UNIVERSIT`A DEGLI STUDI DI MILANO BICOCCA Scuola di ...

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO BICOCCA
Scuola di Dottorato di Scienze
Corso di Dottorato di Ricerca in Fisica e Astronomia
Valentina Quercioli
Matricola 700092
Fotodinamica conformazionale di mutanti della GFP
mediante eccitazione non lineare e a due-colori
Tutore
Prof. Giancarlo Baldini, Prof. Giuseppe Chirico
Coordinatore
Prof. Claudio Destri
Ciclo XXI 2005-2008

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Riassunto
Nell’ultimo ventennio ‘la green fluorescent protein’ (GFP) estratta dalla medusa Aequorea
victoria è diventata uno dei più importanti e utilizzati marker in applicazioni
biologiche. Scoperta da Shimomura [8], la GFP è l’unica proteina che può essere espressa
in ogni tipo di cellula, eucariota o procariota, non è dannosa per le cellule e che fluoresce
senza l’ausilio di cofattori esterni [1] (il cromoforo posto all’interno della proteina è infatti
autofluorescente in vivo). Il premio Nobel per la Chimica 2008 è stato assegnato
a Shimomura, Chalfie e Tsien per la scoperta di questa proteina e per i loro importanti
studi in ambito biologico.
La grande versatilità di questa proteina ottenibile tramite mutazioni selettive di particolari
amonoacidi ha portato ad una richiesta sempre crescente di nuovi mutanti con
particolari proprietà spettroscopiche [11]. Ovviamente questa richiesta si scontra con
la necessità di conoscere in modo approfondito i processi fotofisici che avvengono internamente
alla proteina, indispensabile qualora si pensi ad applicazioni biologiche della
GFP, per esempio di tipo sensoristico, di pH o temperatura. Nonostante negli ultimi
anni molti studi e molte simulazioni siano state effettuati una comprensione dettagliata
degli aspetti fotodinamici della GFP è ancora argomento di discussione.
Uno degli strumenti migliori per la loro determinazione consiste nello studio di mutazioni
della proteina ‘wild-type’. Cinque aminoacidi, nella vicinanza o all’interno del cromoforo
stesso, sembrano giocare un ruolo di fondamentale importanza nella fotodinamica della
GFP: S65, H148, T203, S205, and E222. In questo lavoro ci siamo concentrati su tre
di questi aminoacidi, studiando le proprietà dinamiche della fluorescenza della proteina
GFPmut2 e di due sue mutazioni al residuo istidina H148 (mut2G) a al residuo glutammato
E222 (mut2Q) mediante la tecnica della spettroscopia di fluorescenza risolta nel
tempo, nell’intervallo temporale del nanosecondo o del millisecondo. La maggior parte
dei risultati presentati sono stati ottenuti mediante la Spettroscopia di Correlazione della
Fluorescenza (FCS).
Questa tecnica è stata creata per lo studio di dinamiche molecolari [5] e analizza statisticamente
le fluttuazioni dell’intensità di fluorescenza provenienti dalle poche molecole
contenute nel volume di eccitazione (dell’ordine di 10 −15 litri). Queste fluttuazioni hanno
due principali origini: possono infatti essere dovute al moto diffusivo di molecole che
entrano o escono dal volume di eccitazione o da transizioni chimiche tra stati fluorescenti
e non fluorescenti delle molecole che portano a momentanei spengimenti della loro
fluorescenza (quest’ultimo processo va sotto il nome di flickering). Mediante l’ autocorrelazione
delle intensità delle fluttuazioni di fluorescenza si possono ricavare informazioni
di carattere dinamico e termodinamico sulle molecole in esame [3], [7].
Flickering diversi hanno risposte temporali diverse: in particolare, per i tre mutanti studiati,
due tipi di fenomeni di rilassamento sono stati trovati: il primo, pH dipendente, su

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scala temporale da 10-100µs, il secondo, indipendente dal pH ma fortemente dipendente
dalla intensità di eccitazione laser, da 100-500µs. L’importanza della caratterizzazione
temporale dei processi di flickering risiede nel fatto che dal confronto dei risultati ottenuti
dalle diverse proteine si possono ricavare informazioni sul ruolo specifico dei particolari
aminoacidi coinvolti nelle mutazioni.
In particolare, dal processo dipendente dal pH è stato determinato il ruolo dell’istidina
148: per il mutante in cui questo residuo è stato sostituito con una glicina, è stato trovato
un aumento di circa tre volte nella rate di protonazione, indicando quindi che il processo
di protonazione-deprotonazione del cromoforo, che avviene mediante uno scambio di protoni
dalla soluzione al cromoforo stesso, viene fortemente mediato dall’istidina 148 che
svolge quindi un’azione shermante per il cromoforo.
Dai risultati ottenuti sull’altro processo di flickering dalla proteina in cui è coinvolta la
mutazione al residuo E222 è stato possibile determinare che questo processo di rilassamento,
indipendente dal pH, che avviene allo stato eccitato e che non è inibito dalla
mutazione come ci saremmo aspettati, è probabilmente legato a particolari fenomeni
di riarrangiamenti conformazionali nelle vicinanze del cromoforo che avvengono subito
dopo la fotoeccitazione.
Negli ultimi anni una nuova classe di mutanti della GFP con la proprietà di essere
fotoattivbili è stata scoperta [4], [2], [6]. Per fotoattivazione si intende una rapida conversione
ad uno stato fluorescente mediande l’ eccitazione di molecole con una seconda
sorgente laser. Queste proteine sono molto interessanti soprattutto per le loro molteplici
applicazioni (per esempio nel trackinng di queste molecole all’interno di cellule [10] o nei
dispositivi optoelettronici di nuova generazione, quali memorie ottiche o switches ottici)
[9]).
Il mutante mut2Q ha mostrato questo fenomeno di fotoattivazione che è stato caratterizzato
in questo lavoro, mediante l’eccitazione simultanea di un campione con un laser
di ‘pump’ (488nm) e uno di ‘probe’ (in un range variabile tra 390-430nm). Eccitando
con questa configurazione una soluzione di mut2Q a pH basico è stato osservato che la
fluorescenza totale proveniente dal campione non era data dalla somma delle emissioni di
fluorescenze ottenute eccitando singolarmente il campione o solo con il laser di pump o
solo con il laser d probe, ma mostrava un incremento di circe tre volte. Per caratterizzare
questo incremento e capirne l’origine sono state effettuate misure cambiando parametri
e usando tecniche diverse.
Per esempio, è emersa una forte dipendenza dall’intensità di eccitazione del laser di
pump, la lunghezza d’onda di probe (con un massimo a 420nm) e il pH. Uno dei risultati
più significativi di questo lavoro è la caratterizzazione dinamica di questo processo di
incremento dell’intensità di emissione di fluorescenza, mediante la determinazione del
suo tempo di attivazione τ e (il processo è dell’ordine del millisecondo). Tale risultato è
stato raggiunto combinando due diverse tecniche, la spettroscopia modulata nel dominio
delle frequnze e la Spettroscopia di Correlazione della Fluorescenza (FCS).

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E’ stato infine proposto un modello teorico in cui almeno cinque differenti livelli energetici
sono coinvolti, che tiene conto dei risultati ottenuti in funzione dei diversi parametri e
delle diverse tecniche utilizzate.
Il particolare comportamento di fotoattivazione mostrato dal mutante mut2Q apre la
strada a numerose applicazioni biologiche, per esempio a livello di imaging cellulare
nell’acquisizione di immagini con un maggiore rapporto segnale rumore, o per lo studio
di processi cellulari dell’ordine del tempo di attivazione monitorati tramite spostamenti
nella risposta modulata del mutante e infine, nello sviluppo di applicazioni sensoristiche
per rivelare variazioni locali di pH all’interno della cellula.

Bibliography
[1] Chalfie et al. Science, 263:802–805, 1994.
[2] Habuchi et al. PNAS, 102(27):9511–9516, 2005.
[3] Haupts et al. PNAS USA, 95:13573–13578, 1998.
[4] Jung et al. Biophys. J., 88:1932–1947, 2005.
[5] Magde et al. Phys. Rev. Lett., 29:705–708, 1972.
[6] Patterson et al. Science, 297:1873–1877, 2002.
[7] Schwille et al. Biophysical Journal, 77:2251–2265, 1999.
[8] Shimomura et al. J. Cell. Comp., 59:223–239, 1962.
[9] Irie. Chem. Rev., 100:1685–1716, 2000.
[10] Politz. Trends Cell. Biol., 9:284, 1999.
[11] Tsien. Ann. Rev. Biochem., 67:509–544, 1998.
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