Produzione di animali KO e transgenici come modelli di malattie

INGEGNERIA GENETICA NEGLI ANIMALI
Topi “knockout” e con sostituzioni geniche
E’ possibile introdurre in un gene mutazioni che ne inattivano la funzione. Il
gene può essere clonato e introdotto in cellule staminali embrionali (ES). Si
possono selezionare i ricombinanti sito-specifici ed eliminare quelli ectopici.
Sistema selettivo: uso di vettori di “targeting” contenenti il gene neoR che
conferisce resistenza ad un analogo della neomicina, il G418, oltre al gene
della tk del virus herpes, che conferisce sensibilità al Ganciclovir.
tk neoR
Esone 2 Esone 1
Gene clonato
Vettore

Vettore
tk neoR
+
Esone 2 Esone 1
Gene clonato
Esone 2
tk neoR
Vettore di targeting
Esone 1

1. Ricombinazione omologa
Il vettore di targeting contiene esoni del gene che interessa inattivare,
il gene per la resistenza alla neomicina (neoR) e il gene tk del virus herpes.
Per inserzione attraverso ricombinazione omologa, l’esone alterato del
vettore sostituisce quello normale del gene target e vi porta la resistenza
alla neomicina ma non il gene tk di Herpes. Le cellule saranno quindi resistenti
a G418 ed al Ganciclovir e sopravvivono in presenza di entrambi i farmaci.
Gene target
tk
neoR

2. Ricombinazione ectopica
Il vettore di targeting può inserirsi in una localizzazione ectopica. In questo
caso, la ricombinazione porta nel cromosoma cellulare anche il gene tk di Herpes,
che conferisce alle cellule la sensibilità al Ganciclovir. Queste cellule quindi
muoiono se piastrate in presenza di Ganciclovir e G418.
ex1
tk
ex2 neoR
ex3
ex1 ex2 ex3
tk
neoR

3. Nessuna ricombinazione
Se l’inserimento non ha luogo, le cellule
resteranno sensibili a G418, in quanto non
contengono il gene neoR. Quindi, utilizzando
il sistema selettivo costituito
da G418 + Ganciclovir, solo i ricombinanti
omologhi sono in grado di sopravvivere

Inserimento in animali
Per la produzione di animali knockout, il vettore di targeting viene utilizzato per
modificare cellule staminali embrionali (cellule ES) di topi agouti. agouti La selezione in
presenza di G418 e GCV permette di ottenere una popolazione di cellule eterozigoti per
il gene knocked out.
Queste cellule vengono iniettate in blastocisti precoci prelevate da topi neri (aa). Si
sviluppano topi chimerici, costituiti da cellule AAMm e da cellule aaMM, caratterizzati
dal mantello bicolore. Questo chimerismo può coinvolgere anche i gametociti e
determinare la formazione di gameti che portano la mutazione. L’incrocio con una
femmina nera e normale per il gene che interessa permette di ottenere figli dal
fenotipo agouti che portano la mutazione allo stato eterozigote.
Scegliendo da questa progenie un maschio ed una femmina eterozigoti per
la mutazione ci si aspetta di ottenere ¼ dei figli omozigoti mm.

M M
Cellule ES
Ricombinazione
omologa
M m
Femmina agouti (AAMM)
(donatrice di ES)
Iniezione delle cellule ES
nella blastocisti precoce
Femmina nera (aaMM)
(donatrice di BC)
Blastocisti
precoce
Madre vicaria
Topo chimerico AAMm/aaMM

Topo chimerico AAMm/aaMM
Gameti: AM
Am
aM
x
Figli: AaMM
AaMm
aaMM
Femmina nera (aaMM)
Gameti: aM
Eterozigoti per l’allele
“knocked out”
AaMm
x ¼ dei figli avranno il gene m allo stato omozigote
AaMm