Atomi spektrum Molekulák energiaszintjei Infravörös spektroszkópia ...

Infravörös-, Raman-,
CD-spektroszkópia
Biofizika szemináriumok
2010. Ápr. 12-14.
Dudás Réka
Molekulák energiaszintjei
E össz = E elektron + E rezgési + E forgási
elektronátmenet
energiája
kvantált!
E elektron ~ -1/n 2
n = 1, 2, 3, ...
rezgési energia
kvantált!
E rezgési = ω(v+1/2)
v = 0, 1, 2, ...
forgási energia
kvantált!
E forgási = B·J(J+1)
J = 0, 1, 2, ...
Molekulák jellemző rezgései
• kötések nyúlása
– szimmetrikus
– aszimmetrikus
• kötés-hajlás
–hintázás
– ollózás
–csóválás
–csavarás
De: szimmetrikus kötések rezgése nem IR-abszorbeáló (pl. etilén C=C
kettős-kötésének nyúlása)!
Atomi spektrum
atommodell
atomi
energiaszintek
intenzitás
hν = E2 − E1 hν = E2 − E1
E1 ν
atomi spektrum
frekvencia
Az elektronok kvantált energiával rendelkeznek →
energiaszintek!
Infravörös spektroszkópia
• Infravörös fény
– NIR: λ = 800 nm - 2,5 μm
– MIR v. MID-IR: λ = 2,5 - 50 μm
– FIR: λ = 50 - 1000 μm
• Hullámhossza (=fotonenergiája) a
molekularezgések tartományába esik:
– IR fény elnyelése molekulát rezgésbe
hozza az IR sugárzás intenzitása gyengül.
– csak akkor tudja „megrezegtetni” a molekulát,
ha abban töltésátrendeződés jön létre a
rezgés során (dipólusmomentuma változik)!
• x-tengelyen hullámhossz
és/vagy hullámszám
• y-tengelyen
transzmittancia %-ban (a
völgyek abszorpciónak
felelnek meg)
• a "csúcsokat"
hullámszámmal jelöljük
IR spektrum
E 2
1

IR spektrum analízis
3400-3200 cm -1 : nincs OH v. NH kötést jelző csúcs
3100 cm -1 : nincs telítetlen CH jelenlétét jelző csúcs
2900 cm -1 : kis csúcsok jelzik telített CH jelenlétét
2200 cm -1 : nincs aszimmetrikus háromszoros kötés
1760 cm -1 : erős karbonil elnyelés
1600 cm -1 : nincs szén-szén kettős kötést jelző csúcs
1250 cm -1 : erős, széles C-O kötést jelző csúcs
ethyl acetate
A spektrum olyan vegyület jelenlétére utal, amely karbonilcsoportot tartalmaz, és CH-csoportjai
telítettek. A karbonil csúcs viszonylag magas, 1760 cm -1 -el jellemezhető, amely észterkötést jelez.
Az 1250 cm -1 -nél látható csúcs CO kötést jelez.
(FTIR spektroszkópia)
• Az IR spektrométer felépítése hasonló a
látható tartományban működő abszorpciós
fotométeréhez.
• Ma már csak a Fourier-transzformáció elvén
működő készülékek számítanak modernnek.
• Monokromátor helyén ún.
Michelson-interferométer
– egy sor hullámhosszon
szimultán mérés
(x= kλ erősítés akkor λ 1/ 2-n, λ 1 /3-n stb. is erősítés.
Ha a fél hullámhossz páratlanszor fér rá az úthosszra
kioltás. Egyes hullámhosszakon részleges kioltás.)
Alapfogalmak – Raman-spektroszkópia
• Rayleigh szórás: rugalmas szóródás
– A szórt fény iránya változik, hullámhossza
változatlan marad.
• Raman szórás: rugalmatlan szóródás
(Az összes szórt fény < 10 -6 része).
A szórt fény energiája (ill. λ)
kémiai szerkezetre jellemző
módon változik.
Detector signal
IR spektroszkópia alkalmazása
• fehérjekonformáció meghatározása:
– fehérjék amid-I rezgése különbözik α-hélix és
β-redő szekezetek esetén, ami az IR
spektrumban megmutatkozik
•hődenaturáció követése
• NIR: mérhetők egészen vastag minták
(akár egész test)
Fourier-transzformáció
Optical retardation
0.10 0.20 0.30 0.40
Single-channel intensity
4,000 3,500 3,000 2,500 2,000 1,500 1,000 500
Wavenumber, cm-1 interferogram spektrum
Az a matematikai művelet, amivel a különböző
hullámhossz-kombinációknál mért intenzitásokat
(fényút-különbség!) átszámítja a hullámhossz
függvényében megadott fényintenzitásokká.
A Raman-spektroszkópia segítségével a
tisztán vibrációs vagy rotációs szinteket
tudjuk tanulmányozni.
IR abszorpció Raman szórás
I
Stokes
h(ν 0 - ν 1 )
h(ν 0 - ν 1 ) h(ν 0 + ν 1 )
Stokes
anti-Stokes
hν 0 h(ν0 + ν 1 )
anti-Stokes
ν
Raman eltolódás
2

Raman-spektroszkópia
• Monokromatikus fénnyel besugározzuk a
mintát és a frekvencia-változással
szóródott fényt használjuk
anyagazonosításra.
• Mennyiségi analízisre is alkalmas.
• A lézer felfedezése kellett a módszer
kifejlesztéséhez.
A Raman-spektroszkópia
előnyei
• Keverékek és vizes oldatok vizsgálata is lehetséges
(IR sp.-val nem! – erősen abszorbeálja a víz).
• Minőségi és mennyiségi analízis (csúcs intenzitása
komponensek aránya).
• Széles koncentrációtartományban működik.
• Gyors: spektrumok néhány sec alatt felvehetők.
• Nem igényel minta-előkészítést: akár műanyag- vagy
üvegedények falán keresztül is mérhetünk!
• Mérés akár magas hőmérsékleten és nyomáson.
• A minta mérete széles határok között változhat:
nagyon nagytól (hordozható, optikai szálas eszközök)
mikron nagyságig (Raman mikroszkópia).
• Nem károsítja a mintát.
(Speciális Raman-spektroszkópia)
• Mikro-Raman: Nagy NA mikroszkóp
objektív és konfokális rés igen kicsiny
mintatérfogat megvilágítása.
• Makro-Raman: Alacsonyabb NA lencse
nagyobb mintatérfogat bevilágítása.
• Diszperzív Raman: A Raman spektrum
analízise diffrakciós rács(ok)
használatával (CCD detektorral agy PMT
cső segítségével).
szénszál
„grafit” csúcs
(sp 3 1332 cm -1 )
Raman spektrumok
Aszimmetrikus, poláros kötések
IR-aktívak,
• O-H (víz mérése)
• =C-H
• C=O
• C-Cl
• C-O-C
• (C-)NO 2
Összehasonlítás
gyémánt
egykristály
(sp 3 1332 cm -1 )
Szimmetrikus és homopoláros
kötések
Raman-aktívak, pl.
• C=C
• C=C
• C=S
• C-Cl
• O-O
IR és Raman spektroszkópia egymást kiegészítő technikák.
CD spektroszkópia – Lineárisan polarizált fény
3

CD spektroszkópia – Cirkulárisan polarizált fény Cirkuláris dikroizmus
CD spektroszkópia
• A minta cirkuláris dikroizmusának
mértékét a kétféle cirkuláris komponensre
vonatkozó moláris extinkciós állandók
különbségével jellemzik.
ε −ε
b j
• Méréskor Ab-t és Aj-t mérik. CDspektrum
a két spektrum különbsége.
• ORD-spektroszkópia:
ellipticitás mérése
CD spektroszkópia előnyei
• Oldatban, akár fiziológiás körülmények
között mérhetők a molekulák
tulajdonságai.
• Kevés minta is elegendő.
• Kis konformációváltozásra is érzékeny.
• Mennyiségi analízisre is alkalmas.
• Gyors.
• Királis molekulák: a jobbra és balra cirkulárisan poláros
összetevők terjedési/forgási sebességét nem egyformán
befolyásolják a két komponens között fáziskülönbség
eredő vektor iránya megváltozik. (Elfordítás iránya és mértéke a
molekula térszerkezetére és koncentrációjára jellemző.)
• Ha a molekula a megvilágítás hullámhosszán elnyel, akkor a
cirkulárisan poláros komponensek fázisa és amplitúdója is
változik! elliptikusan poláros az eredő vektor cirkuláris
dikroizmus.
CD spektroszkópia alkalmazása
• Nukleinsav-fehérje kölcsönhatás:
– kideríthető pl. hogy a fágfejben elhelyezkedő
DNS konformációja kisebb kiralitású, mint az
izolált DNS-é.
• Másodlagos fehérjeszerk.
• Konformációváltozások,
tekeredés, hőstabilitás
4