Protocollo diagnosi Monilinia fructicola.pdf - Strateco

A cura di: Luca Riccioni, Maria Teresa Valente, Enzo Marinelli
Vers. n.1 del 6 febbraio 2013
Protocollo diagnostico
per
Monilinia fructicola

Agente causale
Tassonomia
Ceppi individuati
Avversità
Monilinia fructicola (Winter) Honey
Monilia fructicola Batra (anamorfo)
Kingdom: Fungi
Phylum: Ascomycota
Class: Leotiomycetes
Subclass: Leotiomycetidae
Order: Helotiales
Family: Sclerotiniaceae
Genus: Monilinia
Marciume bruno (dei frutti), moniliosi (dei rametti)
Sinonimi Sclerotinia fructicola (Winter) Rehm
Categoria
fitosanitaria:
Descrizione della malattia
Lista A2 EPPO: no. 153;
Introduzione
Monilinia fructicola causa Il marciume bruno dei frutti, una delle malattie fungine più importanti
delle drupacee (Prunus spp.) e delle pomacee (Pyrus e Malus spp.). La malattia può comunque
essere causata anche da altri due funghi appartenenti al genere Monilinia (M. fructigena e M.
laxa), e dall’anamorfo Monilia polystroma (van Leeuwen et al., 2002), specie molto vicina a M.
fructigena, presente in Giappone e recentemente segnalata anche in Europa (Anonymus, 2011)
All’interno dei paesi dell’Unione Europea M. fructicola viene indicato come un patogeno da
quarantena. Fino a poco tempo fa era assente dall'Europa, e solo nel 2001 fu ufficialmente
segnalata come presente in alcuni frutteti di peschi nel Département du Gard, nel sud della
Francia (EPPO, 2002). E’ stata poi segnalata in Spain (De Cale et al, 2009,EPPO, 2006), in
Svizzera e in Ungheria su frutti di drupacee importati (Bosshard et al.; 2006 e Petroczy e
Palkovics, 2006) e nella Repubblica Cecoslovacca durante una indagine condotta nel 2006
(Duchoslavova et al, 2007; EPPO, 2008). Più recentemente è stata segnalata la sua presenza per
la prima volta in Svizzera (Hilber-Bodmer et al, 2010) e in Italia, in Piemonte, su pesche nettarine
cultivars Sweet Red and Orion (Pellegrino et al, 2009), in Emilia Romagna (Montuschi et al.,
2004) ed infine nel Lazio in campioni raccolti nel 2011 e 2012 (Marinelli et. al., 2013). Riguardo la
distribuzione geografica nel mondo, è presente principalmente in Nord, Centro e Sud America,
Australia e Nuova Zelanda (EPPO/CABI, 2010).
M. fructigena è presente invece in Europa e in parti dell'Asia, ma è assente in Sud America,
Australia e Nuova Zelanda (CABI/EPPO, 2000). M. laxa è il patogeno più frequentemente
associato al marciume bruno ed è presente in tutte le principali aree di produzione di drupacee e
pomacee (CABI/EPPO, 1991). M. fructicola in genere attacca maggiormente pesche e nettarine,
M. fructigena mele e pere, e M. laxa albicocche e mandorle (CABI/EPPO, 1997), tutte e tre le
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specie sono però in grado di infettare una vasta gamma di roseacee appartenenti ai generi
Prunus, Malus, Pyrus, Chaenomeles, Crataegus, Cydonia e Eriobotrya, ed esistono segnalazioni
di M. fructicola su uve, fragole e Rubus (Visarathanonth et al, 1988; CABI/EPPO, 1997;
Washington & Pascoe, 2000; Hinrichs-Berger e Muller, 2010). Per un elenco dettagliato dei
potenziali ospiti in Europa del fungo si rimanda all’Appendice 1 del P.R.A. pubblicato su EFSA
Journal (2011).
Ultimamente è stato prodotto un ‘Pest Risk Analisis’ (P.R.A.) (EFSA Journal, 2011), che
nell’analizzare I rischi di introduzione e stabilizzazione del fungo nel territorio UE, ha concluso
dicendo che “le merci che hanno più probabilità di essere responsabili della diffusione
internazionale del patogeno sono le piante radicate e la frutta fresca, e che, con l'eccezione
della frutta secca, la probabilità di ingresso è molto alta. La probabilità di stabilirsi è anche molto
alta a causa delle condizioni ambientali nel territorio UE adatte e per la presenza diffusa di specie
ospite, suscettibili per la maggior parte delle anno. Le pratiche colturali e le misure di controllo
attualmente applicate contro le altre specie di Monilinia non possono impedire la stabilizzazione di
M. fructicola. La probabilità di diffusione è anche molto probabile a causa dei molteplici modi di
dispersione del fungo. L'impatto complessivo in caso di diffusione si considera essere moderata,
infatti per il controllo del marciume bruno non sarebbero necessari né misure culturali
supplementari, né un aumento dei trattamenti fungicidi”.
Sintomatologia
La malattia può seriamente compromettere il raccolto danneggiando i fiori o causando il marciume
dei frutti, sia sulla pianta sia dopo la raccolta. I fiori infetti si imbruniscono e muoiono, e, se
persistono idonee condizioni di umidità, ciuffi di spore fungine sono prodotte sul tessuto morto. Dal
fiore, l’infezione può passare ai rametti, dove il tessuto corticale colpito muore, e appare depresso
con un bordo netto. Le foglie infette mostrano aree circolari imbrunite, che morendo si distaccano
lasciando un buco sulla foglia, l’imbrunimento e la morte del tessuto può interessare la foglia
intera. Il frutto può essere attacato in qualsiasi momento, ma in generale la malattia non diventa
grave fino a quando i frutti si avvicinano alla maturità. I frutti colpiti cadono o rimangono attaccati
all'albero, diventando secchi e avvizziti (“mummie”). La formazioni di conidi in sporodochi può
verificarsi su tutti gli organi infetti.
La malattia è particolarmente grave se durante la fioritura alti livelli di inoculo sono prodotti in
condizioni di tempo umido o piovoso con temperature diurne miti (20-25 °C) e notti fresche. In
generale, l'incidenza di infezioni latenti sui frutti immaturi e l'incidenza del marciume bruno sui frutti
al momento della raccolta e post-raccolta è influenzato dalla quantità di inoculo, dallo stadio
fenologico del frutto al momento dell’infezione e dalle condizioni ambientali (temperatura e
l’umidità).
Sintomi di marciume bruno su
melocotogno, con produzione di
cuscinetti sporodochiali a circoli
di M. fructigena.
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Mummia di susino cv. Angeleno,
con produzione di cuscinetti
sporodochiali di M. fructicola.

Epidemiologia
M. fructicola sverna sui frutti mummificati, o nei tessuti infetti sugli alberi (rametti, peduncoli e cancri
rameali). In primavera e in condizioni di umidità, i conidi prodotti sono dispersi dal vento, infettano i
fiori, e da qui l’infezione può passare ai giovani rametti, alle foglie, edinfine ai frutti.
L'umidità svolge un ruolo importante nel processo di infezione (germinazione dei conidi e
penetrazione). Senza un adeguato periodo di bagnatura (3-15 ore) l'infezione è quasi nulla anche in
presenza di grandi quantità di inoculo.
La temperatura è anche molto importante, soprattutto nella produzione di conidi: temperature intorno
ai 15 °C favoriscono lo sviluppo di grandi quantità di conidi, con una migliore germinazione e,
soprattutto, una maggiore aggressività. Frutti infetti normalmente mummificano, ma se l'infezione si
verifica in prossimità della raccolta, il marciume si può sviluppare in post-raccolta.
Il teleomorfo (Monilinia), che raramente si vede in M. fructigena e M. laxa, è invece importante in M.
fructicola. Sui frutti mummificati che cadono in primavera si formano gli apoteci, che rilasciano le
ascospore che, spinte dal vento e in presenza di condizioni di umidità favorevoli, vanno ad infettare i
fiori.
Ciclo di Monilinia spp.
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Diagnosi
Le specie di Monilinia (Monilia) che causano il marciume bruno delle colture da frutto sono
difficili da distinguere l'una dall'altra. L'identificazione è possibile combinando le caratteristiche
della cultura, come ad esempio la velocità di crescita, la forma e il colore, con i dati morfologici
quali le dimensioni dei conidi e la lunghezza del tubo germinativo. La maggior parte di questi
caratteri sono quantitativi e si sovrappongono, quindi l'identificazione deve essere condotta in
condizioni standardizzate e partendo da colture pure. Anche così, isolamenti di M. fructicola
possono essere erroneamente identificati come M. laxa e viceversa. Di conseguenza,
l’identificazione morfologica da sola non è quasi mai sufficiente per la diagnosi fitosanitaria,
anche perché si tratta spesso di materiale deperibile, come la frutta.
Il protocollo EPPO PM 7/18 (2) raccomanda l'isolamento di Monilinia spp. dall'ospite seguito
dall’identificazione mediante metodi molecolari. L’applicazione dei suddetti metodi è
praticabile anche direttamente dal micelio presente sul frutto stesso.
Diversi metodi di diagnostica molecolare sono stati sviluppati da 1997 ad oggi per M.
fructicola. Nell’ambito del Progetto Arnadia, in seguito ad una indagine svolta presso i Servizi
Fitosanitari Regionale, sono stati scelti due metodi da validare, uno già riportato nel protocollo
EPPO PM 7/18, e largamente utilizzato dai laboratori fitosanitari in tutta Europa (Ioos e Frey,
2000) e l’altro non ancora validato ma che permette di effettuare una multi-analisi delle diverse
specie in un unico test (Cotè et al., 2004).
Normativa fitosanitaria
M. fructicola è considerato un organismo pericoloso dall’Unione Europea, pertanto è
nell’allegato I, Parte A, Sezione I della Direttica 2000/29/EC, come organismo non presente
nel territorio europeo, e la cui introduzione e diffusione va impedita. La Direttiva regolamenta
l’importazione e la movimentazione di materiale di Chaenomeles Lindl., Crataegus L., Cydonia
Mill. Eriobotrya Lindl., Malus Mill., Prunus L., Pyrus L., destinati alla piantagione, ad eccezione
delle sementi, nonché l’importazione di frutta di Prunus spp.
Tale Direttiva è stata recepita in Italia mediante il Decreto Legislativo 19 agosto 2005, n.
214 “Misure di protezione contro l'introduzione e la diffusione nella Comunità di organismi
nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali".
Attualmente, M. fructicola è stata segnalata in diversi paesi europei, incluso l’Italia. La
legislazione europea ed italiana dovrebbero aggiornarsi rispetto alla nuova
distribuzione del fungo. L’EPPO lo ha già fatto spostando M. fructicola nella list A2 dei
microrganismi di quarantena.
6

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Metodologie
diagnostiche

Premessa
Il protocollo diagnostico descritto è il prodotto dell’attività effettuata nell’ambito del Progetto
Finalizzato ‘ARON-ARNADIA’, finanziato dal Ministero per le Politiche Agricole, Alimentari e
Forestali.
Il protocollo diagnostico fornisce le linee guida per la diagnosi e l’identificazione del fungo
Monilinia fructicola nei laboratori presenti sul territorio italiano preposti alla diagnosi degli organismi
da quarantena. L’uso di protocolli diagnostici armonizzati è alla base di un’efficiente applicazione
delle misure fitosanitarie e consente il confronto di risultati ottenuti da diversi laboratori in diverse
circostanze.
La scelta della metodologia diagnostica da validare, secondo i parametri di validazione ISO
16140:2003, ISO 17025 ed EPPO Diagnostic PM7/98, è scaturita da un’attenta rivisitazione delle
metodiche riportate nel protocollo EPPO PM7/91 (1) (2009b) e della bibliografia prodotta
sull’argomento (Ioos et al 2009), nonché da un confronto con i Servizi Fitosanitari Regionali.
Per la definizione di tali parametri le diverse metodologie di diagnosi sono state
effettuate con reagenti e strumentazioni dettagliatamente riportati. Ciò non comporta
l’esclusione dell’uso di reagenti e strumentazioni alternative e la modifica di alcune
procedure per meglio avvicinarsi agli standard di ogni singolo laboratorio, purché ciò
venga adeguatamente validato.
Le prove di validazioni sono riportate nell’Allegato1.
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Flusso di lavoro per l’identificazione di M. fructicola da frutto
Isolamento
Analisi
morfologica
Caratteristiche morfologiche
consistenti con Monilia spp?
No Si
M. fructicola
non presente
Frutti con sintomi di
marciume
9
Risultato
negativo
Conferma
controllo IAC
M. fructicola
non presente
Estrazione
del DNA
Analisi molecolare
Metodo 1 “PCR Cotè”
Risultato
positivo
Analisi molecolare
Metodo 2 “PCR Ioos”
Risultato
negativo
Conferma
controllo IAC
M. fructicola
non presente
Risultato
positivo
M. fructicola
presente

Protocollo di diagnosi molecolare
Metodi Componente fungina riconosciuta
Metodo 1 (test di identificazione):
PCR MULTIPLEX con 3 coppie di
primer specie-specifici (Cotè et al.
2004)
Metodo 2 (test di conferma):
PCR con primer specie-specifici
disegnati su Internal Transcribed
Sequences (ITS ) (Ioos e Frey, 2000)
Regione SCAR (Sequencecharacterized
amplified region) del
DNA genomico fungino
Regione ITS del DNA genomico
fungino
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Strumentazione, materiali e reagenti necessari
Strumentazione
1. Bilancia analitica
2. pHmetro
3. Agitatore magnetico
4. Bagnetto termostatato o termoblocco
5. Macchina per produzione di ghiaccio granulare
6. Centrifuga per provette tipo Eppendorf
7. Omogeneizzatore “TissueLyser” o altro Beat Beater (non necessario)
8. Mortai e pestelli sterili
9. Frigorifero
10. Congelatore
11. Micropipette dedicate all’amplificazione e calibrate (P2, P10, P20, P50, P100, P200,
P1000)
12. Micropipette dedicate all’estrazione dell’acido nucleico e calibrate (P10, P20, P100, P200,
P1000)
13. Termociclatore
14. Vortex
15. Apparati per elettroforesi su gel d’agarosio
16. Transilluminatore o altra strumentazione tipo Gel Doc System per visionare e fotografare i
gel
17. Spettrofotometro o spettrofluorimetro per dosaggio di DNA
Materiali
1. Carta da laboratorio
2. Pestellini sterili per provette di tipo Eppendorf da 1,5 ml
3. Guanti
4. Portaprovette
5. Provette di tipo Eppendorf sterili da 0,2 ml e1,5 ml
6. Puntali sterili e puntali con filtro
7. Ghiaccio
8. acqua bi-distillata
9. acqua milliQ sterile
10. Azoto liquido
Reagenti
1. Kit commerciale per estrazione DNA
2. Composti chimici per la preparazione del tampone di estrazione del DNA: Tris, cloruro di
sodio, EDTA, SDS, acetato di sodio, isopropanolo, etanolo
3. DNAsi-free RNAasi A commerciale
4. Composti chimici per la preparazione del tampone per l’elettroforesi TBE: Tris base, Acido
borico, EDTA
5. Taq DNA polimerasi più relativo tampone e MgCl2
6. dNTPs
7. Primer specifici (vedi tabelle 2 e 4)
8. Agarosio per biologia molecolare
9. Bromuro d’etidio o GelRed per la colorazione del DNA
10. Composti chimici per la preparazione del “DNA-Loading buffer”: Blu di bromofenolo,
Xilencianolo, glicerolo
11. Marker DNA (range 50 bp-1000 bp)
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Estrazione del DNA genomico da micelio cresciuto in piastra o prelevato da
frutto
Per la purificazione del DNA genomico da micelio cresciuto in piastra Petri su PDA (Potato
Dextrose Agar) o prelevato direttamente da frutto infetto, è possibile utilizzare un kit
commerciale per estrazione del DNA genomico o altro protocollo. Una volta isolato, il micelio
puo’ essere conservato a -20°C in attesa di essere processato per l’estrazione di DNA.
Di seguito è riportato il metodo di estrazione descritto da Cenis (1992):
1. Per ottenere il fungo su PDA trasferire un pezzo di pochi millimetri di tessuto infetto (fra
sano e malato) su una piastra Petri contenente il terreno di coltura. Dopo pochi giorni la
colonia o si riconosce morfologicamente con certezza (vedi capitolo saggio morfologico), o
si prosegue con il seguente protocollo.
2. Circa 100 mg di micelio grattato dalla piastra di PDA sono trasferiti in tubi tipo Eppendorf da
1,5 ml contenenti 300 l di buffer di lisi (Tris-HCl 200 mM ph 8,5; NaCl 250 mM; EDTA 25
mM; SDS 0,5%);
3. il micelio viene omogeneizzato mediante “TissueLyser” o altro bead beater per 1 min a 30
Hz. In alternativa, in mancanza dello strumento, il campione puo’ essere omogeneizzato
con un pestellino sterile direttamente nella provetta;
4. il lisato ottenuto si lascia in incubazione a 65°C per 10’;
5. si aggiungono 150 l di NaAc 3 M ph 5,2 e si lascia a -20°C per 10’;
6. il campione viene centrifugato a 13000x g per 10’;
7. il surnatante si trasferisce in un nuovo tubo tipo Eppendorf da 1,5 ml. Il DNA viene quindi
precipitato con l’aggiunta di un ugual volume di isopropanolo;
8. dopo 5’ di incubazione a temperatura ambiente il campione si centrifuga per 10’ a 13000x
g;
9. il pellet subisce un lavaggio con 500 l di EtOH 70% e si lascia quindi asciugare a
temperatura ambiente per circa 10’;
10. il DNA viene risospeso in 50 l di TE buffer (Tris-HCl 10 mM ph 7,5; EDTA1 mM) e
conservato a -20°C.
Il DNA genomico risultante viene quantificato mediante saggio spettrofluorimetrico. In
mancanza di uno spettrofluorimetro, che legge specificamente ed esclusivamente il DNA a
doppio filamento, sara’ necessario digerire gli acidi nucleici estratti con “DNAsi-free RNAsi A”
commerciale seguendo le indicazioni della Ditta produttrice. Il DNA così trattato puo’ essere
quantificato mediante saggio spettrofotometrico alla lunghezza d’onda di 260 nm. Prima di
essere usato come stampo nella reazione di amplificazione PCR, il DNA risultante deve essere
diluito 1:20 in acqua sterile.
Estrazione del DNA genomico da frutto infetto contenente fruttificazioni
miceliari
Per la purificazione del DNA genomico da frutto infetto è necessario campionare la parte del frutto
sintomatica e preferibilmente contenente fruttificazioni miceliari visibili. Una volta prelevato, il
tessuto del frutto sintomatico deve essere tempestivamente congelato in azoto liquido e
processato o conservato a -80°C. E’ necessario frantumare e polverizzare il tessuto in azoto
liquido con mortaio e pestello. La purificazione del DNA deve essere realizzata con opportuni kit
commerciali per evitare inibitori dell’amplificazione, e, prima di essere usato come stampo nella
reazione di amplificazione PCR, il DNA risultante deve essere diluito 1:20 in acqua sterile.
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METODO 1
1.1 Identificazione molecolare mediante una PCR MULTIPLEX con 3
coppie di primer specie-specifici (Cotè et al. 2004)
La metodica consiste in una multiplex PCR con un primer reverse comune a M. laxa, M.
fructigena, M. fructicola e tre primer forward specie-specifici per le tre suddette specie di
Monilinia. I prodotti di amplificazione discriminano le tre specie in base al diverso peso
molecolare (Tabella 1).
Tabella 1. Discriminazione di tre specie di Monilinia in base al
polimorfismo di lunghezza di una specifica regione genomica
Monilinia spp* Prodotto di PCR (bp)
M. fructicola 535
M. fructigena 402
M. laxa 351
* il metodo è in grado di discriminare anche Monilinia
polystroma, il cui prodotto di amplificazione è di 425 bp
1.2 Amplificazione PCR multiplex
Per la diagnosi molecolare con il metodo dell’amplificazione PCR multiplex i primer sono i
seguenti (Tabella 2, Cotè et al., 2004):
Tabella 2 Primer per l’amplificazione secondo il protocollo di Cotè et al., 2004
Nome
identificativo
Descrizione Sequenza
MO368-5 Primer reverse comune a M.
fructicola, M fructigena, M. laxa, M.
polystroma
5’-GCAAGGTGTCAAAACTTCCA-3’
MO368-8R Primer forward specifico per M.
fructigena e M. polystroma
5’-AGATCAAACATCGTCCATCT-3’
MO368-10R Primer forward specifico per M.
fructicola
5’-AAGATTGTCACCATGGTTGA-3’
Laxa-R2 Primer forward specifico per M.
laxa
5’-TGCACATCATATCCCTCGAC-3’
I primer possono essere ordinati ad apposite Ditte che li sintetizzano e li consegnano
liofilizzati. E’ conveniente diluire i primer ad una concentrazione di 100 M in tampone TE
(Tris-HCl 10 mM ph 7,5; EDTA1 mM), seguendo le istruzioni della Ditta fornitrice, e
conservare queste soluzioni madri a -20°C. Si preparano quindi delle sub-aliquote di circa
50 l totali alla concentrazione di 10 M, diluendo la madre in acqua milliQ sterile, e si
conservano a -20 °C.
La reazione di amplificazione si allestisce in ghiaccio. Quando si effettuano più reazioni di
PCR contemporaneamente occorre preparare, in una singola provetta da 1,5 ml o 2 ml,
una soluzione madre (master mix) che contenga tutti i reagenti illustrati nella Tabella 3,
13

meno i DNA-stampo (quello da analizzare), che verranno introdotti direttamente nelle
provette di reazione PCR.
1- passare al vortex tutte le soluzioni (eccetto la DNA-polimerasi) dopo averle
scongelate;
2- aggiungere, in una provetta da 1,5 ml tenuta in ghiaccio, i volumi richiesti dei vari
componenti come indicato in Tabella 3, seguendo l’ordine riportato in tabella;
3- Passare al vortex la master mix e centrifugarla per pochi secondi per raccogliere le
gocce sul fondo;
Tabella 3 : reagenti necessari per la preparazione della master mix
COMPONENTI Concentrazione Volume per 1 Volume per n* Concentrazione
iniziale reazione (l) Reazioni (l) finale
1. Acqua milliQ sterile 5,375 5,375 x n
2. Tampone di
amplificazione
10X 1 1 x n 1 x
3. MgCl2 50 mM 0,5 0,5 x n 2,5 mM
4. dNTPs 10 mM 0,2 0,2 x n 0,2 mM
5. Primer MO368-5 10 M 0,2 0,2 x n 0,2 M
6. Primer MO368-8R 10 M 0,2 0,2 x n 0,2 M
7. Primer MO368-10R 10 M 0,2 0,2 x n 0,2 M
8. Primer Laxa-R2 10 M 0,2 0,2 x n 0,2 M
9. DNA polimerasi 2 U/l 0,125 0,125 x n 0,025 U/l
* nel numero n di reazioni PCR da eseguire viene considerato un campione in più (n+1) per
fare in modo che il volume della master mix non sia limitante.
4- Distribuire, con una micropipetta P20, 8 l di master mix in provette da PCR da 0,2
ml predisposte in ghiaccio, in un apposito portaprovette;
5- Aggiungere 2 l di DNA stampo in ciascun campione e un equivalente volume di
acqua al campione di controllo
VOLUME TOTALE DI REAZIONE: 10 l
14

Una volta pronte, le provette vengono inserite nel termociclatore e sottoposte al seguente
ciclo di amplificazione:
Temperatura Tempo N° di cicli
Denaturazione 95 °C 2’ 1
Amplificazione
95 °C 15”
60 °C 15” 35
72 °C 1’
Estensione finale 72 °C 3’ 1
Step di blocco 4 °C ∞ 1
N.B.: le provette vanno tenute in ghiaccio fino a che il termociclatore non raggiunge la
temperatura di denaturazione (95°C). Una volta arrivato a temperatura, i campioni
possono essere sistemate nella macchina.
1.3 Elettroforesi su gel di agarosio
Per l’esecuzione del saggio seguire le seguenti tappe operative:
1. Preparare il gel di agarosio 1,2% (massa/volume) in TBE 0,5X con il colorante
scelto per marcare il DNA: bromuro di etidio alla concentrazione finale di 0,5 g/ml
(o alla concentrazione d’uso di consuetudine valutata opportuna dal laboratorio
operante) o Gel Red alla concentrazione finale indicata dalla ditta fornitrice
2. Caricare 5 l del campione amplificato più 1 l di loading buffer 6X in ciascun
pozzetto
3. Caricare in un pozzetto un marker idoneo (range circa 50-1000 bp)
4. Correre a 80-120 volt per circa 30 minuti o finchè non si ottenga la separazione
delle bande del controllo di specificità da includere sempre nell’elettroforesi.
7. Osservare il gel mediante un transilluminatore ad U.V. e fotografare
Tamponi necessari all’effettuazione del gel di agarosio:
TBE 10X
Tris 108 g
acido borico 55 g
0,5 M EDTA (pH 8) 40 ml
Portare ad 1litro con H2O distillata
Autoclavare
15
Loading buffer 6X
Blu di bromofenolo
Xilencianolo
0,25%
0,25%
Glicerolo 30%

Valutazione dei risultati
Se il saggio è positivo per ciascuna delle Monilie identificabili verrà visualizzata la
corrispondente banda specie-specifica (Tabella 1, Foto 1)
Foto 1. Elettroforesi su gel d’agarosio dei prodotti di PCR ottenuti con il Metodo 1 su DNA
genomico estratto da 5 isolati di M. fructigena (pozzetti da 1 a 5), 3 isolati di M. fructicola
(pozzetti da 6 a 8) e 6 isolati di M. laxa (pozzetti da 9 a 14)
Uso dei controlli
Vedi pag 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
16
532 bp
402 bp
351 bp

METODO 2
2.1 Identificazione molecolare mediante amplificazione PCR con
primer specie-specifici disegnati su Internal Transcribed Sequences
(ITS) (Ioos e Frey, 2000)
Differenze con il metodo precedente:
- non è una analisi multiplex (più specie in un tubo);
- l’analisi è specifica per individuare la sola specie “target” per volta;
- la discriminazione della specie si basa su polimorfismi di sequenza e non di lunghezza.
La specificità è data dai primer disegnati su una regione ITS che presenta polimorfismi
puntiformi per ciascuna delle tre specie di Monilinia discriminabili.
2.2 Amplificazione PCR
Per la diagnosi molecolare con il metodo dell’amplificazione PCR su ITS specie-specifica i
primer sono riportati nella Tabella 4.
Tabella 4 Primer per l’amplificazione secondo il protocollo di Ioos e Frey 2000
Nome
identificativo
Descrizione Sequenza
ITS1Mfcl Primer forward specifico
per M. fructicola
5’-TATGCTCGCCAGAGGATAATT-3’
ITS4Mfcl Primer reverse specifico
per M. fructicola
5’-TGGGTTTTGGCAGAAGCACACT -3’
ITS1Mlx Primer forward specifico
per M. laxa
5’-TATGCTCGCCAGAGAATAATC-3’
ITS4Mlx Primer reverse specifico
per M. laxa
5’-TGGGTTTTGGCAGAAGCACACC -3’
ITS1Mfgn Primer forward specifico
per M. fructigena
5’-CACGCTCGCCAGAGAATAACC-3’
ITS4Mfgn Primer reverse specifico
per M. fructigena
5’GGTGTTTTGCCAGAAGCACAC-3’
I primer possono essere ordinati ad apposite Ditte che li sintetizzano e li consegnano
liofilizzati ed è consigliabile che siano PAGE purificati, per evitare amplificazioni falsepositive.
E’ conveniente diluire i primer ad una concentrazione di 100 M in tampone TE
(Tris-HCl 10 mM ph 7,5; EDTA1 mM), seguendo le istruzioni della Ditta fornitrice, e
conservare queste soluzioni madri a -20°C. Si preparano quindi delle sub-aliquote di circa
50 l totali alla concentrazione di 10 M, diluendo la madre acqua milliQ sterile, e si
conservano a -20 °C.
17

La reazione di amplificazione si allestisce secondo le indicazioni scritte nel paragrafo 1.2,
seguendo le condizioni riportate in Tabella 5.
Tabella 5. Reagenti per la preparazione della master mix
COMPONENTI Concentrazione
iniziale
Distibuire, con una micropipetta P20, 18 l di master mix in provette da PCR da 0,2 ml
predisposte in ghiaccio, in un apposito portaprovette.
Aggiungere 2 l di DNA stampo in ciascun campione e un equivalente volume di acqua al
campione di controllo.
VOLUME TOTALE DI REAZIONE: 20 l
Una volta pronte, le provette vengono inserite nel termociclatore e sottoposte al seguente
ciclo di amplificazione:
Temperatura Tempo N° di cicli
Denaturazione 94 °C 3’ 1
Amplificazione
94 °C 30”
63 °C 30” 30
72 °C 1,5’
Estensione finale 72 °C 10’ 1
Step di blocco 4 °C ∞ 1
N.B.: le provette vanno tenute in ghiaccio fino a che il termociclatore non
raggiunge la temperatura di denaturazione (95°C). Una volta arrivato a
temperatura possono essere sistemate nella macchina.
2.3 Elettroforesi su gel di agarosio
Volume per 1
reazione (l)
Per l’esecuzione del saggio seguire le seguenti tappe operative:
Volume per n*
Reazioni (l)
1. Acqua milliQ sterile 13,725 13,725 x n
2. Tampone di
amplificazione
Concentrazione
finale
10X 2 2 x n 1 x
3. MgCl2 50 mM 0,8 0,8 x n 2 mM
4. dNTPs 10 mM 0,3 0,3 x n 0,15 mM
5. Primer forward 10 M 0,4 0,4 x n 0,2 M
6. Primer reverse 10 M 0,4 0,4 x n 0,2 M
9. . DNA polimerasi 2 U/l 0,375 0,375 x n 0,0375 U/l
1. Preparare il gel di agarosio 1,2% (massa/volume) in TBE 0,5X con il colorante scelto
per marcare il DNA (bromuro di etidio alla concentrazione finale di 0,5 g/ml, o Gel
Red alla concentrazione finale indicata dalla ditta fornitrice)
18

2. Caricare 10 l del campione amplificato più 2 l di loading buffer 6X in ciascun
pozzetto
3. Caricare in un pozzetto un marker idoneo (range circa 50-1000 bp)
4. Correre per circa 30 minuti a 80 volt, facendo riferimento al fronte del colorante.
7. Osservare il gel mediante un transilluminatore ad U.V. e fotografare
Tamponi necessari all’effettuazione del gel di agarosio: vedi paragrafo 1.3
2.4 Valutazione dei risultati
Se il saggio è positivo per ciascuna delle Monilie testate con i corrispondenti “primer ITS”
verrà visualizzata una banda di 356 paia di basi (Foto 2).
356 bp
1 2 3 4 5
Foto 2. Elettroforesi su gel d’agarosio dei prodotti di
PCR ottenuti con il protocollo di amplificazione di Ioos e
Frey con i primer ITS1Mfcl e ITS2Mfcl specifici per M.
fructicola su DNA genomico estratto da 2 isolati di M.
fructicola (pozzetti da 1 a 2), 2 isolati di M. fructigena
(pozzetti da 3 a 4) e 1 isolato di M. laxa (pozzetto 5)
19

Uso dei controlli
Per ciascun metodo di diagnosi molecolare descritto, è necessario includere dei controlli di
reazione PCR (Foto 3)
Controllo positivo: reazione di PCR su DNA genomico di un isolato di riferimento
di M. fructicola precedentemente testato con le coppie di primer previste per
entrambi i metodi e diluito al limite di rivelazione. Serve per confermare la
correttezza di preparazione della reazione PCR.
Controllo negativo: Miscela di reazione contenente tutti i reagenti ad eccezione
del DNA. Serve a monitorare eventuali contaminazioni.
Controllo di amplificazione interno (IAC, Internal Amplification Controll): La
qualità dell’estrazione del DNA, e quindi la presenza di eventuali inibitori della PCR
si possono controllare con DNA chimerico aggiunto alla miscela di reazione ed
amplificabile con la stessa coppia di primers utilizzata per il DNA bersaglio, ma che
fornisce un amplicone con taglia facilmente distinguibile da quella del DNA
bersaglio. Serve a valutare l’amplificabilità del DNA (per maggiori dettagli vedere
Cotè et al., 2004).
Alternativamente e più semplicemente è possibile controllare la qualità del DNA
usando i primer universali ITS1 e ITS4, disegnati sui geni ribosomali fungini,
sostituendoli ai primer usati per la diagnosi, e abbassando la temperatura di
annealing a 50°C.
Controllo di specificità: reazione di PCR su DNA genomico di M. fructigena e M.
laxa, due specie filogeneticamente affini a M. fructicola, concentrato a valori medi
di rivelazione. Serve per assicurare la specificità del metodo.
Cp Cn Cs M
a b
Foto 3. Elettroforesi su gel d’agarosio dei controlli di PCR per i
metodi 1 (a) e 2 (b); Cp, controllo positivo, Cn, controllo negativo,
Cs, controllo specificità.
20
Cp Cn Cs M

Confronto tra i due metodi
METODO 1
21
METODO 2
Vantaggi Svantaggi Vantaggi Svantaggi
Oltre a rilevare la
presenza di Monilinia
e Monilia, permette di
discriminare la specie
in un’unica reazione
PCR
Piu’economico
Meno sensibile Più sensibile
Se si vuole
identificare la specie
di Monilinia è
necessario effettuare
più amplificazioni,
ciascuna con il
primer specie-
specifico.
Piu’ costoso
(maggior quantità di
DNA polimerasi e
necessità di primer
PAGE-purificati)
Per le analisi di routine per l’dentificazione di M. fructicola si consiglia l’applicazione del
metodo 1 e, in caso di risultato positivo, l’applicazione del metodo 2 per la conferma.

Prove di validazione
22
Allegato 1
l processo di validazione è consistito nella valutazione di un metodo nuovo, nel nostro caso il
Metodo 1, confrontandolo con un metodo standard, già validato, rappresentato in questo studio
dal Metodo 2, sulla base dell’ISO16140 (2003) e del protocollo EPPO PM 7/98(1) (2009).
Si è quindi valutato prima la “performance” del laboratorio per verificare se è in grado di ottenere i
parametri riportati per il metodo standard, quindi si è verificato la “performance” del nuovo metodo,
per verificare se risponde ai requisiti minimi, e infine si è validato il nuovo metodo comparando le
sue “performance” con quelle del metodo standard. Tali valutazioni sono state eseguite presso I
laboratori del CRA-PAV.
Per completare la validazione del Metodo 1, ed in particolare la sua riproducibilità diagnostica è
stato organizzato anche un “Ring test” comparativo in collaborazione con i seguenti laboratori:
1. Laboratorio di Micologia del Servizio Fitosanitario della Regione Emilia Romagna, via
Corticella, 133, 40129 Bologna.
Responsabile: Dr.ssa Carla Montischi (CMontuschi@Regione.Emilia-Romagna.it, tel.
051/4159249)
Operatore: Dott.ssa Baschieri Tiziana (TBaschieri@Regione.Emilia-Romagna.it; tel. 051/5278208)
2. Laboratorio del Servizio Fitosanitario della Regione Piemonte, Environment Park -
palazzina A2, Via Livorno, 60 - 10144 Torino.
Responsabile: Dr. Giovanna Mason (giovanna.mason@regione.piemonte.it; Tel. +39 011 4325067
- fax +39 011 4323710)
Operatore:
3 Centro Trasferimento Tecnologico, Unità Fitoiatria, Fondazione Edmund Mach, Istituto
Agrario di San Michele all'Adige, Via Mach 1, S. Michele all'Adige, 38010 TN
Responsabile: Daniele Prodorutti (daniele.prodorutti@iasma.it, +39 0461 615109. Fax + 39 0461
615500)
Operatore:
4 CRA-PAV, Via C.G. Bertero, 22, Roma.
Responsabile: Dr. Luca Riccioni (luca.riccioni@entecra.it, tel. 06 82070328)
Operatore: Salvatore Vitale (salvatore.vitale@entecra.it)
Sotto vengono riportati i parametri di validazione considerati e definiti secondo l’EPPO PM
7/98(1):
Sensibilità analitica: la più piccola quantità di target che può essere rilevata.
Sensibilità diagnostica: capacità del protocollo di rilevare la presenza del patogeno nei
campioni infetti o contaminati rispetto ad un metodo standard;
Specificità analitica/diagnostica: capacità del protocollo di NON rilevare la presenza del
patogeno nei campioni non infetti o non contaminati dal patogeno in esame/rispetto ad un
metodo standard;

Accuratezza relativa: il valore risultante dal calcolo della Sensibilità diagnostica e della
Specificità diagnostica;
Accordanza (Ripetibilità): corrispondenza dei risultati ottenuti utilizzando lo stesso protocollo
con gli stessi campioni di riferimento e nelle stesse condizioni di lavoro (strumentazioni,
operatore, laboratorio), ripetendo la metodica a brevi intervalli di tempo;
Concordanza (Riproducibilità): corrispondenza dei risultati ottenuti utilizzando lo stesso
protocollo con gli stessi campioni di riferimento in diversi laboratori.
Campioni: tutte le prove di validazione sono state eseguite su una serie di campioni di riferimento
‘target’ e ‘non target’ rappresentati da isolati di M. fructicola, M. fructigena, M. laxa e M.
polystroma in coltura (Tabella 7) e su campioni di pomacee (mela e pera) e drupacee (pesca e
susina) inoculate artificialmente con M. fructicola, M. fructigena, M. laxa (Tabella 8).
Campioni di riferimento ‘target’: isolati che coprono la diversità genetica, la distribuzione
geografica e le diverse specie ospiti del patogeno.
18 campioni ‘target’ rappresentati da diversi isolati di coltura pura di M. fructicola e da campioni
ospiti inoculati artificialmente con M. fructicola (Tabelle 7 e 8).
Campioni di riferimento ‘non target’: isolati infetti da patogeni simili che colpiscono la stessa
specie ospite, da patogeni geneticamente correlati, campioni non infetti appartenenti alla stessa
specie ospite.
22 campioni ‘non target’ rappresentati da diversi isolati di coltura pura di M. laxa, M. fructigena e
M. polystroma, da campioni vegetali inoculati artificialmente con M. fructigena e M. laxa, e da
campioni vegetali sani (Tabelle 7 e 8).
23

Tabella 7. Isolati di Monilinia spp utilizzati per la valutazione dei protocolli di diagnosi
morfologica e molecolare per l’identificazione di M. fructicola utilizzati in questo studio.
codice
CRA-PAV
ISOLATI Ospite IDENTIFICAZIONE
codice
precedente
* Vedere database del CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures-Fungal Biodiversiry
Centre (Utrecht, The Netherlands).
**ER… e MC…, isolati in collezione presso il CRA-PAV.
24
PCR Cotè PCR Ioos
ER1607** CBS228.72 Pesco M. fructicola M. fructicola
ER1608 CBS101512 Susino M. fructicola M. fructicola
Sequenziamento
ITS
ER1610 MC990 M. fructicola M. fructicola M. fructicola
ER1611 MC934 M. fructicola M. fructicola M. fructicola
ER1612 MC991 M. fructicola M. fructicola
ER1613 MC1006 M. fructicola M. fructicola M. fructicola
ER1724 CBS203.25 CBS* M. fructicola M. fructicola M. fructicola
ER1725 CBS101511 CBS M. fructicola M. fructicola
ER1727 CBS101508 CBS M. fructicola M. fructicola
MC 997 M. fructicola M. fructicola
MC 999 M. fructicola M. fructicola
MC 1403 M. fructicola M. fructicola
ER1737 Ciliegia M. fructicola M. fructicola
ER1733 Pesca M. fructicola M. fructicola
ER1738 MC390/00 Mela M. fructigena
MC 978 M. fructigena
MC 979 M. fructigena
MC 981 M. fructigena
MC 992 M. fructigena
ER1736 Mela cotogna M. fructigena
ER1715 Albicocca M. laxa M. laxa
MC 1432 M. laxa
MC1433 M. laxa
MC 1435 M. laxa
MC 1438 M. laxa
MC 1439 M. laxa
MC 2113 Ciliegia M. laxa M. laxa
ER1728 CBS102688 CBS M. polystroma

Tabella 8. Ospiti inoculati artificialmente e non, utilizzati per i test diagnostici
molecolari.
INOCULI FRUTTI SAGGIATI N° di campioni
M. fructicola Pesca, pera, susina, mela 4
M. fructigena Pesca, pera, susina, mela 4
M. laxa Pesca, pera, susina, mela 4
Non inoculato Pesca, pera, susina, mela 4
Le infezioni artificiali del materiale ospite sono state condotte attraverso i passaggi di seguito
riportati:
- I frutti sono stati preliminarmente disinfettati con ipoclorito di sodio al 1% per 3’
- Dopo l’incubazione in ipoclorito di sodio i frutti hanno subito tre lavaggi: il primo con
acqua di rubinetto, il secondo con acqua bidistillata e il terzo con acqua bidistillata sterile
- Una volta asciutti, sotto cappa, ciascun frutto è stato lievemente reciso con la punta di un
bisturi sterile.
- Su ciascuna ferita è stato posto un tassello di micelio (5 mm di diametro) prelevato al
margine di colonie di Monilinia spp. di circa 5 giorni di età allevate su PDA a 20°C al buio.
- I frutti inoculati sono stati disposti in ambiente confinato, sterile e saturo di umidità
costituito da vaschette in alluminio contenenti carta bibula inumidita con acqua distillata
sterile e chiusi in bustine di plastica trasparenti.
- Il materiale inoculato è stato così incubato a temperatura ambiente fino alla comparsa dei
sintomi dell’infezione e delle fruttificazioni miceliari.
25

Metodo standard
PCR ITS (Ioos e Frey, 2000)
Verifica delle «performance» del laboratorio
Parametri Valori metodo
standard
Sensibilità analitica 0,5 pg* --
Specificità analitica 100% si
Ripetibilità 100% si
Riproducibilità 100% si
*La sensibilità analitica è stata calcolata de novo, poichè non era
stata calcolata nel lavoro originale pubblicato.
Parametri
SCHEMA
Processo di validazione
conferma
“RING TEST”
26
Metodo da validare
Multiplex PCR (Cotè et al. 2004)
Verifica delle «performance» del metodo 1
Parametri Valori metodo in
validazione
Sensibilità analitica 25 pg
Specificità analitica 100%
Ripetibilità 100%
Test comparativo del metodo 1 con il metodo standard (metodo 2)
Sensibilità diagnostica - VP/(VP+FN)
Specificità diagnostica - VN/(VN+FP)
Accuratezza relativa - (VP+VN)/(VP+VN+FP+FN)
Ripetibilità (concordanza)
Riproducibilità (accordanza)
Parametri Valori %
Sensibilità diagnostica - PA/(PA+PD) 54,5*
Specificità diagnostica - NA/(NA+ND) 100,0
Accuratezza relativa - (PA+NA)/(PA+NA+PD+ND) 77,3
Valori %
Metodo 1
Valori %
Metodo 2
96% 97%
100% 100%
98% 99%
99% 99%
98% 98%

VALIDAZIONE DEL METODO 2 (Ioos and Frey, 2000)
Il protocollo di diagnosi molecolare proposto da Ioos e Frey (2000) è stato ulteriormente migliorato
e già validato con il lavoro di Ioos e Iancu nel 2008, e inserito in Appendice 1 del Protocollo
diagnostico per M. fructicola EPPO PM 7/18(2) del 2009. In tale lavoro i parametri di validazione
sono stati valutati secondo l’ISO 16140 e i risultati ottenuti sono schematizzati in tabella 9.
Tabella 9. Dati relativi ai parametri di validazione del protocollo di
diagnosi molecolare in Appendice 1 del documento EPPO PM 7/18(2) del
2009
*: non saggiato
Al fine di verificare le capacità del laboratorio CRA-PAV di eseguire lo standard test (nel nostro
caso il metodo 2), si è proceduto come descritto al punto 5.4.4 del documento EPPO PM 7/98(1)
del 2009:
- Esecuzione dell’analisi:
L’analisi è stata eseguita seguendo dettagliatamente le istruzioni riportate nel Appendice 1
del protocollo EPPO PM 7/18(2) con 2 minime modifiche che non ne giustificano una
ulteriore validazione:
1) tempo di polimerizzazione ciclica di PCR: 1,5’ (invece di 1’)
2) cicli di amplificazione PCR: 30 (invece di 35)
I valori di verifica dello “standard test” sono stati ottenuti utilizzando:
-Protocollo per estrazione di DNA genomico da fungo descritto da Cenis (1992)
-Kit per estrazione di DNA genomico da tessuto vegetale “NucleoSpin® Plant II”
(Macherey-Nagel)
-Enzima Taq polimerasi: Dynazyme Taq DNA polimerasi, Finnzymes, Cat N° F-501
-dNTPs: Fermentas, Cat N° R0182
Parametri Valori
Sensibilità analitica n.s.*
Specificità analitica 100%
Accordanza 100%
Concordanza 100%
-primers specie-specifici: PAGE purificati, sintetizzati da PRIMM company
-Termociclatore: Biometra's T-Personal Thermal Cycler, cod. N° 050.551
-Transilluminatore: Biorad Geldoc 2000
-Marker per DNA: 1kb plus DNA ladder, Invitrogen, Cat N° 10787018
27

- Confronto dei valori ottenuti con quanto aspettato:
I risultati ottenuti sono riportati in Tabella 10:
Tabella 10 Test di verifica e implementazione dello “standard test”
Criteri di
performance
Sensibilità
analitica (1)
Specificità
analitica
Valori
“standard test”
0.5 pg (2) /
100% SI
Ripetibilità 100% SI
Riproducibilità 100% SI
Coincidenza
Test verifica
(SI/NO)
(1) La pubblicazione originale del protocollo proposto in Appendice 1 del documento EPPO PM
7/18(2) non contiene la sensibilità analitica, che è stata opportunamente implementata come
descritto in tabella 7 del protocollo EPPO PM 7/98(1) del 2009 .
(2) Il valore riportato per la sensibilità analitica è stato sovrastimato per ragioni cautelative; il valore
potenziale di sensibilità analitica è stato stimato in 0,05 pg.
28
Eseguiti 3 esperimenti con 8 diluizioni seriali di
DNA fungino: ER1607, ER1608, ER1610,
ER1611, ER1612
Funghi target e non target saggiati:
ER1607, ER1608, ER1728, ER1715, 390/00, MC
978, MC 979, MC 981, MC 992, MC 1432, MC
1432, MC1433 MC 1435 MC 1438 MC 1439 MC
2113 ER1736
Saggiati tre livelli (basso, medio, alto) di
concentrazione del DNA fungino (ER1733) in due
esperimenti separati
Saggiati tre livelli (basso, medio, alto) di
concentrazione del DNA fungino (ER1733) in 3
esperimenti separati con condizioni operative
diverse (es. termociclatore)

VALIDAZIONE DEL METODO 1 (Cotè et al. 2004)
La validazione del metodo 1 è stata realizzata mediante:
1- valutazione delle “performance” in termini di sensibilità analitica e specificità analitica calcolati
secondo le modalità descritte in tabella 7 del documento EPPO PM 7/98(1) del 2009: per la
specificità sono stati saggiati tutti gli isolati riportati in tabella 7 del presente documento; per la
sensibilità è stato eseguito un saggio con 8 diluizioni seriali contenente anche DNA della
pianta, ripetuto tre volte. La ripetibilità è stata valutata saggiando un campione con DNA al
limite di rilevamento (25pg) e poco sopra, replicato 8 volte e ripetuto in tre esperimenti. Dati
riportati nella tabella successiva.
Tabella 11. Parametri di validazione
analitici del metodo 1
Parametri Valori metodo 1
Sensibilità analitica 25 pg
Specificità analitica 100%
Ripetibilità 100%
2- comparazione con lo standard test (metodo 2) secondo quanto indicato in Appendice 2 del
protocollo EPPO PM 7/98(1) del 2009.
I campioni, target e non target, sono stati analizzati a tre livelli quantitativi di DNA: quantità limite di
rivelazione (0,5 pg), quantità media (50 pg) e quantità alta (500 pg). Sono stati processati con
entrambi i metodi in parallelo con un numero di campioni riportato in tabella 12. Al DNA di ciascun
campione saggiato è stato aggiunto un quantitativo fisso di DNA estratto da pesca e da susina,
diluito 1:10, pari al volume iniziale di ciascun campione in modo che la diluizione finale del DNA
dell’ospite risultasse 1:20. Lo scopo di tale aggiunta è verificare la specificità di reazione PCR e
l’assenza di inibitori di amplificazione. Per ciascun campione utilizzato, target e non target, sono
state eseguite 3 repliche a brevi intervalli di tempo.
Tabella 12: numero di campioni usati per validare il metodo 1 mediante comparazione con il
metodo standard.
Tipo di materiale Numero di campioni saggiati per diversi livelli
quantitativi di DNA
Livello basso Livello medio Livello alto
DNA di isolati da coltura pura dell’organismo
target in DNA ospite
10 7 5
DNA di isolati da coltura pura dell’organismo
non target in DNA ospite
- 22 -
29

I valori di validazione del metodo 1, schematizzati in Tabella 12, sono stati ottenuti utilizzando:
Protocollo per estrazione di DNA genomico da fungo descritto da Cenis (1992)
Kit per estrazione di DNA genomico da tessuto vegetale “NucleoSpin® Plant II”
(Macherey-Nagel)
Enzima Taq polimerasi: DyNAzyme II DNA polimerasi, Finnzymes, Cat N° F-501
dNTPs: Fermentas, Cat N° R0182
primers specie-specifici: sintetizzati da PRIMM company
Termociclatore: GeneAmp PCR System 2400
Transilluminatore: Biorad Geldoc 2000
marker per DNA: 1kb plus DNA ladder, Invitrogen, Cat N° 10787018
Tabella 13: dati ottenuti dalla correlazione tra metodo 1 e metodo 2 (metodo
standard). PA, positivi in accordo (positivi ottenuti in entrambi i metodi); PD,
positivi in disaccordo (positivi ottenuti solo con il metodo standard); NA,
negativi in accordo (negativi ottenuti in entrambi i metodi); ND, negativi in
disaccordo (negativi ottenuti solo con il metodo standard).
Metodo 1
(test da
convalidare)
I dati di confronto elaborati sono schematizzato in tabella 14
Tabella 14: dati di confronto tra metodo 1 e metodo 2. PA, positivi in accordo;
PD, positivi in disaccordo; ND, negativi in disaccordo; NA, negativi in accordo.
Parametri Valori %
Sensibilità diagnostica - PA/(PA+ND) 54,5*
Specificità diagnostica - NA/(NA+PD) 100,0
Accuratezza relativa
- (PA+NA)/(PA+NA+PD+ND)
Metodo 2 (Standard test)
+ - Totali
+ 36
PA PD
0 66
- 30 ND NA
66 66
Totali 66 66 132
*La sensibilità diagnostica del Metodo 1 è risultata bassa, come ci si aspettava,
poiché il limite di rivelazione (sensibilità analitica) è pari a 25 pg, contro i 0,5 pg
ottenuti con il metodo standard .
Tuttavia tale limite di rilevazione risulta essere sufficiente per la identificazione del target
sia quando si analizza il DNA estratto da coltura pura del fungo che quando si analizza il
DNA proveniente da tessuto ospite sintomatico, in quanto il limite di rilevamento di 25pg è il
linea con altri i metodi di identificazione molecolari pubblicati.
30
77,3

RING TEST
Al fine di verificare ulteriormente la validità e l’efficacia di entrambi i Metodi e di valutare quanto
l’uso di diversi reagenti e strumentazioni in diversi laboratori, con diversi operatori, possa influire
sui valori di perfomance dei test (concordanza o riproducibilità), è stato realizzato un ring test per
entrambi i Metodi a cui hanno partecipato i 4 laboratori sotto riportati con le relative
apparecchiature:
1. Laboratorio di Micologia del Servizio Fitosanitario della Regione Emilia Romagna
- Enzima Taq polimerasi: Dynazyme Taq DNA polimerasi, Finnzymes, Cat N° F-501
-dNTPs: Fermentas, Cat N° R0182
-primers specie-specifici: forniti dal laboratorio organizzante
-Termociclatore
2. Laboratorio del Servizio Fitosanitario della Regione Piemonte
- Enzima Taq polimerasi: Dynazyme Taq DNA polimerasi, Finnzymes, Cat N° F-501
-dNTPs: Fermentas, Cat N° R0182
-primers specie-specifici: forniti dal laboratorio organizzante
-Termociclatore
3 Centro Trasferimento Tecnologico, Unità Fitoiatria, Fondazione Edmund Mach, Istituto
Agrario di San Michele all'Adige.
- Enzima Taq polimerasi: Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen Cat N°
-dNTPs: Fermentas, Cat N° R0182
-primers specie-specifici: forniti dal laboratorio organizzante
-Termociclatore
4 CRA-PAV
- Enzima Taq polimerasi: Bioline Taq Cat N°
-dNTPs: Fermentas, Cat N° R0182
-primers specie-specifici: forniti dal laboratorio organizzante
-Termociclatore
31

In ciascun laboratorio i Metodi 1 e 2 sono stati eseguiti su 15 campioni anonimi (“blind”), più tre
controlli, per tre volte in tempi diversi (Tabella 15).
Tabella 15. Campioni di DNA fungino estratto da coltura pura. A
ciascun campione è stato aggiunto un quantitativo di DNA estratto
da pesca e da susina, diluito 1:10, pari al volume iniziale di ciascun
campione, in modo che la diluizione finale del DNA dell’ospite
risultasse 1:20.
Campioni identità
a
b
c
32
Peso atteso
dell’amplificato
Metodo 1 (bp)
Peso atteso
dell’amplificato
Metodo 2 (bp)
Controllo negativo
(sano) 0 0
Controllo positivo
M. fructicola 100pg 535 356
Controllo specificità
M. fructigena+M. laxa
50pg+50pg 402+351 0
1 M. fructicola 500pg 535 356
2 M. fructicola 50pg 535 356
3 M. fructicola 0,025pg 0 0
4 M. fructicola 500pg 535 356
5 M. fructicola 50pg 535 356
6 M. fructicola 0,025pg 0 0
7 sano 0 0
8
M. fructigena+M. laxa
50pg+50pg 402+351 0
9 M. fructicola 100pg 535 356
10 M. fructicola 0,025pg 0 0
11 M. fructicola 50pg 535 356
12 M. fructicola 500pg 535 356
13 sano 0 0
14
M. fructigena+M. laxa
50pg+50pg 402+351 0
15 M. fructicola 100pg 535 356

I risultati ottenuti da ciascun laboratorio sono schematizzati in Tabella 16.
Tabella 16 Risultati del ring test dei 4 laboratori partecipanti. I dati, espressi
singolarmente per ognuna delle ripetizioni (I, II, III) di ciascun Metodo, indicano la
corrispondenza (+) o la deviazione (-) dal risulto atteso
Campioni
Laboratorio 1 Laboratorio 2 Laboratorio 3 Laboratorio 4
Metodo1 Metodo2 Metodo1 Metodo2 Metodo1 Metodo2 Metodo1 Metodo2
I II III I II III I II III I II III I II III I II III I 1 II III I 2 II III
1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + +
3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
4 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
5 - + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + +
6 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
9 + + + + + + + + + + + + + - - + + - - + + + + +
10 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
11 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
12 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
13 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
14 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + +
15 + + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + +
1 I risultati di tale replica sono affetti da un controllo positivo che non ha amplificato, pertanto tale replica non
è stata inclusa nell’analisi dei risultati
33

L’analisi dei risultati è stata eseguita mettendo a confronto le corrispondenze dei dati ottenuti con
quelli attesi (tabella 17) e calcolando le percentuali dei parametri di sensibilità diagnostica,
specificità diagnostica, accuratezza relativa (tabella 18).
Tabella 17. valori ottenuti dal “ring test” espressi come totali di Veri Positivi (VP),
Veri Negativi (VN), Falsi Positivi (FP) e Falsi Negativi (FN)
Risultati attesi
Risultati Metodo 1
Tabella 18. Risultato del Ring test del Metodo 1 e Metodo 2. Veri Positivi (VP), Veri
Negativi (VN), Falsi Positivi (FP) e Falsi Negativi (FN).
Parametri
Sensibilità diagnostica - VP/(VP+FN)
Specificità diagnostica - VN/(VN+FP)
Accuratezza relativa - (VP+VN)/(VP+VN+FP+FN)
Ripetibilità (concordanza)
Riproducibilità (accordanza)
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Risultati Metodo 2
+ - tot + - tot
+ 85 3 88 86 2 88
VP FN
FP VN
VP FN
FP VN
- 0 77 77 0 77 77
tot 85 80 165 86 79 165
Valori %
Metodo 1
Valori %
Metodo 2
96% 97%
100% 100%
98% 99%
99% 99%
98% 98%

Isolamento
La procedura standard per l'isolamento è di posizionare frammenti di materiale infetto (con o senza
sterilizzazione di superficie) su un di una piastra di PDA acidificato con acido lattico o con
antibiotico.
Substrato di coltura
Potato Dextrose Agar (PDA, Oxoid) (van Leeuwen & van Kesteren, 1998; De Cal e Melgarejo,
1999).
Caratteristiche di crescita su piastra
SAGGIO MORFOLOGICO
I tassi di crescita per M. fructicola su PDA a 22° C con 12-16 ore-luce UV vicino (320 -380 nm)
sono di 9-20 mm in 24 ore (De Cal & Melgarejo, 1999), con una media attorno ai 13 mm (van
Leeuwen & van Kesteren, 1998).
Morfologia
Ife: le ife primarie hanno pareti molto sottili, una lunghezza di circa 250 micron e 7-10 di larghezza
con uno o più rami che si sviluppano prima del setto iniziale. I rami secondari e successivi sono
spesso molto stretti.
Conidi: blastici, formanti catene con il più giovane all'estremità distale, ellissoidali, ovoidali o
limoniformi spesso con estremità tronca, 8 -28 × 5-19 micron (per lo più 12-16 × 8-11 micron), ialini
(grigiastri in massa). Su agar-acqua di rubinetto (18 ore a 25° C), la maggior parte dei conidi forma
un unico lungo tubo di germinazione non ramificato di 750-900 micron. I microconidi di solito si
formano nella colonie più vecchie.
Sclerozi: normalmente non si formano, ma i frutti infetti sviluppano degli strati stromatici che
possono arrivare a sostituisce la maggior parte del pericarpo.
Apoteci: si formano in modo irregolare sui frutti mummificati in primavera.
Confronto con specie simili
Monilinia fructigena ha grandi conidi (per lo più 17-21 × 10-13 micron), e forma spesso due tubuli
germinativi per conidio.
Monilinia laxa ha conidi di dimensioni simili a quella in M. fructicola, i tubi germinativi sono singoli
ma brevi (150 -350 micron) e attorcigliati.
Sono pubblicate diverse chiavi di riconoscimento morfologico. In questo studio è stata presa in
considerazione la chiave sinottica di Lane (2002), basata sulle caratteristiche morfologiche delle
colonie, per distinguere le tre specie M. fructicola, M. fructigena e M. laxa.
Questo metodo prevede il posizionamento di tasselli di 4 mm di diametro, prelevati da
colonie di 4 giorni cresciute su PDA a 22° C al buio, al centro di due piastre di PDA e
incubate per 10 giorni a 22° C in 12 ore luce/12 h buio.
35

Le colonie di M. fructicola:
hanno una crescita rapida tanto da riempire piastre Petri da 9 cm già al 6-7 giorno.
la sporulazione è molto abbondante, in anelli concentrici, con una colorazione da
nocciola a nocciola chiaro.
il margine della colonia è per lo più intero e la superficie della colonia liscia.
croste stromatiche irregolari e/o sclerozi discoidi si possono sviluppare sulla
superficie delle piastre o all'interno nelle colonie con più di un mese di età.
Numerosi microconidi si possono formare in particolare ai bordi delle piastre Petri.
La colorazione delle colture deve essere valutata secondo Rayner (1970).
Confronto con specie simili
Monilinia fructigena: nelle condizioni sopradescritte, le colonie di M. fructigena hanno
bassi tassi di crescita (circa la metà di quella di M. fructicola). Il colore delle colonie di M.
fructigena è giallo tendente al crema. M. fructigena ha una sporulazione assai scarsa.
Monilinia laxa: nelle condizioni sopradescritte, le colonie di M. laxa hanno bassi tassi di
crescita (circa la metà di quella di M. fructicola). M. laxa ha un margine marcatamente
lobato e la superficie presenta delle caratteristiche rosette.
Un contorno scuro è spesso associato ai petali delle rosette presenti nelle colonie.
Le colonie a rosetta hanno l'aspetto di un fiore aperto, dovuto alla presenza di micelio in
strati distinti l'uno sopra l’altro, che può essere riconosciuto sia nella parte superiore che
in quella inferiore delle piastre. La sporulazione è scarsa.
Tabella 18. Chiave sinottica di Lane: confronto tra le caratteristiche delle colonia di Monilinia
spp. da pomacee e drupacee. Colture cresciute su PDA al 4% incubate a 22° C a 12 h buio/12 h
vicino-luce UV (320 -380 nm)
1.Colore
M. fructicola M. laxa M. fructigena
Nocciola/nocciola
chiaro (‘grigio’)
36
Nocciola/nocciola
chiaro (‘grigio’)
Giallo/crema
2.Crescita in 24 h 9 – 20 mm 2 – 11 mm 0 – 12 mm
3.Sporulazione Abbondante Sparsa Sparsa
4.Anelli concentrici di spore Si No Qualche volta
5.Margini lobati No Si No
6.Presenza di rosette No (rara) Si No
7.Rosette con archi neri No Si No

Nell’ambito del progetto il quadro sinottico di Lane è stato testato su 29 isolati presenti nella
micoteca ER del CRA-PAV cosi suddivisi: M. fructicola (15 isolati), M. fructigena (6 isolati), M. laxa
(8 isolati). È stata seguita la metodica descritta da Lane (2002) è i risultati sono riassunti nella
tabella 19 sotto riportata.
Tabella 19. Identificazione di 15 isolati di Monilinia spp con la chiave sinottica di Lane
Isolati Numero totale Identificazione con
la chiave sinottica
37
% di
identificazione
M. fructicola 15 10 66,7
M. fructigena 6 2 33,3
M. laxa 8 3 37,5
La prova conferma l’inattendibilità della identificazione su base morfologica,
rendendo necessaria la conferma con metodi molecolari.

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39

Indice
Descrizione della malattia pag. 2
Metodologie diagnostiche 7
Protocolli di diagnosi molecolare 10
METODO 1 (Cotè et al., 2004) 13
METODO 2 (Ioos e Frey, 2000) 17
Uso dei controlli 20
Confronto tra i due metodi 21
Allegato 1 – Prove di verifica 22
Validazione del Metodo 2 27
Validazione del Metodo 1 29
Ring test 31
Saggio morfologico 35
Bibliografia 38
40