0 : c
szöges
+
hegyes
+
−
+
: = kritikus koncentráció
egyensúly
egyensúly
Nc − k
Egyensúlyban:
Nc − k
k
>
k
k
<
k
szöges
−
hegyes
−
−
+
−
+
N
N
elongációs
sebesség
0
c c szöges
c
c
c c hegyes
c egyensúly = c c
szöges
c
hegyes
c
= 0.
1 μM
= 0.
6 μM
szöges vég
hegyes vég
[G-aktin]
s
−1
−1

TAPOSÓMALOM EGYENSÚLY IN VIVO:
az aktin-alapú mozgás esszenciális feltétele
A perzisztenciahossz:
- statisztikus távolság, amelyen belül a polimerlánc merevnek tekinthető, azaz a polimerlánc irány ezen a szakaszon
állandó
- a polimerlánc hajlítómerevségével áll összefüggésben: minél rövidebb Lp, annál hajlékonyabb a lánc és fordítva
EI = hajlítómerevség
E =Young modulus
I = hajlítási tehetetlenségi nyomaték
(körkeresztmetszetű rúd esetében I=r 4 π/4)
k B =Boltzmann állandó
T = abszolút hőmérséklet
A FILAMENTUMOK MECHANIKÁJA
Termikus (entrópikus) rugalmasság és perzisztencia hossz
A citoszkeletális filamentumok hosszú, láncszerű polimernek tekinthetők, amelyek a környezetükben lévő hőmozgást
végző molekulákkal véletlenszerűen ütköznek. Ez a filamentumok alakjának változását eredményezi.
A polimerlánc alakja a random diffúziós Brown-féle mozgásra emlékeztet random lánc (random coil)
L = kontúrhossz
L p = EI
k BT
L p = perzisztenciahossz
Z = vég-vég távolság
F

típus
merev
szemiflexibilis
flexibilis
L p és L viszonya
L p >> L
L p ~ L
L p