lezione emostasi 2 [modalità compatibilità] - Aulett@'99

Platelets
• Lifespan in peripheral
blood 7-10 days
• Range 150-400x 109 • Range 150-400x 10 /l

Numero piastrine circolanti
Contatori Automatici
Conta manuale al
microscopio
Valori normali: 150.000-400.000/mmc
Piastrinopenia < VN > Piastrinosi

METODI USATI PER IL CONTEGGIO
AUTOMATICO DELLE PIASTRINE
CITOFLUORIMETRICO
IMPEDENZOMETRICO
– ELETTRO OTTICO

Conta piastrinica
Conta Ottica PLTo Conta ad impedenza PLTi

Piastrine : Istogramma volumetrico
Metodo
impedenziometrico
PL = soglia inferiore, PU = soglia superiore,
PDW = platelet distribution width (larghezza della curva tagliata al 20%),
P-LCR = platelet –large cell ratio (percentuale di grandi piastrine).
MPC = Mean PLT Contenent (misura della concentrazione complessiva
dei componenti interni delle piastrine)

MPV
• Più alto negli uomini
• Correlazione inversa non lineare fra MPV e
N.ro PLT
• Aumenta in corso di: Diminuisce in
corso di:
Diabete mellito Leucemia Acuta
IMA An. Megaloblastica
Arteriopatie Periferiche
Malattie mieloproliferative
Pre-eclampsia
Splenectomia

PDW
• Indica l'anisocitosi piastrinica.
Aumenta in corso di:
• An. Megaloblastica
• An. Aplastica
• AREB (anemia refrattaria con eccesso di blasti)
• LMC
• In presenza di crioglobuline e
paraproteine

MPC
E' misura della concentrazione complessiva
dei componenti interni delle piastrine,
•
fornisce indicazioni su:
Morfologia, Attivazione, Screening.
Di conseguenza utile per:
• monitoraggio terapie antiaggreganti
• monitoraggio terapie antinfiammatorie

Classification of Platelet Disorders
•Quantitative Disorders
•Abnormal distribution
•Dilution effect
•Decreased production
•Increased destruction
•Qualitative Disorders
•Inherited disorders
(rare)
•Acquired disorders
– Medications
– Chronic renal failure
– Cardiopulmonary
bypass

Quantitative Abnormalities 1
• Thrombocytopenia - Decreased count
•

Quantitative abnormalities 2
• Thrombocytosis - Increased count
• > 450 x 10 9 /l
• Reactive eg infection inflammation
• Chronic bleeding
• Haematological malignancy

INTERFERENZA NELLA
CONTA PIASTRINICA
•Frammenti eritrocitari
•Frammenti di globuli bianchi
•Parassiti, batteri
•Ombre eritrocitarie
•Piastrine giganti
•Aggregati piastrinici
•Effetto da anticoagulante

Cause più comuni di conta piastrinica
erronea nel paziente ematologico
AGGREGATI PIASTRINICI
CAUSA FREQUENTE DI CONTA SOTTOSTIMATA
Sono epressione dell’agglutinazione piastrinica in vitro da parte di autoanticorpi
•IgG EDTA- e temperatura – dipendenti
•Crioagglutinine EDTA – dipendenti
•IgG EDTA- dipendenti e temperatura – indipendenti
Gli AUTOANTICORPI EDTA – DIPENDENTI
interagiscono con antigeni criptici della glicoproteina II b,
smascherati dalla chelazione del calcio da parte dell’EDTA

Qualitative defects
• Count may be normal/low/high
• May be no apparent abnormality on film
• May show changes eg size, appearance
etc
• Functionality is variably affected
• May be inherited or acquired

CAUSE PRINCIPALI DI TROMBOCITOPATIE
I. DIFETTI DI ADESIONE:
• Sindrome di Bernard-Soulier
• Malattia di Von Willebrand
II. DIFETTI DI AGGREGAZIONE:
Tromboastenia di Glanzmann
III. DIFETTI DI SECREZIONE:
• Difettiva attività di ciclo-ossigenasii (congenita; da assunzione di aspirina e altri FANS)
•Alterata biogenesi dei granuli (“storage pool defects”; sindrome di Chediack-Higashi)
IV. DIFETTI DOVUTI A FARMACI
(calcio antagonisti, anestetici, certi antibiotici)

PIASTRINOPATIE ACQUISITE
PORPORA / EMORRAGIE SENZA PIASTRINOPENIA
- FARMACI (ASPIRINA, FANS, ecc)
- INSUFFICIENZA RENALE CRONICA
- GAMMAPATIE MONOCLONALI

FUNZIONALITA’ PIASTRINICA
Tests di laboratorio
IN VIVO TEMPO DI EMORRAGIA
ANAMNESI
OSSERVAZIONE
CLINICA
IN VITRO AGGREGAZIONE PIASTRINICA
utile x monitoraggio terapie antiaggreganti

INDAGINI FUNZIONALI NELLE
PIASTRINOPATIE:
•Aggregometrtria
•Dosaggio VWF
•Espressione di proteine di superficie

Aggregometria ottica

Test di valutazione della
cascata coagulativa
plasmatica

Il plasma (addizionato di sodio citrato) viene ottenuto
per centrifugazione ed utilizzato per misurare il tempo
necessario alla formazione del coagulo di fibrina
quando al plasma del paziente si aggiungono reattivi
differenti per ciascun test.

Test
PT (%)
Rapporto Anticoagulante (0,5 ml) : sangue
1 : 9
(4,5 ml)
90
(12,7 sec.)
1 : 8
(4,0 ml)
83
(13,3 sec.)
1 : 7
(3,5 ml)
64
(15,7 sec.)
1 : 3
(1,5 ml)
5
(148,7 sec.)
PTT (sec.) 19,5 20,2 22,2 87,3
FIBRINOGENO (mg/dl) 358 340 304 208

Metodi di studio globali per il sistema
della coagulazione (I)
Il Tempo di Protrombina o Attività Protrombinica
(PT) e il Tempo di Tromboplastina Parziale
Attivato (aPTT) indagano rispettivamente la Via
Estrinseca (PT) e la Via Intrinseca (aPTT) e
ambedue indagano la Via comune della
coagulazione (FV, FX, FII e fibrinogeno).
Dosaggio del Fibrinogeno
Tempo di Trombina (TT)

Metodi di studio globali per il sistema della
coagulazione (II)
La contemporanea esecuzione di PT e aPTT
permettera’ di escludere o di confermare la
presenza di un’alterazione del sistema di
coagulazione e di orientare le successive indagini
verso l’identificazione di uno o più fattori della
coagulazione che potrebbero essere carenti.
Dosaggio del Fibrinogeno
L’esecuzione del TT risulta necessaria per
indagare il sistema della coagulazione in presenza
di fibrinogeno con concentrazione inferiore a 100
mg/dl.

Tempo di Protrombina (TP)
• Misurazione: tempo di formazione di un
coagulo di fibrina da plasma ricalcificato e
trattato con tromboplastina a 37°C.
Refertazione:
• % = TP controllo normale / TP paziente x 100
• RATIO = TP paziente/ TP controllo normale
• INR

Tempo di protrombina (PT)
Misurazione: tempo di formazione di un coagulo di fibrina da plasma ricalcificato
Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori VII, X, V, protrombina (II)
e fibrinogeno (I).
Monitoraggio della terapia anticoagulante orale con dicumarolici (INR)
I dicumarolici inibiscono l’attivita’ dei fattori VII, IX, X e della protrombina.
PT corto --> - privo di significato patologico
PT lungo --> - epatopatia.
- deficit vitamina K
- CID
- sindrome nefrotica
- farmaci

Poiché il PT viene comunemente utilizzato per il monitoraggio della
terapia anticoagulante orale, si è reso necessario individuare un
sistema di espressione che consentisse di interpretare il risultato
del PT in maniera univoca, minimizzando le differenze dovute alla
diversa sensibilità dei diversi reagenti commerciali utilizzati per
l’effettuazione di questo test:
INR =
International Normalized Ratio (INR)
( PT del paziente in secondi
PT del Pool di plasmi normali in sec
ISI = International Sensitivity Index
)
ISI

How Different Thromboplastins
Influence the PT Ratio and INR
Thromboplastin
reagent
A
B
C
D
E
Patient’s
PT
(Seconds)
16
18
21
24
38
Mean
Normal
(Seconds)
PTR ISI INR
12 1.3 3.2 2.6
12
13
11
14.5
1.5
1.6
2.2
2.6
2.4
2.0
1.2
1.0
2.6
2.6
2.6
2.6

PT si allunga per livelli di fattore
Fatt. VII < 50%
Fatt. V < 50%
Fatt. X < 50%
Fatt.II < 30%
Fibrinogeno < 100 mg/dL
Paraproteine
Policitemia
Prelievo difficile
Provetta non riempita correttamente
Contaminazione eparina
Cause di errore
Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore

Test COAGULATIVI (II)
aPTT - Tempo necessario alla formazione del
coagulo di fibrina quando il plasma viene
ricalcificato in presenza di sostituti del fattore
piastrinico 3 (cefalina) associati ad attivatori
della fase di contatto (ac.ellagico, silice
micronizzata, caolino)
⇒studia la via intrinseca e la via comune della
coagulazione.
⇒Misurato in secondi o come ratio

aPTT: espressione dei risultati
aPTT paziente
Ratio = ----------------------------------aPTT
plasma di controllo
Plasma di controllo
Plasma di controllo
• Plasma liofilo o pool di plasmi normali
• Media del range di riferimento
• Limite superiore del range di riferimento
• Mediana di 20 soggetti normali
• Valore basale

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE
ATTIVATO (aPTT)
Deficit congeniti o acquisiti dei fattori della via
intrinseca (VIII/IX/XI) o della fase di contatto
(XII)
Con minor sensibilita’del PT, indaga i deficit dei
fattori della via comune (X,V,della protrombina e
del fibrinogeno)
Monitoraggio della terapia con eparina standard
Presenza di Lupus Anticoagulant (LAC)

aPTT si allunga per livelli di fattore
VIII < 50%
XI < 50%
IX < 30%
XII < 30%
Fibrinogeno < 100 mg/dL
Livelli di eparina 0.15-0.2 U/mL
Policitemia
Prelievo difficile
Provetta non riempita correttamente
Contaminazione eparina
Cause di errore
Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore

TEMPO DI TROMBINA
TT - Tempo necessario alla formazione del
coagulo di fibrina quando il plasma viene
ricalcificato in presenza di concentrazioni
ottimali di trombina
⇒ studia la fibrino-formazione

IMPIEGO DEI TEST DI SCREENING NELL’ESPLORAZIONE
DELL’EMOSTASI
PT APTT TT IPOTESI
DIAGNOSTICA
Normale Allungato Normale Deficit di FXII,
FXI, FIX, FVIII
Allungato Normale Normale Deficit di FVII
Allungato Allungato Normale Deficit di
fibrinogeno,
protrombina, FV,
FX
Allungato Allungato Allungato Deficit di
fibrinogeno, FDP,
antitrombinici

Meccanismi di controllo della
coagulazione
Come tutti i sistemi che vanno incontro ad un
meccanismo di attivazione, anche il sistema della
coagulazione necessita di un sistema di controllo.
Tale sistema è rappresentato da proteine dotate di
attività inibitoria, fra le quali:
Antitrombina (AT)
Proteina C (PC)
Proteina S (PS)
Deficit di queste proteine rappresentano un fattore di
rischio per l’insorgenza della malattia trombotica

INIBITORI PLASMATICI DELLA COAGULAZIONE
ANTITROMBINA: serpina, serin protease inhibition, è
sintetizzata dal fegato ed è dotata di un effetto inibitore dei
fattori serin proteasici, FIIa, FXa, FIXa, FXIa, FXIIa.
Le eparine, tramite il loro legame con la AT sono in grado di
accelerare grandemente le reazioni di inibizione dell’AT sui
fattori.
COFATTORE EPARINICO II: in presenza di eparina ha azione
anti-trombinica non legata all’AT.
PROTEINA C: prodotta dal fegato, è K-dipendente. In
presenza di trombina, ioni Ca e trombomodulina, viene attivata.
L’APC inibisce il FVa ed il FVIIIa, stimola la fibrinolisi e
protegge l’attivatore tessutale del plasminogeno.
PROTEINA S: glicoproteina K-dipendente sintetizzata dal
fegato, dll’endotelio e dai megacariociti. Circa il 40% della PS
funge da cofattore della APC ed è in grado di degradare il FVa
e FVIIa

inibitore sede di sintesi target
AT-III fegato trombina, Xa
Proteina C fegato Va, VIIIa
Proteina S fegato proteina C

VALUTAZIONE DEGLI INIBITORI
FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE
• Metodi immunologici e funzionali
– Dosaggio ATIII
– Test di resistenza alla proteina C
• Variazione fisiologiche ( gravidanza)
• Influenze farmacologiche (es: estroprogestinici,
antivitamine k)
• Fattori genetici (trombofilia eredofamiliare)

Lo studio trombofilico:
•ESAMI DI I LIVELLO
•ESAMI DI II LIVELLO
•ESAMI DI III LIVELLO

ESAMI DI I LIVELLO:
•PT
•aPTT
•FIBRINOGENO
•AT
•TT

ESAMI DI II LIVELLO
•LAC
•PROTEINA C
•TEST DI RESISTENZA ALLA PC
ATTIVATA
•PROTEINA S

ESAMI DI III LIVELLO
•Test molecolare per
l’identificazione di mutazioni

HEREDITARY THROMBOTIC RISK FACTORS
Factor V Leiden mutation
Prothrombin 20210 mutation
Protein C deficiency
Protein S deficiency
Antithrombin deficiency

Real time PCR apparatus

Frequenze di due comuni polimorfismi di fattori della
coagulazione nella nostra popolazione di controllo
(Area metropolitana di Palermo)

La coagulazione Intravascolare
disseminata (CID)
Sequenza degli eventi:
• Attivazione incongrua della cascata
coagulativa
• Consumo massivo di fattori della
coagulazione
• Formazione di microtrombi e microemboli
• Sindrome emorragica

Coagulazione Intravascolare
Disseminata (CID)
1. all’emocromo avremo calo continuo delle
piastrine, anche nel giro di 30- 40 minuti!!
2. fibrinogeno ed ANTI TROMBINA III che si
consumano e si riducono velocemente;
3. dimostrazione di monomeri di fibrina;
4. Prodotti di degradazione del Fibrinogeno
5. D-Dimero
6. Tempo di Quick che si riduce;
7. PTT che aumenta
8. Riduzione dei fattori V = Trombina
9. Riduzione del fattore VIII

Meccanismi di attivazione dell’emostasi
La fibrinogenolisi (fDP (fDP)
I prodotti di degradazione del fibrinogeno
derivanti dall’azione della plasmina
Per azione della plasmina sul
fibrinogeno, si formano i prodotti di
degradazione X, Y, D ed E
(fibrinogenolisi).
Questi possiedono attività inibente
la trasformazione del fibrinogeno in
fibrina.
La loro presenza è indice di
iperfibrinolisi (es. CID)
Attivazione della
fibrinolisi
Plasmina
Fibrinogeno Fibrina s Fibrina I (coagulo)
fDP
X, Y, D, E

Meccanismi di attivazione dell’emostasi
I prodotti di degradazione della fibrina
derivanti dall’azione della plasmina
Per azione della plasmina sulla fibrina,
si formano diversi prodotti, fra i quali
il più importante è il D-Dimero.
La sua presenza segnala segnala depositi depositi di di
fibrina e quindi è indice di possibile
stato trombotico ed ischemico.
L’attività fibrinolitica evidenziata
tramite la determinazione del DD è un
fenomeno riscontrabile molto
precocemente, quando altri indici sono
ancora compensati.
E’ l’unico parametro che evidenzi la
formazione di fibrina.
La fibrinogenolisi (fDP)
Fibrinogeno Fibrina s
Attivazione della
fibrinolisi
Plasmina
Fibrina I
(coagulo)
fDP
(D-Dimero)

Reasons for elevated D-dimer
Fibrinogen Fibrin D-dimer
Increased fibrin formation
Increased fibrinolysis
Decreased clearance

Uso del D-Dimero nella diagnosi
della trombosi venosa profonda e
dell’embolia polmonare
I metodi per il dosaggio del D-Dimero hanno
un’elevata sensibilità ma bassa specificità e
vengono utilizzati per il loro ELEVATO
VALORE PREDITTIVO NEGATIVO.
Un valore elevato di D-Dimero non è
diagnostico per la trombosi venosa o
l’embolia polmonare, mentre un risultato
normale esclude il sospetto di tali patologie