esercitazione isolamento - AgrariaFree
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Esercitazione di microbiologia generale<br />
Isolamento
Per conoscere le le proprietà di specie di<br />
microrganismi che convivono nel medesimo<br />
ambiente dovremo riuscire a:<br />
1. 1. Letteralmente separarli fisicamente gli gli uni uni dagli dagli altri; altri;<br />
2. 2. Farli Farli crescere separati in in laboratorio<br />
in condizioni<br />
artificiali.<br />
Operazioni fondamentali dell’indagine microbiologica<br />
ISOLAMENTO E COLTIVAZIONE
Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula)<br />
dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule)<br />
con cui convive.<br />
Coltivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) su<br />
un substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine una<br />
popolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie.<br />
Coltura pura o axenica<br />
Coltura o popolazione cellulare derivante dalla moltiplicazione di una<br />
singola cellula microbica
TECNICHE DI SEMINA E<br />
ISOLAMENTO<br />
Presupposto fondamentale per lo studio e<br />
l’identificazione dei m.o., isolati dai vari materiali<br />
sottoposti all’esame microbiologico, è quello di<br />
disporre di una coltura pura<br />
Per coltura pura si intende<br />
l’insieme delle cellule che si<br />
ottengono dalla riproduzione di<br />
una sola cellula iniziale
TECNICHE DI ISOLAMENTO<br />
Per ottenere una coltura pura è quindi necessario :<br />
•diluire il campione iniziale per separare le cellule<br />
presenti (<strong>isolamento</strong>)<br />
•trasferire una singola colonia in un terreno sterile in<br />
modo da ottenere una popolazione di cellule identiche<br />
(coltura pura)
TECNICHE DI ISOLAMENTO<br />
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO<br />
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA<br />
ISOLAMENTO PER COLTURA<br />
MONOCITOGENETICA
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO<br />
• E’ necessario un terreno agarizzato su piastra Petri<br />
•Si depone sul terreno una piccola quantità del campione<br />
da analizzare (popolazione mista)<br />
•Con l’ansa si striscia il campione su tutta la piastra<br />
•Il sistema può variare in relazione al percorso da far<br />
seguire all’ansa sulla superficie dell’agar
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO 1
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO 2
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO<br />
Le cellule vengono rilasciate in maniera disuguale:<br />
• le « strisciate » iniziali rilasceranno molte cellule che daranno<br />
origine, dopo incubazione, ad una patina<br />
•Il progressivo esaurimento del carico dell’ansa determinerà<br />
alla fine la semina di poche cellule separate tra loro.
Terreni di coltura<br />
Tecniche di semina per <strong>isolamento</strong>
Semina per <strong>isolamento</strong>
Terreni di coltura<br />
Tecniche di semina per <strong>isolamento</strong>
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA<br />
•È necessario preparare una serie di provette<br />
contenenti acqua sterile, soluzione salina o terreno<br />
liquido<br />
•Il campione viene inoculato in modo tale che<br />
ciascuna provetta riceva una certa quantità della<br />
sospensione cellulare della provetta precedente<br />
•In questo modo ciascuna provetta rappresenta<br />
una determinata diluizione del campione iniziale
Campione<br />
iniziale<br />
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE<br />
SUCCESSIVA<br />
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml<br />
9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml<br />
Diluizione 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE<br />
SUCCESSIVA<br />
Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione<br />
viene depositata su terreno agarizzato già solidificato<br />
Con una bacchetta di vetro si spande il campione su<br />
tutta la piastra<br />
A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno<br />
separate le une dalle altre
ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO E<br />
PER DISSEMINAZIONE<br />
DILUIZIONI<br />
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4
SEMINA E ISOLAMENTO PER<br />
INCLUSIONE<br />
Piastramento per inclusione: un volume noto di coltura viene<br />
pipettato su una piastra Petri sterile, viene poi aggiunto il<br />
terreno agarizzato ancora fuso ma non troppo caldo (45-48 °C).<br />
Il terreno viene mescolato alla coltura. Viene utilizzato per lo<br />
sviluppo di mo anaerobi
ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO<br />
Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione<br />
viene depositata su terreno agarizzato già solidificato<br />
Con una bacchetta di vetro si spande il campione<br />
su tutta la piastra<br />
A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno<br />
separate le une dalle altre
Isolamento per coltura monocitogenetica<br />
Questo tipo di <strong>isolamento</strong> permette di poter catturare una<br />
cellula dalla piastra di coltura mediante l’utilizzo di un ago<br />
capillare. In questo modo si ha l’assoluta certezza di aver<br />
isolato una singola cellula<br />
micromanipolatore<br />
Capillare con il quale vengono<br />
posizionate le cellule<br />
sulla piastra (ingrandimento)<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
a b c d<br />
Posizionamento delle<br />
cellule su terreno completo.<br />
Le cellule sono posizionate<br />
a quattro a quattro. I numeri<br />
e le lettere indicano<br />
La posizione di ogni cellula
ID dei microrganismi<br />
Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2)<br />
Forma Rilievo<br />
puntiforme<br />
circolare<br />
filamentos<br />
a<br />
rizoide<br />
irregolare<br />
d < 1 mm<br />
irregolare, a filo<br />
intrecciato<br />
irregolare, ramificata<br />
effuso<br />
piatto<br />
sopraelevato<br />
convesso<br />
umbonato<br />
sottile, allungato
ID dei microrganismi<br />
Aspetto macroscopico delle colonie (2 di 2)<br />
Superficie Margine<br />
liscia<br />
rilevata<br />
radiata<br />
concentrica<br />
rugosa<br />
ondulata<br />
anelli concentrici<br />
raggrinzita<br />
intero<br />
ondulato<br />
eroso<br />
filamentoso<br />
arricciato
ID dei microrganismi<br />
Caratteristiche biochimiche<br />
– Capacità di utilizzare determinati substrati<br />
come unica fonte di carbonio<br />
– Presenza di particolari enzimi<br />
– Produzione di specifici prodotti metabolici<br />
terminali<br />
– Capacità di fermentare particolari zuccheri