Protocollo diagnosi Ceratocystis platani.pdf - Strateco
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<strong>Protocollo</strong> <strong>diagnosi</strong> <strong>Ceratocystis</strong> <strong>platani</strong> - Progetto ARNADIA<br />
<strong>Protocollo</strong> Real-Time PCR con fluoroforo intercalante (EvaGreen)<br />
Si descrive la metodica di Real-Time PCR basata sull’utilizzo di un fluoroforo intercalante, EvaGreen.<br />
Preparare la seguente miscela di reazione:<br />
Componenti Stock<br />
Supermix (dNTPs, Sso7d-fusion polymerase,<br />
MgCl2, EvaGreen come fluoroforo e stabilizzatori)<br />
Primer forward<br />
5'-CGTACCTATCTTGTAGTGAGATGAATGC-3'<br />
Primer reverse<br />
5'-GAGTTTACAGTGGCGAGACTATACTG-3'<br />
Templato<br />
Acqua<br />
14<br />
Concentrazione<br />
finale<br />
Vol. (l)<br />
2X 1X 10<br />
10010M 0.5M 1<br />
10010M 0.5M 1<br />
Variabile a seconda della<br />
concentrazione della<br />
preparazione<br />
variabile (non necessario<br />
più di 1-5 ng)<br />
Variabile a seconda della<br />
concentrazione della preparazione<br />
Variabile a seconda del volume del<br />
templato<br />
Volume totale di reazione 20<br />
È stato stabilito di considerare positivo un rilevamento ottenuto con un valore del ciclo soglia (CT, threshold cycle) fino a 37.9
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