Embriogenesis somatik langsung pada tanaman ... - Pustaka Deptan

Embriogenesis Jurnal Bioteknologi somatik Pertanian, langsung Vol. pada 10, tanaman No. 1, 2005, cendana pp. 1-61Embriogenesis somatik langsung pada tanaman cendanaDirect somatic embryogenesis on sandalwoodDeden SukmadjajaBalai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik PertanianJalan Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111, IndonesiaABSTRACTSandalwood (Santalum album L.) is a commercially importantcommodity of Indonesia, particularly in West and East NusaTenggara. However, the population has significantly decreasedand the planting materials are difficult to be providedthrough conventional methods. A study was conducted topropagate sandalwood by using in vitro technology throughsomatic embryogenesis. Primary somatic embryos were formedon immature or mature zygotic embryos planted on MS basalmedium containing benzyl-aminopurine or thidiazuron. Primarysomatic embryos then formed secondary embryos whenthey were transferred to MS medium with or without indoleaceticacid. Transferring somatic embryos onto MS mediumcontaining gibberrelic acid could not convert the embryos intoplantlets, but they regenerated forming shoot multiplication.Culturing shoots from somatic embryo on MS inductionmedium enriched with indole butyric acid produced a fewnumber of roots.[Keywords: Santalum album, somatic embryogenesis, primarysomatic embryo, secondary somatic embryo]ABSTRAKCendana (Santalum album L.) merupakan salah satu tanamanyang bernilai ekonomi tinggi bagi Indonesia khususnya diNusa Tenggara Barat dan Timur. Namun, populasi tanamantersebut cenderung menurun dan penyediaan bahan tanamansecara konvensional sulit dilakukan. Penelitian ini bertujuanuntuk memperbanyak tanaman cendana secara in vitro melaluiembriogenesis somatik secara langsung. Embrio somatikprimer diperoleh dengan cara menanam eksplan embriozigotik muda dan dewasa pada media dasar MS yang mengandungbensil-aminopurin atau thidiazuron. Pada tahapselanjutnya, embrio somatik primer akan membentuk embriosomatik sekunder setelah disubkultur pada media dasar MSdengan atau tanpa penambahan asam indolasetat. Pemindahanembrio somatik pada media pendewasaan atau perkecambahanMS yang mengandung asam giberelat tidak dapat mendorongembrio menjadi plantlet, tetapi mengarah pada prosesregenerasi membentuk multiplikasi tunas. Induksi akar padatunas-tunas yang berasal dari embrio somatik pada mediadasar MS yang mengandung asam indol butirat hanya menghasilkanakar dalam jumlah yang sedikit.[Kata kunci: Santalum album, embriogenesis somatik, embriosomatik primer, embrio somatik sekunder]PENDAHULUANCendana (Santalum album L.) merupakan salah satukomoditas yang bernilai ekonomi tinggi. Tanaman inibanyak terdapat di Nusa Tenggara Timur, namun populasinyacenderung menurun akibat tidak seimbangnyaantara eksploitasi dan upaya pelestariannya. DiPulau Sumba, misalnya, tanaman cendana telah punah,sedangkan di Pulau Timor cendana akan mengalaminasib serupa apabila tidak ada upaya penyelamatannya.Eksploitasi kayu cendana terutama disebabkanoleh permintaan pasar yang tinggi, baik di dalammaupun luar negeri (Musakabe 2000). Oleh karena ituperlu segera dilakukan upaya pengembangannya.Salah satu faktor yang menentukan keberhasilanpengembangan tanaman cendana adalah ketersediaanbibit yang bermutu. Penyediaan bibit melalui perbanyakansecara konvensional kurang memadai untuksuatu tanaman yang akan dikembangkan secara luas.Teknologi yang biasa digunakan dan memberikanharapan dalam penyediaan bibit dalam jumlah besardan waktu singkat ialah kultur in vitro. Aplikasi bioteknologidalam bidang pertanian bukan hanya untukperbanyakan, tetapi juga untuk perbaikan karaktertanaman.Perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan dapatdilakukan melalui tiga cara, yaitu pembentukan tunasadventif, proliferasi tunas lateral, dan embriogenesissomatik. Penelitian perbanyakan tanaman cendanamelalui proliferasi tunas telah dilakukan oleh Kamildan Umboh (1990). Di masa mendatang, perbanyakanklonal melalui embriogenesis somatik untuk produksibenih sintetis tanaman kehutanan akan lebih banyakmendapat perhatian dibandingkan cara lainnya (Attreeet al. 1990).Embriogenesis somatik merupakan suatu proses dimana sel-sel somatik (baik haploid maupun diploid)berkembang membentuk tumbuhan baru melaluitahapan perkembangan embrio yang spesifik tanpamelalui fusi gamet (Williams dan Maheswara 1986).Regenerasi melalui embriogenesis somatik memberikan

2 Deden Sukmadjajabanyak keuntungan, antara lain: (1) waktu perbanyakanlebih cepat; (2) pencapaian hasil dalam mendukungprogram perbaikan tanaman lebih cepat; dan (3) jumlahbibit yang dihasilkan tidak terbatas jumlahnya(Mariska 1996). Di samping itu, dengan strukturnyayang bipolar dan kondisi fisiologis yang menyerupaiembrio zigotik maka perbanyakan melalui pembentukanembrio somatik lebih menguntungkan daripadapembentukan tunas adventif yang unipolar.Embriogenesis somatik pada tanaman kehutananmempunyai beberapa tahapan perkembangan yangspesifik, seperti induksi kalus embriogenik atau embriosomatik (pembentukan langsung), pemeliharaan,pendewasaan, perkecambahan, dan aklimatisasi (Leluet al. 1993). Pembentukan embrio somatik secaralangsung lebih disukai karena dapat menekan masalahsulitnya pembentukan benih somatik pada tahap perkecambahan(Rai dan McComb 2002).Keberhasilan regenerasi melalui embriogenesissomatik dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lainformulasi media yang berbeda pada setiap tahap perkembanganembrio somatik serta jenis eksplan yangdigunakan. Pada tahap pembentukan struktur globulardan hati sering digunakan zat pengatur tumbuhsitokinin seperti benzyladenin (BA) atau yang mempunyaiperan fisiologis yang sama yaitu thidiazuron(Husni et al. 1997) atau 2,4-D, dan NAA apabilaembrio somatik melalui fase kalus (Hutami et al. 2002).Untuk tahap pendewasaan, konsentrasi sitokininditurunkan dan untuk tahap perkecambahan seringditambahkan GA 3(Mariska et al. 2001a; 2001b; Raidan McComb 2002). Sebagai eksplan umumnya digunakanjaringan atau organ yang bersifat embriogenikseperti embrio zigotik, kotiledon, mata tunas, danhipo/epikotil.Di India, penelitian perbanyakan klonal pada tanamancendana dikembangkan dengan menggunakanbioreaktor dengan cara memanipulasi berbagai faktoryang mempengaruhi proses produksi embrio somatikpada setiap tahapannya, seperti komposisi sukrosa,nitrogen, asam absisic (Das et al. 2001) atau ionkalsium dalam media (Anil dan Rao 2000). Dengandemikian, perbanyakan tanaman melalui embriogenesissomatik memerlukan beberapa tahapan denganformulasi media yang berbeda, bergantung padatahap perkembangan embrio somatik. Penelitian inibertujuan mempelajari sistem regenerasi dan perbanyakansecara in vitro tanaman cendana melaluipembentukan embrio somatik secara langsung.BAHAN DAN METODEPenelitian dilaksanakan di laboratorium kultur jaringanBalai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologidan Sumberdaya Genetik Pertanian padabulan Februari sampai Desember 2003. Bahan tanamanyang digunakan adalah embrio dari buah cendanamuda dan dewasa yang diperoleh dari Nusa TenggaraBarat dan Yogyakarta.Bagian luar kulit buah (pericarp) dibuka/dipecah,kemudian benih dikeluarkan dan dikumpulkan. Benihdikeringanginkan di atas cawan petri di dalam laminarselama 5-10 menit. Embrio yang berada di bagian dalambenih dikeluarkan dengan menggunakan pinset steril,kemudian ditanam dalam media perlakuan yang sudahdisiapkan di dalam botol kultur.Media yang digunakan sebagai perlakuan disesuaikandengan tahapan percobaan yaitu:• Tahap induksi embrio somatik: MS + BA 0,5 mg/l;MS + BA 1 mg/l; MS + BA 2 mg/l; MS + thidiazuron0,5 mg/l; MS + thidiazuron 1 mg/l dan MS +thidiazuron 2 mg/l.• Tahap pembentukan embrio somatik sekunder: MS+ IAA 0,5 mg/l dan MS + IAA 1 mg/l.• Tahap perkecambahan/pembentukan plantlet: MS1/2tanpa GA 3; MS1/2 + GA 30,5 mg/l; MS1/2 + GA 31 mg/l; MS tanpa GA 3; MS + GA 30,5 mg/l dan MS +GA 31 mg/l.• Tahap perakaran: MS + IBA 5 mg/l dan MS + IBA10 mg/l.Medium dasar MS (Murashige dan Skoog 1962) dilengkapidengan sukrosa 3% (w/v), serta dibuat padatdengan menambahkan agar 0,2% (Phytagel/Gelrite).Selanjutnya, pH media dibuat 5,8 dengan menambahkan1 N NaOH atau 1 N HCl sebelum diotoklaf padasuhu 121 o C selama 15 menit. Biakan diinkubasi padasuhu 25 + 2 o C di bawah cahaya neon 1.000-2.000 luxselama 16 jam.Dalam media induksi, eksplan embrio somatik akanmembentuk sel-sel embriogenik yang kemudian berkembangmembentuk fase globular (fase embriosomatik primer). Eksplan kemudian dipindahkan kedalam media pendewasaan untuk mengoptimalkanpembentukan embrio somatik sekunder. Embrio somatikyang telah membentuk kotiledon dipindahkan kedalam media perkecambahan untuk pembentukanplantlet. Kondisi penyimpanan biakan pada semuatahap perlakuan adalah sama.

Embriogenesis somatik langsung pada tanaman cendana 3Setelah plantlet cukup kuat untuk dipindahkan,dilakukan aklimatisasi di kamar kaca. Media tanamyang digunakan berupa campuran tanah dan pupukkandang atau kasting (1:1) dalam pot plastik. Di sampingitu, pada pot tersebut disediakan bibit tanamancabai yang diharapkan berfungsi sebagai tanamaninang.Pengamatan dilakukan terhadap persentase eksplanmembentuk embrio primer, persentase embrio primermembentuk embrio somatik sekunder, jumlah embriosomatik yang berkecambah, dan persentase plantlet/tanaman yang tumbuh. Data dianalisis menggunakanuji Duncan pada p < 0,05.HASIL DAN PEMBAHASANBahan tanaman (buah) yang digunakan sebagaieksplan berasal dari Yogyakarta untuk buah masak(mature) dan dari NTT untuk buah masak dan muda(immature). Embrio zigotik dari kedua tingkat kemasakanbuah tersebut diisolasi dan ditanam padamedia perlakuan untuk induksi embrio somatik. Hasilpengamatan menunjukkan bahwa setelah berumur 8minggu, eksplan yang berasal dari Yogyakarta tidakmenunjukkan adanya pertumbuhan pada semua mediaperlakuan yang dicobakan. Hal ini diduga karenabahan tanaman (biji) sudah tidak mempunyai viabilitaslagi akibat disimpan terlalu lama. Eksplan dari buahyang berasal dari NTT memberikan respons yangberbeda dalam membentuk embrio somatik pada beberapaperlakuan media yang diberikan.Secara umum, media dasar MS yang diperkaya denganBAP menunjukkan respons yang lebih baik dalammembentuk embrio somatik dibandingkan dengan MS+ thidiazuron, baik untuk eksplan embrio muda maupunembrio dewasa. Persentase pembentukan embriosomatik dari eksplan embrio zigotik muda pada mediaMS + BAP 2 mg/l menunjukkan nilai tertinggi (71,4%),sedangkan untuk eksplan embrio zigotik dewasa, nilaitertinggi (63,6%) diperoleh pada media MS + BAP1 mg/l (Tabel 1).Keberhasilan pembentukan embrio somatik sekunderdari embrio zigotik dewasa dengan perlakuan MS+ IAA 0; 0,5; dan 1 mg/l tidak menunjukkan perbedaanyang nyata (Tabel 2). Namun demikian, media MStanpa IAA menunjukkan persentase keberhasilanpaling tinggi (87,5%) diikuti MS + IAA 0,5 mg/l sebesar73%. Pada embrio somatik muda, keberhasilanregenerasi eksplan membentuk embrio somatik sekunderpada media MS + IAA 1 mg/l hanya 15% dantidak berbeda nyata dengan MS + IAA 0,5 mg/l sekitarTabel 1. Pengaruh zat pengatur tumbuh dalam mediadasar MS terhadap pembentukan embrio somatik darieksplan embrio zigotik muda dan dewasa pada cendanasetelah 8 minggu.Table 1. Effect of plant growth regulators in MS basal mediumon somatic embryo formation from mature and immaturezygotic embryo explant of sandalwood after 8 weeks.Zat pengatur tumbuh Persentase embrio somatikPlant growth regulator Percentage of somatic embryo(mg/l) Dewasa/Mature Muda/ImmatureMS + BAP 0,5 33,3a 46,1aMS + BAP 1 63,6a 53,8aMS + BAP 2 23,1a 71,4aMS + thidiazuron 0,5 16,7a 15,0bMS + thidiazuron 1 18,7a 14,8bMS + thidiazuron 2 33,3a 18,7bKeterangan/Notes:Angka pada satu kolom yang diikuti oleh huruf yang samatidak berbeda nyata pada taraf 5% uji Duncan.Numbers at each column followed by the same letter are notsignificantly different at 5% Duncan test.Tabel 2. Pengaruh media terhadap persentase embrio primeryang membentuk embrio sekunder dari eksplan embriozigotik muda dan dewasa cendana umur 7 minggu.Table 2. Effect of media on percentage of primary embryos toform secondary embryos from mature and immature zygoticembryo explant of sandalwood after 7 weeks.MediaMediaPersentase embrio somatikPercentage of somatic embryoDewasa/MatureMuda/ImmatureMS (kontrol) 87,5a 71,25aMS + IAA 0,5 mg/l 73a 43,25abMS + IAA 1 mg/l 52a 15bKeterangan/Notes:Angka pada satu kolom yang diikuti oleh huruf yang samatidak berbeda nyata pada taraf 5% uji Duncan.Numbers at each column followed by the same letters are notsignificantly different at 5% Duncan test.43,25%. Persentase embrio somatik sekunder tertinggi(71,25%) diperoleh dari media MS tanpa penambahanIAA.Media MS tanpa zat pengatur tumbuh IAA tampaknyaselalu memberikan hasil yang lebih tinggi, baikuntuk embrio zigotik muda maupun dewasa. Embriozigotik terdiri atas jaringan yang sangat muda danbersifat embrionik sehingga tanpa zat pengaturtumbuh pun tetap dapat beregenerasi. Kandungangaram-garam anorganik yang tinggi dalam media MSserta adanya vitamin dan sukrosa cukup memadaiuntuk mendukung proses pembentukan dan perkembangansel-sel somatik dari embrio zigotik menjadi

6 Deden SukmadjajaGambar 3. Pertumbuhan biakan cendana pada media induksiperakaran.Fig. 3. Growth of sandalwood culture on root induction media.persentase embrio somatik sekunder yang dihasilkanrelatif sama antara embrio zigotik muda dan dewasa.Pada media perkecambahan, embrio somatik yangpaling banyak bermultiplikasi membentuk tunasterdapat pada media MS1/2 + GA 30,5 mg/l. Umumnyamedia MS yang diencerkan setengahnya menghasilkanjumlah tunas yang lebih tinggi dibandingkanmedia MS penuh untuk setiap penambahan GA 3.Media MS + GA 30,5 dan 1 mg/l menghasilkan tunasabnormal paling tinggi, yaitu masing-masing 33,3%dan 25%. Induksi perakaran belum memberikan hasilyang memuaskan, meskipun akar dapat terbentuk padamedia MS + IBA 5 mg/l dengan jumlah yang masihsedikit.UCAPAN TERIMA KASIHPenulis mengucapkan terima kasih kepada DirekturSEAMEO-BIOTROP yang telah memberikan dukungandana terhadap penelitian ini melalui Bagian ProyekPengembangan Biologi Tropika Indonesia Bogor TA2003.DAFTAR PUSTAKAAnil, V.S. and K.S. Rao. 2000. Calcium-mediated signaling duringsandalwood somatic embryogenesis. Role for exogenouscalcium as second messenger. Plant Physiol. 123: 1301-1312.Attree, S.M., S. Budimirand, and L.C. Fawke. 1990. Somaticembryogenesis and plantlet regeneration from cultured shootsand cotyledons of seedlings from stored seeds of black andwhite spruce (Picea mavina and P. glauca). Can. J. Bot. 68:30-34.Becwor, M.R., T.L. Noland, and S.R. Wann. 1987. Somatic embryodevelopment and regeneration from embryogenic Norwayspruce callus. Tappi J. 70: 155-160.Das, S., S. Ray, S. Dey, and S. Dasgupta. 2001. Optimation ofsucrose, inorganic nitrogen and absisic acid levels for Santalumalbum L. somatic embryo production in suspension culture.Process Biochem. 37(1): 51-56.Husni, A., I. Mariska, dan M. Kosmiatin. 1997. Embriogenesis somatiktanaman lada liar. Makalah Seminar Mingguan Balai PenelitianBioteknologi Tanaman Pangan, Bogor, 5 September 1997.Hutami, S., I. Mariska, R. Purnamaningsih, M. Herman, D.Damayanti, and T.I. Utami. 2002. Regeneration of papaya(Carica papaya) through somatic embryogenesis. Proc. the 2 ndIndonesian Biotechnology Conference. Indonesian BiotechnologyConsortium, Jakarta.Kamil, H. and M.I.J. Umboh. 1990. Root induction of Santalumalbum by using IBA and NAA. Proc. The Symposium onBiotechnology for Forest Tree Improvement. Bogor, 21-23March 1990. Biotrop Special Publication No. 49.Lelu, M.A., K.K. Klimaszewska, C. Jones, C. Ward, P. VanAderkas, and P.J. Charest. 1993. A laboratory guide to somaticembryogenesis in spruce and larch. Information Report.Petawawa National Forestry Institute, Canada.Lelu, M.A., K.K. Klimaszewska, C. Jones, C. Ward, P. VanAderkas, and P.J. Charest. 1994. An improved method forsomatic plantlet production of hybrid larch (Lorix xLeptoeuropaea) Part 2 Control of germination and plantletdevelopment. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36: 117-127.Mariska, I. 1996. Embriogenesis somatik tanaman kehutanan.Prosiding Kursus Bioteknologi, 4-9 November 1996. BadanPengkajian dan Penerapan Teknologi. Serpong. 13 hlm.Mariska, I., S. Hutami, M. Kosmiatin, dan W.H. Adil. 2001a.Regenerasi massa sel embriogenik kedelai setelah diseleksipada kondisi Al berbeda dan pH rendah. Berita PuslitbangtanNo. 20: 1-3.Mariska, I., D. Sopandie, S. Hutami, E. Syamsudin, dan M.Kosmiatin. 2001b. Peningkatan ketahanan terhadap Al padatanaman kedelai melalui kultur in vitro. Laporan RisetUnggulan Terpadu VIII. Kantor Menristek dan LIPI, Jakarta.Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapidgrowth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant15: 473-497.Musakabe, H. 2000. Peluang dan kendala cendana dalamperekonomian Propinsi Nusa Tenggara Timur. Kumpulanmakalah Seminar Nasional Kajian terhadap TanamanCendana (Santalum album L.) sebagai Komoditi UtamaPerekonomian Propinsi Nusa Tenggara Timur (NTT) MenujuOtonomisasi. Pemda NTT dan LIPI, Jakarta. 26 Juni 2000.Rai, V.R. and J. McComb. 2002. Direct somatic embryogenesisfrom mature embryos of sandalwood. Plant Cell Tissue andOrgan Culture 69: 65-70.Rout, G.R., S. Samantaray, and P. Das. 1995. Somatic embryogenesisand plant regeneration from callus culture of Acaciacatechu a multipurpose leguminous tree. Plant Cell Tissue andOrgan Culture 42: 283-285.Tremblay, F.M. 1990. Somatic embryogenesis and plantletregeneration from embryos isolated from stored seeds of Piceaglauca. Can. J. Bot. 68: 236-242.Williams, E.G. and Maheswara. 1986. Somatic embryogenesisfactors influencing coordinated behaviour of cells as onembryogenic group. Ann. Bot. 57: 443-462.