TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE - Il Saturatore

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
Pancreas mRNA
proinsulina
Uso clinico
cDNA
proinsulina
Plasmide
ricombinante
Insulina Batterio
trasformato

Il DNA ricombinante: gli enzimi di restrizione
Si dicono nucleasi gli enzimi che idrolizzano un legame
fosfodiesterico di una molecola di DNA o RNA, generalmente
in corrispondenza di una sequenza specifica di nucleotidi.
Le nucleasi vengono distinte in nucleasi per RNA e quelle per
DNA.
Nell’ambito di quelle per il DNA, distinguiamo poi le
esonucleasi, che possono tagliare solo il nucleotide ad
un’estremità della molecola (ad esempio una 3’-5’
endonucleasi del veleno di serpenti), dalle endonucleasi, che
operano invece tagli all’interno di una doppia elica di DNA.

Distinguiamo tre tipi di endonucleasi per DNA:
• tipo I: riconoscono un sito e operano un taglio lontano da esso, in
una posizione variabile.
• tipo II: riconoscono un sito e operano un taglio al suo interno, in
una posizione specifica.
tipo III: presentano un diverso meccanismo di azione, ma hanno in
comune con le endonucleasi di tipo I la mancanza di specificità di
taglio.
La rottura in siti specifici della doppia elica di DNA è un sistema di
difesa di molti procarioti nei confronti di DNA estraneo che riesca
ad entrare nella cellula (ad esempio, il DNA di un fago). In questo
modo si contrasta l’infezione della cellula e se ne preserva
l’integrità del genoma.

Il sistema delle nucleasi non è specifico per un invasore
piuttosto che per un altro: si basa sulla probabilità che un lungo
tratto di DNA contenga la sequenza riconosciuta dal pool di
nucleasi della cellula. Tuttavia, il DNA di un procariota contiene
a sua volta migliaia di basi ed è possibile che il sito di
restrizione riconosciuto dalle sue nucleasi sia presente anche
nel suo genoma.
Com’è possibile che venga tagliato il DNA esogeno e non
quello endogeno?
Il sistema di difesa basato sulle endonucleasi è complementare
a un sistema di riconoscimento del DNA endogeno basato sulla
metilazione: in un dato organismo, è presente, per ogni enzima
di restrizione, una metiltransferasi in grado di metilare un
nucleotide sullo stesso sito riconosciuto dall’endonucleasi. I siti
così metilati sono protetti dall’azione delle endonucleasi.

Sono invece tagliati i tratti di DNA estraneo appena entrano nella
cellula.
Se un fago riesce comunque ad entrare e infettare la cellula
ospite, il genoma virale subisce lo stesso pattern di metilazione
del DNA cellulare, risultanto così refrattario alla digestione da
parte delle endonucleasi.
Se si duplica ed esce dalla cellula potrà facilmente infettare
batteri dello stesso tipo, dei quali può contrastare il sistema di
difesa, ma non organismi o ceppi che posseggano un sistema di
endonucleasi/metiltransferasi diverso.
Si dice quindi che il fago è ristretto ad un determinato ceppo, da
cui il nome “enzimi di restrizione” dato alle endonucleasi.
Nelle endonucleasi di tipo I e III la metiltransferasi è un dominio
della stessa proteina, mentre per quelle di tipo II l’attività è svolta
da una proteina diversa

In virtù della loro specificità di taglio, le endonucleasi di tipo II
sono quelle di gran lunga più interessanti per le applicazioni
biotecnologiche.
La maggior delle endonucleasi di tipo II riconosce sequenze
specifiche di 4, 5 o 6 nucleotidi. Caratteristica comune a questi
siti è il fatto di essere quasi tutti palindromici (o “a simmetria
binaria”).

La simmetria binaria del sito di riconoscimento è
giustificata dalla simmetria binaria dell’enzima stesso,
generalmente in forma dimerica: data la struttura della
doppia elica, nucleotidi su filamenti opposti distanziati di
circa 5 unità si trovano sullo stesso lato della doppia elica.

Vi sono due possibili tagli: quelli che lasciano estremità blunt
(taglio “pari” sui due filamenti) e quelli che lasciano estremità
sticky (con un numero di basi diverso sui due filamenti). I
nucleaotidi “sporgenti” prendono il nome di “overhangs”.
Ciascun enzima di restizione è caratterizzato:
1. Dal sito di restrizione riconosciuto
2. Dalla modalità di taglio (blunt, stiky)

Data la grande importanza biotecnologica delle endonucleasi
di tipo II, si è cercato di isolarne quante più possibile. Oggi ne
sono note migliaia, di cui diverse centinaia sono in
commercio. Il nome, per convenzione, deriva dall’organismo
dal quale è stato isolato.
Gli enzimi di restrizione che riconoscono un identico sito,
anche se non lo tagliano nella stessa posizione, sono detti
isoschizomeri.

DNA ricombinante
L’impiego in vitro di due classi di enzimi – gli enzimi di
restrizione e la ligasi – ha consentito di sviluppare la
tecnologia del DNA ricombinante. Due frammenti di DNA
duplex tagliati con il medesimo enzima di restrizione che dia
un taglio “sticky” avranno overhangs complementari che, in
opportune condizioni, tenderanno ad appaiarsi.

La ligasi, a spese dell’ATP, potrà formare due legami
fosfodiesterici. Una volta formato il legame covalente, il
DNA ricombinante è stabile. Si noti che si mantiene il sito di
restrizione, per cui i due frammenti uniti potranno sempre
essere separati per digestione con l’enzima di restrizione
corrispondente (in questo caso BamHI).
Se una delle due molecole tagliate è circolare (ad esempio
un plasmide), la reazione di “taglia e cuci” per
restrizione/ligazione porta, in due passaggi, un DNA
circolare.

La ligasi catalizza anche la formazione di due legami covalenti
tra due estremità blunt, tra le quali, ovviamente, non vi ci può
essere riconoscimento tra overhangs. Come prevedibile, la
reazione richiede condizione più drastiche e tempi più lunghi.
A meno che non sia stato usato la stessa endonucleasi per
rendere blunt i due frammenti, il sito di restrizione viene a
perdersi.
La ligazione di estremità blunt, per quanto meno efficiente, è
più generale, in quanto le estremità blunt possono essere
generate con enzimi di restrizione diversi, o addirittura
“smussando”, con enzimi specifici (polishing enzymes), le
estremità sticky. Il prodotto PCR di alcune DNA polimerasi è
blunt. Inoltre, grazie al fatto che il legame indipendentemente
dalla sequenza dei frammenti coinvolti, si possono legare corti
tratti di DNA duplex sintetici a qualsiasi estremità blunt di
frammenti ottenuti in altro modo.

Separazione di polinucleotidi
Per poter analizzare il DNA, è cruciale
disporre di metodi che consentano la
separazione di frammenti di diversa
lunghezza. Tutti i metodi di separazione
del DNA si basano sul principio
dell’elettroforesi: si applica un campo
elettrico alla miscela da risolvere, posta
in una matrice che fa da “setaccio
molecolare”.
Il DNA, a pH neutro, presenta caica
netta negativa, per cui tutti i frammenti
tenderanno a migrare verso il catodo.
La velocità di migrazione è funzione
della lunghezza del frammento. Alla fine
della corsa i frammenti di diversa
lunghezza si disporranno quindi in
bande discrete.
Per frammenti lunghi fino a 1000 bp si
impiega il gel di poliacrilamide (PAGE),
mentre per frammenti più grandi si usa
il più poroso gel di agarosio. Applicando
campi elettrici pulsati ai gel di agarosio
si possono separare interi cromosomi.
Il DNA non subisce danni durante la
migrazione, per cui lo si può facilmente
recuperare in forma pura tagliando la
banda corrispondente al frammento che
interessa (elettroforesi preparativa).

Le bande di DNA possono essere visualizzate in vari modi. Il
metodo aspecifico più usato consiste nel trattare il gel con
bromuro di etidio, una sostanza che diventa fluorescente solo
quando lega il DNA. Illuminando il gel con una radiazione di
opportuna lunghezza d’onda, si osserverà quindi luce di
fluorescenza in corrispondenza delle bande.
Si può far correre la miscela che si vuole risolvere parallelamente
a una miscela di markers, ovvero a frammenti di DNA di
lunghezza nota. Ciò consente di stimare la lunghezza delle
diverse bande.

Il blotting
Proprio perché porosi, i gel di agarosio non sono adatti a
mantenere a lungo le bande discrete di DNA: i frammenti, in
breve tempo, tendono a diffondere. In seguito alla
separazione su gel, è però possibile trasferire le bande di
DNA su un supporto di nitrocellulosa, sul quale viene
preservata la distribuzione dei frammenti ottenuta per
elettroforesi anche per tempi lunghi.
Si ottiene quindi una replica stabile del gel, che consente
l’applicazione di diverse tecniche di riconoscimento dei
frammenti.

Il Southern blotting
Il Southern blotting (dal nome dello scopritore), consente di
identificare il frammento di DNA nel quale si trovi la sequenza
complementare a una sonda sintetica marcata
radioattivamente.
Ad esempio, un intero genoma può essere digerito con
enzimi di restrizione e fatto migrare in gel di agarosio. Un
singolo frammento può essere individuato mediante southern
blotting.
Il blotting viene condotto in ambiente fortemente basico, in
modo che il DNA si denaturi e si separino i due filamenti che
lo costituiscono.
I filamenti così separati possono così ibridizzare (formazione
di un breve tratto di doppi elica) con una sequenza di DNA o
RNA (sintetica) marcata radioattivamente che sia
complementare. Un’autoradiografia consente di individuare la
banda che contiene il tratto complementare alla nostra
sonda.
5’ – GGGCCCTTTAAAATCGCA ATGTTAACGGGGCCCTTTAAAATC........TGTTTAAACCCGGGTTT TAA TTTAAACCCGGGTTT-3’
3’ – CCCCGGGAAATTTTAGCGATACAATTGCCCCGGGAAATTTTAG.......AC.AAATTTGGGCCCAAAATT AAATTTGGGCCCAAA 5’
5’ – GGGCCCTTTAAAATCGCA ATGTTAACGGGGCCCTTTAAAATC........TGTTTAAACCCGGGTTTTAATTTAAACCCGGGTTT -3’
3’ - TACAATTGCCCCGGGAAATTT
3’ - TACAATTGCCCCGGGAAATTT

La rilevazione di un frammento di DNA e le sue dimensioni
possono essere importanti per diversi scopi, ad esempio
la diagnosi di una malattia genetica.

PCR
La reazione di polimerizzazione a catena (polymerase
chain reaction, PCR) è una tecnica di amplificazione in
vitro di un tratto specifico di DNA.
Il materiale di partenza può essere una quantità minima di
DNA, generalmente il materiale genetico estratto da una
cultura cellulare, da un campione di tessuto, ecc.

In vivo:
L’enzima che catalizza l’aggiunta di un nucleotide alla catena
in formazione è la DNA polimerasi.
Esistono diverse DNA polimerasi, ma sono tutte accomunate
da una forma a “mano” grazie alla quale la proteina può
“avvolgere” il DNA.

La polimerizzazione dei nucleotidi avviene a partire dai loro
derivati trifosfato. La rottura del legame fosfoanidridico
fornisce l’energia per formare il legame fosfoesterico con
l’ossidrile in posizione 3’ del nucleotide successivo.
Il deossinucleotide aggiunto è, tra i 4 che costituiscono il
DNA, quello complementare al filamento stampo.

Le DNA polimerasi non possono iniziare la sintesi del
filamento complementare ex novo: non possono cioè partire
da un singolo filamento, possono solo allungare una doppia
elica, anche molto corta.
Interviene pertanto un enzima che riesce a partire da un
singolo filamento e sintetizzare un corto tratto di RNA (non
DNA) che formi una doppia elica con il filamento singolo.
Questo corto “innesco” per la DNA polimerasi è detto primer.
L’enzima primasi è una RNA polimerasi specializzata che si
unisce al complesso del pre-innesco e sintetizza un primer di
RNA complementare al frammento da duplicare.
Perché un frammento di RNA e non uno direttamente di DNA?
perché le RNA polimerasi, contrariamente alle DNA
polimerasi, possono partire da un filamento singolo e non
richiedono un primer. Evoluzionisticamente, non si è cioè
sviluppata una DNA polimerasi che possa partire da un singolo
filamento e si è quindi affermato questo sistema più
complesso, che richiede un ulteriore passaggio. Il corto tratto a
RNA sarà infatti eliminato in seguito da enzimi specifici.

I primers di RNA saranno poi rimossi e rimpiazzati dai
corrispondenti filamenti in DNA da una DNA polimerasi.
Segmenti adiaceti saranno poi legati covalentemente
dall’enzima ligasi

La DNA polimerasi richiede che la doppia elica di DNA
venga localmente aperta da parte di proteine specifiche.
Inizialmente, l’apertura della doppia elica interessa poche
centinaia di nucleotidi, che formano la bolla di replicazione. In
questa regione i filamenti singoli sono esposti e può essere
iniziata la duplicazione.
L’apertura della doppia elica a livello della forcella di
replicazione viene catalizzata da enzimi noti come elicasi.
I tratti a filamento singolo che si generano vengono protetti
da specifiche proteine (single strand DNA binding proteins o
SSB)

La forcella di replicazione in E. coli è quindi un sistema
complesso che vede la partecipazione di un elevato numero
di proteine

Nella PCR:
La PCR sfrutta la capacità della DNA polimerasi di
sintetizzare la catena complementare a un filamento
singolo di DNA in presenza dei 4 deossinucleotidi
trifosfato e di adeguati primer.
Rispetto al processo di trascrizione che avviene in vivo,
dove il distacco tra i due filamenti della doppia elica è
mediato da enzimi, nella PCR si sfrutta il fenomeno della
denaturazione termica. La doppia elica del DNA tende a
dissociarsi nei due filamenti costituenti ad una temperatura di
circa 95°C.
Essendo richiesta una fase ad alta temperatura, non è
possibile impiegare le DNA polimerasi degli organismi più
comuni, inattivate dal calore. La soluzione è utilizzare una
DNA-polimerasi termostabile, isolata da organismi che
normalmente vivono ad alte temperature (ad esempio
Thermus aquaticus, da cui Taq polimerasi, la prima ad
essere stata usata). La Taq polimerasi è attiva attorno a
72°C e resistente alla denaturazione fino ad oltre i 95°C.

La Taq polimerasi, come tutte le DNA polimerasi, necessita
di un tratto a doppia elica sul quale si possa innestare l’elica
complementare allo stampo.
Affinchè la polimerasi agisca, occorre quindi un primer (uno
per filamento), un corto segmento di DNA a singolo filamento
che si appai al DNA che si vuole amplificare formando un
breve tratto a doppia elica.
I primer, che ovviamente devono essere di sequenza nota e
complementare alla catena con cui li si vuole appaiare, sono
ottenuti per sintesi. Le tecnologie attuali consentono di
sintetizzare tratti di DNA di lunghezza fino a 100 nucleotidi
(molto più corti di un gene: per questo non si possono
sintetizzare direttamente i geni, anziché applicare la PCR).
Le sequenze corrispondenti ai primers sono l’unica parte del
DNA da amplificare che deve essere nota in partenza.
5’ – GGGCCCTTTAAAATCGCA ATGTTAACGGGGCCCTTTAAAATC........TGTTTAAACCCGGGTTT TAA TTTAAACCCGGGTTT-3’
3’ – CCCCGGGAAATTTTAGCGATACAATTGCCCCGGGAAATTTTAG.......AC.AAATTTGGGCCCAAAATT AAATTTGGGCCCAAA 5’
5’ – GGGCCCTTTAAAATCGCA ATGTTAACGGGGCCCTTTAAAATC........TGTTTAAACCCGGGTTTTAATTTAAACCCGGGTTT -3’
3’ - TACAATTGCCCCGGGAAATTT
TTTAAACCCGGGTTTTAA -3’
3’- CCCCGGGAAATTTTAGCGATACAATTGCCCCGGGAAATTTTAG........ ACAAATTTGGGCCCAAAATTTTTAAACCCGGGTTT - 5’

Nel complesso, nella miscela di reazione (generalmente
pochi µl di soluzione) occorreranno quindi:
• DNA da amplificare. Il tratto che interessa può in realtà
essere la minima parte di quello presente, spesso l’intero
genoma.
• La Taq polimerasi o uno dei diversi enzimi analoghi che
sono stati isolati e messi in commercio e i suoi cofattori (ioni
Mg 2+ ).
• I quattro deossinucleotidi trifosfato, che costituiscono il
substrato della DNA polimerasi anche in vivo.
• i 2 primer che si appaino agli estremi delle due catene
complementari nel tratto che si vuole amplificare. I primer
devono essere aggiunti in grande eccesso, affinchè siano
sufficienti per tutti i cicli.

La miscela di reazione può quindi essere incubata a 95°C per
denaturare il DNA (30 secondi o più). La si porta poi a circa 55°C
per favorire l’appaiamento delle catene singole con i primer e
infine a circa 72°C, la temperatura alla quale la Taq polimerasi è
più attiva. Gli steps di temperatura sono generati da uno
strumento detto thermocycler.
I tempi e le temperature per ognuno dei passaggi dipende in
realtà da una quantità di fattori: il tipo di polimerasi usata, la
lunghezza del segmento da amplificare, la natura dei primers, ecc.
Un ciclo tipo è il seguente:
circa 95°C
(temperatura di
denaturazione)
circa 55 °C
(temperatura di
annealing)
circa 72°C
(temperatura
ottimale per la
Taq)

L’operazione può essere
ripetuta per diverse volte.
Ciò consente anche alle
catene sintetizzate ad ogni
ciclo di fare da stampo in
quello successivo, dando
così un’amplificazione
esponenziale.
Considerando che parte
dell’enzima e dei
deossinucleotidi trifosfato
si degradano ad ogni ciclo,
il numero massimo di cicli
è limitato (generalmente

Si noti che, nei primi cicli, il prodotto è parzialmente
eterogeneo. Quando i primer si legano al materiale di
partenza o a prodotto di amplificazione che in tutti i cicli sia
stato ottenuto a partire dallo stesso primer tra i due presenti,
la polimerasi può continuare indefinitamente e la lunghezza
per più cicli di seguito con lo stesso primer tra i due presenti
della catena prodotta dipenderà prevalentemente dal tempo
che la polimerasi ha a disposizione per la sua reazione.
Se invece il primer si lega ad una catena derivante dalla
polimerizzazione con l’altro primer, il tratto amplificato finale
sarà quello delimitato dai due primer.
È estremamente improbabile che un segmento venga
amplificato. Dopo pochi cicli vengono quindi a prevalere i
segmenti “corti”, di lunghezza ben definita. Il prodotto finale è
pressochè puro.
Alla fine dei cicli, si lascia il DNA alla temperatura ottimale per
la sua rinaturazione, per cui i filamenti complementari,
presenti in ugual quantità, si appaiano dando luogo a doppie
eliche.
Si noti anche che, durante l’intervallo alla temperatura di
annealing, i filamenti di DNA potrebbero anche combinarsi
con i filamenti complementari pittosto che con i primers. I
primi ovviamente non potrebbero costituire uno stampo per la
DNA polimerasi. II numero di doppie eliche complete che si
formano durante l’annealing è tuttavia minimo, dato che i
primer vengono aggiunti in grande eccesso. Solo dopo alcuni
cicli i primer si esauriscono.

Le tecniche del DNA ricombinante e della PCR possono essere
integrate: I primer per la PCR devono essere complementari ai
due estremi del DNA che interessa, ma possono anche
contenere, a monte (posizione 3’) della regione complementare,
una corta sequenza che non lo sia. Tale sequenza viene
incorporata nel prodotto finale della PCR.
5’ – GGGCCCTTTAAAATCGCA ATGTTAACGGGGCCCTTTAAAATC........TGTTTAAACCCGGGTTT TAA TTTAAACCCGGGTTT-3’
3’ – CCCCGGGAAATTTTAGCGATACAATTGCCCCGGGAAATTTTAG.......AC.AAATTTGGGCCCAAAATT AAATTTGGGCCCAAA 5’
3’ - CTTAAG
PCR
5’ – GGGCCCTTTAAAATCGCA ATGTTAACGGGGCCCTTTAAAATC........TGTTTAAACCCGGGTTTTAATTTAAACCCGGGTTT -3’
TACAATTGCCCCGGGAAATTT
TTTAAACCCGGGTTTTAA
AAGCTT – 3’
3’- CCCCGGGAAATTTTAGCGATACAATTGCCCCGGGAAATTTTAG........ ACAAATTTGGGCCCAAAATTTTTAAACCCGGGTTT - 5’
In questo modo possono essere introdotti siti di restrizione,
che possono venire impiegati per unire il prodotto PCR a
altre molecole di DNA.

RT-PCR
La RT-PCR (reverse transcriptase PCR) consente di
trascrivere un filamento di RNA (generalmente mRNA) in DNA
e amplificarlo. Il DNA che si ottiene prende il nome di cDNA.
La RT-PCR ha due fondamentali applicazioni:
1. Quantificare il livello di trascrizione di un gene, per valutare
le risposte cellulari a particolari situazioni (nutrimenti, stress).
Al limite si può analizzare l’intero trascrittoma, ovvero
l’insieme dell’mRNA presente in un dato momento nella
cellula (e quindi, indirettamente, della quantità di proteina
espressa).
2. Un secondo motivo per voler amplificare dell’mRNA
anziché il gene da cui è stato trascritto si pone per gli
eucarioti: il gene eucariotico contiene generalmente introni,
che non verranno poi codificati. Il messaggio che verrà
tradotto nella proteina risiede quindi nel mRNA. I batteri non
sono in grado di operare lo splicing, per cui occorre fornire
loro il “codice” che è già stato processato dagli eucarioti,
ovvero l’mRNA maturo, trascritto in DNA mediante RT-PCR.

Non vi sono enzimi cellulari che consentano di amplificare il
mRNA (né avrebbero senso, dato il ruolo che ricopre l’RNA
nelle cellule). Si può però sfruttare l’enzima virale trascrittasi
inversa, utilizzata dai retrovirus nel primo passaggio di
integrazione del loro genoma a RNA in quello della cellula
ospite. La trascrizione inversa è quindi un processo che non
avviene normalmente negli organismi cellulari, né eucariotici
né procariotici. Si tratta di un meccanismo attraverso il quale
alcuni virus che presentano un genoma a RNA (retrovirus)
possono “trascriverlo” a DNA in modo che possa essere
integrato al genoma della cellula infettata.
Dopo l’ingresso del virus nella cellula, la trascrittasi inversa
usa l’RNA virale come stampo per sintetizzare una catena di
DNA complementare, dando luogo ad una elica ibrida DNA-
RNA. La catena di RNA virale viene poi degradata dalla
RNasiH (un enzima virale facente parte della stessa catena
polipeptidica della trascrittasi inversa). Infine, la trascrittasi
inversa forma la catena complementare e quindi la doppia
elica.
Come le DNA polimerasi, la trascrittasi inversa necessita di
un primer (ne occorre uno anziché due come nella normale
PCR, perché l’RNA è a singolo filamento).

Una volta che il genoma virale si è integrato con il genoma ospite,
le proteine virali codificate dal materiale genetico virale sono
espresse dal sistema di trascrizione cellulare. Le proteine virali,
insieme al suo genoma a RNA (quindi trascritto dalle RNA
polimerasi della cellula sotto il controllo di una regolazione virale)
possono riassemblarsi a dare nuovi virus.

Siccome le proteine virali sono poche, sono anche
pochi i possibili bersagli molecolari per un’azione
antivirale. La trascrittasi inversa è uno di questi. Gli
inibitori della trascrittasi inversa sono i primi farmaci
anti-HIV ad essere stati utilizzati.

Per poter trascrivere un filamento di RNA in DNA, la
trascrittasi inversa necessita, come la taq polimerasi, di un
primer.
Nei procarioti e in generale quando si voglia amplificare un
mRNA specifico si deve ricorrere a primer sintetici che
abbiano sequenza complementare all’mRNA che interessa, in
modo analogo a quanto visto per la PCR.
Un’importante modificazione posttrascrizionale tipica degli
eucarioti, la poliadenilazione in 3’, offre un modo per
amplificare contemporaneamente tutti gli mRNA presenti
impiegando come primer universale un poliT. La coda di poliA
è anche sfruttata per separare gli mRNA dalle altre molecole
presenti in un lisato cellulare.

Supponiamo di voler
amplificare tutto il
trascrittoma di cellule di un
tessuto. Si estrae il mRNA
maturo e lo purifica.
L’mRNA viene a questo
punto incubato con il primer
poli T e con la trascrittasi
inversa. Si forma una
doppia elica ibrida
DNA/RNA.
Aggiungiamo l’enzima
RNaseH, chè è in grado di
idrolizzare il filamento di
RNA, lasciando quello
singolo di DNA. In
alternativa, si può elevare il
pH: l’RNA non è stabile
all’idrolisi alcalina e quindi
rimane solo il filamento di
DNA.
Se nella miscela di
reazione è presente una
DNA polimerasi e i 4
deossinucleotidi trifosfato, i
singoli filamenti di DNA
possono generare le doppia
eliche di DNA.

Se nell’ambiente di reazione è presente la taq polimerasi e i
primers specifici per l’amplificazione di uno specifico gene, si
può procedere direttamente all’amplificazione del cDNA per
PCR.

Un passaggio in RT-PCR è indispensabile quando si voglia
amplificare il DNA codificante per una proteina eucariotica e
portarlo ad una forma “leggibile” dai procarioti, che non sono
in grado di riconoscere e eliminare gli introni dall’mRNA.

Esempio: ottenimento di un cDNA del gene dell’insulina.

Sequenziamento del DNA
Il metodo di elezione per il sequenziamento di catene di DNA
fino a 500 bp è quello enzimatico, detto anche di Sanger. Si
tratta di una reazione catalizzata da una DNA polimerasi su un
singolo filamento condotta in presenza non solo dei quattro
deossinucleotidi trifosfato, ma anche di loro derivati privi
dell’ossidrile in 3’ (dideossinucleotidi), aggiunti in minima
quantità.
Per avere più materiale, si può condurre una PCR, ovviamente
usando la Taq polimerasi come DNA polimerasi.

Affinchè la DNA polimerasi possa formare il filamento
complementare, occorre fornire anche un primer, che individua
l’inizio del tratto da sequenziare.
Nelle prime versioni di questo metodo, si conducevano
separatamente 4 reazioni di PCR, ognuna in presenza di un
diverso nucleotide modificato. La duplicazione si blocca, per
ognuna delle 4 reazioni, quando viene incorporato il nucleotide
modificato: tali derivati possono essere aggiunti alla catena
nascente dalla DNA polimerasi ma poi ne impediscono il
proseguimento. Il loro inserimento è casuale, per cui si
generano filamenti di lunghezza diversa, ciascuna terminante
con il derivato terminatore.
La proporzione di nucleotidi “normali” e modificati è tale per cui,
statisticamente, si formeranno tutti i filamenti tronchi terminanti
con un determinato nucleotide.
n
copie

Le catene sono tutte marcate radioattivamente (si aggiungono
nucleotidi con un atomo radioattivo, o al primer o a una porzione
dei nucleotidi trifosfato), per cui possono essere visualizzate
mediante autoradiografia su un gel. Si utilizzano gel di
poliacrilamide perché consentono di separare molecole che
differiscono in lunghezza per un singolo nucleotide.

I 4 prodotti di PCR vengono fatti correre parallelamente su un
gel. In questo modo è possibile ricostruire la sequenza completa
del filamento complementare.

La variante più recente di questo metodo prevede che i quattro
nucleotidi modificati leghino un label fluorescente, ognuno in
grado di emettere luce di “colore” diverso. Con questo metodo
è sufficiente una singola reazione di PCR in presenza di tutti e
quattro i nucleotidi modificati. Le repliche parziali vengono
separate mediante elettroforesi: il “colore” di ciascuna banda
indicherà la natura del nucleotide terminate (A, T, G o C). In
questo modo, si può ricostruire a l’intera sequenza.

Clonaggio
Il clonaggio consiste nello sfruttare la capacità di cellule,
generalmente batteriche, di ospitare DNA estraneo e di
consentirne l’amplificazione insieme al proprio. Attraverso il
clonaggio, possiamo quindi disporre di quantità illimitate di DNA
di sequenza desiderata. Il clonaggio è quindi un’amplificazione in
vivo di DNA ricombinante.
Se lo si inserisse come tale in una cellula, il DNA non sarebbe
replicato e si perderebbe immediatamente. Per poter essere
mantenuto nelle cellule batteriche da una generazione all’altra, il
frammento che vogliamo amplificare deve essere (a) integrato
nel genoma cellulare oppure (b) essere inserito in una molecola
di DNA extragenomico di cui facciano parte sequenze tali da
consentirne la permanenza nella cellula e la replicazione. Nel
secondo caso, di gran lunga più frequente, si parla di vettori di
clonaggio. Quelli più utilizzati sono i plasmidi, piccoli cromosomi
circolari accessori derivanti da varianti naturali normalmente
presenti nelle cellule batteriche. I plasmidi permettono di clonare
tratti di DNA corrispondenti a uno o pochi geni. Recentemente,
con la possibilità di sequenziare interi genomi, si sono resi utili
vettori di clonaggio più “capienti”, grazie ai quali è possibile
clonare tratti di DNA molto più lunghi. I cromosomi artificiali
batterici (BAC), i fagi e i cosmidi ne sono esempi.
Per il clonaggio sono generalmente impiegati ceppi batterici da
cui siano stati eliminati i sistemi di metilazione/restrizione, in
modo che non interferiscano con il DNA che vogliamo inserire. Si
noti che i vettori di clonaggio possono essere facilmente separati
dalle altre componenti della cellula (compreso il suo genoma) e il
frammento che vi abbiamo inserito può essere recuperato dal
plasmide tagliandolo con gli stessi enzimi di restrizione con i
quali lo abbiamo inserito.

I plasmidi sono elementi genetici accessori normalmente
presenti nelle cellule procariotiche.
• Contrariamente al cromosoma principale, i plasmidi sono
normalmente presenti in più di una copia, spesso in numero
variabile da cellula a cellula. Non sono generalmente
indispensabili alla crescita della cellula in condizioni normali, ma
codificano per proteine coinvolte nella resistenza ad antibiotici,
proteine associate alla virulenza, ma anche enzimi che
catalizzano particolari reazioni metaboliche.
• I plasmidi sono entità genetiche relativamente indipendenti e
possono spesso trasferirsi da cellula a cellula, anche tra specie
diverse.

Type of plasmid
Resistance
Fertility
Killer
Degradative
Virulence
Gene functions
Antibiotic resistance
Conjugation and
DNA transfer
between bacteria
Synthesis of toxins
that kill other bacteria
Enzymes for
metabolism of
unusual molecules
Pathogenicity
Examples
Rbk of Escherichia
coli and other
bacteria
F of E. coli
Col of E. coli, for
colicin production
TOL of
Pseudomonas
putida, for toluene
metabilism
Ti of Agrobacterium
tumefaciens,
conferring the ability
to cause crown gall
disease on
dicotyledonous
plants

I plasmidi ricombinanti
L’inserimento di plasmidi in batteri viene chiamato
trasformazione ed è ottenuto trattando una cultura di batteri
con agenti chimici o fisici che ne aumentano
temporaneamente la permeabilità di membrana.

I plasmidi più comunemente usati come vettori di clonaggio
hanno dimensioni variabili tra 2000 e 5000 bp e sono stati
originariamente ottenuti da plasmidi naturali, tra cui, in
particolare, il plasmide di E. coli ColE1. Alcuni possono
replicarsi in più specie, altri sono più selettivi e possono
replicarsi solo in una. Nella loro sequenza devono contenere
almeno:
1. Un’origine di replicazione (ori) affinché possano essere
duplicati ad ogni ciclo cellulare. Il tipo di origine di
duplicazione determina il numero medio di copie presenti nel
batterio: si distinguono ori che danno un high copy number
da quelle che danno un low copy number. I primi
consentono di ottenere una quantità maggiore di DNA.
L’origine di replicazione è spesso specie-specifica. Si può
però modificare la sequenza del plasmide in modo che
contenga siti ori specifici per più di un organismo.
2. Un marker, o selettore: tra le funzioni svolte dai plasmidi in
natura, vi è quella di veicolare un’attività antibiotica (vedi ad
esempio le multiresistenze nelle infezioni nosocomiali).
Codificano cioè per una o più proteine in grado di bloccare
l’azione di un antibiotico (ad esempio, ampicillina,
kanamicina, streptomicina). A livello molecolare, tale azione
può essere di diverso tipo: ad esempio il gene di resistenza
alla ampicillina codifica per un enzima, la β-lattamasi, che
rompe l’antibiotico, inattivandolo. Si è pensato di sfruttare
questa funzione dei plasmidi (che non è non l’unica in
natura) per mantenere il plasmide nel batterio durante i vari
cicli di duplicazione cellulare. Se si aggiunge l’antibiotico al
mezzo di cultura, solo i batteri in cui il plasmide è presente
sopravviveranno e si riprodurranno. In assenza di antibiotico
il plasmide tenderebbe a perdersi. In un plasmide possono
essere presenti geni di resistenza a più di un antibiotico.

La resistenza all’antibiotico è lo stratagemma che si usa per
selezionare i cloni batterici in cui la trasformazione con il
plasmide ricombinante abbia avuto successo (in genere, una
minima parte). La cultura trattata con il plasmide viene “stesa”
su un terreno solido (LB agar) in cui sia disciolto l’antibiotico al
quale il plasmide conferisce resistenza. Le cellule nelle quali è
presente potranno crescere come popolazione clonale (cellule
identiche, derivate da una singola cellula) fino a formare
colonie visibili ad occhio nudo. La colonia a questo punto può
essere isolata e coltivata in terreni liquidi. Il plasmide può
essere purificato dalla cultura batterica in modo semplice e
veloce.

3. Un sito in cui siano contenuti dei siti di restrizione unici
(single cutters), in modo da potervi inserire il frammento di
DNA tagliato con gli stessi enzimi. Sarebbe sufficiente anche
un solo sito di restrizione unico, ma molti plasmidi
commerciali presentano un multiple cloning site, in modo
che vi sia un’ampia scelta di enzimi di restrizione da usare
(nota bene: la scelta dei siti di restrizione da impiegare per
ottenere DNA ricombinante è ristretta dalla possibilità che
tali enzimi taglino il frammento di DNA che interessa).
Il MCS non è indispensabile al plasmide in sé ma è richiesto
affinché lo si possa usare come vettore di clonaggio. Un
MCS consente inoltre di clonare in serie più frammenti.

I BAC ricombinanti
I BAC (cromosomi artificiali batterici) sono costrutti di DNA
basati sul plasmide naturale della fertilità (F) di E. coli, più
grande di altri plasmidi che si riscontrano in natura. Rispetto ai
plasmidi, I BAC possono accomodare frammenti più lunghi di
DNA (fino a 300 Kbp). Grazie a questa capienza, sono spesso
impiegati nel seqenziamento di genomi.

I fagi ricombinanti
I batteriofagi, o fagi, sono virus che infettano i batteri. Il loro
materiale genetico, una volta entrato nella cellula può (a) integrarsi
con quello della cellula ospite, di cui diventa parte integrante (via
lisogenica) (b) moltiplicarsi in più copie: i geni virali vengono quindi
espressi in grande quantità e diversi virus si assemblano,
comportando la rottura della cellula (via litica). Si dicono temperati i
fagi che vanno generalmente incontro a lisogenia, ma che sono
occasionalmente in grado di iniziare un ciclo litico. Il batteriofago
temperato più studiato è il batteriofago λ.
L’integrazione del genoma virale è una ricombinazione non omologa
(mediata da proteine che riconoscono siti specifici nel DNA), del tipo
incontrato per molti virus.

Tanto il processo lisogenico che quello litico avvengono
anche se, all’interno del genoma virale, inseriamo un
frammento di DNA estraneo al fago. I fagi ricombinanti che si
ottengono possono infettare cellule di E. coli come quelli
naturali. Si può introdurre direttamente il genoma
(trasfezione) o infettare le cellule con l’intero virus
assemblato in vitro (infezione).
trasfezione

Il genoma fagico ricombinante può essere introdotto nella cellula
ospite per infezione, “impacchettandolo invitro con le proteine del
capside.
Affinché si possa avere l’impacchettamento in vitro del genoma
fagico ricombinante a partire dalle proteine del capside, sono
indispensabili le sequenze cos, situate normalmente alle
estremità del genoma fagico. Tali sequenze sono riconosciute
dalle proteine fagiche (codificate cioè da geni del genoma fagico)
Nu1 e A, che ne mediano l’impaccamento nella “testa” del virus.
Per un efficiente impacchettamento, è anche critica la lunghezza
del DNA. Se è troppo corta (ad esempio non si è avuta
l’inserzione del frammento esogeno), non si ha formazione di un
fago attivo. Se è troppo lunga, l’impaccamento è impedito.
infezione

La resa del processo di trasfezione/infezione è relativamente
bassa, per cui solo poche cellule la subiranno. Incubando
cellule di E. coli stratificate uniformemente su un terreno solido, si
osserveranno delle placche (cellule lisate) che si originano da un
singolo “focolaio” di infezione. I fagi che si trovano nella placca,
derivando da un singolo fago, costituiranno una popolazione
clonale (copie identiche del fago originario).
I fagi di una placca potranno essere prelevati e usati per infettare
una cultura in terreno liquido: si viene quindi ad ottenere un
numero di fagi sufficiente per purificarne il DNA contenuto e, con
esso, il nostro frammento.

I cosmidi ricombinanti
I cosmidi sono plasmidi in cui
sono stati inseriti siti cos, che
consentono loro di impaccarsi -
in vitro - nella testa di un
batteriofago λ. Possono anche
essere visti come batteriofagi cui
sono stati tolti tutti i geni fagici,
rimpiazzati con gli elementi tipici
di un plasmide: ori, markers,
MCS. Nella testa del virus, vi è
quindi sufficiente spazio per un
grosso inserto, fino a 45kb. Un
inserto di tali dimensioni non
potrebbe essere inserito in un
fago λ (perché gran parte dello
“spazio disponibile” è occupato
dai geni fagici), ma neppure in un
plasmide. In sostanza, con
l’aggiunta dei siti cos, si
consente l’introduzione del
plasmide per infezione, un
sistema più efficiente della
trasformazione.
Una volta entrato nella cellula, il
cosmide si comporta come un
normale plasmide (non possiede
i geni del batteriofago per la
ricombinazione, né per la sintesi
delle proteine del capside).

Vector Type
Plasmid
λ phage
Cosmid
P1 phage
BAC (bacterial artificial
chromosome)
YAC (yeast artificial chromosome)
Cloned DNA (kb)
20
25
45
100
300
1000

Clonaggio di interi genomi:
le librerie genomiche
Tra le principali applicazioni del clonaggio vi è la possibilità di
amplificare corti tratti di DNA ottenuti per frazionamento di
molecole molto lunghe. I frammenti amplificati per clonaggio,
disponibili in quantità pressoché illimitata, possono essere
caratterizzati e sequenziati. Ad esempio, è possibile tagliare un
grosso frammento di DNA con un singolo enzima di restrizione. Ne
deriveranno frammenti più piccoli che possono essere inseriti in un
plasmide tagliato con lo stesso enzima di restrizione.
Si noti che i frammenti sono casuali e non rispecchiano
necessariamente i limiti tra unità funzionali (geni, elementi di
regolazione, enhancer, ecc).

I plasmidi possono essere trasformati in batteri a dare diversi
cloni batterici, facilmente isolabili e amplificabili. L’insieme di
questi cloni, che potenzialmente coprono tutto il DNA
originario, prende il nome di libreria.
Questa operazione potrà essere eventualmente ripetuta
rompendo il DNA originario con altri enzimi di restrizione: si
ottengono librerie ridondanti con frammenti in parte sovrapposti
(contigs). L’analisi delle sequenze sovrapposte consente di
risalire all’ordine in cui i frammenti si presentano nella
molecola di DNA originaria (metodo “shotgun”) e, quindi, alla
sua sequenza complessiva.

Al limite, si può costruire una vera e propria libreria genomica,
un insieme di cloni batterici che nel loro complesso contengono
tutto il DNA di un organismo. Per queste applicazioni, dovranno
essere impiegati i vettori di clonaggio più “capienti” (fagi o
BAC).
Ad esempio, l’intero genoma umano è stato frazionato
(Progetto Genoma Umano) in 393216 BACs.
Queste librerie, eventualmente “sfoltite” per essere il meno
ridondanti possibile, sono rese disponibili alla comunità
scientifica.

Clonaggio di interi trascrittomi: le librerie di cDNA
Le librerie genomiche non danno informazioni circa il diverso
livello di espressione dei geni. Da questo punto di vista, è più
informativa una libreria di cDNA, ottenuta mediante clonaggio del
cDNA ottenuto per RT-PCR su tutti gli mRNA espressi da una
cellula. Non si arriverà a clonare tutto il materiale genetico (non
tutto è trascritto a mRNA), ma si ottengono informazioni, seppur
indirettamente, sulle proteine espresse. Confrontando librerie
genomiche con quelle di cDNA si possono avere informazioni
sulla forza di promotori ed enhacer, sulla inducibilità di alcuni
geni, sullo splicing, ecc.

Clonaggio di sequenze specifiche
Il clonaggio può essere integrato con la PCR per isolare una
sequenza ben definita ed eventualmente modificata. Inserendo
siti di restrizione ai lati del segmento amplificato (usando
opportuni primers), è possible inserirlo agevolmente in un
vettore di clonaggio.
Si noti che, se si mantiene il sito di restrizione grazie al quale si
è inserito l’inserto nel plasmide, lo si potrà sempre recuperare
e clonare, ad esempio, in un altro vettore (subclonaggio).

Espressione
Un semplice clonaggio consente di isolare e caratterizzare un
segmento di DNA, che può essere replicato a piacere in modo
semplice ed efficace. Se il clonaggio viene condotto in
appositi vettori, detti vettori di espressione, è possibile
sfruttare non solo il sistema di duplicazione del DNA della
cellula procariotica ospite, ma anche il suo sistema di
trascrizione, ottenendo così la proteina codificata dal tratto di
DNA (via mRNA). Se l’espressione avviene in un organismo
diverso da quello in cui è stato isolato il gene si parla di
espressione eterologa.
Ciò è di straordinaria utilità, perché le proteine espresse e
purificate possono trovare le più varie applicazioni. È inoltre
possibile produrre di una proteina in quantità sufficiente per
essere caratterizzata mediante tecniche biochimiche.
Combinando questa tecnologia con quella della mutagenesi
sito-specifica, è possibile esprimere e caratterizzare anche
proteine mutanti.
Nella grande maggioranza dei casi, la cellula ospite è
batterica (E. coli). Le cellule batteriche non sono in grado di
operare uno splicing sugli mRNA, per cui, volendo clonare ed
esprimere una proteina eucariotica, dovremo utilizzare il
cDNA ottenuto mediante RT-PCR dall’mRNA maturo estratto
dalla cellula eucariotica. Se usassimo il prodotto PCR
ottenuto dal genoma eucariotico, vi sarebbero inclusi anche
gli introni, che la cellula batterica non saprebbe “interpretare”
come tali.
Rimane l’eventualità che la cellula procariotica non sia in
grado di operare modificazioni post-traduzionali indispensabili
alla funzione della proteina eucariotica. In questo caso è
indispensabile esprimerla in cellule eucariotiche impiegando
speciali vettori.

DNA
Sequenza di regolazione
della trascrizione (INIZIO
trascrizione)
mRNA
Inizio trascrizione
Proteina
Espressione in procarioti
Affinché un vettore di clonaggio sia anche di espressione, il
frammento di DNA inserito deve essere un gene,
comprendente le sequenze non codificanti di regolazione
della sua espressione, sia a livello della trascrizione che
della traduzione.
Reg. trad.
(INIZIO)
Sequenza trascritta a RNA
Fine trascrizione
Inizio traduzione Fine traduzione
Sequenza di regolazione
della trascrizione (STOP
trascrizione)
Codone di stop

Sequenza di regolazione
della trascrizione (INIZIO
trascrizione)
Promotore
Inizio trascrizione
Reg. trad.
(INIZIO)
RBS
Sequenza trascritta a RNA
Fine trascrizione
Codone di stop
Inizio traduzione Fine traduzione
Sequenza di regolazione
della trascrizione (STOP
trascrizione)
Sequenza di
terminazione della
trascrizione

Promotore
La sintesi dell’RNA incomincia in corrispondenza di siti
specifici sullo stampo di DNA: la RNA polimerasi si lega
ad una sequenza di basi detta promotore.
Nei procarioti, i promotori sono sequenze di DNA di circa
40 basi localizzate immediatamente a monte del gene. Un
tipico promotore batterico consiste di due sequenze di
consenso (sequenze comuni a tutti i promotori): la
sequenza TTGACA centrata in posizione -35 (riferito alla
posizione di inizio della trascrizione) e quella TATAAT in
posizione -10.

Ribosome binding site
La sintesi proteica nei procarioti
consiste di tre fasi: inizio,
elongazione o allungamento e
terminazione.
L’inizio è innescato dal legame
della subunità piccola, insieme
al fattore IF-3, all’RBS. Il
legame con l’RBS consente il
corretto posizionamento dei siti
attivi del ribosoma sul codone di
inizio dell’ mRNA.
Il codone di inizio per i geni
batterici è generalmente AUG, il
codone per la metionina.
A questo punto il tRNAi – met
(formilata) si lega al suo
codone.
Infine, la subunità maggiore si
lega alla subunità minore
formando il complesso di
iniziazione.
Quindi: sia la sequenza RBS
che il codone AUG definiscono
il reading frame

Il plasmide contenente gli elementi genetici accessori necessari
per la trascrizione (oltre a quelli necessari per la selezione e per
la replicazione) può essere trasformato in una cellula
procariotica come un plasmide di clonaggio. Come vettori di
espressione per procarioti, è sufficiente utilizzare i plasmidi
perché un gene è di dimensioni ridotte e non richiede vettori più
capienti, come BAC o cosmidi.

Ciascun batterio possiede diversi tipi di siti promotori (siti cui si
lega la RNA polimerasi), che potrebbero essere posti a monte
di un gene plasmidico per regolarne la trascrizione. Tra i
possibili siti promotori presenti nel genoma di E. coli, ci si è
focalizzati su quelli che controllano geni inducibili. È infatti utile
poter indurre l’espressione di una proteina mediante induttori
(piccole molecole, possibilmente stabili) al momento
desiderato, ad esempio quando la cultura ha raggiunto un certo
livello di crescita, dato che la sovraespressione di una proteina
esogena tende a rallentarla.
Uno dei sistemi più semplici consiste nell’impiegare il
promotore per l’operone del lattosio (o lac). Invece del lattosio,
l’induttore naturale, si impiega un suo analogo sintetico più
stabile, l’IPTG.

Le proteine repressore interagiscono direttamente con il DNA in
corrispondenza di una sequenza specifica: quando vi si legano,
impediscono alla RNA polimerasi di proseguire la trascrizione.
L’associazione e la dissociazione di queste proteine regolatrici
dal DNA è a sua volta regolata da piccole molecole, che
legandosi a siti allosterici determinano modificazioni
conformazionali tali da modificare le proprietà di legame della
proteina al DNA.
Le molecole sono spesso metaboliti o loro derivati: segnalano
quindi al sistema di trascrizione quando debbano essere
espresse proteine in risposta a una mutata situazione
ambientale.
L’esempio meglio studiato è quello del repressore lac. In
presenza del suo ligando (l’allolattosio) il repressore si stacca
dalla sequenza di regolazione

Come il lattosio, l’IPTG si lega alla proteina lacI,
inducendone la dissociazione dal DNA e quindi
consentendo alla RNA polimerasi di trascrivere il gene
immediatamente a valle (che normalmente, nei batteri, è
l’operone lac, ma che noi possiamo sostituire con il gene
che ci interessa).

Per ottenere rese ancora più alte si può ricorrere ad un
duplice sistema di amplificazione basato su un promotore
virale, il T7, riconosciuto dalla RNA polimerasi virale T7.
Vi sono ceppi ingegnerizzati di E. coli in cui il gene per la
RNA polimerasi T7 viene posto sotto il controllo del
promotore lac (quindi inducibile dall’IPTG). Una volta che ne
è indotta l’espressione, la RNA polimerasi potrà a questo
punto trascrivere il gene di interesse posto nel plasmide
sotto il controllo del promotore virale T7. La produzione di
polimerasi T7 determina un’enorme espressione dei geni
dipendenti dal suo promotore (T7, appunto).

Se si mette a monte del promotore T7 anche un promotore
lac, rendiamo ancora più stringente l’induzione: l’IPTG
rimuoverà contemporaneamente la repressione sul gene
plasmidico e sulla RNA polimerasi T7. Un gene per il
repressore lac, lacI, può essere inserito nel plasmide per
aumentarne la concentrazione all’interno della cellula, in
modo che l’espressione sia completamente soppressa in
assenza di induttore.
Questi stratagemmi per rendere il più possibile stringente
l’induzione sono motivati dal fatto che, a volte, la proteina
sovraespressa in grandi quantità è tossica per la cellula. Il
controllo sui tempi di espressione diventa quindi cruciale per
ottimizzare le condizioni di espressione.

Mutagenesi sito specifica

Espressione in eucarioti
La maggior parte delle proteine eucariotiche può essere
espresso in cellule procariotiche (via cDNA), ma alcune
richiedono modificazioni post-traduzionali che i procarioti
non riescono a compiere. In questi casi occorre quindi
esprimere le proteine in sistemi eucariotici.
Siccome la maggior parte degli eucarioti non tollera DNA
extracromosomale (tipo plasmidi), il DNA che si vuole
esprimere deve essere inserito, con gli elementi di
regolazione riconosciuti dalla cellula ospite, nel DNA
genomico.
Il DNA può essere microiniettato in cellule animali. il tasso di
successo è molto basso, perché un’inserzione spontanea
nel genoma è molto improbabile.

Si ha maggiore efficienza utilizzando vettori di espressione
per eucarioti, generalmente derivati da virus, dei quali si
sfrutta la capacità, mediante ricombinazione, di inserire
DNA nel genoma della cellula ospite (come i fagi nella via
lisogena).
Principi simili a quelli visti per i fagi possono essere ad
esempio applicati al baculovirus, in grado di infettare cellule
di insetto (che possono poi essere mantenute in cultura).
Per ciascun tipo di eucariote si è sviluppato un set
appropriato di vettori.

In genere si preferisce
usare cellule eucariotiche
in cultura, perché è più
facile recuparare la
proteina espressa.
Un’eccezione è data da
tessuti di animali dai quali
la proteina è secreta e
facilmente recuperabile.
Ad esempio,
un’importante farmaco
proteico, l’attivatore
tissutale del
plasminogeno, viene
secreto nel latte di pecore
transgeniche. Il gene per
l’attivatore tissutale del
plasminogeno è in realtà
presente in tutte le cellule
ma è posto sotto il
controllo del gene per la
β-lattoglobulina, una
proteina sintetizzata solo
dalla ghiandola
mammaria.