KARAKTERISASI PROTEASE DARI EKSKRETORI ... - Damandiri

14
PURIFIKASI PROTEASE DARI EKSKRETORI/SEKRETORI
STADIUM L 3 Ascaridia galli
ABSTRAK
Enzim proteolitik yang disekresikan oleh parasit memainkan peran pada proses
penetrasi dan migrasi jaringan inang. Penelitian ini bertujuan untuk memurnikan
protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli. L 3 diperoleh
dari usus halus 100 ekor ayam petelur HySex Brown tujuh hari setelah pemberian dosis
6000 L 2 melalui oesofagus ayam. Sebanyak 5 – 10 ekor L 3 dikultur secara in vitro
dalam setiap ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa
merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37 o C dan 5% CO 2 selama 3 hari.
Ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L 3 yang dilepaskan ke dalam
medium kultur. Protease dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel matriks sephadex
G-100 dan anion exchange matriks DEAE sephadex A-50. Aktivitas protease diuji
terhadap kasein. Konsentrasi protein dihitung mengikuti metode Bradford. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim pada fraksi 31 kromatogram filtrasi gel
lebih tinggi dibandingkan dengan anion exchange. Protease yang disekresikan oleh
stadium L 3 A. galli dapat dimurnikan berdasarkan berat molekulnya.
Kata kunci: Ascaridia galli, nematoda, ekskretori/sekretori, protease, kromatografi
ABSTRACT
Proteolytic enzymes secreted by parasites are thought to play a key role in the
processes of penetration and migration trough the host tissue. The research was carried
out to purify protease from exretory/secretory of A. galli L 3 stage. A. galli L 3 were
recovered from intestines of 100 HySex Brown heads chickens 7 days after oesophagus
inoculation with 6000 L 2 . L 3 recovered in this manner were cultured (5 – 10 ml -1 ) in
flasks containing rosswell park memorial institute (RPMI) 1640 media, pH 6.8, without
phenol red. Cultures were incubated at 37 0 C in 5% CO 2 and culture fluid was collected
after 3 days in culture. Excretory/secretory was prepared from metabolic product of L 3
released in culture medium. Protease purified using anion exchange matrix DEAE
sephadex A-50 and gel filtration matrix sephadex G-100 chromatography. The protease
activity was assayed against casein. Protein concentration were counted as described in
Bradford method. The result showed that enzyme activity on chromatography gel
filtration more highly compared anion exchange. These result indicate that the protease
secreted by A. galli L 3 stage could purify based on molecular weight.
Key words: Ascaridia galli, nematode, excretory/secretory, protease, chromatography

15
PENDAHULUAN
Protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori dari berbagai stadium
kehidupan cacing parasitik telah menarik perhatian para ilmuan karena peranannya yang
penting dalam reaksi biologi, termasuk metabolisme protein, reaksi imun, nutrisi parasit,
penetrasi ke jaringan inang, dan patogenesis helmintosis. Telah dibuktikan bahwa
peningkatan konsentrasi protease yang dilepaskan cacing parasitik pada peristiwa invasi
ke jaringan inang definitif (Cock et al. 1993; Hadas dan Stankiewicz 1997; Todorova
2000; dan Iglesias et al. 2005).
Ascaridia galli adalah cacing parasitik nematoda yang dapat menginfeksi
berbagai jenis unggas, termasuk ayam petelur. Siklus hidup A. galli secara lengkap telah
dijelaskan oleh Permin dan Hansen (1998), dimana telur yang dihasilkan oleh A. galli
dewasa di dalam lumen inang definitif akan mengalami maturasi di lingkungan
manakala dikeluarkan bersama tinja. Siklus hidup sebagai parasit dimulai ketika inang
definitif menelan telur infektif (L 2 ) sampai menjadi dewasa dan bereproduksi
menghasilkan telur. Sebelum menjadi dewasa, A. galli mengalami dua fase kehidupan di
dalam tubuh inang definitif, yaitu fase lumen dan fase jaringan. Mekanisme invasi ke
jaringan oleh L 3 A. galli untuk menjalani fase histotrofik belum banyak diketahui.
Diduga bahwa L 3 melepaskan protease ekstraseluler untuk menembus pertahanan
mukosa saluran cerna inang definitif sehingga larva dapat establish di dalam jaringan.
Peneliti terdahulu melaporkan bahwa enzim proteolitik ditemukan pada ekstrak
somatis dan ekskretori/sekretori stadium L 3 , L 4 dan dewasa Ostertagia ostertagi (Cock
et al. 1993). Hadas dan Stankiewicz (1997) menyatakan bahwa cacing nematoda
Trichostrongylus colubriformis dan Haemonchus contortus melepaskan enzim
proteolitik pada stadium L 3 . Hasil penelitian Todorova (2000) merefeksikan bahwa
protease serin, sistein dan metal hadir pada kultur in vitro stadium L 1 Trichinella
spiralis. Ford et al. (2005) membuktikan bahwa stadium L 3 Onchocerca volvulus
menghasilkan protease serin. Namun, informasi tentang keberadaan protease pada
stadium L 3 A. galli belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu, fokus penelitian ini adalah
memurnikan protease dari produk ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli. Tujuan

16
penelitian ini adalah untuk mendapatkan protease murni yang dilepaskan melalui
ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli.
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Helmintologi, Bagian Parasitologi dan
Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat
Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, dan Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia
Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor. Waktu Penelitian berlangsung dari
bulan Mei 2005 sampai Mei 2006.
Rancangan Penelitian
Cacing A. galli betina dewasa diperoleh dari dalam lumen usus halus ayam
kampung yang terinfeksi secara alami. L 1 diambil langsung dari uterus A. galli betina
dewasa. L 1 diinkubasi secara in vitro selama 20 – 30 hari pada temperatur ruangan untuk
mendapatkan L 2 . L 2 dikultur secara in vivo untuk mendapatkan L 3 pada 100 ekor ayam
Isa Brown umur 12 minggu yang telah diperiksa telur cacing dalam tiap gram tinjanya
(TTGT), dipelihara secara individual dalam kandang baterei, diberi pakan komersial dan
air minum secara ad libitum sebagai ayam donor (Tiuria et al. 2003). Ayam dinekropsi
tujuh hari setelah pemberian L 2 dan jumlah L 3 yang ditemukan dihitung. Larva A. galli
diinkubasi dalam sumur cell culture plate, masing-masing sumur diisi 25 – 50 larva
dalam 5 ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, Sigma-Aldrich), pH
6,8, tanpa merah fenol yang ditambahkan 100 unit/ml penisilin G, 100 µg/ml
streptomisin, 5 µg/ml gentamisin, dan 0,25 µg/ml kanamisin dalam inkubator CO 2
selama 3 hari. Campuran medium dengan ekskretori/sekretori L 3 A. galli disentrifus
pada 12.000 g dengan temperatur 4 o C selama 5 menit. Protease yang dilepaskan melalui
ekskretori/sekretori L 3 A. galli dipurifikasi dengan kromatografi filtrasi gel dan anion
exchange (Cock et al. 1993).

17
Preparasi Ekskretori/Sekretori Stadium L 3 A. galli
Telur cacing A. galli diambil dari uterus cacing betina dewasa. Telur cacing
tersebut diinkubasi dalam cawan petri plastik berisi aquadestilata steril hingga terbentuk
larva infektif (L 2 ) selama 21 – 30 hari pada suhu kamar (Tiuria 1991; Athaillah 1999
Darmawi 2003; Balqis 2004; dan Balqis et al. 2005). L 2 A. galli yang berkembang
diberikan secara oral kepada ayam petelur HySex Brown umur 12 minggu dengan dosis
6000 L 2 , dan 7 hari kemudian dipotong untuk diambil isi lumen dan kerokan mukosa
usus halus. Isi lumen dibersihkan dengan NaCl fisiologis dan disaring dengan saringan
larva. L 3 A. galli dihitung di bawah mikroskop stereo (Bauer 2001; dan Balqis et al.
2005).
Sebanyak 25 – 50 ekor L 3 dikultur dalam cawan petri berisi 5 ml medium RPMI-
1640 pH 6,8 (tanpa phenol red). Media diberi suplemen 100 unit/ml penicillin G, 100
µg/ml streptomisin, 0,25 µg/ml amphotericin B, dan 5 µg/ml gentamisin. Larva dikultur
selama 3 hari pada temperatur 37 0 C dan tekanan CO 2 5%. Cairan kultur dikoleksi,
disentrifugasi (12.000 g) dan disaring dengan membran filter (0,2 µm), serta didialisa
dengan phosphate-buffered saline (PBS) untuk mendapatkan ekskretori/sekretori A. galli
(Rhoads et al. 1997; dan Balqis et al. 2005).
Uji Konsentrasi Protein
Sepuluh mg Bovine Serum Albumin (BSA) dilarutkan dengan 10 ml aquadest dan
dibuat 10 tingkatan konsentrasi sebagai standar. Sebanyak 100 µl dari masing-masing
tingkatan ditempatkan dalam tabung reaksi steril lainnya dan ditambahkan dengan 5 ml
larutan Bradford. Sebagai blanko digunakan 3 tabung reaksi steril masing-masing diisi
dengan 100 µl aquadest dan ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Sebanyak 100
µl sampel substansi bioaktif asal larva stadium L 3 A. galli diisikan ke dalam tabung
reaksi steril dan masing-masing ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Standar,
blanko, dan sampel masing-masing dimasukkan kedalam tabung kuvet untuk dilihat
hasil absorbansinya dengan menggunakan Spectrophotometer pada panjang gelombang
(λ) 578 nm (Rukayadi dan Suhartono 1999).

18
Uji Aktivitas Enzim
Aktivitas proteinase diuji terhadap casein. Campuran 250 µl 0,2% casein
Hamarstain dalam Tris mM (pH 7,0) dan 50 µl enzim diinkubasi selama 10 menit pada
temperatur 70 o C. Reaksi dihentikan dengan penambahan 500 µl asam trichloroacetic 0,1
M dan diinkubasikan pada 37 o C selama 10 menit. Setelah pemusingan, 375 µl
supernatan dicampur dengan 1,25 ml sodium carbonate dan 50 µl reagen Folin-Ciocalteu
dan diinkubasikan pada 37 o C selama 20 menit. Jumlah degradasi ditentukan dari
absorbansi pada λ 578 nm (Kong et al. 2000). Aktivitas 1 unit enzim ditetapkan sebagai
jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menguraikan 1µg tyrosine dan casein di dalam 1
ml volume reaksi per menit (Chung et al. 1997).
Pemurnian Protease Stadium L 3 A. galli
Tahapan ekstraksi dan pemurnian protease A. galli meliputi pengendapan
protein, proses dialisis, penggunaan filtrasi gel dengan matriks sephadex G-100, dan
anion exchange dengan matriks DEAE-Sephadex A-50. Untuk menggumpalkan protein,
sebanyak 500 ml supernatan hasil sentrifugasi yang mengandung enzim ekstrak kasar
ditambahkan dengan 40% (b/v) ammonium sulfat teknis, sedikit demi sedikit sambil
diaduk dengan magnetik stirer hingga larut dan dibiarkan selama satu malam pada suhu
rendah. Filtrat protease dipisahkan dengan sentrifugasi 12.000 g selama 40 menit lalu
dilarutkan dengan buffer Tris-HCl 10 mM pH 8. Setelah itu dilakukan pengujian
aktivitas dengan metode Walker (1984) pada substrat musin dan penentuan kadar protein
menurut metode Bradford (1976).
Ammonium sulfat yang ada dalam enzim dipisahkan dengan cara dialisis.
Kantong dialisis (cut-off 12 kD) dengan lebar 25 mm, diametar 16 mm dipotong
sepanjang 15 cm, disiapkan dengan cara berikut: kantong direndam dengan air mengalir
selama 3-4 jam guna menghilangkan glisin. Selanjutnya kantong dialisis diberi
perlakuan dengan 0,3% (w/v) larutan Na 2 S dengan suhu 80°C selama 1 menit untuk
menghilangkan sulfur. Kemudian dicuci dengan air panas (suhu 60°C) selama 2 menit.
Selanjutnya direndam dalam H 2 SO 4 0,2% (v/v). Terakhir dicuci dengan air panas sampai

19
bau asamnya hilang. Saat akan digunakan, salah satu ujung kantong diikat dengan
benang jahit, lalu dimasukkan 10 ml larutan enzim dan ujung yang lain diikat dengan
benang jahit pula. Kantong dimasukkan dalam larutan buffer Tris-Cl 20 mm, pH 8
dengan volume 100 kali volume filtrat dan diagitasi secara perlahan pada suhu 4°C
selama 4 jam.
Larutan Protease dimasukkan dengan menggunakan pipet dengan volume
sebesar 5 % dari 27,5 (void volume) yaitu 1,375 ml. Setelah semua sampel dimasukkan
dalam kolom, gradien pengelusi dan fraction colector (Pharmacia, Biotech)
dioperasikan. Buffer yang digunakan untuk elusi ialah Tris-HCl 10 mM pH 8,0. Ukuran
fraksi yang digunakan sebesar 2 ml per tabung, seluruhnya ada 20 fraksi. Setiap fraksi
diukur aktivitasnya pada substrat musin menurut Metode Walter (1984) dan
penghitungan kadar proteinnya menggunakan metode Bradford (1976).
Kromatografi
Sebelum aktivitas enzim diuji, terlebih dahulu dilakukan optimasi pada buffer
boraks, buffer universal, dan buffer Tris-HCl (pH 6 - 10), asam fosfat (pH 6 - 8), dan
asam asetat (pH 5 - 10). Protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori L 3 A. galli
dipurifikasi dengan kromatografi filtrasi gel dan anion exchange. Supernatan kultur
diendapkan dengan ammonium sulfat 40% selama 1 malam pada temperatur 4 o C dan
disentrifus pada 10.000 rpm selama 10 menit. Pellet dilarutkan ke dalam buffer Tris-HCl
(pH 7) dan didialisa dengan buffer yang sama pada 4 o C selama 24 jam. Larutan
terdialisa digunakan pada kolom gel filtrasi matriks Sephadex G-100 (Sigma, USA) dan
anion exchange matriks DEAE-Sephadex A-50 (Sigma, USA), disetimbangkan dengan
buffer Tris-HCl (pH 7) dan dielusi pada gradien NaCl 0 – 0,1 M dalam 0,01 mM Tris-
HCL (pH 7) pada nilai volume fraksi 0,5 ml/min dan 3 ml. Masing-masing fraksi diuji
konsentrasi protein dan aktivitas enzimatisnya (Kong et al. 2000; dan Balqis et al.
2006).

20
HASIL PENELITIAN
Pengaruh beberapa jenis dan pH buffer dilakukan dengan memberikan perlakuan
0,1 M Tris-HCl (pH 6 - 10), 0,05 M asam fosfat (pH 6 - 8), dan 0.05 M asam asetat (pH
5 - 10) disajikan pada Gambar 1. Aktivitas enzim diuji pada crude ekskretori/sekretori
stadium L 3 A. galli. Hasil optimasi diketahui bahwa buffer Tris mempunyai aktivitas
enzim yang tinggi dibandingkan dengan kedua jenis buffer lainnya, dimana aktivitas
enzim mulai terlihat pada pH 6 yang mencapai optimum pada pH 7 tetapi aktivitas
enzim rendah pada pH 8 dan semakin menurun pada suasana basa. Aktivitas enzim pada
buffer fosfat mulai terlihat pada pH 5 yang dapat dipertahankan pada pH 6, tetapi
aktivitasnya menurun pada pH 7 dan 8. Aktivitas enzim meningkat pH 9 dan
dipertahankan sampai pH 10. Aktivitas enzim juga terlihat dalam buffer asetat pada pH
6 dan aktivitasnya semakin meningkat sampai pada pH 8. Namun, nilai aktivitas enzim
yang dicapai pada buffer fosfat atau asetat masih berada di bawah nilai aktivitas enzim
pada buffer Tris-HCl. Berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui bahwa buffer Tris-
HCl adalah buffer yang paling sesuai untuk optimasi aktivitas enzim dari
ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli sehingga untuk pengujian selanjutnya pada
penelitian ini digunakan buffer 0,1 M Tris-HCl pada pH 7.
0.014
0.012
Aktivitas enzim (u/ml)
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
4 5 6 7 8 9 10 11
pH
0,1 M tris HCl 0,05 M fosfat 0,05 M asetat
Gambar 1. Aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L 3
A. galli pada buffer dan pH yang berbeda

21
Untuk mendapatkan enzim protease yang bebas dari molekul lainnya, dilakukan
pengendapan protein dengan menggunakan ammunium sulfat pada konsentrasi 20-70%.
Hasil optimasi aktivitas enzim dengan ammunium sulfat disajikan pada Gambar 2.
Aktivitas enzim terdeteksi pada konsentrasi 20% dan menurun pada konsentrasi 30%.
Aktivitas enzim meningkat sebesar 14 kali pada konsentrasi 40%, tetapi aktivitas enzim
menurun pada konsentrasi 50% dan terus menurun pada konsentrasi 60%, sedangkan
pada konsentrasi 70% aktivitasnya terlihat sedikit meningkat. Berdasarkan hasil yang
diperoleh diketahui bahwa konsentrasi ammunium sulfat yang paling sesuai untuk
pengendapan protein dari ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli adalah ammunium
sulfat dengan konsentrasi 40%.
Aktivitas enzim (U/ml)
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Konsentrasi (%)
Gambar 2. Optimasi aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L 3
A. galli dengan pengendapan ammunium sulfat
Aktivitas enzim pada pengendapan protein dan dialisis terjadi peningkatan
masing-masing sebesar 359,20% dan 362,05% dibandingkan dengan crude. Protein
total yang merupakan perkalian antara kadar protein dan volume pada pengendapan
protein dan dialisis terjadi penurunan sebesar 3,09% dan 3,51% dibandingkan dengan
crude. Aktivitas total yang merupakan perkalian antara aktivitas enzim dan volume pada
pengendapan protein dan dialisis terjadi penurunan sebesar 78,16% dan 65,84%

22
dibandingkan dengan crude. Aktivitas spesifik yang merupakan pembagian antara
aktivitas enzim dan kadar protein pada pengendapan protein dan dialisis terjadi
peningkatan sebesar 2666,67% dan 1960,67% dibandingkan dengan crude. Tingkat
kemurnian pada pengendapan protein dan dialisis meningkat sebesar 2524% dan 1868%
dibandingkan dengan crude. Hasil yang merupakan pembagian antara aktivitas total dan
volume pada pengendapan protein dan dialisis terjadi penurunan sebesar 78,9% dan
65,59% dibandingkan dengan crude. Hasil uji konsentrasi protein, aktivitas enzim,
aktivitas spesifik enzim, tingkat kemurnian dan hasil dari ekskretori/sekretori stadium L 3
A. galli pada tiap-tiap tahap purifikasi disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1.Tahapan purifikasi protease dari ekskretori/sekretori L 3 A. galli
Protein Aktivitas Akt. Spe- Tingkat Hasil
Tahap Total (mg) Total (U) sifik(U/mg) Kemurnian (%)
Crude (supernatan) 4485 2,84 0,0006 1,0 100,0
Pengendapan-
Am. sulfat 40% 138,75 2,22 0,0160 25,24 78,9
Dialisis 157,5 1,87 0,0118 18,68 65,59
Aktivitas enzim terlihat pada dua peak (puncak) yang dielusi dari gel filtrasi
yaitu fraksi 8 dan 31 dengan aktivitas enzim masing-masing 0,10 U/ml dan 0.625 U/ml.
Kadar protein terlihat pada 2 puncak, yaitu fraksi gabungan 4 dan 5, dan fraksi 11
dengan konsentrasi protein 0,88 mg/ml dan 0,46 mg/ml. Hasil kromatografi gel filtrasi
disajikan dalam Gambar 3. Aktivitas enzimatik terlihat pada empat puncak yang dielusi
dari anion exchange yaitu fraksi gabungan 25 dan 30, fraksi 45, fraksi gabungan 55, 60,
65, dan 70, dan fraksi 95. Konsentrasi protein terlihat pada lima puncak, yaitu fraksi
gabungan 20, 25,30,dan 35, fraksi 45, fraksi gabungan 60 dan 65, 75 dan 80, dan fraksi
90. Fraksi 45 merupakan puncak gabungan antara aktivitas enzim dan konsentrasi
protein tertinggi yaitu 0.003 U/ml dan 37,33 mg/ml (Gambar 4). Berdasarkan hasil yang
diperoleh dari kromatografi anion exchange dan gel filtrasi terlihat fraksi 31 mempunyai
aktivitas enzim tertinggi, sehingga fraksi 31 akan dipakai untuk imunisasi ayam petelur.

23
Konsentrasi protein
(mg/ml)
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35
Nomor fraksi
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Aktivitas enzime (U/ml)
Protein
Enzim
Gambar 3. Kromatogram gel filtrasi matriks sephadex G-100
Konsentrasi protein (mg/ml)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Nomor Fraksi
0.0035
0.003
0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
Aktivitas Enzim e (U/m l)
Protein
Enzim
Gambar 4. Kromatogram anion exchange matriks DEAE sephadex A-50

24
Protein total, aktivitas total aktivitas spesifik tingkat kemurnian dan haril dari
kromatografi gel filtrasi lebih tinggi dibandingkan dengan kromatografi anion exchange.
Masing-masing uji terjadi peningkatan sebesar 1,07 kali, 19 kali, 18,83 kali, 18,81 kali
dan 19,97 kali (Tabel 2). Berdasarkan hasil yang diperoleh terlahat bahwa hasil
kromatografi gel filtrasi matriks sephadeks G-100 lebih baik bila dibandingkan dengan
kromatografi anion exchange matriks DEAE sephadeks A-50.
Tabel 2. Purifikasi protease dari ekskretori/sekretori L 3 A. galli dengan kromatografi
Protein Aktivitas Akt. Spe- Tingkat Hasil
Kromatografi Total (mg) Total (U) sifik(U/mg) Kemurnian (%)
Gel filtrasi 1,2 0.19 0,1563 246,42 6,59
Anion exchange 1.12 0.01 0,0083 13,10 0,33
PEMBAHASAN
Optimasi enzim dilakukan dengan memberikan perlakuan larutan penyangga
buffer Tris-HCl (pH 6 - 10), asam fosfat (pH 6 - 8), dan asam asetat (pH 5 - 10) pada
reaksi hidrolisis. Aktivitas enzim tertinggi pada penyangga asam fosfat adalah 0,003
U/ml, pada penyangga asam asetat adalah 0,006 U/ml, sedangkan pada penyangga Tris-
HCl adalah 0,012 U/ml. Hasil optimasi jenis larutan penyangga dengan beberapa pH
menunjukkan bahwa larutan penyangga Tris-HCl pH 7 memberikan aktivitas terbaik
bagi aktivitas enzim (Gambar 1). Aktivitas enzim meningkat sebesar 14 kali pada
konsentrasi 40% ammunium sulfat (Gambar 2). Suhartono (1989) menyatakan bahwa
optimasi buffer pada purifikasi protein diperlukan untuk menjaga konsentrasi ion
hidrogen pada larutan protein. Pemilihan buffer yang sesuai sangat penting untuk
menjaga protein pada pH yang diinginkan dan untuk memastikan hasil penelitian yang
konstan. Buffer anion mempengaruhi konformasi enzim dan efek tidak langsung pada
muatan sisi aktif enzim.

25
Pengendapan (pemekatan) protein dengan amonium sulfat adalah metode yang
sering digunakan karena memiliki daya larut tinggi di dalam air, relatif murah, dan
kestabilan protein di dalam larutan amonium sulfat (2 M – 3 M) tahan bertahun-tahun.
Pemilihan amonium sulfat didasarkan pada kelarutan protein yang berinteraksi polar
dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam dan daya tolak menolak
protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (pada pH dan temperatur tertentu)
meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan kelarutan protein
akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan garam dengan konsentrasi
tertentu kelarutan protein menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan ionion
garam semakin banyak yang menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi
permukaan protein sehingga mengakibatkan protein saling berinteraksi, beragregasi, dan
kemudian mengendap (Harris 1989).
Pada tahap dialisis, garam yang berlebih di dalam sampel dapat dihilangkan
dengan cara menempatkan sampel di dalam kantung (membran) dialisis semipermeabel
yang direndam di dalam larutan buffer. Molekul yang berukuran kecil akan keluar
melalui membran sedangkan molekul yang besar akan tertahan di dalam membran
dialisis. Ukuran pori kantung dialisis yang terbuat dari bahan selulosa asetat ini
berdiameter 1 – 20 nm yang menunjukkan berat molekul minimum yang dapat tertahan
di dalam membran (Harris 1989).
Pemurnian protease yang biasa dilakukan adalah dengan menggunakan
kromatografi kolom. Ada beberapa cara kromatografi kolom, diantaranya adalah
kromatografi gel filtrasi dan kromatografi anion exchange. Berdasarkan hasil yang
diperoleh dari kromatografi gel filtrasi (Gambar 3) dan anion exchange (Gambar 4)
terlihat fraksi 31 mempunyai aktivitas enzim tertinggi. Kromatografi gel filtrasi
merupakan teknik pemisahan protein dan makromolekul biologi lain berdasarkan ukuran
molekul. Matriks gel filtrasi merupakan gel berpori yang dikemas di dalam kolom dan
dielusi dengan fase cair-mobil. Pori-pori matriks dapat menampung molekul yang
berukuran lebih kecil dan memisahkannya dari molekul yang berukuran molekul tinggi.
Kromatografi gel filtrasi dapat pula digunakan untuk estimasi berat molekul.
Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas antara molekul bermuatan

26
di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif yang bermuatan berlawanan sebagai
pengisi kolom. Permukaan protein terdiri dari muatan positif dan negatif tergantung dari
rantai samping asam amino asam dan basa (Amersham 2003).
Konsentrasi protein ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli pada tiap-tiap
tahapan purifikasi mulai dari tahap crude sampai pada tahap kromatografi menunjukkan
penurunan seperti disajikan pada Tabel 1 dan Tabel 2. Hal ini menunjukkan bahwa
senyawa-senyawa pengotor dan protein-protein lain sudah terpisahkan. Penelitian
tentang konsentrasi protein yang dilepaskan oleh cacing dilaporkan Satrija et al. (2004)
bahwa kadar protein antigen cacing pita Raillietina echinobothrida sebelum dipekatkan
berkisar antara 0,286 – 0,361 mg/ml, sedangkan setelah dipekatkan dengan vivaspin
mengandung protein antigen 0,691 mg/ml. Darmawi et al. (2006 b ) membuktikan bahwa
keberadaan protein L 3 cacing nematoda A. galli dapat dimonitor melalui
spektrofotometer setelah tiga hari dikultur dalam medium RPMI 1640.
Ekskretori/sekretori cacing nematoda seperti Ascaris suum, Toxocara canis,
Brugia malayi, Loa loa, Dictyocaulus viviparus, Dirofilaria immitis, dan Ostertagia
ostertagi mengandung enzim. Enzim yang dilepaskan cacing selama establish dapat
berperan sebagai substansi biologik aktif untuk perkembangan parasit. Protease dapat
dideteksi keberadaannya pada ekstrak tubuh dan ekskretori/sekretori larva (L 3 ) dan (L 4 )
cacing nematoda O. ostertagi pada sapi. Aktivitas proteolitik terlihat pada produk
ekskretori/sekretori L 4 (Cock et al. 1993). Cacing Clonorchis sinensis dilaporkan
Nagano et al. (2004) secara molekular mengekspresikan protease sistein. Protease sistein
juga diekspresikan oleh cacing dewasa Paragonimus westermani (Kim et al. 2000), dan
H. contortus (Ruiz et al. 2004). Darmawi et al. (2006 a ) membuktikan bahwa cairan
kultur larva A. galli memiliki aktivitas enzimatis yang ditandai dengan sifatnya yang
mampu mendegradasi casein. Cacing nematoda gastrointestinal ruminansia juga
mengandung enzim proteolitik (Knox dan Jones 1990).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli
memiliki aktivitas protease dan berhasil dipurifikasi melalui kromatografi filtrasi gel.
Hal ini membuktikan bahwa stadium L 3 A. galli membutuhkan enzim ekstraseluler
untuk survive menjalani fase histotrofik. Hasil penelitian ini mendukung hasil penelitian

27
peneliti terdahulu bahwa aminopeptidase yang ditemukan oleh Rhoads et al. (1997) pada
stadium L 3 – L 4 nematoda A. suum berkenaan dengan proses molting. Rhoads et al.
(2001) membuktikan juga bahwa pada stadium L 3 – L 4 A. suum pada babi melepaskan
hyaluronidase dengan kadar tertinggi hyaluronidase ditemukan pada hari keempat dan
keenam di dalam medium kultur. Proses perkembangan L 3 menjadi L 4 dan proses
migrasi larva A. suum ke jaringan difasilitasi dan tergantung pada hyaluronidase. Ford et
al. (2005) melaporkan bahwa protease yang disekresikan melalui ekskretori/sekretori
Onchocerca volvulus berperan multifungsi untuk perkembangan parasit, termasuk
molting, establishment, embriogenesis, dan reproduksi.
Berdasarkan temuan para peneliti terdahulu (Cock et al. 1993; Rhoads et al.
1997; Harnett et al. 1997; Kim et al. 2000; Todorova 2000; Rhoads et al. 2001; Satrija et
al. 2004; Nagano et al. 2004; Ford et al. 2005; dan Darmawi et al. 2006 ab ) maka
protease yang telah berhasil dipurifikasi dari ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli
pada penelitian ini sangat mungkin berperan multifungsi bagi kelangsungan hidup
parasit dan sebagai perantara interaksi parasit dengan inang definitifnya.
KESIMPULAN
1. Stadium L 3 A. galli melepaskan protease yang mempunyai aktivitas enzim 0,19
U/ml dengan aktivitas spesifik 0,15 U/mg.
2. Aktivitas enzim yang terdapat pada fraksi 31 kromatogram filtrasi gel lebih
tinggi dibandingkan dengan aktivitas enzim pada anion exchange.
Saran
Dari hasil penelitian disarankan bahwa perlu dilakukan penelitian selanjutnya
untuk mengetahui karakter dan jenis enzim yang dilepaskan oleh stadium L 3 A. galli.