Protocollo diagnosi Ceratocystis platani.pdf - Strateco

Protocollo diagnosi Ceratocystis platani - Progetto ARNADIA
Caratteristiche tecniche della Real-Time PCR
Spettri di assorbanza ed emissione dei fluorofori utilizzati come
reporter e quencher
Reporter e Quencher
Massima
assorbanza
Massima
emissione
EvaGreen 500nm 530nm
6-FAM (6-carboxyfluorescein)
BHQ1 (6-carboxytetramethyl-rhodamine)
Controlli:
495nm 518nm
534nm
(range 480-580)
16
Excitation Led in
CFX-96 BioRad
Channel 1
(450-490nm)
Channel 1
(450-490nm)
Photo body detector
in CFX-96 BioRad
Channel 1
515-530nm
Channel 1
515-530nm
Controlli negativi:
Includere:
Controllo NTC (“No Template Control”) in cui il templato è sostituito con H20 ogni
15-20 campioni saggiati. Serve per appurare contaminazioni verificatesi in sede di
assemblaggio delle reazioni di PCR.
Un'altro controllo NTC è rappresentato da una reazione in cui il templato è sostitutito
con i buffer di estrazione del DNA. Serve per appurare contaminazioni verificatesi in
sede di estrazione del DNA.
Controllo contenente DNA genomico estratto da legno di platano non infetto. Oltre a
verificare che i primers e la sonda sono specifici per il target molecolare fungino
(peraltro già verificato ampiamente in sede di sviluppo del metodo) verifica
ulteriormente eventuali contaminazioni in sede di estrazione e di assemblaggio delle
reazioni di PCR.
Un'altro controllo negativo (non obbligatorio), è rappresentato da reazioni contenenti
come templato meta-DNA estratto da legno necrotico di platano affetto da malattie
del legno diverse dal cancro colorato. Serve per verificare che i primers e la sonda
sono specifici per il target molecolare fungino (peraltro già verificato ampiamente in
sede di sviluppo del metodo) e che non si siano verificate contaminazioni in sede di
estrazione e di assemblaggio delle reazioni di PCR.
Controlli positivi:
Includere:
Reazioni contenenti come templato DNA genomico di un isolato di C. platani
utilizzato come riferimento e/o l'amplicone target clonato in vettore plasmidico. È
buona norma includere una reazione con concentrazione alta (1-5 ng) e una
reazione con una concentrazione bassa (10pg-100fg).
Reazioni contenenti meta-DNA estratto da legno sicuramente infetto e già
rilevato precedentemente con tali metodiche.