Studi Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap ...

48Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...and Barry, 2000). Dengan demikian dapat diasumsikan bahwa perbedaan antaraM. tuberculosis sensitif dan resisten INH terletak pada dinding bakteri.Salah satu respon imun alamiah (innate immunity) dalam menghadapi masuknyaM. tuberculosis secara inhalasi ke dalam tubuh adalah dengan cara fagositosis.Makrofag alveolar mempunyai peranan yang sangat penting dalam hal ini. Dinding seldari M. tuberculosis mengandung beberapa protein yang bersifat imunogenik (Fentondan Vermeulun, 1996), Proses fagositosis pada M. tuberculosis ternyata memilikikeunikan. Perlekatan antara kuman dan fagosit melibatkan reseptor pada permukaansel. (Crevel, 2002). Penelitian yang dilakukan oleh Schlesinger (1993) membuktikanadanya perbedaan fagositosis terhadap M. tuberculosis yang virulen dan avirulen. Halini terjadi karena adanya perbedaan peran dari reseptornya. Adanya perubahan padabagian dinding sel M. tuberculosis memungkinkan terjadinya perubahan aktivitasfagositosis oleh makrofag terhadap M. tuberculosis. Dengan demikian adalah relevanuntuk meneliti fagositosis makrofag terhadap infeksi M. tuberculosis yang sensitif danresisten INH.Tujuan PenelitianPenelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan resistensi INH denganfagositosis makrofag dengan menilai apakah terdapat perbedaan fagositosis terhadapM. tuberculosis sensitif dan resisten INHTinjauan PustakaMycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis merupakan patogen penting pada manusia. Setiaptahun 3 juta penduduk dunia meninggal akibat kuman ini (Schlesinger, 1993 ; Hmama,1998). M. tuberculosis merupakan kuman intraseluler, termasuk genus Mycobacteriumyang berbentuk batang dan merupakan golongan bakteri gram positif, tersusuntunggal (Robert et al, 1991). Mycobacterium mempunyai dinding sel dengan sifatsifatfisik dan kimiawi tertentu yang memungkinkan untuk bertahan hidup danbermultiplikasi di dalam makrofag ( Fenton and Vermeulen, 1996). Sifat tumbuhnyalambat, bersifat tahan asam, tahan alkohol, dan aerofilik, hal ini karena lapisan dindingselnya mempunyai sifat- sifat khusus (Robert et al, 1991).Fagositosis Makrofag terhadap M. tuberculosisMakrofag sebagai sel pertahanan dapat melakukan aktivitasnya dengan berbagaicara yaitu fagositosis dan destruksi mikrorganisme, kemotaksis, sebagai sel penyajiantigen, mensekresi enzim dan substansi biologis yang lain serta mengontrolpertumbuhan sel tumor (Lewis and McGee, 1992 ; Jawetz, 2000). Aktivasi makrofagmerupakan fenomena yang kompleks. Makrofag yang teraktivasi menunjukkankemampuan yang meningkat untuk membunuh beberapa jenis mikroorganisme, tetapipeningkatan kemampuan membunuh ini tidak berlaku bagi sel sasaran yang lain(Kresno, 2001). Makrofag alveoli yang berasal dari sumsum tulang dalampembentukannya akan melalui beberapa stadium yang dimulai dari monoblast,promonosit dan akhirnya membentuk monosit. Monosit akan memasuki sirkulasi darahdan setelah mencapai kapiler alveoli sebagian akan bermigrasi ke dalam rongga alveolidan selanjutnya berfungsi sebagai makrofag alveoli yang akan memulai responimun (Matthes et al., 1994; Iseman, 2000). Makrofag berperan penting pada responimun bersama-sama dengan APC (Antigen Presenting Cell) yang lain akan memprosesdan menampilkan antigen kepada sel T sehingga menimbulkan respon imun. Padaproses fagositosis dan imun rekognisi akan melibatkan beberapaLOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005 ISSN: 1410-2315

Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...49reseptor yang terdapat pada permukaan makrofag dan dinding sel bakteri diantaranya adalah reseptor komplemen, reseptor mannosa dan scavenger reseptor.Pada dinding bakteri yang terlibat diantaranya adalah lipoprotein M. tuberculosis,Lipoarabinomannan (LAM). Ikatan dengan Toll-like reseptor (TLRs) pada imun rekognisidapat terjadi pada permukaan sel atau pada fagosom (Aston, et al, 1998 ; Crevel. et al,2002). Setelah terjadi kontak dengan bakteri maka membran sel makrofag akanmengadakan invaginasi kemudian membentuk vakuola yang akan menyelimuti seluruhkuman. Vakuola akan membentuk fagolisosom setelah mengadakan fusi denganlisosom yang mengandung enzim hidrofilik yang aktif pada suasana asam. Akibatnyasel-sel bakteri akan dicerna di dalam vakuola dan debris yang terbentuk akan disekresisecara eksositosis. Pada infeksi tuberKulosis bakteri ini tidak selalu dapat dicernaoleh makrofag, bahkan bakteri dapat bermultiplikasi setelah beradaptasi secarabiokimiawi dan biofisika dengan lingkungan yang ada dalam fagolisosom. Sebagianbakteri akan mati dan sisanya akan bermultiplikasi kembali sampai mencapai jumlahyang besar (Matthes, et al., 1994)Penelitian yang dilakukan oleh Schlesinger (1993) membuktikan adanyaperbedaan fagositosis terhadap M. tuberculosis yang virulen dan avirulen. Hal ini terjadikarena adanya perbedaan peran dari reseptornya. Pada reseptor complemen (CR)berperan baik pada strain virulen maupun avirulen, namun reseptor mannosa hanyaberperan pada strain yang virulen dan tidak berperan pada strain avirulen.Resistensi Kuman terhadap Obat Anti TuberkulosisProblem resistensi kuman terhadap obat-obat antibiotik hampir terjadi pada semuakuman. Sekali suatu mutasi resisten timbul pada populasi sel, sifat ini dapat dipindahkanke sel lain. Demikian juga dengan penggunaan berbagai macam obat anti tuberkulosis.Resistensi basil terhadap obat-obat anti tuberkulosis semakin tinggi, seperti padaStreptomisin, Ethambutol dan Isoniazid. Berdasar penelitian di Yogyakarta tingkatresistensi M. tuberculosis terhadap Isoniazid (INH) sudah cukup tinggi yaitu mencapai16% (Rintiswati dan Wijayanti, 1999). Penelitian serupa di Bandung tahun 1984-1985dinyatakan prosentase resistensi kuman M. tuberculosis terhadap Isoniazid sebesar37,5 % (Kosasih, 1989).Isoniazid adalah bentuk hidrazid asam isonikonat sering disebut INH. Merupakankristal putih, tidak berbau dan larut dalam air. INH dapat bersifat tuberkulosid maupuntuberkulostatik tergantung dosisnya (Jawetz, 2000). Konsentrasi minimum sebagaituberkulostatik adalah 0,025-0,050 mcg/ml. Efek bakteriostatik ini hanya pada kumantuberkulosis yang aktif (Wattimena, 1991).Mekanisme Resistensi INHMekanisme kerja Isoniazid belum diketahui dengan jelas, demikian pula bagaimanaterjadinya resistensi terhadap obat ini. Terdapat beberapa teori diajukan ataupunpenelitian-penelitian. Terjadinya resistensi diduga berhubungan dengan kegagalan obatmasuk ke dalam sel bakteri karena menurunnya daya penetrasi obat atau kemampuanpenyerapan obat oleh mikroorganisme (Wattimena, 1991).Sementara menurut Rouse and Morris (1995) adanya delesi, point mutasi frameshiftspada gen katG yang mengkode enzym katalase-peroksidase yang merubahINH menjadi bentuk aktifnya diyakini berkaitan dengan resistensi INH meski dari 6sampel yang diteliti hanya 1 sampel yang menunjukkan delesi lengkap.Adapun penelitian yang dilakukan Telenti et al. (1997) mutasi terdapat padabeberapa gen yaitu katG, inhA, ahpC atau multiple mutasi, jadi terdapat lebih dari 1gen yang mengalami mutasiISSN: 1410-2315LOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005

50Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...Sementara Chen (1998) meneliti adanya tiga gen yang disebut ceo didugaberkaitan dengan terjadinya resistensi pada M. tuberculosis. Dengan demikianmekanisme resistensi INH hingga saat ini masih menimbulkan banyak pertanyaan.Cara Penelitian1. Uji kepekaan M. tuberculosis terhadap Isoniazid (INH)Sputum penderita tuberkulosis paru yang diambil di wilayah Yogyakartadihomogenisasi kemudian dikultur pada media Lowenstein Jensen, selanjutnyadiinkubasi pada suhu 37 o C selama 3-6 minggu. Setelah Mycobacterium tumbuhbagus dilakukan uji kepekaan kuman terhadap obat-obat anti tuberkulosis denganmetode proporsional (Sandjaya,1995). Dipilih isolat M. tuberculosis yang sensitifdan resisten terhadap INH.2. Pengambilan MakrofagMakrofag Bronchoalveolar (BAL)Pengambilan makrofag BAL dilakukan di Rumah Sakit Dr. Sardjito oleh seorangahli. Probandus adalah orang yang sehat dan tidak merokok.. Sebelum dilakukanpengambilan makrofag alveolar probandus mengisi informed consent yang telahdisediakan. Sehari sebelumnya probandus dilakukan premedikasi dengan cara :a. Menelan Ekstrak belladonna, HCl codein, Ativan dan Narfoz pada pukul 20.00WIB selanjutnya setelah pukul 24.00 tidak boleh makan dan minum.b. Keesokan harinya pukul 06.00 WIB probandus menelan Ekstrak belladonna,HCl codein, Ativan dan Narfoz, dosis ditentukan oleh dokter ahli. Pengambilancairan dilakukan dengan bantuan bronkhoskopi. Cairan dimasukkan ke tabungerlenmeyer steril kemudian dibawa dengan termos es.Kultur MakrofagCairan bronchoalveolar yang diperoleh diambil 1-2 cc untuk di kultur dandilakukan uji kepekaan kuman terhadap antibiotik di laboratorium Mikrobiologi.Cairan lainnya di bawa ke laboratorium Ilmu Hayati untuk dilakukan kultur makrofagsebagai berikuta. Cairan yang berada dalam tabung Erlenmeyer dipindahkan ke tabungsentrifus kemudian disentrifugasi selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelletditambah medium RPMI dan dilakukan resuspensi, sentrifugasi lagi selama10 menitb. Dilakukan hal yang sama 1 kali lagi. Pellet ditambah medium penumbuhyang telah diberi penstrep, fungison dan FBS 15 %c. Pelet yang telah diberi medium penumbuh seperti di atas selanjutnya dibagike dalam microplate 12 well, masing-masing 1 ml.d. Inkubasi dalam inkubator CO 2selama 24 jam, supernatan dibuang, cuci 1-2kali RPMI.3. Pengambilan Makrofag dari Monosit Darah Perifer ManusiaDarah perifer dari sukarelawan diambil sebanyak 50 ml. disentrifugasi dengankecepatan 5000 rpm selama 12 menit. Supernatan dibuang, dicampur denganRPMI 1640 sebanyak 1:2, secara hati-hati dimasukkan dalam tabung conical 15ml yang telah berisi Ficoll sebanyak ¼ dari campuran tadi. Selanjutnyadisentrifugasi lagi selama 20 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Buffy coat diambil,ditambah medium RPMI 1640 secukupnya dan disentrifugasi selama 10 menit.Supernatan dibuang, pellet diresuspensi dengan medium penumbuh kemudiandibagi pada 3 buah petri kultur, diinkubasi pada inkubator CO2 selamaLOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005 ISSN: 1410-2315

Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...512 jam. Setelah 2 jam kemudian supernatan dibuang selnjutnya dicuci dengan RPMI1640 sebanyak 2-3 kali sehingga diperoleh monosit yang menempel pada petri.Makrofag dipanen dengan cara meresuspensi secara berulang-ulang kemudiandimasukkan dalam tabung conical 15 ml, disentrifugasi 10 menit, supernatandibuang, pellet diresuspensi dengan medium penumbuh, kemudian dihitungdengan hemositometer menggunakan trypan blue. Hasil dibagi dalam mikroplate24 well yang telah diberi cover slip dengan kepadatan 5 x 10 4 kemudiandimasukkan lagi ke dalam inkubator CO2. Infeksikan dilakukan tiga hari kemudian.4. Persiapan Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis dari kultur pada media Lowenstein Jensen baik ituisolat lokal resisten maupun sensitif INH, masing-masing diambil 1-2 CFUdimasukkan ke dalam tabung yang berisi Ringer Laktat (RL) sebanyak 100 mldiresuspensi dengan menggunakan jarum 27 G , ditambah 900 ml RL kemudiandivortek dan disamakan dengan indeks Mc. Farlan dengan menambah RLsehingga diperoleh M. Tuberculosis dengan kepadatan 10 8 . Selanjutnya M. Tuberculosisyang telah sesuai dimasukkan kedalam eppendorf dan selanjutnyasiap diinfeksikan kepada makrofag.5. Fagositosis MakrofagMakrofag yang telah siap diinfeksi diganti medianya dengan media tanpa antibiotik,selanjutnya masing–masing well ditambahkan dengan suspensi mikobakterium100 ml (10 x 10 6 ), sedangkan sebagai kontrol digunakan lateks. Inkubasi dalaminkubator CO 2selama 2 jam, cuci dengan RPMI, keringkan di atas bunsen sebagaifiksasi selanjutnya dilakukan pengecatan dengan Acri-Fluor TM (pengecatansebelumnya dengan ZN, Kinyoun, Giemsa dan Auramin-rodamin hasil kurangbagus). Hasil pengecatan kemudian dilihat dengan mikroskop fluoresen. Bakteridi dalam makrofag akan terlihat berpendar berwarna kuning kemerahan. Bakteriintraselular dihitung pada 200 lapang pandang dan diabadikan dengan kameradigital.Ada tidaknya perbedaan fagositosis terhadap M. tuberculosis sensitif dan resistendiuji dengan uji statistik Mann-Whitney dengan program SPSS 11Hasil Penelitian dan PembahasanPengambilan makrofag alveolar yang dilakukan sebanyak 6 kali ternyata tidakmembuahkan hasil. Kultuir makrofag selalu terkontaminasi. Jenis kontaminan berbedabedademikian pula setiap dilakukan uji kepekaan kuman terhadap antibiotik. Padahalsetiap pengambilan memerlukan biaya yang cukup besar. Dengan berbagaipertimbangan akhirnya diputuskan makrofag alveolar diganti dengan makrofag yangberasal dari monosit darah perifer. Pengambilan sampel darah perifer dilakukansebanyak 16 kali. Tidak semua sampel dapat dilakukan pengujian. Pada awal penelitianmasih banyak dilakukan trial and error mengingat penelitian ini di Indonesia masihjarang dilakukan. Beberapa kendala yang mengganggu penelitian adalah sebagaiberikut :1. Jika pencucian kurang limfosit masih banyak namun jika pencucian berlebihmonosit ikut terbuang2. Sulitnya melepas ikatan antara M. tuberculosis dengan koloninya sehingga jumlahM. tuberculosis yang difagositosis dapat dihitung3. Pengambilan gambar terganggu dengan pendaran sinar fluorosen, sehingga untukmendapatkan hasil 1 preparat perlu pemotretan berulang kali sehingga jumlahseluruh pemotretan lebih dari seratus kali.ISSN: 1410-2315LOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005

52Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...Kultur makrofag dari monosit darah perifer ternyata tidak mudah. Hal ini dapatdimengerti karena monosit yang merupakan bagian dari sel sel darah putih hanya 5,2% dari keseluruhan sel-sel darah putih sedangkan sel darah putih orang dewasa normaladalah 4.000-11.000 mmk sementara sel darah merah berjumlah 4.000.000-5.000.000 mmk.Gambar. 5Kultur makrofag- setelah berhasil didsolasi, pengecatan dengan Acri-Fluor TMpengamatan pada mikroskop cahya, perbesarn 400x.Gambar 6.Kultur makrofag-monosit setelah berhasil didsolasi, pengecatan dengan Acri-Fluor TM perbesaran 400xLOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005 ISSN: 1410-2315

Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...53Gambar 7.M. tuberculosis, sebelum dapat dipisahkan dari koloninya, pengecatan denganAcri-Fluor TM pengamatan pada mikroskop flurosen perbesaran 1000Gambar 8.M. tuberculosis setelah berhasil dipisahkan dari koloninya , pengecatandengan Acri-Fluor TM pengamatan pada mikroskop flurosen perbesaran 1000xGambar 9.M. tuberculosis intraselular, 1 batang setelah difagosit makrofag, pengecatandengan Acri-Fluor TM pengamatan pada mikroskop flurosen perbesaran 1000xISSN: 1410-2315LOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005

54Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...Gambar 10.M. tuberculosis intraselular, 4 batang setelah difagosit makrofag,pengecatan dengan Acri-FluorTM pengamatan padamikroskop flurosen perbesaran 1000xMakrofag dari monosit darah perifer baru dapat diisolasi dan dikultur setelahberulang kali pengambilan darah perifer. Kecepatan dan lama sentrifugasi nampaknyaberperan penting. Pengamatan di mikroskop setelah pencucian menurunkan resikohilangnya monosit setelah dicuci. Pada populasinya makrofag-monosit ternyata lebihsuka berkelompok, makrofag yang merasa terganggu (misal karena pencucian) makasecara berkelompok akan berpindah hingga menemukan tempat yang cocok.Isolat M. tuberculosis terdiri atas : isolat sensitif 1 (S1) yaitu isolat yang diambildari pasien dengan kode 401, isolat sensitif 2 (S2) adalah isolat yang diambil daripasien dengan kode 356. Sementara pada isolat resisten 1 (R1) diambil dari pasiendengan kode BLK1 dan isolat resisten 2 (R2) diambil dari pasien dengan kode BLK2Pada pemisahan M. tuberculosis dari koloninya dengan cara meresuspensiberulang-ulang dengan menggunakan spuit insulin 27 G, pada penelitian ini dilakukansebanyak 10 kali secara perlahan-lahan. Sementara berdasar penelitian yang dilakukanoleh Keane, (1997) dilakukan dengan spuit insulin 25 G sebanyak 5 kali. Adanyamodifikasi ini dikarenakan penggunaan spuit insulin 25 G sebanyak 5 kali resuspensi,hasil yang diperoleh M. tuberculosis masih banyak yang bergerombol, sehingga bakteriintraselular tidak dapat dihitung.Fagositosis dilihat pada mikroskop fluoresen pada preparat yang telah dicat dengan‘Acri Fluor’. Pengecatan dilakukan setelah preparat dikeringkan di atas bunsen, denganmenggenangi cat Acri-Fluor selama 15 menit. Cat dibuang kemudian dicuci denganaquades sebanyak 2 kali. Preparat kemudian digenangi dengan destainer selama 2menit, selanjutnya destainer dibuang dan dicuci dengan aquades sebanyak 2 kali.Penghitungan dilakukan pada 200 lapang pandang. Fagositosis makrofag yang dapatdigunakan hasilnya sebanyak 4 kali ulangan. Hasil fagositosis dapat dilihat pada tabel1.LOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005 ISSN: 1410-2315

Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...55Tabel 1.Fagositosis Makrofag terhadap M. tuberculosisS1 S2 R1 R2I 38 47 63 1II 41 65 125 11III 52 57 102 2IV 67 1 33 2Rata-rata 49.5 42.5 80.75 4SEM 6.5637 14.3149 20.4221 2.3452Dari tabel di atas dapat dibuat grafik sebagai berikut :Fagositosis Makrofag9080706050403020100S1 S2 R1 R2Isolat M. tuberculosisGambar 11.Grafik batang, aktifitas fagositosis makrofag terhadap M. tuberculosissensitif dan resisten INHData di atas menunjukkan tingkat fagositosis lebih tinggi pada isolat resisten satu(R1) namun hal ini justru berkebalikan pada isolat resisten dua (R2). Sementara padaisolat sensitif menunjukkan tingkat fagositosis yang tidak jauh berbeda. Dengandemikian isolat resisten memiliki variasi lebih besar dibanding isolat sensitif. Pada ujidaya beda yang dilakukan dengan menggunakan statistik Mann-Whitney tes diperolehhasil yang tidak bermakna (p>0,05) dengan demikian tidak ada perbedaan antarafagositosis makrofag terhadap M. tuberculosis yang sensitif maupun yang resistenterhadap Isoniazid.ISSN: 1410-2315LOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005

56Farida JR, Study Perbandingan Aktivitas Fagositosis Makrofag terhadap Mycobacterium ...Kesimpulan dan SaranKesimpulan1. Tidak ada perbedaan fagositosis makrofag terhadap M. tuberculosis yang sensitifdan resisten INH.2. Variasi fagositosis makrofag pada M. tuberculosis resisten lebih tinggi dibandingM. tuberculosis sensitif INH.Saran1. Perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan kultur makrofag dari monosit darahperifer sehingga diperoleh hasil yang optimal2. Perlu dilakukan penelitian untuk uji viabilitas M. tuberculosis yang diresuspensidengan spuit insulin 26 dan 27 G3. Perlu dilakukan penelitian serupa setelah ada hasil pada poin 1 dan 24. Perlu dilakukan penelitian dengan sampel hanya makrofag atau seminimalmungkin tercampur sel lain, misal makrofag bronchoalveolar dengan mencarimetoda agar tidak terkontaminasi.Daftar PustakaCrevel van R., Tom H. M.O., W.M. van der Meer., 2002, Innate Immunity to M. tuberculosis,Clin. Microbiol. Rev., Vol. 15 (2) : 294-309Fenton, M.J. and Vermeulen, M.W., 1996, Immunopathology of Tuberculosis : Role ofMacrophage and Monocyte. Infect. Immun. (64) : 683-8Fulton, S.A., Johnsen, J.L., Wolf, S.F., Sieburth, D.S. and Boom W.H., 1996, Interleukin-12 Production by Human Monocytes Infected with M. tuberculosis : Role ofPhagocytosis, Infect. Immun. : 2523-31Jawetz, Melnick, and Adelberg’s, 2001, Mikrobiologi Kedokteran, Alih bahasa olehMudihardi, E., Kuntaman, Wasito, E.B., Mertaniasih, N.M., Harsono, S., danAlimsardjono, L., Penerbit Salemba Medika, Jakarta.Keane, J., Balcewicz-Sablinska M. K., Remold, H.G., Chupp, G.L., Meek, B.B., FentonM..J. and Kornfeld H, 1997, Infection by M. tuberculosis Promotes HumanAlveolar Macrophages Apoptosis, Infect. Immun., 65 (1) : 298-304Rintiswati N., Wijayanti Y. 1999 Kepekaan M. tuberculosis terhadap Obat Anti Tuberculosis,B. I. Ked., 31 : 77-83Schlesinger, L.S., 1993 Macrophage Phagocytosis of Virulent but Not Attenuated Strainof M. tuberculosis Is Mediated by Mannose Receptors in Addition toCoomplement Receptors, J. Immunol., (150) : 2920Slaiden, R.A., and Barry C.E., 2000, The Genetics and Biochemistry of INH Resistancein M. tuberculosis, Microb. Infect., 2 : 659-69.LOGIKA, Vol. 2, No. 2, Juli 2005 ISSN: 1410-2315