La mappatura genica - Agraria

La mappatura genica
nel miglioramento genetico delle specie agrarie

Mappa genetica o di associazione
“è basata sull’individuazione degli eventi di
ricombinazione che si realizzano all’interno di
a m p i e f a m i g l i e m e d i a n t e l o s t u d i o
dell’ereditabilità di marcatori genetici”

I MARCATORI GENETICI
m1
m2
m1
m2
m3 m3
Sono porzioni di DNA spesso:
- non codificanti
- distribuiti uniformemente sul genoma
- ad eredità mendeliana semplice

Un marcatore genetico deve:
Marcatori genetici
- Definire delle classi discrete nei genotipi in esame (deve essere
codominante e quindi permettere il riconoscimento dei genotipi
omozigoti ed eterozigoti nella popolazione esaminata);
- Possedere un elevato grado di polimorfismo;
- Non essere influenzato da effetti pleiotropici o epistatici di altri loci;
- Non essere influenzato dall’ambiente;
- Non essere influenzato dallo stadio fenologico della pianta o del
tessuto in esame;
- Essere evidenziato in maniera costante ed univoca con metodi
semplici ed economici.

Marcatori genetici
- Morfologici (forma del fiore, colore del fiore, etc.)
- Biochimici (isoenzimi, proteine di riserva)
- Molecolari

Un marcatore molecolare è un locus genomico (rilevabile con
sonde o primer) che contraddistingue un tratto cromosomico
e le regioni che lo circondano
I marcatori molecolari non sono generalmente riferibili
all’attività di specifici geni, ma si basano sulla rilevazione di
differenze (= polimorfismi) nella sequenza nucleotidica del
DNA (dovute a inserzioni, delezioni, duplicazioni,
traslocazioni, ecc)
Marcatore molecolare

Caratteristiche favorevoli
• Non influenzati dall’ambiente
• Stabili
• Numerosi
• Polimorfici (sequenze non codificanti)
• Campioni di qualsiasi tessuto
• Analisi indipendenti da sesso ed età
• Facili da monitorare
• Analisi automatizzabili

Marcatori molecolari
I marcatori molecolari possono essere classificati
in due gruppi:
- Basati sull’ibridazione;
- Basati sulla reazione a catena del DNA.

RFLP
SSR
AFLP
Principali classi di marcatori molecolari utilizzati per
l’ottenimento di mappe genetiche
RAPD
Codominanti
Dominanti

DOPPIA
MARCATORI AFLP.
estrazione DNA
DIGESTIONE EcoRI e MseI
5’AATTCCAC TCGT 3’
3’GGTG AGCAT 5’
LIGAZIONE adattatore (ds) EcoRI 3’ CATCTGACGCATGGTTAA 5’
ADATTATORI adattatore (ds) MseI 5’TACTCAGGACTCTA 3’
5’AATTCCACN NTCGTTA 3’
3’TTAAGGTGN NAGCAAT 5’
PREAMPLIFICAZIONE primer EcoRI “+1” A
SELETTIVA primer MseI “+1” C
A
5’AATTCCACN NTCGTTA 3’
3’TTAAGGTGN NAGCAAT 5’
C
5’AATTCCACA GTCGGTTA 3’
3’TTAAGGTGT CAGCAAT 5’
AMPLIFICAZIONE primer EcoRI “+3” AAC
SELETTIVA primer MseI “+3” CAA
AAC
5’AATTCCACNNN NNNTCGGTTA 3’
3’TTAAGGTGNNN NNNAGCAAT 5’
AAC
5’AATTCCACAAC TTGTCGGTTA 3’
3’TTAAGGTGTTG AACAGCCAAT 5’

A
B
Marcatori RAPD.
Estrazione del DNA
A B
PCR Primer universali

Mappa genetica o di associazione
– Popolazione segregante
– Marcatori genetici
– Software utili per la costruzione di una mappa

Popolazione segreganti
• Megagametofiti di Gimnosperme
• Diaploidi (o doppi aploidi)
• Popolazioni derivate da reincrocio (BC: BackCross)
• Popolazioni F 2
• Linee inbred ricombinanti (RIL)
• Popolazioni derivate da linee parentali non fissate
(utilizzate per le specie perenni, auto-incompatibili e che
non sopportano la depressione da inbreeding)

Diaploidi o doppi aploidi
F 1
Gameti F 1
Colture in vitro delle antere e
rigenerazione di piante aploidi
Raddoppiamento cromosomico
e produzione di diaploidi
P 2
Genotipi
AA : aa
(1 : 1)

Popolazione derivate da reincrocio
AA aa
Parent 1 Parent 2
x
F 1
x
(Aa) (aa)
BC1F1 (Aa : aa)
1 : 1
x
BC2F1 (Aa : aa)
1 : 1
x
(aa)
BC 3 F 1 x
(aa)
BC 4 F 1 x
(aa)
(aa)
Genotipi
Aa : aa
(1 : 1)

Popolazione F 2
AA aa
Parent 1 Parent 2
x
F 1
(Aa)
F 2
(AA : Aa : aa)
1 : 2 : 1
Genotipi
AA : Aa : aa
(1 : 2 : 1)

AA aa
Parent 1 Parent 2
x
F 1
(Aa)
F 2
(AA : Aa : aa)
1 : 2 : 1
Linee inbred ricombinanti
F 3
F 4
F 5
F 6
x
x
x
x
Genotipi
AA : aa
(1 : 1)

Rilevamento del polimorfismo
Parent 1
Parent 2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.

Ottenimento della mappa
Software:
-Mapmaker 3.0 (Lander et al., 1980)
-JoinMap (Stam et al., 1993)
Analisi statistiche
* Analisi per singolo locus
* Test a due punti
* Test a tre punti
* Calcolo della distanza di mappa

Analisi per singolo locus
Tale analisi è un approccio statistico che permette di testare,
mediante il metodo del χ 2 o più frequentemente mediante il
“LOD score” , se la segregazione delle classi genotipiche è in
accordo con il rapporto di segregazione atteso nella
popolazione in esame
RILs F 2

RILs

F 2

Test a due punti
Il test a due punti permette di stimare le distanze tra tutti i
loci e di ottenere dei gruppi di associazione o “linkage”.

Test a tre punti
Il test a tre punti (ma anche test multipli) è utilizzato
per stabilire l’ordine dei loci all’interno di un gruppo di
associazione.

A B C
a b c
A B C
a b c
Gameti parentali e ricombinanti derivati da un incrocio a tre punti
A B C
a b c
A b c
a
B C
A B C
a b c
A B C
a b c
A B
a b
c A
C
A B C
a b c
Gameti parentali Singolo incrocio Singolo incrocio Doppio incrocio
Genotipo Osservato Tipi di gameti
ABC 390 Parentale
abc 374 Parentale
Abc 81 Singolo-crossover tra i geni A e B
aBC 85 Singolo-crossover tra i geni A e B
ABc 27 Singolo-crossover tra i geni B e C
abC 30 Singolo-crossover tra i geni B e C
AbC 5 Doppio-crossover
aBc 8 Doppio-crossover
Total 1000
a
b
B
C
c

Genotipo Osservato Tipi di gameti
ABC 390 Parentale
abc 374 Parentale
Abc 81 Singolo-crossover tra i geni A e B
aBC 85 Singolo-crossover tra i geni A e B
ABc 27 Singolo-crossover tra i geni B e C
abC 30 Singolo-crossover tra i geni B e C
AbC 5 Doppio-crossover
aBc 8 Doppio-crossover
Total 1000
Step 1: Determinare i genotipi parentali
Sono rappresentati dai genotipi più frequenti
ABC ; abc
Step 2: Determinare l’ordine dei geni
Utilizzando i genotipi ricombinanti

Genotipo Osservato Tipi di gameti
ABC 390 Parentale
abc 374 Parentale
Abc 81 Singolo-crossover tra i geni A e B
aBC 85 Singolo-crossover tra i geni A e B
ABc 27 Singolo-crossover tra i geni B e C
abC 30 Singolo-crossover tra i geni B e C
AbC 5 Doppio-crossover
aBc 8 Doppio-crossover
Total 1000
Step 3: Determinare la distanza tra i geni
dividendo il numero totale dei gameti ricombinanti per
il numero totale dei gameti
Distanza tra A - B : 100*[(81+85+5+8)/1000] = 17.9 cM
Distanza tra B - C : 100*[(27+30+5+8)/1000] = 7.0 cM
Step 4: Disegnare la mappa
A B C
17.9 cM 7.0 cM

Ordine dei geni

Calcolo della distanza di mappa
Il calcolo della distanza di mappa è realizzato mediante la
conversione della frequenza di ricombinazione (la
probabilità che un gamete parentale produca un gamete
ricombinante) unità di mappa (cM)
Tale conversione è realizzata mediante l’uso di una delle
funzioni riportate di seguito:
* Morgan
* Haldane
* Kosambi
Attraverso tali funzioni è possibile ottenere una distanza
attendibile tra i loci in esame.

Calcolo della distanza di mappa

Organismo Dimensioni Densità genica N° di geni % codificante
(pb) (kb/gene)
H. influenzae 1.8 x 10 6 1 1800 85
E. coli 4.6 x10 6
2 2300 84
Lieviti 12.1 x10 6
2 6000 70
C. elegans 100 x10 6
5 20000 50
A. thaliana 100 x10 6
5 20000 50
Uomo 3,000 x10 6 200 150000 10
Riso 400 x10 6
5 >30000 40
Mais 2,500 x10 6
30 >30000 10
Frumento 16,000 x10 6
200 >30000 10

Mappa genetica di frumento duro

Mappa genetica di pomodoro

Mappatura di un gene di resistenza ad oidio in pomodoro
ol-2

Gruppo di associazione del locus OL-2
cM
4.33
0.7
0.4
0
0.2
0.5
E39/M37-290
E32/M47-174
E32/M50-174
E40/M56-100bp
Ol-2, E34/M61-270,
E42/M45-248bp
E41/M32-390bp
OPU3 1500
SCAU3 1500
E32/M53-280bp

Genome Location of QTL for SUB, BB, BPH, BL, ST, DT, AC, GC, GT and
Aroma
Chr.1 (117.3)
2.70
6.70
3.80
1.40
9.40
0.70
6.00
13.70
4.80
4.20
1.70
5.00
2.40
2.20
1.70
4.50
0.00
0.80
8.20
0.00
2.80
7.10
1.90
3.20
1.70
2.80
8.00
9.90
G107
C161
RM84
RM1
R1944
RM272
G359
RM243
1.60
1.70
2.10
3.20
1.80
0.40
11.00
38.60
RM35
A331501
RM81A
R210
RM23
RZ744
RM24
R1928 20.00
A330402
RM9
RM5
C122 9.80
RM237
RM246A 2.60
OSR27 7.60
G393
RM212
RM319
6.80
0.80
C86
R2414
4.50
0.10
RM104 1.60
9.20
0.40
5.30
1.50
4.50
5.40
0.80
3.30
2.70
0.40
1.00
8.60
4.10
18.40
5.80
10.90
Chr.2 (196.5) Chr.3 (143.2) Chr.4 (111.7) Chr.5 (112.7) Chr.6 (114.5) Chr.7 (95.4) Chr.8 (102.6) Chr.9 (96.1) Chr.10 (107.9) Chr.11 (160.8) Chr.12 (103.2)
osr11
RM154
RM110
OSR14
RM233
RM211
RM279
RM53
RM29
RM341
RM262
C499
G45
RG157
RM106
XLRRb
RM266
XLRRc
28.10
8.50
0.60
1.10
8.60
5.70
18.90
1.40
12.50
11.30
10.50
4.10
A330101 8.30
RM263
RM221
RM6
RM240
C560-2 23.60
RM250A
C235B
RM213
RM166
RM208
RM48
G275
RM207
G1234
RZ531
RM218
(RM231)
OSR16
RM7
RM232
RM251
RM282
RM338
RM16
R250
RM168
RM55
RM293
RM227
2.00
0.00
7.30
9.20
0.70
0.60
0.00
7.00
8.20
18.70
14.60
0.80
A330106
RM156
5.00
17.10
15.70
4.80
R2373
R1854
RM335 13.90
A330602
RZ69
RM261 16.80
R288
A331202
A330103 4.90
RM185
1.00
3.70
7.50
RM246B
RM252
RM241
RM317
OSR15
RM131
RM280
5.30
8.20
2.50
7.20
2.50
5.30
1.50
2.90
0.60
8.50
4.60
3.70
2.80
9.30
R3166
RM289b
C515B
G54
R372
36.00
R566
RM249
RM289a 12.10
4.60
3.40
R2289
RM164
8.00
0.50
3.40
R1553
RM173
RM233B
RM233D
RZ70
9.60
0.00
7.70
C1018 7.60
RM26
RM334
RM31
GN188
2.00
0.00
0.70
1.90
9.00
C1230 8.00
A330102
G342
RM170
RM190
osr19
RM204
RM225
RM217
RM253
RM111
R2147
RM136
R2171
A331203
RG64
C235A
RM3
RM238
20.20
6.80
1.90
7.50
1.70
2.30
5.00
4.00
16.00
27.80
0.80
1.40
C1057
RM125
RM214
RM2
OSR22
RM11
C451
OSR4
RM10
RM234
5.70
4.60
6.80
1.40
6.20
2.10
3.70
6.40
8.90
5.70
2.90
2.30
13.70
1.80
4.00
1.70
4.70
RM172
C213
17.60
RM248
2.40
OSR35
RM250B
RM337
RM152
OSR30
RM310
RM25
RM72
RM126
RM44
RM342
RM223
RM42
RM210
RM256
OSR7
RM80
RM230
19.40
4.80
3.40
0.00
0.00
0.70
0.80
0.00
0.60
0.00
0.00
0.00
0.80
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
1.10
1.00
0.00
0.00
0.70
0.00
0.80
7.30
1.60
2.90
2.30
0.80
0.00
4.50
2.20
9.00
2.60
1.00
0.00
8.00
1.90
1.10
2.10
1.30
2.50
3.10
4.00
0.80
0.60
2.40
RM285
3.30
7.80
6.70
RZ927 2.10
R1709A
9.40
OPA02
R2285E 1.90
R2285A 1.80
G36 0.40
RG757 0.00
RM41 2.30
S10709 4.80
b 9.70
g 0.00
RasE 3.10
RasD 0.90
R1164 1.00
SSCPnew 0.60
TRG1 13.40
aa 8.60
x 2.60
RB0783
YAC30L
A331106
v 27.50
ad
ag
RZ698
u
RM219
C1454
RG553
OPA03
G103
RZ206
R79
C397
RM105
RM257
RM278
RM242
A330304
C356
OSR29
OSR28
RG662
RM201
RM215
RG451
RM245
OSR12
RZ404
RM205
RM222
RM216
4.50
RM184c
18.90
R1629
A331508
R2174
XLRRd
RG257 24.70
S2-AS3c
RM239
S-AS2d
0.20
RM271
6.90
RG561
R1877
1.20
RM269 2.70
OSR33 0.50
RM258
4.30
RM171 0.90
RM228 1.50
RM147
1.50
S2-AS3a 1.70
6.40
0.00
3.60
5.10
9.90
1.60
9.30
G127 7.10
Integrated map from 3 populations (172 RILs “FR13AxCT6241”, 74 DHLs “IR49830xCT6241” and 188 F2 “Joa Hom Nin x KDML105”
Submergence tolerance (SubQTL)
Bacterial leaf blight resistance (BlbQTL)
Brown planthopper resistance (BphQTL)
Leaf and nect blast resistance (PiQTL)
Salt tolerance (SalTolQTL)
Drought tolerance (DtQTL)
Amylose content (Wx)
Gel consistency (GcQTL)
Gelatinization temperature (GtQTL)
Aroma
R1963
RM264
7.10
0.00
1.50
6.80
1.20
2.40
29.30
RM286
Ferritin
C950
R1506
G181B
RM224
RM139
RM144
XLRRa
2.50
3.90
7.50
0.00
6.60
1.10
RM332 5.90
2.50
2.30
0.70
1.00
1.70
0.70
RM120 10.80
RM209
9.20
OSR1
C3 4.90
ADH2 2.30
RM202 1.60
RM287 0.00
RM4A 7.70
RM4B 1.40
RM20B 11.70
RM229
RM21
G24 8.70
R77A
1.50
PB7-8
0.00
RM206
C50A
1.10
1.90
osr6
4.00
RM254
RM20A
RM4
R77B
RM247
RG574
R642
G317
RM19
OSR32
C1336
G24B
R2672
RM179
A331210
C449
RM309
G2140
A330603
CAGACT
RG457
RM270
R1709B
G148
RM235
RG181
C901
RM17
RM12
A330604