Protocollo diagnosi Monilinia fructicola.pdf - Strateco

VALIDAZIONE DEL METODO 2 (Ioos and Frey, 2000)
Il protocollo di diagnosi molecolare proposto da Ioos e Frey (2000) è stato ulteriormente migliorato
e già validato con il lavoro di Ioos e Iancu nel 2008, e inserito in Appendice 1 del Protocollo
diagnostico per M. fructicola EPPO PM 7/18(2) del 2009. In tale lavoro i parametri di validazione
sono stati valutati secondo l’ISO 16140 e i risultati ottenuti sono schematizzati in tabella 9.
Tabella 9. Dati relativi ai parametri di validazione del protocollo di
diagnosi molecolare in Appendice 1 del documento EPPO PM 7/18(2) del
2009
*: non saggiato
Al fine di verificare le capacità del laboratorio CRA-PAV di eseguire lo standard test (nel nostro
caso il metodo 2), si è proceduto come descritto al punto 5.4.4 del documento EPPO PM 7/98(1)
del 2009:
- Esecuzione dell’analisi:
L’analisi è stata eseguita seguendo dettagliatamente le istruzioni riportate nel Appendice 1
del protocollo EPPO PM 7/18(2) con 2 minime modifiche che non ne giustificano una
ulteriore validazione:
1) tempo di polimerizzazione ciclica di PCR: 1,5’ (invece di 1’)
2) cicli di amplificazione PCR: 30 (invece di 35)
I valori di verifica dello “standard test” sono stati ottenuti utilizzando:
-Protocollo per estrazione di DNA genomico da fungo descritto da Cenis (1992)
-Kit per estrazione di DNA genomico da tessuto vegetale “NucleoSpin® Plant II”
(Macherey-Nagel)
-Enzima Taq polimerasi: Dynazyme Taq DNA polimerasi, Finnzymes, Cat N° F-501
-dNTPs: Fermentas, Cat N° R0182
Parametri Valori
Sensibilità analitica n.s.*
Specificità analitica 100%
Accordanza 100%
Concordanza 100%
-primers specie-specifici: PAGE purificati, sintetizzati da PRIMM company
-Termociclatore: Biometra's T-Personal Thermal Cycler, cod. N° 050.551
-Transilluminatore: Biorad Geldoc 2000
-Marker per DNA: 1kb plus DNA ladder, Invitrogen, Cat N° 10787018
27