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Quad. Mus. St. Nat. Livorno, 20: 21-26 (2007)
Il contributo dell’a-DNA nello studio delle popolazioni
antiche: il caso lucchese
ALESSANDRO MANFREDINI 1 , DAVID CARAMELLI 2 , FRANCESCO MALLEGNI 1
RIASSUNTO: Le origini delle popolazioni italiche antiche sono poco chiare, in generale c’è accordo sul ritenere
che la loro cultura si è sviluppata a livello locale. Al momento, in questo scenario, le relazioni migrazionali ed
evolutive della popolazione Lucchese antica sono solo parzialmente conosciute. Con questo contributo intendiamo
estendere lo studio determinando sequenze di DNA mitocondriale in cloni multipli derivati da reperti ossei
appartenuti a genti lucchesi vissute nel periodo compreso tra la preistoria ed il Tardo Medioevo.
Parole chiave: Dna antico, DNA mitocondriale, popolazioni umane antiche.
SUMMARY: The origins of the ancient italic population are unclear, in general there is agreement that their culture developed
locally. At the moment, in this scenario the Lucchesi’ evolutionary and migrational relationschips are partially unknow. In
this paper we intended to extend the study determing mitochondrial DNA sequences in multiple clones derived from bone
samples of Lucchesi inhabitans who lived between the pre history period and late antiquity.
Key words: Ancient Dna, Mitochondrial DNA, ancient human populations.
Introduzione
Il nuovo approccio metodologico sperimentale
adottato dagli antropologi molecolari si
incontra e si scontra con il linguaggio dell’antropologia
fi sica e dell’archeologia fi no a scivolare
nell’affascinante campo dello studio dell’evoluzione
umana. Sin dagli albori dell’antropologia
molecolare, termine coniato nel 1962 da Emile
Zuckerkandl, il problema è stato quello di cercare
di conciliare la storia registrata nelle molecole
con quella raccontata dalle testimonianze fossili
e archeologiche. L’empirismo paleoantropologico
e il metodo sperimentale dell’antropologia molecolare
non sono altro che due orizzonti scientifi ci
il cui fi ne ultimo è la ricostruzione della storia
naturale dell’uomo; ragione per cui il dialogo
tra fossili e molecole non solo è possibile, ma
anche necessario. Le evidenze molecolari sono
21
una documentazione che vanno a riempire, per lo
meno parzialmente, le lacune delle testimonianze
fossili che purtroppo lasciano scoperte molte
tappe dell’evoluzione delle specie.
La ricostruzione storiografica dell’evento
evolutivo necessita quindi dell’integrazione di
tutte le informazioni fornite dalle diverse discipline.
Oggigiorno il recupero e lo studio del DNA
rinvenibile in reperti scheletrici e tessuti antichi
rappresenta la frontiera più avanzata negli studi
di antropologia molecolare.
Stato dell’arte
L’indagine del DNA antico ha contribuito a
comprendere alcuni passi della storia evolutiva
umana, particolarmente importante è stato il
risultato ottenuto dal confronto tra le sequenze
di mtDNA ottenute da reperti neandertaliani e
1. Unità di Antropologia, Dipartimento di Biologia – Università degli Studi di Pisa – 56126 Pisa,
Via Santa Maria, 53.
2. Laboratori di Antropologia, Dipartimento di Biologia Evoluzionistica – Università degli Studi di Firenze
Via del Proconsolo, 12 - 50122 Firenze.

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di Homo sapiens antichi. Ad oggi sembra infatti
che si possa escludere una diretta discendenza
della nostra specie dai neandertaliani (Krings
et al., 1997, Caramelli et al., 2003). L’analisi della
variabilità del mtDNA ha apportato un grande
contributo anche a livello popolazionistico, l’
analisi delle sequenze della regione non codifi -
cante D-loop ha permesso di ricostruire l’origine
e la storia demografi ca delle popolazioni umane
(Harpending et al., 1993) e, a livello più strettamente
regionale, ha permesso di acquisire notevoli
informazioni sulla fi logenesi e la struttura
genetica di popolazioni europee (Bertranpetit et
al., 1995 a, b; Sajantila et al., 1995; Francalacci et
al., 1996), africane (Vigilant et al., 1991), asiatiche
(Mountain et al., 1995) e americane (Santos et al.,
1994). Il pensiero comune sulla diversità genomica
intra e infra popolazioni moderne è che
essa sia il frutto dei cambiamenti demografi ci e
delle pressioni evolutive che hanno interessato
i loro antenati pre e proto-storici (Cavalli Sforza
1994, Von Haeseler et al.,1995; Richards et al.,
2000; Torroni et al., 2001; Underhill et al., 2001). Si
ipotizza, infatti, che gli eventi responsabili della
variabilità genetica complessiva di una nazione,
come ad esempio l’Italia, siano da ricercare in
tempi molto remoti quando era bassa la densità
della popolazione (Piazza et al., 1988). Oggigiorno
questa assunzione non è stata ancora del tutto
verifi cata, perché non esistono dati suffi cienti
sulle popolazioni antiche. Uno studio su larga
scala sul mtDNA antico dimostra come un drastico
cambiamento nel pool genico mitocondriale
possa richiedere anche solo pochi secoli (Wang et
al., 2000). Dati recenti sulla popolazione Etrusca
mostrano come sia riscontrabile una discontinuità
genetica tra queste e le attuali popolazioni
che abitano la medesima area (Vernesi et al., 2004,
Belle et al., 2006), contrariamente invece alla continuità
che sussiste tra la popolazione Picena e
le attuali popolazioni centro Italiche (Cappellini,
2003). Sempre studi recentissimi sulla popolazione
paleoveneta ipotizzano una continuità
genealogica con i veneti moderni (Manfredini,
2007) mentre i risultati ottenuti da un primo studio
sulla popolazione lucchese, peraltro basato
su un numero di sequenze esiguo e distribuite
lungo la scala temporale che va dalla preistoria
al tardo medioevo, non fanno intravedere una
continuità genetica tra gli antichi e moderni lucchesi
(Conzato, 2007). Considerato lo stato attuale
Manfredini, Caramelli, Mallegni
degli studi risulta necessario raccogliere ulteriori
dati sulle popolazioni antiche, e paragonare gli
individui moderni ed antichi in varie località e
in tempi differenti al fi ne di condurre uno studio
genetico diacronico e sincronico.
La possibilità di implementare gli studi sul
DNA antico appartenente alle genti dell’area lucchese
contribuirà a ricomporre parte del grande
puzzle della storia del popolamento italiano, ma
prima di tutto vuol essere uno strumento che
aiuti a far chiarezza sulla storia locale e in particolare
sulle dinamiche dei cambiamenti avvenuti
in tempi proto storici e storici, considerato anche
che sino alla costituzione di Lucca in colonia
latina (180 a.C.) sono poche le testimonianze a
disposizione dell’antropologia. Lo studio delle
ossa rinvenute nei siti preistorici ha rilevato
una certa eterogeneità antropologica della regione,
ma le interpretazioni sono varie poiché i
reperti ossei provengono da stazioni di cui non
si conosce la corretta successione cronologica,
per cui non c’è la possibilità di cogliere possibili
cambiamenti di popolazione o di sapere se e
quando si sono avute infi ltrazioni di nuovi tipi
umani (Mallegni, 1985). Le osservazioni scaturite
dallo studio osteologico sono un buon substrato
per presupporre che anche a livello molecolare
vi siano delle variazioni, visto che cambiamenti
fenotipici sono la risultante di cambiamenti del
genotipo. Interessante, potrebbe essere la ricerca
di una continuità o discontinuità genetica tra le
passate e l’attuale popolazione del territorio,
nella consapevolezza che ricostruire la storia di
una popolazione solo su base molecolare non
è sufficiente e che l’approccio migliore resta
sempre quello dell’indagine interdisciplinare e
diacronica.
Scopo del lavoro
Sfruttando le potenzialità del mtDNA (DNA
mitocondriale) si proverà a tessere la storia molecolare
umana in un’area geografi ca ristretta,
un’indagine di micro-evoluzione cha abbraccia
un arco temporale che si estende dalla Preistoria
alla fi ne del Medioevo. L’area prescelta è quella
di Lucca e delle zone limitrofe, una scelta mirata
poiché, a differenza di altre zone della Toscana
come la parte meridionale molto conservativa
(Francalacci et al., 1996), ha la peculiarità d’essere
contraddistinta da una rete viaria che la mise in

contatto con il Nord, con il centro Italia e con la
regione costiera; si sarebbero favoriti, presumibilmente,
apporti genetici differenziati. Interrogando
le molecole si cercherà di comprendere le vicende
del popolamento di quest’area assumendo
come variabile il fattore tempo; si farà il confronto
tra le sequenze mitocondriali delle popolazioni
che transitarono e/o stazionarono nell’area
lucchese e quelle moderne; queste ultime sono
il risultato del mescolamento di individui con
caratteristiche omogenee, o anche molto diverse,
tra loro. L’utilizzo delle molecole come un fi lo
d’Arianna lungo la scala temporale per ricostruire
le vie di migrazione vuol essere non solo un
ulteriore contributo alla ricostruzione della storia
antropologica dell’area lucchese, ma anche una
sorta di studio pilota per le ricerche diacroniche
complete in aree geografi che circoscritte.
Il confronto tra popolazioni aiuterà a capire
se esiste una continuità genealogica tra i lucchesi
di oggi e la popolazione del passato oggetto
d’indagine, a delineare un andamento diacronico
della variabilità genetica per la ricostruzione dei
fenomeni sia di drift genico, sia di tipo migratorio
che eventualmente abbiano interessato il territorio
lucchese e le altre zone limitrofe.
Materiali e metodi
Il materiale genetico antico può essere recuperato
da numerosi tipi di materiale biologico, quali
resti mummifi cati, coproliti, preparati istologici
e ossa. Quest’ultime insieme alle radici dentarie
sono la fonte del DNA antico ‘lucchese’ recuperato
per questo studio. Il materiale, al momento
già campionato per quest’indagine, è attribuibile
a 34 individui distribuiti lungo la scala temporale
che va dalla preistoria all’alto medioevo. I
reperti scheletrici preistorici provengono dallo
scavo archeologico della necropoli del Frizzone
nel comune di Lucca e sono nel complesso
attribuibili a genti vissute a cavallo tra il III e
II secolo a.C.. Il periodo tardo antico (II–IV sec.
d.C.) è rappresentato da campioni provenienti
da Palazzo Orsucci (LU), quello alto medioevale
(IX–X sec. d.C.) dalle sepolture rinvenute nella
chiesa di San Quirico (LU). Si prevede inoltre
di estendere il campionamento a 96 individui
risalenti al periodo tardo medioevale (XIII–XVII
sec. d.C.) rinvenuti nell’area cimiteriale dell’ex
Caserma Mazzini e a 36 sepolture emerse dallo
a-DNA nello studio delle popolazioni antiche
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scavo di San Ponziano ascrivibili ad un periodo
compreso tra il IV e XIV sec. d.C.
Nell’analisi del DNA antico gli ostacoli principali
contro cui ci si deve misurare costantemente
sono il basso numero di molecole endogene conservate
e il loro stato di degradazione dovuto alla
diagenesi e ai processi di demolizione spontanea
che si innescano alla morte cellulare, problemi in
parte risolti dall’utilizzo della reazione a catena
della polimerasi (pcr) capace di replicare selettivamente
un frammento di DNA e di aumentarne
il numero in modo esponenziale.
I comportamenti da assumere quando si manipola
DNA antico sono indicati nei ’Golden Criteria’
(Coper, Poinar, 2000), regole e precauzioni
da seguire per evitare contaminazioni durante
le fasi sperimentali. Prima di essere sottoposto
alle indagini biomolecolari il reperto osseo viene
pulito rimuovendo con carta abrasiva uno strato
superfi ciale di circa 1 mm, successivamente tutte
le superfi ci sono ortogonalmente irradiate per 45
minuti con raggi UV a 254 nanometri al fi ne di
eliminare e inattivare eventuale DNA eterologo;
il materiale viene polverizzato e conservato a
–20°C. Il grado di racemizzazione degli amminoacidi
è utile per valutare la degradazione
del DNA e quindi la bontà del campione che si
decide di portare avanti nelle fasi sperimentali.
L’estrazione del DNA con il metodo del fenolocloroformio
consente di solubilizzare i lipidi,
denaturare le proteine, inattivare gli enzimi e di
separare il DNA da vari componenti cellulari. Il
DNA viene poi concentrato tramite adsorbimento
su silice o resine ed infi ne purifi cato da tutti quei
composti che inibiscono la replicazione del DNA
mediante pcr (Caramelli, Lari, 2004).
Le regioni che compongono il DNA mitocondriale
hanno tassi di evoluzione diversi, il
segmento non codifi cante D-loop composto da
600 paia di basi di cui fan parte le regioni ipervariabili
HVR I e II, ha un tasso di divergenza
molto elevato. Le HVRs hanno un alto numero
di siti polimorfi ci e rilevano circa il 3% della variabilità
tra gli individui. La regione HVR I, su
cui si focalizza il presente studio, è il segmento
più informativo per confronti tra popolazioni
separatesi in tempi evolutivamente recenti visto
il grado di omologia con gli scimpanzé ed altri
mammiferi. Il tratto HVRI (360 paia di basi)
viene virtualmente diviso in tre frammenti che
si sovrappongono parzialmente poiché non è

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possibile amplifi care frammenti maggiori di 200
paia di basi. La moltiplicazione del numero di
tratti di DNA avviene tramite la pcr (polymerase
chain reaction), una replicazione in vitro che in
poche ore fornisce milioni di copie di sequenze
di DNA. I prodotti di pcr vengono controllati
mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio
e infi ne purifi cati dai dimeri di primers. Il prodotto
purifi cato viene duplicato in vivo con la
tecnica del clonaggio sfruttando il meccanismo
di replicazione del DNA all’interno di cellule
batteriche (Escherichia coli). Infine si procede
con il sequenziamento dei cloni utilizzando il
metodo della sequenza ciclica a terminazione
con fl uorescenza (BigDye terminator). Trattando
materiale degradato, in poca quantità, con la possibilità
che sia contaminato da DNA esogeno, la
strategia basata sull’amplifi cazione e il clonaggio
consente di poter discriminare la componente
antica da quelle inquinanti; sequenziando i cloni
si aumenta l‘attendibilità del risultato prendendo
come sequenza corretta quella più rappresentata.
Per i campioni di cui sarà possibile amplifi care
e clonare tutti e tre i tratti della regione HVRI
sarà ricostruita l’intera sequenza consenso di
360 paia di basi che verranno poi confrontate
tra loro e con la sequenza di riferimento CRS al
fi ne di evidenziare eventuali mutazioni rispetto
alla CRS stessa.
Inoltre si utilizzerà un nuovo programma di
simulazione, Serial SimCoal, per comprendere le
relazioni genealogiche fra la popolazione lucchese
antica e i lucchesi moderni. In questo modo,
tramite simulazioni di coalescenza (informatiche)
di modelli genealogici che incorporano anche
le sequenze antiche, intendiamo indagare vari
scenari evolutivi che hanno potuto portare allo
sviluppo della attuale popolazione lucchese.
Considerazioni fi nali e prospettive
La questione dell’origine di un popolo non ha
mai una risposta semplice e univoca. Un popolo
è il risultato storico, in un dato momento, della
concomitanza di fattori diversi, non il prolungamento
di un’unica realtà precedente.
Basandoci su precedenti lavori, sia archeologici
che genetici, e sui nuovi dati che speriamo di
acquisire, si cercherà, utilizzando un programma
di simulazione di coalescenza che permette di
simulare scenari demografi ci complessi inclu-
Manfredini, Caramelli, Mallegni
dendo campioni antichi, un’eventuale continuità
genealogica (o discontinuità) fra la popolazione
lucchese nel periodo pre romano e quella attuale.
Attraverso la simulazione di vari scenari evolutivi,
diversi per taglia delle popolazioni, per il tasso
di crescita, si confronteranno statisticamente i
dati di diversità genetica osservata, con quelli
simulati. In questo modo sarà possibile escludere
alcuni scenari evolutivi, ed evidenziare gli
scenari più probabili.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la Fondazione
Cassa di Risparmio di Lucca per aver
incoraggiato e sostenuto economicamente sia
gli studi passati che il programma di Ricerca,
ad oggi ancora in corso, sulla Paleogenetica di
campioni biologici di diversa antichità del territorio
lucchese.
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Extended Abstract
The use of ancient DNA (aDNA) in the recostruction
of populations origins and evolution is nowadays
largely common. During the last years, paleogenetic
studies on preclassical Italy populations
have tried to reconstruct the genetic inheritance
of our peninsula. Through the partial analysis of
the mitochondrial hypervariable region (HVR-
I nucleotide positions 16024-16283) recovered
from individuals lived in the Province of Lucca
between the pre history period and late antiquity,
using a new program of Serial Coalescent Simulations,
appear the genetic discontinuity between
the ancient and modern Lucchesi populations. To
better understand the demographic processes in
this area, we will investigate other samples at the
aim to include more ancient sequences.