Terzuoli L. Il metodo di immunofluorescenza indiretta nella ... - Simel

LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO
DELLE MALATTIE AUTOIMMUNI
ORGANO-SPECIFICHE
Il metodo di immunofluorescenza indiretta nella
rilevazione di autoanticorpi organo-specifici
Dott.ssa Lucia Terzuoli
Dipartimento di Medicina Interna, Scienze Endocrino-
Metaboliche e Biochimica
Università di Siena
Centro Congressi “Hotel Palladio”
Bassano del Grappa (Vi)
mercoledì 7 ottobre 2009
VANTAGGI DEL METODO
buona sensibilità e specificità di reazione semplicità e rapidità di esecuzione
permette di indagare contemporaneamente la presenza di
autoanticorpi rivolti contro un mosaico di antigeni
biochimicamente distinti
facile riproducibilità
costo contenuto
è una tecnica estremamente soggettiva
in quanto l’interpretazione dei risultati è
condizionata da numerosi fattori tra cui
l’esperienza dell’operatore ed il tipo di
microscopio
LIMITI DEL METODO
alcuni antigeni nucleari altamente solubili in soluzione
fisiologica possono essere facilmente perduti nel
corso delle procedure di lavaggio
le variabili metodologiche
richiedono di ottimizzare la
standardizzazione
è quantitativo discreto
non consente l’identificazione delle specificità anticorpali perciò deve essere
completato da indagini sierologiche antigene specifiche o che consentano di definire
la specificità antigenica dell’anticorpo
La fluorescenza è un fenomeno che insorge quando una molecola
assorbe luce, si eccita e rilascia luce ad una lunghezza d’onda più
lunga ma con frequenza più bassa.
Le sostanze fluorescenti più utilizzate sono:
Isotiocianato di fluoresceina
Isotiocianato di tetrametilrodamina
fluorocromo
Isotiocianato di
fluorescina
Isotiocianato di
tetrametilrodamina
acronimo
FITC
TRITC
massimo di
assorbimento
( λ)
490-495 nm
550 nm
massimo di
emissione
( λ)
517 nm
580 nm
luce
emessa
gialloverde
rossoarancio
L’immunofluorescenza indiretta (IFI)
rappresenta la tecnica di
riferimento per la diagnosi di
laboratorio delle patologie
autoimmuni ed è a tutt’oggi la più
usata per le indagini di primo livello
Questa tecnica fu messa a punto
nel 1941 da Albert Coons
La diagnosi di laboratorio delle malattie autoimmuni si basa sul fatto che
esse sono caratterizzate dalla presenza di autoanticorpi diretti contro
antigeni ubiquitari presenti in tutti i tessuti dell’organismo (elementi del
citoscheletro, antigeni mitocondriali, componenti nucleari, antigeni
ribosomiali).
Ciascuna di esse è associata ad un gruppo particolare di anticorpi, che
ricercati nel siero possono essere utilizzati come marcatori ed aiutare il
clinico nella diagnosi differenziale.
Il metodo IFI si basa sulla capacità di anticorpi antiimmunoglobuline umane
coniugate ad una sostanza fluorescente di rivelare la presenza di anticorpi
fissati ad antigeni specifici espressi in substrati diversi costituiti da cellule
in coltura e/o sezioni di tessuti murini o di primate e fissati su vetrino.
antigene
Radiazione emessa
Anticorpo non marcato
Anticorpo marcato
Radiazione rivelata
La fluoresceina-5isotiocianato
(FITC) è un
colorante fluorescente che
appartiene al gruppo dei
coloranti derivati dallo
xantene.

I fluorocromi sono in grado di essere rilevati
grazie al microscopio a fluorescenza
Lampada a globo di quarzo
contenente vapori di
mercurio ad alta pressione
I filtri
Il filtro di eccitazione lascia passare
solo le lunghezze d’onda utili per
l’eccitazione della fluorescenza,
mentre il filtro di sbarramento
trattiene la radiazione non assorbita
e lascia passare solo la luce dovuta
alla fluorescenza.
Filtro di
sbarramento
Filtro di eccitazione
Led (Light Emitting Diode)
Diodo emettitore di luce
CAMPIONE
I led emettono un’incredibile quantità di luce bianca fredda a fronte di
un basso consumo e una altissima durata.
Hanno vita utile tra le 30000 – 50000 ore.
Molto resistenti a vibrazioni e urti, oltre che ad umidità e freddo
(l' accensione è possibile anche a temperature molto basse).
La luce che arriva al vetrino è incidente e proviene dal basso.
Non necessitano di allineamento lampada.
Il loro raggio di illuminazione è molto stretto, pertanto no filtri.
Necessita di diverse cassette, una specifica per la fluorescina, una
per la rodamina.
Le lampade a globo di quarzo offrono durata abbastanza elevata, ma
richiedono diversi minuti prima di riscaldarsi e quindi poter fornire luce
accettabile. Inoltre dopo essere spente bisogna attendere 10-15 minuti
per farle raffreddare prima di poterle riaccendere. Devono essere
allineate, prima del funzionamento.
E’ raccomandato un utilizzo di 200 – 300 ore, perché questo tipo di
lampade ha un’emissione che tende a decrescere nel tempo.
La lampada
emette tutti i
colori
A = lampada
B = filtro
C = filtro che diminuisce l’intensità della luce
D = filtro primario. Seleziona lunghezze
d’onda comprese tra 450 – 490 nm
E = specchio dicromatico. Riflette le
lunghezze d’onda più basse assorbite dalla
fluorescina e trasmette le più alte emissioni
F = obiettivo. Dirige la luce sul vetrini e
permette la visione della luce emessa
G = portavetrino
H = filtro secondario
I = oculare
Obiettivo
Lunghezza 160 mm
Spessore
coprivetrino
che dovrebbe avere il
Obiettivo planare (il campo inquadrato risulta
piatto)
Apertura numerica (NA): massimo angolo
con cui la lente raccoglie la luce
Ingrandimento effettuato

Il metodo può essere eseguito in manuale o in automatico
La reazione in immunofluorescenza è dipendente da diversi fattori:
anticorpi del paziente (concentrazione, specificità, avidità, classe)
substrato
condizioni di reazione (forza ionica del tampone e pH, condizioni di
incubazione, caratteristiche del coniugato)
settaggio del microscopio
Pertanto è essenziale:
la standardizzazione della metodica di esecuzione
la standardizzazione della lettura dei preparati
La ricerca dei vari autoanticorpi sui corrispondenti substrati si esegue di
solito ad una diluizione iniziale del siero prestabilita secondo metodica ed
eseguita con tampone fosfato o soluzione salina. La diluizione iniziale del
campione da analizzare è fondamentale per ottenere la massima
specificità del test senza diminuirne la sensibilità.
La diluizione iniziale del campione dipende dal tipo di anticorpo ricercato e
dalla specificità del metodo; molti produttori raccomandano uno specifico
titolo di cut-off da usare come diluizione per lo svolgimento di un
determinato test.
Per determinare il titolo da utilizzare per lo screening il dosaggio
andrebbe eseguito su numerose diluizioni di siero di controllo ottenuto da
soggetti non affetti da malattie autoimmuni.
La diluizione che generi una positività del 5-10% per tutta la popolazione
di controllo costituisce un ragionevole punto di partenza per evitare
l’eccesso di falsi positivi, pur mantenendo una sensibilità adeguata alla
rivelazione dei casi di malattia.
Diluire il siero con
PBS
Porre il liquido di
montaggio e il
vetrino coprioggetto
Lavare con PBS
Porre nella vaschetta di
Coplin. Tre cicli di 5 min.
Depositare
controllo positivo
controllo negativo
Incubare in camera umida
per 30 min
campione
Osservazione al microscopio
a fluorescenza
NO sieri lipemici
No sieri emolitici
NO sieri con contaminazione batterica
Incubare in camera umida
per 30 min
Lavare con PBS
che possono causare autofluorescenza dei preparati
Porre nella vaschetta di
Coplin. Tre cicli di 5 min.
Depositare su tutti i pozzetti
l’anticorpo secondario coniugato con
FITC
per la possibile presenza di enzimi proteolitici che possono
danneggiare i substrati
I campioni di siero possono essere conservati senza problemi per
alcune settimane in frigorifero a 4°C o per periodi più lunghi a
–20°C o a temperature inferiori.
I congelamenti protratti possono però provocare fenomeni di
liofilizzazione con cambiamenti anche sostanziali del titolo
anticorpale.
Scongelamenti e ricongelamenti frequenti possono essere causa di
perdita di attività anticorpale.

Il substrato adeso al vetrino può essere rappresentato da cellule o
sezioni di tessuto, contenenti differenti determinanti antigenici. La
scelta del substrato determinerà l’anticorpo da rivelare. Così ad
esempio, le cellule Hep-2 sono usate per rilevare anticorpi per
antigeni nucleari (ANA), il triplo tessuto di ratto è usato per molti
anticorpi citoplasmatici, i neutrofili umani sono usati per gli anticorpi
antineutrofili citoplasmatici (ANCA).
Cellule Hep-2
Sezioni di tessuto di ratto
Tempi di incubazione più lunghi dei
30 minuti non aumentano la
specificità della reazione, ma al
contrario favoriscono legami
aspecifici
Il mezzo di montaggio è costituito da
glicerolo al 10% in PBS a pH variabile
tra 8,3 e 9,1. Varie sostanze chimiche
possono essere aggiunte al liquido di
montaggio (DABCO, PPD, NPG) per
migliorarne la ritenzione della luce
fluorescente.
Granulociti neutrofili umani
Sezioni di tessuto di primate
La preparazione dei substrati è un punto fondamentale e particolarmente delicato:
l’obiettivo fondamentale è la conservazione della morfologia delle strutture, la non
denaturazione degli antigeni, l’accessibilità all’antigene da parte di ciascun reagente
anticorpale.
Preparazione dei substrati tessutali
Il congelamento rapido con azoto liquido o con isopentano raffreddato con azoto
liquido o con CO 2 solida (è considerato il metodo più adatto per conservare l’integrità
antigenica del substrato e la morfologia del preparato in esame)
Inclusione in paraffina (ottimo per conservare ed evidenziare le caratteristiche
morfologiche del substrato, ma la fissazione e le procedure di inclusione possono far
perdere parzialmente o completamente reattività antigenica al preparato)
Preparazione delle cellule
Allestimento di colture per ottenere monostrati cellulari.
Fissazione per mantenere integra la struttura antigenica.
I metodi di fissazione possono essere molto diversi e non sempre sono chiaramente
specificati nei foglietti illustrativi che accompagnano i prodotti; le tecniche di
fissazione più comuni sono quelle in metanolo-acetone ed in paraformaldeide-TritonX
per le cellule Hep-2; etanolo, formaldeide e metanolo per granulociti neutrofili.
La permeabilizzazione delle membrane cellulari con un solvente lipidico è necessaria per
consentire la penetrazione degli anticorpi all’interno delle cellule.
Vengono generalmente impiegati
anticorpi policlonali di pecora o coniglio
anti IgG umane coniugati con
isotiocianato di fluorescina. L’uso di
coniugati monospecifici è preferibile
dal momento che IgM ed IgA hanno
scarso significato clinico e riducono la
specificità del test. Le caratteristiche
del coniugato sono perciò molto
importanti per la qualità finale
dell’esame.
L’impiego del blu di Evans riduce la
fluorescenza aspecifica di fondo
controcolorando le strutture che non
hanno legato il coniugato.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Nella lettura dei vetrini gli aspetti da valutare sono rappresentati:
quadro fluoroscopico
titolo
Per una corretta interpretazione dei risultati è necessario che in ogni
seduta analitica vengano inseriti un controllo negativo ed uno positivo.
Il controllo negativo è necessario per una valutazione del grado di
autofluorescenza del preparato e quindi per l’assegnazione dei livelli di
intensità dei campioni.
Il controllo positivo serve a confermare che le procedure di esecuzione
del test sono state compiute correttamente in tutti i vari passaggi.
Il controllo endpoint permette di discriminare il positivo dal negativo: è
infatti il livello minimo di intensità di fluorescenza necessario perché un
campione sia considerato positivo; esso deve essere validato da un
reference range study eseguito sulla popolazione che afferisce al servizio
di medicina di laboratorio.

Nell’interpretazione dei quadri fluoroscopici è
bene considerare che non esiste una
correlazione assoluta tra pattern e tipo di
malattia: essi sono indicativi di diverse malattie
autoimmuni; la specificità anticorpale deve
essere successivamente confermata da indagini
di II livello.
Talora in uno stesso siero sono presenti miscele
di autoanticorpi a concentrazione diversa con
diverse specificità e quindi con quadri
fluoroscopici diversi.
L’intensità di fluorescenza osservata può essere espressa con una
valutazione quantitativa discreta ottenuta effettuando diluizioni seriate del
siero fino a scomparsa della fluorescenza, adottando come titolo il reciproco
dell’ultima diluizione in cui si è osservata fluorescenza.
Diluizione 1:40
Diluizione 1:160
Diluizione 1:640
Diluizione 1:80
Diluizione 1:320
Controllo end-point
Se si utilizza un controllo endpoint la diluizione più alta del campione che presenta una
intensità di fluorescenza superiore od uguale al controllo stesso rappresenta il titolo
L’uso di diversi filtri di barriera modifica
sensibilmente l’intensità di fluorescenza visibile e
la definizione delle strutture non fluorescenti
Obiettivo 10X
Filtro secondario: 520–560 nm
Obiettivo 10X
Filtro secondario: 520 nm
Hep-2, obiettivo 40x
L’intensità di fluorescenza osservata può
essere espressa, in accordo con le linee
guida fornite dal Center for Disease
Control (CDC) di Atlanta, con una scala di
valori crescenti da + a ++++.
Intensità di fluorescenza
Può essere fortemente condizionata da variabili che dipendono dal microscopio.
La sorgente luminosa può generare considerevoli differenze nella sensibilità
della tecnica a seconda della lampada impiegata; una sorgente luminosa non
adeguata porta irrimediabilmente ad una non corretta interpretazione del
titolo.
Obiettivo 20x
NA 0,40
Obiettivo 40x
NA 0,70
Obiettivo 100x
NA 1,25
Hep-2; obiettivo 40X.
Lampada nuova
Hep-2
Diversi ingrandimenti
Hep-2; obiettivo 40X.
Lampada vecchia
L’utilizzo di obiettivi a diverso
ingrandimento porta a valutazioni molto
diverse dello stesso campo
fluoroscopico.
Obiettivi a più forte ingrandimento
concentrano la luce; la stessa quantità
di luce illumina un campo più piccolo
perciò l’aumento dell’intensità della
luce porta ad un aumento dell’intensità
di fluorescenza. Inoltre un obiettivo a
più forte ingrandimento ha anche una
maggior apertura numerica; anche
questo contribuisce ad aumentare
l’intensità di fluorescenza.
E‘ necessario che per la definizione del
titolo dei campioni in esame venga
utilizzato sempre lo stesso obiettivo.

L’apertura numerica dell’obiettivo influenza la
risoluzione dell’immagine.
Obiettivi con più grande apertura produrranno
un’immagine più intensa.
Obiettivo 10X
NA 0,40
Ditta A
Obiettivo 10X
NA 0,22
Controllo negativo Controllo positivo t = 1 h
Controllo positivo t = 1 g Controllo positivo t = 7 gg
t = 1h t = 1g
t = 7 gg
Ditta A
Campione 2
Quenching
La fluorescina è sensibile alla luce.
Una lunga esposizione del vetrino riduce la fluorescenza.
Si può cercare di ridurre il problema usando filtri che riducano
l’intensità della luce e aggiungere al mounting medium agenti antiquencing.
La velocità con cui decade la fluorescenza è direttamente proporzionale alla potenza
della lampada, perciò l’intensità di fluorescenza non deve mai essere graduata su
un’area esaminata per definire il pattern fluoroscopico
t = 1h t = 1g
t = 7 gg
Ditta A
Ditta B
Campione 1
Controllo negativo Controllo positivo t = 1 h
Controllo positivo t = 1 g Controllo positivo t = 7 gg

t = 1h t = 1g
t = 7 gg
Ditta B
Campione 1
Controllo negativo Controllo positivo t = 1 h
Controllo positivo t = 1 g Controllo positivo t = 7 gg
t = 1h
t = 7 gg
Ditta C
Ditta C
t = 1g
Campione 2
t = 1h
t = 7 gg
Ditta B
t = 1g
Campione 2
t = 1h t = 1g
t = 7 gg
Ditta C
Ditta D
Campione 1
Controllo negativo Controllo positivo t = 1 h
Controllo positivo t = 1 g Controllo positivo t = 7 gg

t = 1h t = 1g
t = 7 gg
Ditta D
Campione 1
t = 1h t = 1g
t = 7 gg
Controllo positivo kit lotto 1 Campione positivo lotto 1
Proprio perché l’IFI è una
metodica soggettiva sarebbe
raccomandabile che il
campione fosse
letto da due diversi
osservatori per diminuire le
probabilità di registrare un
pattern erroneo.
Controllo positivo kit lotto 2
E E la la storia storia continua… continua…
Ditta D
Campione 2
Campione positivo lotto 2