Interazioni non covalenti - Structural Biology

Interazioni non covalenti
Idrogeno alifatico - C - H· · ·H - C - -0.03 kcal/mol
Ponte salino - COO - · · · + H3N - -5
Dipolo-dipolo C=O · · · O=C +0.3
Ghiaccio - O - H· · ·O - -4
Backbone delle prot. N - H· · ·O= -3
Catena laterale della Phe
Energia
di legame
Cambio di
energia libera
Acqua etanolo
-1
-2.4

• L’IMPORTANZA DELLE CARICHE

Legge di Coulomb
ΔE =
1
ε
q 1 · q 2
R 12
µ = d · z
E = -1.32 kcal/mol
E = +1.32 kcal/mol
E = +0.66 kcal/mol
E = -0.66 kcal/mol

HCl completamente ionizzato
d = 1.27 Å
µ = 6.1 Debye
µ exp = 1.03 D 17%

Preferenziali: Ala Glu Leu Met
Sfavoriti: Pro Gly Tyr Ser

µ = 3.5 D

Interazione elettrostatica tra NH 3 + e COO - in Ala che
diminuisce all’aumentare della distanza (Ala) 4
Ala + + Ala - Ala -
NH 3 + -CH(CH3)-COOH NH 3 + -CH(CH3)-COO -
Ala + + Ala - Ala -
NH 2 -CH(CH3)-COO -
pK 1 pK 2
2.34 9.69
+ Ala-Ala + Ala-Ala - Ala-Ala - 3.12 8.30
+ Ala-Ala-Ala + Ala-Ala-Ala - Ala-Ala-Ala - 3.39 8.03
+ Ala-Ala-Ala-Ala + Ala-Ala-Ala-Ala - Ala-Ala-Ala-Ala - 3.42 7.94

In un sistema non perturbato
pK α = ΔG o /2.303 RT
ΔG c = 2.303 RT (pK’ α - pK α )
i.e. Alanina
pK α imperturbato COO - (Ala) 4 3.42
pK’ α perturbato COO - Ala 2.34
=> ΔG c = 2.303 · 0.6 (2.34-3.42) = -2.5 kcal/mole
Interazione elettrostatica abbassa l’energia libera della
molecola di 2.5 kcal/mole =>
dissociazione piu’ facile pK α piu’ basso

Effetto dell’ambiente su alcuni gruppi di alcune proteine
Lys Acetato-decarbossilasi 6.0 10.4
Glu Carbossi-peptidasi
Cys Papaina
7.0 4.5
3.3 9.5

Subtilisina
Proteasi a serina
His 64 Agisce da base durante la catalisi accettando un protone da Ser 221
Enzima attivo a pH alcalino quando His 64 non e’ protonata
=> Attivita’ catalitica varia con il grado di ionizzazione di questo residuo
Strategia:
Mutagenesi sito-diretta su residui carichi
Osservare influenza su pk di His 64
Puo’ questo essere previsto da un modello elettrostatico?
Elimino
Asp Ser 99
Glu Ser156
Abbassano il pK

Dipendenza di k cat /k M dal pH
Asp Ser99
Subtilisina
Calcolo il potenziale dell’His in presenza di Asp; Calcolo il potenziale dell’His in
presenza di Ser: La differenza mi permette di conoscere il ΔpK

Nature - 1985 - 314 - p.235

-le interazioni elettrostatiche sono interazioni deboli e quindi
dell’ordine di qualche kcal/mol;
-le interazioni elettrostatiche possono essere utili nel
riconoscimento molecolare: infatti una definita distribuzione
delle cariche sulla proteina crea un potenziale elettrostatico
utile all’interazione con il suo partner molecolare;
-introduzione o eliminazione di cariche possono essere
utilizzate per modulare i pK di singole catene laterali;
la misura di un parametro in funzione della forza ionica
permette di comprendere la sua dipendenza da fattori
elettrostatici.

Espande quando congela
espansione = 1.6 cm 3 mole -1
Contrae quando si scioglie
fino a 4 o C, poi espande
nuovamente
H-bond in ghiaccio
~ -7 kcal/mole
O O
2.76 Å
µ = 1.8 D

Paragone tra melting e boiling points
per molecole di grandezza simile
Composto Melting point (K) Boiling point (K)
H 2 O 273 373
H 2 S 190 211
Acido acetico 290 391
Propanone 178 330
Etanolo 156 351
Propano 63 231
Metanammina 181 267
Etano 101 185

L’acqua forma legami idrogeno anche nello stato liquido

Affinche’ due molecole in soluzione interagiscano favorevolmente, esse
devono superare una perdita di entropia e devono interagire l’una con
l’altra in maniera piu’ forte di quello che fanno individualmente con l’acqua.
Come esempio, piccole molecole che interagiscono tra esse parimenti che
con l’acqua, hanno un K AB = 1/55 M = 0.02 M-1, dove 55 M e’ la
concentrazione delle molecole d’acqua, nell’acqua in fase liquida.

• K AB = [AB] / [A ] [ B] M -1
• Piccole molecole che interagiscono
tra esse parimenti che con l’acqua,
hanno un K AB = 1/55 M = 0.02
M-1, dove 55 M e’ la
concentrazione delle molecole
d’acqua, nell’acqua in fase liquida.

CH 3
C = O HN
NMA N-MethylAcetamide
HN
C = O
CH3
CH 3
CH3

Cambiamenti di energia libera per il trasferimento di vari
composti dall’etanolo all’acqua a 25 O C
COMPOSTO ΔG (kcal/mole) ΔG 1 (kcal/mole)
Glicina -4.63 0
Alanina -3.90 +0.73
Valina -2.94 +1.69
Leucina -2.21 +2.42
Isoleucina -1.69 +2.97
Fenilalanina -1.98 +2.65
Prolina -2.06 +2.60
Contributo di un gruppo CH 2
Etano +3.02 -
Metano +2.26 -
Etano-Metano - +0.76
Alanina-Glicina - +0.73
Leucina-Valina - +0.73
ΔG O TR = -RT ln SH 2 O / S etan

ΔG O TR = -RT ln SH 2 O
CH 4 benzene CH 4 acqua
CH 4 etere CH 4 acqua
C 2 H 6 benzene C 2 H 6 acqua
S benz
transferimento di metano da benzene ad acqua
ΔH ΔS ΔG
-2.8 -18 +2.6
-2.4 -19 +3.3
-2.2 -20 +3.8
Queste molecole non vogliono essere trasferite verso l’ambiente
Idrofilico per un motivo entropico

Relazione inversa tra solubilita’ e area richiesta per
accomodare il soluto
20 cal mol -1 Å -2
I residui apolari tendono ad aggregare per minimizzare
dimensioni clatrato

Creazione di cavita’
T4 Lisozima Leu Ala
ΔΔG=a+b Δsurf
b=20 cal mol -1 Å -2
SCIENCE 1992 - 255 - p.178

processo:
Soluto idrofobico in
solvente idrofilico1.
l1. creazione di una cavità
nel solvente;
2. introduzione del soluto
nella cavità;
3. riarrangiamento del soluto
per ottimizzare interazione e
del solvente in modo da
ottimizzare l’interazione.

1) Creare cavita’ nel solvente. 2) Introdurre il soluto nella cavita’.
3) Riarrangiamento soluto e solvente per massimizzare interazioni.
Il’effetto idrofobico diminuisce al diminuire della temperatura

Hydrophobic Effect – causes non-polar compounds to minimize
their interaction with water – this is the MAJOR driving force in
folding a protein into its native structure

Hydrogen Bonds

Hydrogen Bond determina specificità
E’ importante l’energetica totale
--------
“Hydrogen Effect”
Differente dall’energia di dissociazione del legame
idrogeno di un singolo legame, che è equivalente
all’entalpia di quel legame
L’energetica dipende dall’entalpia di formazione di
ognuno dei legami e dai cambi di entropia nel solvente
e nei reagenti

Analisi di proteine mutanti
K s Costante di dissociazione
ΔΔG B negativo => Proteina mutante lega il ligando meno
fortemente del wild-type => Ks(mut)>Ks(wt)

E+S---ES---E+P
ΔG T # = = RT ln ( kB T/h) – RT ln ( k cat /K M )
• ΔG T # = ΔGB + ΔG #
ΔG T # è costituito da un termine energetico favorevole ΔGB , associato
con il legame del substrato e da un termine sfavorevole ΔG # , associato
con l’attivazione chimica.
K M può essere usato per calcolare ΔG B , mentre k cat può essere utilizzato
per determinare ΔG #

ΔG T # = ΔGB + ΔG #
Cinetica enzimatica

• ΔΔG T = = ΔGT = ( WT) - ΔGT = ( mut)
• ΔΔG T = = RT ln ( k cat /K M )mut/( k cat /K M )WT
ΔΔG T = sarà negativo per mutazioni che hanno
diminuito ( k cat /K M ) sia per aumento di K M che per
Mutazioni che portano ad una riduzione di k cat

Tirosil-tRNA sintasi - aminoacilazione del tRNAtyr con tirosina
E + Tyr + ATP [E·TyrAMP] + PPi
ETyr-AMP + tRNA tyr E + Tyr-tRNA tyr + AMP
Strategia:
• Eliminare legame idrogeno con mutazione
• Verificare struttura
• Misura catalitica Ks ≈ 10 -9 M
ΔΔG=-RTln[(k cat /K M ) MUT /(k cat /K M ) WT ]
Fersht et al Nature 1985, 314, 235-238

La delezione di una catena che interagisce con un gruppo non
carico del substrato porta ad una perdita di 0.5-1.5 Kcal/mol
indipendentemente dalla catena usata.
In specificità variazioni da 2-12 volte
Elimanata la catena che faceva legame idrogeno
Stessa situazione se elimino la catena carica
Carica-dipolo Carica-dipolo
La elimino da ambedue le parti

Delezione di un gruppo che forma un legame idrogeno con un
gruppo carico del substrato
Interazione
carica-dipolo
ΔΔG T
≠ ≈ 4 kcal/mol
Variazione specificita’ ≈ 10 3
Interazione
dipolo-dipolo

Stretching

Alcune caratteristiche delle catene laterali
δ
ε
• Studi NMR mostrano che H
normalmente su Nε
• pK di protonazione ≈ 7
• La carica risuona tra i due N atomi
• Deprotonazione pK ≈ 14.4