Fluoreszcencia kioltás és Fluoreszcencia ... - Biofizikai Intézet

Fluoreszcencia kioltás
és
Fluoreszcencia Fluoreszcencia Rezonancia
Rezonancia
Energia Transzfer
Biofizika szeminárium
2009. március 2-4. PTE ÁOK Biofizikai Intézet
Ujfalusi Zoltán
Fotonok és molekulák ütközése
Fotonok és molekulák ütközése
Fény (foton) ütközése a molekulákkal
⇒ fényszóródás
⇒ abszorpció
Fényelnyelés:
-Egy foton energiája -> molekula energiája (ΔE = hν/λ).
-Az elnyelt energia átalakul:
-Hő
- Fluoreszcencia
- Foszforeszcencia
- Fluoreszcencia kioltás és fluoreszcencia rezonancia energia transzfer
Fluoreszcencia kioltás
• A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának
csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében melyek
elektronszerkezete megfelelő g ahhoz, , hogy gy a gerjesztett
g j
állapotban lévő fluorofórral „ütközve” annak gerjesztési
energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában
disszipálják (például hő).
• Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos
átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió.
Lumineszcencia
A molekuláknak azt a fényemisszióját,
amelyet a valamilyen módon (például
fénnyel való besugárzással) gerjesztett
molekula a hőmérsékleti sugárzáson kívül
kibocsát, gyűjtőnéven lumineszcenciának
nevezzük.
Fluoreszcencia
Ground electronic state
Kioltás típusai
Statikus : A kioltó és a fluorofór még a gerjesztés előtt egy
komplexet (sötét komplex) alkot, mely komplex nem képes fényt
emittálni. A gerjesztett állapotban lévő molekulák száma csökken.
Fluorofór Kioltó
- Diffúzió által nem befolyásolt!
- Fluoreszcencia élettartam nem érzékeny rá!
+ : Nincs emisszió
Sötét komplex
(a gerjesztés előtt
h*υ
jön létre) Gerjesztés
2009.03.04.
1

Kioltás típusai
Dinamikus : A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok
révén egymás közelébe kerülnek, egy ütközési komplexet hoznak
létre, majd a gerjesztett fluorofór átadja az energiáját a kioltónak.
Fluorofór
- Diffúzió által befolyásolt!
- Fluoreszcencia élettartamot csökkenti!
+ :
Kioltó
h*υ
Gerjesztés
Kioltók típusai
• Semleges kioltók: Akrilamid,
nitroxidok sztérikus viszonyok
monitorozása. it á
• Töltéssel rendelkező kioltók:
jodid, cézium, kobalt
elektrosztatikus viszonyok
monitorozása [a fehérje töltése
fontos (Lys, Arg, His, Asp, Glu)].
Ütközési komplex
(a gerjesztés után
jön létre)
+
Fluorofór Kioltó
Stern-Volmer egyenlet
(a kioltás mértékének kvantifikálása)
Max Volmer (1885-1965)
Otto Stern (1888-1969)
Fizikai Nobel díj (1943)
Hogyan dönthető el, hogy milyen
típusú kioltásról van szó?
Dinamikus kioltás Statikus kioltás
Eredmények értékelése
A fluorofórok hozzáférhetőségét tükrözi a Stern-Volmer
állandó (K SV).
A bimolekuláris sebességi állandó (k q ) szintén a kioltás
eredményességét, azaz a fluorofórok hozzáférhetőségét
tükrözi.
k q = 1 x 10 10 M -1 s -1 diffúzió kontrollált kioltás
k q < 1 x 10 10 M -1 s -1 sztérikus elfedettség
k q > 1 x 10 10 M -1 s -1 kötés kialakulása
Stern-Volmer egyenlet
F0
= 1+
K sv[
Q]
F
F 0 : fluoreszcencia intenzitás
a kioltó hiányában
F : fluoreszcencia intenzitás
a kioltó jelenlétében
Ksv : Stern-Volmer állandó
[Q] : kioltó koncentrációja
2009.03.04.
2

Módosított Stern-Volmer egyenlet
(Lehrer-egyenlet)
A kioltó számára nem egyformán hozzáférhető fluorofórok esetén!
7
6
5
K SV= 5 M -1
α : a kioltó által hozzáférhető
fluorofór aránya
7
6
5
meredekség: 1/(αK SV)
metszéspont: 1/α
IAEDANS fluoreszcenciájának kioltása
akrilamiddal
K SV
4
3
2
1
0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
[Formin] (μM)
K SV
A FRET feltételei
• Fluoreszcens donor és akceptor molekula.
4
3
2
1
0
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
[Formin] (μM)
• A donor és akceptor molekula közötti távolság 2-10 nm!
• Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor
abszorpciós spektruma között.
Triptofán fluoreszcenciájának kioltása
akrilamiddal
Fluorescence Inteensity
150
100
50
0
350 400 450 500 550 600 650
Wavelength (nm)
Fluoreszcencia Rezonancia Energia
Transzfer
(FRET) - Theodor Förster, 1948
• „A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban lévő
fluoreszkáló molekula (donor), valamint egy megfelelő
spektroszkópiás k kó iá kkövetelményeket l é k ki kielégítő lé í ő molekula l k l ( (akceptor) k )
között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli
energiaátadás formájában jön létre.”
• A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekula emissziója
révén valósul meg!
k t~1/R 6
E
R
A FRET molekuláris mechanizmusa
2009.03.04.
3

Spektrális átfedés
Hullámhossz
J= átfedési integrál
n= közeg törésmutatója
R= donor-akceptor távolság
κ= orientációs faktor
Kritikus Förster-távolság
k
−4
−6
2
t = konst. ⋅ J( λ)n
kfR
κ
Az a távolság melyen a FRET hatásfok a felére csökken
(transzferhatásfok 0.5).
k
E =
τ
k + k
f
t = kt
D
+ k + k
ic IC t
FRET hatásfok
6
E
R0
= 6 6
R0
+ R
Az energia transzfer hatásfoka
1: „steady-state” mérések
E= 1 –(F DA / F D)
2: időfüggő mérések (fluoreszcencia élettartam)
6
R0
= 6
R0
+ R
E 6
FDA : fluoreszcens intenzitás az akceptor jelenlétében
FD : fluoreszcens intenzitás az akceptor hiányában
E= 1 –(τDA / τD) тDA : élettartam az akceptor jelenlétében
τD : élettartam az akceptor hiányában
Fluoreszcencia Rezonancia
Energia Transzfer
k t= konst. * J(λ) n -4 k fR -6 κ 2
k t = (1/τ D ) * (R 0 /R) 6
R 0 = 0.211 • [η -4 Q 0 κ 2 J(λ)] 1/6
k t~1/R 6
E
R
J(λ): átfedési integrál, n: törésmutató (1.33-1.6),
k f: a fluoreszcencia emissziójának sebességi
állandója, R: a donor és az akceptor molekula
közötti távolság, κ: orientációs faktor (2/3)
k t: az energia transzfer sebességi állandója, τ D : a
donor molekula fluoreszcencia élettartama az
akceptor hiányában, R: a donor és az akceptor
molekula közötti távolság, R 0: Förster távolság a
donor és az akceptor molekula között.
Kritikus Förster-távolság
κ á ó ó á é
2 (κ-négyzet) = orientációs faktor, a donor emissziós vektorának és az
akceptor abszorpciós vektorának relatív orientációjáról tudósít
•várható érték 0 – 4 között
•általában a κ2 = 2/3 (gyors mozgások miatti átlagolódás következtében)
η = a közeg törésmutatója (1.33-1.6)
Q0 = a donor kvantumhatásfoka akceptor hiányában
J(λ) = átfedési integrál
Távolságmérés FRET segítségével
(Molekuláris mérőszalag)
FRET hatásfok
h á f k
6
E
R0
= 6 6
R0
+ R
2009.03.04.
4

Hőmérséklet-függő FRET mérések
Relativee
f '
2,5
2,0
1,5
1,0
5 10 15 20 25 30 35
[Temperature]
Összefoglalás
• FRET távolságok meghatározására alkalmas megfelelő donor
akceptor párok esetén.
• Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása.
• Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása.
2009.03.04.
5