lezione 7

Espressione Genica
Informazione
contenuta nei geni
(DNA) viene
decodificata prima in
RNA (Trascrizione) e
successivamente in
proteine (Traduzione)

Nucleotidi e Ribonucleotidi

L’RNA è costituituito da un singolo filamento
ripiegato in strutture specifiche

Trascrizione….i protagonisti:
•Stampo di DNA
•RNA polimerasi
•Ribonucleotidi trifosfato (ATP, GTP, UTP, CTP)

RNA polimerasi Batterica
RNA polimerasi DNA-dipendente MA NON NECESSITA DI
INNESCO per avviare la trascrizione
nucleoside trifosfato + RNAn ⇄ difosfato + RNAn+1
Procede in direzione 5’-3’

Polimerizzazione dei
ribonucleotidi ad opera
dell’RNA polimerasi
durante la trascrizione
L’RNA polimerasi catalizza
un legame fosfodiestere tra il
gruppo 3’OH libero dell’RNA
nascente ed il fosfato in alfa
del nuovo ribonucleotide

Stadi della Trascrizione
1) Fase di inizio
2) Fase di allungamento
3) Fase di Terminazione

RNA polimerasi batterica
Apoenzima dotato di attività catalitica:
2 subunità α, β e β’
Oloenzima: Apoenzima + subunità σ
La subunità σ “guida”
l’RNA Polimerasi
fino alla sequenza
genica da trascrivere
che si riconosce dal
suo promotore

Il promotore genico…
-è una sequenza di DNA altamente conservata
-si trova a monte del gene da trascrivere
-è riconosciuto dalla RNA polimerasi e dagli altri fattori di
trascrizione
- È coinvolto nella regolazione della trascrizione genica

Sequenze Consenso per i prinicipali Promotori Batterici

Ciclo di trascrizione dell’RNA polimerasi batterica
1) L’oloenzima si lega
al promotore
2) La polimerasi
denatura il DNA al
sito di inizio della
trascrizione.
3) La polimerasi inizia a
trascrivere (Trascrizione
Abortiva)
4-5) Si stacca σ e la
polimerasi diventa più
processiva (Fase di
Allungamento)
6-7) In presenza di segnali
(Terminatori) avviene il
distacco della polimerasi dal
DNA ed il rilascio di RNA

La direzione dell’RNA polimerasi è determinata
dall’orientamento del promotore
L’ RNA polimerasi procede sempre in direzione 5’-3’

RNA polimerasi Eucariotiche
Esistono tre tipi di RNA polimerasi eucariotiche

L’RNA polimerasi II è molto simile all’RNA
polimerasi batterica ma ci sono delle differenze
1) Richede l’intervento dei
fattori trascrizionali basali
2) Tiene conto del
compattamento del DNA
nei nucleosomi
I fattori trascrizionali basali, aiutano l’RNA
I fattori trascrizionali basali, aiutano l’RNA
polimerasi II a posizionarsi correttamente sul
promotore.
Svolgono una funzione analoga alla subunità
σ dell’RNA polimerasi batterica

Fasi di inizio della trascrizione eucariotica
I promotori eucariotici
contengono una sequenza
consensus chiamata TATA
box
La TATA box è
riconosciuta e legata da
TFIID
TFIID è costituita da varie
subunità: TBP e TAFs
TBP è responsabile del
riconoscimento della
TATA box
TFIIB si associa dopo il legame di
TFIID

TFIIF stabilizza
l’interazione dell’RNA
polimerasi II con TFIID e
TFIIB e recluta TFIIE
TFIIE recluta TFIIH

TFIIH è dotata di attività
elicasica e di fosforilazione del
dominio CTD (C-terminal
domain) dell’RNA polimerasi II

Ruoli dei fattori trascrizionali basali

Modifiche post-traduzionali delle code delle proteine
istoniche possono influenzare l’espressione genica
Acetilazione
Istoni H3 ed H4
(Attivazione
genica)
Metilazione Istone
H3 (Inattivazione
genica)
De-acetilazione
Istone H3 ed
H4
(Inattivazione
genica)

Acetilazione, metilazione e fosforilazione degli istoni

Fattori Trascrizionali
Posseggono delle particolari regioni (motivi) che legano il DNA
Stabiliscono un gran numero di contatti con il DNA, coinvolgendo
legami idrogeno, legami ionici ed interazioni idrofobiche
Tali legami determinano un’interazione con il DNA molto forte ed
altamente specifica
I motivi sono generalmente costituiti da alfa eliche e foglietti beta

Motivo ELICA-GIRO-ELICA
L’alfa-elica C-terminale (Rosso) si lega in modo sequenza
specifica al livello del solco maggiore del DNA

Motivo a dita di Zinco

Motivo a cerniera di leucine (“Leucine Zipper”)

Motivo Elica-Ansa-Elica
Tale motivo consiste di una breve alfa-elica connessa da un’ansa ad
una seconda alfa-elica più lunga. La flessibilità dell’ana permette ad
un’elica di ripiegarsi e di compattarsi contro l’altra.
L’elica più lunga di solito è responsabile dell’interazione con il DNA

Dal Gene alla Proteina nei Procarioti ed Eucarioti

Differenze tra i trascritti procariotici e i trascritti eucariotici

Disposizione di Esoni ed Introni in differenti geni

Processo di Splicing

Sequenze consensus che dirigono il taglio e la
poli-Adenilazione del 3’ del trascritto

Passaggi principali nella generazione
dell’estremità 3’ di un mRNA eucariotico
1) Legate al CTD della pol II ci sono
CPSF (Fattore della specificità del taglio e della poli-
Adenilazione) e CsTF (Fattore di stimolazione del taglio)
2) CPSF riconosce il consenus AAUAAA; CstF richiama altri
fattori di taglio che determinano il taglio del trascritto al sito
CA
3) L’enzima PoliA-polimerasi (RNA polimerasi stampoindipendente)
catalizza l’aggiunta di una coda di A (circa 250
nucleotidi) al gruppo 3’OH libero del dinucleotide CA al sito
di taglio
4) La coda di poli-A viene riconosciuta e legata dalle PolyAbinding
protein che stabilizzo il trascritto ed impediscono che
venga degradato da RNasi

I trascritti dopo aver subito le modifiche del:
1) Aggiunta del Cap di 7-metil Guanosina al 5’
2) Splicing
3) Aggiunta di coda di poli-A
Vengono esportati dal nucleo al citoplasma attraverso i pori nucleari

Dal gene alla proteina…..

Traduzione…i protagonisti
•RNA messaggero
•Ribosoma
•tRNA “carichi” di amminoacido
•Amminoacil transferasi
…..sullo sfondo…il codice genetico

Codice genetico
Il codice è letto in gruppi di tre nucleotidi (triplette)
Ciascuna tripletta sull’mRNA è chiamato codone
Il codice è ridondante: codoni diversi possono codificare per un
singolo amminoacido

Per una data sequenza di RNA ci sono tre differenti quadri di lettura
MA solo un quadro di lettura possibili in un mRNA codifica per
una proteina!!!

Struttura del tRNA

Appaiamento codone-anticodone
Fenomeno del vacillamento
La terza base è oscillante

Come si forma amminoacil-tRNA?
Avviene ad opera dell’Amminoacil-tRNA sintetasi mediante un processo a 2 fasi:
1) Attivazione degli amminoacidi
2) Formazione del legame esterico tra il gruppo carbossilico dell’amminoacido
ed il 3’OH libero dell’adenina al livello del CCA all’estremità 3’ del tRNA

Il messaggio contenuto nell’RNA è decodificato dai ribosomi

Ribosoma contiene quattro siti fondamentali: per mRNA, per
amminoacil-tRNA, per peptidil-tRNA e sito di uscita per i tRNA
“scarichi”

1) L’amminoacil tRNA si
lega al sito A del ribosoma
2) Formazione del legame
peptidico catalizzata dalla
peptidil-transferasi

3) La subunità maggiore del
ribosoma trasloca rispetto
alla subunità minore. Ciò
porta il peptidil-tRNA al
livello del sito A e il tRNA
“scarico” al livello del sito E
nella subunità maggiore
(posizione ibrida)

4)La subunità minore si sposta
di una tripletta lungo l’mRNA.
Ora il peptidil-tRNA è passato
completamente nel sito P e il
tRNA “scaricato” nel sito E

5) Un nuovo
amminoaciltRNA
entra nel
sito A mentre il
tRNA scarico
esce dal sito E

Una tipica sequenza
consensus di inizio della
traduzione è ACCAUGG
La subunità minore scorre
lungo l’mRNA alla ricerca
del codone AUG
il tRNA iniziatore che
porta legato una Metionina
si lega al livello del sito P
della subunità minore del
ribosoma

Nei batteri il tRNA
iniziatore porta una
Metionina modificata
(Formil-Metionina)

Fase di terminazione della traduzione
Quando un codone di stop viene “letto dal
ribosoma” si posizionano nel sito A del
ribosoma i Fattori di rilascio della traduzione
(RF)
Codoni di stop:
UAA, UAG, UGA