GISNe - Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale

GRUPPO ITALIANO DI
SCIENZE NEUROENDOCRINE
(GISNe)
Comitato organizzatore locale
Roberto Cosimo Melcangi
Giancarlo Panzica
1° RIUNIONE SCIENTIFICA
22 FEBBRAIO 2007
Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina legale,
corso M. D'Azeglio 52 TORINO
PROGRAMMA E RIASSUNTI DELLE
COMUNICAZIONI

9.45-11.00
PRESENTAZIONE DEL GISNe ed
CONVEGNO
APERTURA DEL
11.00-11.20
NEUROENDOCRINOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE
ELENA DOZIO (MILANO
IL LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR INDUCE LA CHEMOMIGRAZIONE DI
NEURONI IMMORTALIZZATI GnRH-SECERNENTI ATTRAVERSO
L'ATTIVAZIONE INDIPENDENTE DELLE VIE DI SEGNALE JAK/STAT3,
MAPK/ERK1/2 AND PI3-K/AKT. (A01)
MARIA FOSCA FRANZONI (TORINO)
ENDOCANNABINOIDI E ATTIVITÀ' RIPRODUTTIVA IN PESCI E ANFIBI. (A02)
11.20-12.50
ORMONI TIROIDEI E STEROIDEI
ALBERTO VERROTTI (CHIETI)
ORMONI TIROIDEI NEI PAZIENTI EPILETTICI TRATTATI CON
CARBAMAZEPINA ED ACIDO VALPROICO. (A03)
MERCEDES FERNANDEZ (BOLOGNA)
CELLULE STAMINALI E ORMONE TIROIDEO. (A04)

GIULIA D'INTINO (BOLOGNA)
UTILIZZO DI TRIIODOTIRONINA (T3) PER FAVORIRE LA
RIMIELINIZZAZIONE NEL MODELLO DI SCLEROSI MULTIPLA IN PRIMATE
(MARMOSET CALLITHRIX JACCHUS). (A05)
PATRIZIA MUZZI (TORINO)
GLI ORMONI TIROIDEI MATERNI SONO ATTIVI NELLA TRASCRIZIONE
DURANTE LO SVILUPPO EMBRIONALE: RISULTATI SU UN MODELLO DI
TOPO TRANSGENICO. (A06)
GIOVANNA DANZA (FIRENZE)
SELADIN-1/DHCR24 NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE: EFFETTI
NEUROPROTETTIVI E REGOLAZIONE ORMONALE. (A07)
SARA MARIA BONOMO (MILANO)
IL PERIODO PERIMENOPAUSALE: UN POSSIBILE FATTORE DI RISCHIO PER
LO SVILUPPO DI PATOLOGIE NEURODEGENERATIVE. (A08)
ROBERTA GIORDANO (TORINO)
NUOVI ASPETTI DI REGOLAZIONE DELL'ASSE IPOTALAMO-IPOFISI-
SURRENE (HPA) NELL'UOMO: RUOLO DEI RECETTORI PER I
MINERALCORTICOIDI. (A09)
MARIA CRISTINA MOSTALLINO (CAGLIARI)
MODIFICAZIONI DELL'ESPRESSIONE GENICA DEL RECETTORE GABA-A IN
CELLULE IPPOCAMPALI IN COLTURA INDOTTE DAL PROGESTERONE. (A10)
ILARIA ROGLIO (MILANO)
STEROIDI NEUROATTIVI E NEUROPATIA PERIFERICA. (A11)

14.00-17.30
ASPETTI COMPORTAMENTALI E MECCANISMI
NEUROENDOCRINI
LEONIDA FUSANI (SIENA)
RUOLO DEGLI ESTROGENI OVARICI ED EXTRAGONADICI NEI PROCESSI DI
MEMORIA SPAZIALE. (A12)
SIMONE MACRÌ (ROMA)
LIVELLI AUMENTATI DI CORTICOSTERONE MATERNO RIDUCONO LA
VARIABILITÀ INTERINDIVIDUALE IN PARAMETRI ENDOCRINI,
COMPORTAMENTALI E IMMUNITARI NELLA PROLE ADULTA DEL TOPO.
(A13)
FRANCESCA CIRULLI (ROMA)
RUOLO DELLE NEUROTROFINE NELLE REGOLAZIONI NEUROENDOCRINE E
NELLA VULNERABILITÀ ALLO STRESS: MODELLI ANIMALI. (A14)
ELENA MURA (TORINO)
EFFETTI DEGLI XENOESTROGENI SUL DIFFERENZIAMENTO DEL
COMPORTAMENTO E DEI RELATIVI CIRCUITI NERVOSI. (A15)
ALESSANDRA COLCIAGO (MILANO)
GENI BERSAGLIO DEI BIFENILIPOLICLORURATI: INFLUENZE
DELL'INQUINAMENTO AMBIENTALE SULLA DIFFERENZIAZIONE
CEREBRALE. (A16)
PAOLA SACERDOTE (MILANO)
INTERAZIONI NEUROENDOCRINO-IMMUNOLOGICHE NELLO STRESS
CHIRURGICO. (A17)

MARCO LUPPI (BOLOGNA)
STUDIO DELLA SECREZIONE DI ARG-VASOPRESSINA INDOTTA PER
INFUSIONE INTRACEREBROVENTRICOLARE DI SOLUZIONI IPERTONICHE
DURANTE LE FASI DEL CICLO VEGLIA-SONNO NEL RATTO. (A18)
ANDREA SGOIFO (PARMA)
LO STRESS SOCIALE: DIFFERENZE INDIVIDUALI NELLA REATTIVITA'
SIMPATO-ADRENERGICA E NEUREOVEGETATIVA CARDIACA. (A19)
GIUSEPPINA PISU (CAGLIARI)
L'ISOLAMENTO SOCIALE ALTERA LA PLASTICITÀ E LA FUNZIONE DEL
RECETTORE GABA-A. (A20)
ALESSANDRO BARTOLOMUCCI (PARMA)
REGOLAZIONE NEUROENDOCRINA ED AMBIENTALE DI PATOLOGIE
METABOLICHE E COMPORTAMENTALI. (A21)
RITA BERARDELLI (TORINO)
ASPETTI NEUROENDOCRINI NELL'ANORESSIA NERVOSA. (A22)
ANDREA MARCANTONI (TORINO)
ACCOPPIAMENTO CANALI DEL CALCIO-SECREZIONE IN CELLULE
CROMAFFINI SURRENALI ISOLATE. (A23)
GLORIA BIGI (MILANO)
LA COMPARSA PRECOCE DELLA TOLLERANZA ALL'EFFETTO
IPOFAGIZZANTE DELL'ANTAGONISTA DEL RECETTORE DEI
CANNABINOIDI SR141716 NON ANNULLA IL BLOCCO DELL'EFFETTO
ORESSIGENICO DI HEXARELINA, UN AGONISTA DEL RECETTORE DELLA
GHRELINA. (A24)

LORENZA BONELLI (TORINO)
EFFETTI DI GHRELIN IN FORMA ACILATA E NON ACILATA SULLA
SECREZIONE SPONTANEA E STIMOLATA DI GONADOTROPINE. (A25)
MARCELLA BALBO (TORINO)
SISTEMA SEROTONINERGICO E REGOLAZIONE NEURO-ORMONALE. (A26)
ROBERTA POSSENTI (ROMA)
LA PROTEINA NEUROSECRETORIA VGF È IL PRECURSORE DI PEPTIDI
BIOLOGICAMENTE ATTIVI. (A27)
FABRIZIO RIGANTI (TORINO)
PATOLOGIE ENDOCRINO-METABOLICHE E ALTERAZIONI QUALITATIVE E
QUANTITATIVE DEL SONNO. RISULTATI PRELIMINARI DI STUDI
ACTIGRAFICI NELL'UOMO. (A28)
GIUSEPPE FANCIULLI (SASSARI)
GLUTEN EXORPHIN B5: UN PEPTIDE OPPIOIDE ALIMENTARE IN CERCA DI
AZIONI BIOLOGICHE. (A29)
SARA BONDIONI (MILANO)
RETINOIDI ED ESPRESSIONE DEL RECETTORE DOPAMINERGICO D2 IN
TUMORI IPOFISARI SECERNENTI E NON SECERNENTI UMANI. (A30)
ERIKA PEVERELLI (MILANO)
IL TERZO LOOP INTRACELLULARE DEL RECETTORE SST5 UMANO È
CRUCIALE PER L'INTERNALIZZAZIONE DEL RECETTORE DOPO
STIMOLAZIONE CON SOMATOSTATINA-28. (A31)
MARTA ANNUNZIATA (TORINO)
GLI ANALOGHI DELLA SOMATOSTATINA E GLI ANTAGONISTI DEL GHRH
INIBISCONO LA PROLIFERAZIONE E LA SOPRAVVIVENZA DELLE CELLULE
ENDOMETRIALI ECTOPICHE. (A32)

Il Leukemia Inhibitory Factor induce la Chemomigrazione di Neuroni
Immortalizzati GnRH-Secernenti attraverso l’Attivazione Indipendente delle Vie
di Segnale JAK/STAT3, MAPK/ERK1/2 and PI3-K/Akt
Elena Dozio, Massimiliano Ruscica, Marcella Motta, Roberto Maggi, Paolo Magni
Istituto di Endocrinologia, Centro di Eccellenza per le Malattie Neurodegenerative,
Università degli Studi di Milano, Milano, Italia.
Il Leukemia Inhibitory Factor (LIF) è una citochina pleiotropica appartenente alla
famiglia dell’interleuchina-6. Poichè si conoscono ancora poco gli effetti del LIF sulla
funzione riproduttiva a livello centrale, mentre sono più conosciuti quelli a livello
periferico, abbiamo voluto studiare il possibile coinvolgimento del LIF nello sviluppo
dei neuroni GnRH-secernenti. Nel presente studio sono state utilizzate, come modello
in vitro, le cellule GN11, una linea di neuroni murini GnRH-secernenti immaturi. Le
cellule GN11 esprimono recettori funzionali per il LIF (analisi RT-PCR,
Immunocitochimica e Western Blot), la cui attivazione è risultata in grado di
stimolare entro 3 h sia la chemiotassi (migrazione in presenza di gradiente di
concentrazione) che la chemiocinesi (migrazione in assenza di gradiente di
concentrazione) delle cellule, con la massima efficacia alla concentrazione di 100
ng/mL (Boyden’s chamber) e mediante l’attivazione delle vie di segnale
JAKs/STAT3, MAPK/ERK1/2 e PI3-K/Akt (analisi Western Blot). L’inibizione
selettiva delle proteine JAKs, MEK and PI3-K ha suggerito che tali vie sono attivate
in modo indipendente e che JAK2 non è la principale chinasi attivata dal LIF (analisi
Western Blot, Boyden’s chamber assay). Queste osservazioni suggeriscono che il LIF
potrebbe essere coinvolto nella migrazione dei neuroni GnRH durante lo sviluppo
embrionale attraverso l’attivazione di segnali intracellulari differenti e indipendenti.

GnRH neurons are possibly targeted by endocannabinoids: an immunohistochemical study in the
amphibian brain
Franzoni MF
Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo, Università di Torino, Via Accademia Albertina,13.
TORINO
Cannabinoids and their endogenous counterpart endocannabinoids control various
functions through the CB1 and CB2 cannabinoid receptors. CB1 receptors are the most
abundant G-protein-coupled receptors in the mammalian CNS, suggesting their
participation to important behavioral and physiological effects. Since CB1 was also
characterized in the CNS of fish, amphibians, birds and also in many invertebrates, it was
assumed that the endocannabinoid signalling system does represent a highly conserved key
neuromodulatory system.
The involvement of CB1 in reproductive function was reported in mammals. Therefore in
this study, by means of immunohistochemistry supported by laser confocal microscopy,
the neuroanatomical relationships between cannabinergic innervation and gonadoliberin
(GnRH)-containing neurons have been studied in the prosencephalon of the green frog
Rana esculenta and the clawed toad Xenopus laevis (Anuran amphibians).
CB1 immunostained neurons and nerve fibers are distributed in the prosencephalon of both
species and, after the double immunofluorescence labelling, a close contiguity
between CB1-like- and GnRH-like-immunoreactive neural systems has been observed in
the mediobasal telencephalon, preoptic area and hypothalamus.
To better assess the possible colocalization of CB1 and GnRH in the same neuron or nerve
terminal, the double immunostained sections were observed with a laser confocal microscope.
Although the majority of immunostained neurons shows either GnRH- or
CB1-like-immunoreactivity, a few neurons and nerve terminals exhibit double labellings
suggesting that a subgroup, at least, of the GnRH neurons is targeted by the endocannabinoids.
Financial support by MURST (ex-60% 2004) to MFF
,

ORMONI TIROIDEI NEI PAZIENTI EPILETTICI TRATTATI CON
CARBAMAZEPINA ED ACIDO VALPROICO
Alberto Verrotti, Alessandra Scardapane, Rossella Manco, Francesco Chiarelli
Clinica Pediatrica, Università di Chieti
INTRODUZIONE: Alcuni studi hanno evidenziato cambiamenti nei livelli sierici
degli ormoni tiroidei nei pazienti epilettici trattati con carbamazepina (CBZ) ed acido
valproico (VPA) con risultati contrastanti.
SCOPI: In questo studio sono stati analizzati i cambiamenti nei livelli sierici di
ormoni tiroidei durante il trattamento con CBZ e VPA ed è stata valutata la
concentrazione degli ormoni tiroidei dopo test di stimolazione con ormone tiroidostimolante
(TSH) in un gruppo di bambini epilettici trattati con questi farmaci.
METODI: La terapia con CBZ e VPA può essere associata a diversi effetti avversi di
tipo endocrinologico. In questo studio sono state analizzate le alterazioni dei livelli
sierici di ormoni tiroidei in 37 bambini trattati con CBZ e VPA per diversi tipi di
epilessia. Negli stessi pazienti sono state inoltre valutate le concentrazioni sieriche di
ormoni tiroidei dopo test con ormone di rilascio della tireotropina (TRH test).
RISULTATI: I livelli sierici di tiroxina (T 4 ) e di free-tiroxina (FT 4 ) erano
significativamente più bassi nei pazienti trattati con CBZ (T 4 67,6 ±11,2 nmol/L vs
89,9 ±13,9 p

CELLULE STAMINALI E ORMONE TIROIDEO
Fernandez M., Pirondi S., Pardisi M., Chen B.L., Calzà L.
Animal Stem Cell Laboratory – DIMORFIPA, Università di Bologna
L'ormone tiroideo, agendo attraverso i suoi recettori tipo α e β (TRα1,2, TRβ1,2) ha un ruolo
fondamentale nello sviluppo del sistema nervoso, regolando proliferazione, sopravvivenza e
differenziazione dei precursori neuronali e gliali. In particolare, sviluppo e maturazione degli
oligodendrociti sono sotto il controllo dell'ormone tiroideo. Cellule “neurali staminali” e precursori
degli oligodendrociti sono anche presenti nel sistema nervoso centrale dei mammiferi adulti, più
specificamente nel giro dentato dell'ippocampo e nella zona subventricolare (SVZ) le prime, sparsi
in sostanza bianca e grigia i secondi. In studi precedenti abbiamo osservato che il grado di
maturazione dei precursori degli oligodendrociti ottenuti dalla SVZ di animali adulti ipotiroidei era
inferiore rispetto a quelli ottenuti da animali eutiroidei. Al contrario, i precursori degli
oligodendrociti ottenuti dalla SVA di animali ipertiroidei presentavano una maturazione accelerata.
Utilizzando lo stesso modello di precursori neurali staminali ottenuti dalla SVZ di animali adulti
(“neurosfere”), stiamo studiando gli effetti del trattamento in vitro con T3 sia nella proliferazione,
che sul differenziamento. Per quanto riguarda la proliferazione, stiamo studiando gli effetti del T3
nella capacità di formare neurosfere (numero e grandezza). Nella fase finale di proliferazione, le
neurosfere sono utilizzate: i) per la caratterizzazione immunocitochimica e quindi lo studio
dell'espressione di proteine marcatori di cellule indifferenziate e precursori neurali dei lineage
neuronale e gliale, quali nestina, doublecortina, vimentina, NG2; ii) per l'estrazione del RNA
messaggero per lo studio dell'espressione dei geni (real-time PCR) che codificano per le proteine
recettori dell'ormone tiroideo (TRα, TRβ) così come altri geni coinvolti nel differenziamento dei
precursori neurali verso il lineage oligodendrocitico (geni della famiglia olig). Inoltre, si sta
studiando anche l'effetto del trattamento in vitro con T3 nella capacità di differenziamento dei
precursori ottenuti durante la fase di proliferazione, trattati e non con T3 durante la fase di
differenziamento, utilizzando a questo scopo le metodiche d'immunocitochimica e biologia
molecolare. Oltre al modello di cellule staminali neurali dalla SVZ di ratti adulti, stiamo lavorando
con cellule staminali otttenute della cute di ratti (1 giorno post-natale) e cellule staminali embrionali
di ratto. Anche in questi modelli sperimentali si sta studiando l'effetto dell'ormone tiroideo nella
capacità delle cellule di proliferare e di differenziamento verso lineages specifici.

Utilizzo di triiodotironina (T3) per favorire la rimielinizzazione nel modello di
sclerosi multipla in primate (marmoset Callithrix jacchus).
1 D’Intino G., 1 Lorenzini L., 2 Perretta G., 2 Taglioni A., 1 Sivilia S., 1 Giardino L., 1 Calzà
L.
1 DIMORFIPA, Università di Bologna; 2 Dipartimento di Zoologia e Modellli Animali,
CNR, Roma
L’encefalomielite allergica sperimentale (EAE), è il modello animale utilizzato per lo
studio della sclerosi multipla umana, malattia neurodegenerativa carattterizzata da
fenomeni infiammatori e di demielinizzazione. Il nostro laboratorio ha utilizzato il
modello dell’EAE in ratte femmine Lewis e Dark-Agouti, per studiare eventuali
strategie farmacologiche e terapeutiche atte a potenziare la rimielinizzazione, e
risultati promettenti sono stati ottenuti mediante trattamento con ormone tiroideo nella
fase acuta della patologia. Per avere conferma dell’efficacia del trattamento con
ormone tiroideo nel favorire la rimielinizzazione nel modello dell’encefalomielite
allergica sperimentale, abbiamo ripetuto l’esperimento nel primate marmoset
(Callithrix jacchus). Grazie infatti a caratteristiche filogenetiche molto vicine
all’uomo, il marmoset risulta essere altamente suscettibile alla malattia, presentando
fenomeni infiammatori, di demielinizzazione, patologia assonale e lesioni della
sostanza grigia simili alla sclerosi multipla. Il modello di malattia in questo primate si
ottiene mediante 4 iniezioni intradermiche, rispettivamente nei cavi ascellari e nei
cavi inguinali, con una soluzione di 100µl costituiti da MOG 1-125rh umana,
adiuvante completo di Freud e Micobatterio tubercolosis. Un gruppo di animali è stato
in seguito trattato con triiodiotironina (T3, 10microgr/Kg intramuscolo) a tempi
stabilti (giorno 12,13,14 e 26,27,28). Gli animali sono stati osservati monitorando
l’andamento clinico della malattia, mediante l’utilizzo di una scala espansa per la
valutazione di disabilità sensoriali e motorie in cui si attibuisce un punteggio da 0 a
45. E’ stata inoltre utilizzata la risonanza magnetica per monitorare le lesioni cerebrali
al giorno 15 ed al giorno 40 successivi all’immunizzazione. Sia gli animali trattati che
non trattati con ormone tiroideo hanno sviluppato la malattia tra i giorni 30 e 32 dopo
l’immunizzazione e negli animali non trattati la gravità della malattia ha raggiunto un
punteggio di 15 al 42 gg dopo l’immunizzazione. Negli stessi tempi (giorno 42), il
punteggio degli animali trattati con ormone tiroideo è stato di 7, evidenziando quindi
l’efficacia del trattamento con ormone tiroideo (t di Student p≤0,05).
Nell’ottica di valutare il danno mielinico, è stato esaminato 1 cm su midollo spinale
lombare mediante colorazioni istologiche specifiche per la mielina (Sudan black,
luxolo fast blue), misurando l’area di demielinizzazioneGli animali EAE non trattati
hanno mostrato una estesa demielinizzazione (52,9%+/-1,7%), significativamente
superiore rispetto agli animali trattati con T3 (42,3%+/-1,2%; t di Student p≤0,001). I
risultati positivi ottenuti su questo modello rappresentano il punto di partenza per lo
sviluppo di un protocollo clinico in cui viene somministrato la triiodotironina (T3)
come adiuvante nella terapia della sclerosi multipla (fase 2).
.
1 Animal Stem Cell Laboratory, DIMORFIPA, University of Bologna, Via Tolara di
Sopra 50, 40064 Ozzano Emilia (Bologna), Italy; 3 Veterinary Hospital
“Valdinievole”, Valdinievole Pistoia, Italy;.

Animal models for neurodegenerative diseases represent an irreplaceable tool for
pathophysiology studies and new therapies development. Experimental Allergic
Encephalomyelitis (EAE) is a reliable and used animal model for multiple sclerosis
(MS), the most diffuse demyelinating human disease. We have extensively used the
rat model of EAE induced by active immunization in Lewis and Dark-Agouti female
rats to study pharmacological strategies aimed to potentiate remyelination. Promising
results obtained treating rats with thyroid hormone have generated clinical protocols
(phase 2 trial). However, in order to further support the use of triiodothyronine (T3) in
human as adjuvant therapy for MS, we are repeating rat experiments in the common
marmosets (Callithrix jacchus) immunized with human myelin-oligodendrocyte
glycoprotein (1-125rh-MOG, a generous give by Dr. P. Villoslada, Navarra
University, Pamplona, Spain). This primate is in fact phylogenetically close to human,
highly susceptible to the disease, which presents inflammation, demyelination, axonal
pathology and grey matter lesion. EAE was induced in 18 common marmoset, N=10
female and N=8 male; age 56.2+9.5 months (range 18-138 months). Animals were
intradermally injected two in axillary and two in inguinal regions with 100microl each
side (100microg MOG + 3mg/ml Micobacterium tubercolosis in CFA 50%v/v, under
ketamine anaesthesia). A group of animals was treated with T3 (10microg/kg im, at
days 12,13,14 and 26,27,28 after immunization). Animals were observed for clinical
signs of the disease by using an expanded scale for neurological sensory and motor
disabilities, ranging from 0 to 45. Human endpoint was established at score 20. MRI
(T2-weighted images) was also used to monitor brain lesion 15 and 40 days after
injection. Inclusion criteria was established at score 5 (min). Both untreated and
treated animals develop the disease 30-32 days after immunization and the severity of
the disease reaches score 15 in untreated animals 42 days after immunization. At the
same time, mean score in T3-treated animals was 7, proving efficacy of the treatment
(Student’s t test p

MATERNAL THYROID HORMONES ARE TRANSCRIPTIONALLY ACTIVE DURING
EMBRYONIC DEVELOPMENT: RESULTS FROM A TRANSGENIC MOUSE MODEL
Carmelo Nucera 1,4,6, , Patrizia Muzzi 2 , Cecilia Tiveron 3 , Antonella Farsetti 4,5 , Fabiola Moretti 4,5,
Linda Della Pietra 4 , Francesca Mancini 4 , Ada Sacchi 4 , Laura Tatangelo 3 , Andrea Giaccari 6 ,
Francesco Trimarchi 1 , Francesco Vermiglio 1 , Alessandro Vercelli 2 , Alfredo Pontecorvi 4,6
1 Sezione di Endocrinologia-Dipartimento Clinico-Sperimentale di Medicina e Farmacologia, University of Messina,
Messina (Italy). 2 Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale, University of Torino, Torino (Italy). 3 Centro
Telethon, Istituto Regina Elena, Roma (Italy). 4 Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Regina Elena, Roma
(Italy). 5 Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare, C.N.R. di Roma (Italy). 6 Istituto di Endocrinologia, Università
Cattolica del Sacro Cuore “A. Gemelli”, Roma (Italy).
Abstract
Even though several studies highlighted the role of maternal thyroid hormones (TH) during
development, direct evidence of their interaction with embryonic thyroid receptors (TRs) is still
lacking. To this end, we generated a transgenic mouse ubiquitously expressing a reporter gene tracing
TH action during embryo-fetal development. We engineered a construct (TRE2x) containing two THresponsive
elements controlling the expression of the LacZ reporter gene which encodes for betagalactosidase
(ß-gal). TRE2x specificity was evaluated in NIH3T3 cells by cotransfecting TRE2x along
with TRs and retinoic or estrogen receptors with their specific ligands. TRE2x transactivation was
observed only upon physiological T3 stimulation, mediated exclusively by TRs. TRE2x microinjected
zygotes were implanted into pseudopregnant BDF1 mice. Transient transgenic embryos were screened
both by ß-gal enzymatic activity assay and polymerase chain reaction (PCR). ß -gal staining, absent up
to embryonic day 9.5 (E9.5), was observed at E11.5-E12.5 until the onset of fetal thyroid function
(FTF) (E17.5) in several tissue primordia. Immunohistochemical TRs localization was essentially
overlapping with ß-gal staining. Interestingly, no ß-gal staining was detected in embryos of
hypothyroid transgenic mice. Our results provide the first in vivo direct evidence that during embryonic
life and before the onset of FTF, maternal TH are transcriptionally functional through the action of
embryonic TRs.

SELADIN-1/DHCR24 nel sistema nervoso centrale: effetti neuroprotettivi e regolazione
ormonale.
Giovanna Danza, Susanna Benvenuti, Paola Luciani, Fabiana Rosati, Ilaria Cellai, Cristiana
Deledda, Silvana Baglioni, Francesca Dichiara, Matteo Morello, Alessandro Peri
Unità di Endocrinologia, Dipartimento di Fisiopatologia Clinica, Centro di Eccellenza per la
Ricerca sulle Malattie Croniche, Infiammatorie, Degenerative e Neoplastiche per lo Sviluppo di
Nuove Terapie (DENOThe), Università degli Studi di Firenze.
La malattia di Alzheimer (AD) è caratterizzata da perdita di neuroni e sinapsi in regioni
selettive del cervello. Le ragioni che determinano la vulnerabilità selettiva di alcune zone cerebrali
rispetto ad altre non sono tuttora note. Alcuni anni fa il gene seladin-1 (SELective Alzheimer’s
Disease INnicator 1) è stato identificato ed è stato dimostrato che la sua espressione è ridotta nelle
regioni celebrali maggiormente colpite dall’AD. Seladin-1 conferisce protezione contro la tossicità
indotta da beta amiloide (Abeta) e contro lo stress ossidativo in vitro. E’ inoltre in grado di inibire
l’attività della caspasi 3 e protegge quindi dall’apoptosi.
Utilizzando un modello di neuroblasti fetali umani derivanti da epitelio olfattorio (FNC),
abbiamo dimostrato che gli estrogeni ed alcuni SERMs up-regolano l’espressione di seladin-1 ed
aumentano la resistenza ai peptidi di Abeta ed allo stress ossidativo. Il silenziamento del gene
seladin-1 annulla l’effetto neuroprotettivo di estrogeni e SERMs, indicando che questa proteina è
un mediatore dell’azione neuroprotettiva degli estrogeni.
La sequenza di seladin-1 è identica a quella di DHCR24, l’enzima che catalizza l’ultimo
passaggio della biosintesi del colesterolo. Pertanto seladin-1/DHCR24 assume il ruolo di una
proteina multifunzionale, che possiede sia proprietà anti-apoptotiche, sia una attività enzimatica
come enzima chiave della biosintesi del colesterolo. Vi sono evidenze che il colesterolo
intracellulare ha un effetto protettivo a livello cerebrale. Ad esempio, l’effetto tossico dei peptidi di
Abeta, che determina la morte delle cellule neuronali nell’AD, può essere prevenuto
dall’arricchimento della membrana plasmatica in colesterolo. Abbiamo dimostrato, in una linea
cellulare di neuroblastoma umano (SH-SY5Y), che l’up-regolazione dell’attività enzimatica di
seladin-1 per transfezione transiente o la sua inibizione con un inibitore selettivo sono in grado di
aumentare o diminuire significativamente il colesterolo della membrana plasmatica. L’aumento del
colesterolo così indotto protegge le cellule dall’azione tossica dei peptidi di Abeta diminuendo
l’interazione fisica di questi con la membrana cellulare e contrastando l’ingresso di calcio
intracellulare. La diminuzione del colesterolo ottenuta tramite l’inibizione selettiva di seladin-1
aumenta invece la tossicità di Abeta favorendo la sua interazione con la membrana e l’ingresso di
calcio nella cellula. Questi dati indicano come l’effetto neuroprotettivo di seladin-1 sia dovuto
anche alla sua capacità di modulare il contenuto di colesterolo della membrana plasmatica.
Dal momento che l’ippocampo e la zona subventricolare, due zone cerebrali affette nell’AD,
sono le uniche due zone del cervello adulto che contengono cellule staminali con potenziale
neurogenico, abbiamo inoltre ipotizzato che seladin-1 potesse essere un prodotto prevalente di
questi precursori. Utilizzando come modello di cellule multipotenti cellule staminali mesenchimali
umane (hMSC), abbiamo dimostrato la presenza di alti livelli di espressione di seladin-1, che si
riducono significativamente dopo la differenziazione in senso neuronale (hMSC-n). E’ quindi
ipotizzabile che la ridotta espressione di seladin-1 nelle aree cerebrali colpite nella AD possa essere
dovuta, almeno in parte, ad una alterazione quantitativa o funzionale del pool di cellule staminali.
Gli elevati livelli di espressione di seladin-1 nelle cellule multipotenti fa presupporre che
questo gene possa avere un importante ruolo nei processi ontogenetici. D’altra parte è noto che gli
ormoni tiroidei svolgono un ruolo importante nei processi di sviluppo del sistema nervoso centrale.
Abbiamo dunque indagato se l’espressione di seladin-1 fosse regolata anche dagli ormoni tiroidei
nei modelli cellulari FNC e hMSC. I nostri dati indicano che sia T3 che T4 aumentano
significativamente l’espressione di seladin-1 in entrambi i modelli cellulari ma non nelle cellule

differenziate in senso neuronale (hMSC-n). Questi risultati nell’insieme dimostrano il ruolo che
seladin-1 può avere a livello del sistema nervoso centrale sia sui processi ontogenetici che su quelli
legati ai meccanismi di neuroprotezione.

MENOPAUSAL TRANSITION: A POSSIBLE RISK FACTOR FOR NEURODEGENERATIVE
EVENTS
Sara Maria Bonomo
Dipartimento di Farmacologia, Chemioterapia e Tossicologia Medica, Università degli Studi di
Milano
Background and objective. Incidence and prevalence of Alzheimer Disease (AD) are higher in
postmenopausal women than in aged matched men. Since at menopause the endocrine system
and other biological paradigms undergo substantial changes, we thought to be of interest studying
whether (and how) the balance between some biological parameters allegdedly neuroprotective
(e.g. related to estrogen, dehydroepiandrosterone and CD36 functions) and others considered proneurotoxic
(e.g. related to glucocorticoids and interleukin-6 activities) vary during lifespan in either
sex in either normalcy or neurodegenerative disorders.
Subjects and Methods. Along this aim, we investigated in 209 healthy subjects (73 M, 106 F, 20-
91 yr-old) and 85 AD patients (36 M, 49 F, 65-89 yr-old) the gene expression of estrogen receptors
(ERs), glucocorticoid receptors (GRs), interleukin-6 (IL-6) and CD36, a scavenger receptor of class
B that would play a key role in the proinflammatory events associated with AD. Results obtained
were related to plasma titers of estrogens, cortisol and dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS).
Studies were performed in peripheral leukocytes, since these cells: 1) are easily obtainable by a
simple blood sampling, 2) express many molecules and multiple receptors which undergo the
same regulatory mechanisms as those operative in the brain and 3) share many function with
microglial cells.
Results. In healthy men all the study parameters remained quite stable during lifespan.() In
women, instead, at menopausal transition some changes occurred that may predispose to
neurodegeneration. In particular, there was: 1) up-regulation of ERs, and a concomitant increase of
IL-6 gene expression, events likely due to the loss of the inhibitory control exerted by estradiol; 2)
an augmentation of GRα:GRβ ratio, indicative of an augmented cortisol activity on GRα not
sufficiently counteracted by the inhibitory GRβ function; 3) a reduced CD36 expression directly
related to the increased cortisol activity and, 4) an augmented cortisol:DHEAS ratio, unanimously
recognized as an unfavorable prognostic index for the risk of neurodegeneration. In AD patients of
either sex, the expression of the study parameters was similar to that found in sex- and agematched
healthy subjects, thus indicating their unrelatedness to the disease, and rather a better
correlation with biological events. Specificare l’andamento nell’uomo.
Conclusions. Menopausal transition is a critical phase of women’s life where the occurrence of an
unfavorable biological milieu would predispose to an increased risk of neurodegeneration.
Collectively, the higher prevalence of AD in the female population would depend, at least in part,

from the presence of favoring biological risk factors, whose contribution to the development of the
disease occurs only in the presence of possible age-dependent triggers.

NUOVI ASPETTI DI REGOLAZIONE DELL'ASSE IPOTALAMO-IPOFISI-SURRENE
(HPA) NELL'UOMO: RUOLO DEI RECETTORI PER I MINERALCORTICOIDI
Roberta Giordano, Micaela Pellegrino, Marcella Balbo, Rita Berardelli, Lorenza Bonelli, Andreea
Picu, Ezio Ghigo, Emanuela Arvat
Div. Endocrinologia e Malattie del Metabolismo, Dip. Medicina Interna, Università di Torino
L’asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA) rappresenta un’unità integrata neuroendocrina la cui attività
è principalmente regolata da due componenti: la componente nervosa, mediata da neurotrasmettitori
e neuropeptidi influenzanti la produzione ipotalamica di CRH e AVP, e la componente endocrina,
rappresentata dall’effetto di feedback negativo dei glucocorticoidi (GC) circolanti che viene
esercitato attraverso l’interazione con due sottotipi recettoriali: i recettori per i mineralcorticoidi
(MR) e quelli per i glucocorticoidi (GR). Mentre i GR sono localizzati pressoché ubiquitariamente a
livello del S.N.C. e mediano il cosiddetto “reactive” feedback, deputato soprattutto al controllo
della risposta dell’asse HPA allo stress, i MR sono presenti prevalentemente a livello ippocampale e
mediano il feedback cosiddetto “proactive”, deputato al mantenimento dell’attività basale dell’asse
HPA. Mentre esistono evidenze nell’animale che antagonisti dei MR, quali il canrenoato di potassio
(CAN), sono in grado di stimolare l’asse HPA, gli studi compiuti nell’uomo hanno prodotto risultati
contrastanti. Nostri precedenti studi nell’uomo hanno dimostrato che nel soggetto giovane la
somministrazione acuta serale, momento della giornata corrispondente al nadir del ritmo circadiano
dell’HPA, del CAN, è stata in grado di contrastare il fisiologico calo notturno dei livelli di ACTH e
cortisolo, ed ha indotto una chiara amplificazione della risposta ormonale al CRH e all’AVP. Questi
risultati indicano che anche nell'uomo, come nell’animale, i MR sono coinvolti nella mediazione del
feedback corticosteroideo, in particolare nel mantenimento dell'attività basale dell'asse HPA.
L'evidenza inoltre che il pretrattamento con alprazolam, una benzodiazepina dotata di un peculiare
effetto inibitorio sull’asse HPA, è in grado di abolire l'effetto del CAN ha suggerito che il sistema
GABAergico può essere coinvolto anche nella mediazione del feedback corticosteroideo mediato
dai MR. Un deterioramento dell’attività dei MR ippocampali, con conseguente riduzione del
feedback inibitorio dei GC, è stato ipotizzato possa essere alla base dell’iperattivazione funzionale
HPA di numerosi quadri clinici, quali l’invecchiamento, la depressione, l’anoressia nervosa. Nostri
studi più recenti hanno dimostrato che in soggetti anziani sani la secrezione serale di ACTH e
cortisolo, superiore rispetto a quella dei soggetti giovani, è solo parzialmente aumentata dal CAN,
indicando che le modificazioni dell’attività dell’asse HPA osservabili nell’invecchiamento possono
essere, almeno parzialmente, dovute ad una alterazione della funzione dei MR ippocampali. E’ noto
infine che la secrezione surrenalica di aldosterone, oltre che dal sistema renina-angiotensina, è in
parte modulata dall’ACTH che è in grado di passare la barriera emato-encefalica e di legarsi ai MR
centrali. Al fine di verificare se una condizione di cronico aumento delle concentrazioni di
aldosterone circolante possa esercitare qualche influenza sull’attività dell’asse HPA, più
recentemente i nostri studi sono stati indirizzati ad indagare l’attività dell’asse HPA e l’effetto del
CAN in pazienti con iperaldosteronismo cronico. I risultati di queste ricerche hanno dimostrato che
tali pazienti presentano una aumentata secrezione corticotropa basale e soprattutto una
iperesponsività corticotropa e surrenalica al CRH; inoltre è stato dimostrato che in presenza di
iperaldosteronismo cronico il CAN è in grado solo parzialmente di stimolare la secrezione
corticotropa basale, mentre non modifica quella stimolata da CRH, dimostrando che
l’iperaldosteronismo cronico è caratterizzato da un aumento dell’attività HPA associato ad un
possibile danno dei recettori centrali MR. L’impiego di antagonisti MR risulta quindi essere un utile
strumento per la valutazione della sensibilità dell’asse HPA all’azione di feedback inibitorio GC in
condizioni fisiologiche ed in stati di iperattivazione cronica.
Sulla base di questi dati, le prossime ricerche saranno indirizzate a valutare: 1) gli effetti
neuroendocrini di un trattamento cronico con antagonisti MR; 2) se il pre-trattamento con
fludrocortisone, un agonista MR, inibisca l’attività HPA ed attraverso quali meccanismi; 3) se
l’infusione di idrocortisone influenzi le risposte corticotropa e surrenalica al canrenoato di potassio.
1

Modificazioni dell’espressione genica del recettore GABA A in cellule ippocampali in coltura
indotte dal progesterone
Maria Cristina Mostallino a e Giovanni Biggio abc
a Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Neuroscienze, Sezione di Cagliari; b Dipartimento di
Biologia Sperimentale, Sezione di Neuroscienze, c Centro di Eccellenza per la Neurobiologia delle
Dipendenze, Università di Cagliari, Cagliari
L’espressione delle subunità che compongono il recettore GABA A nei neuroni può essere
modificata da alcuni modulatori endogeni della funzione del recettore come i neurosteroidi. Questi
effetti dei neurosteroidi potrebbero essere dovuti ad una loro azione diretta sul recettore GABA A
che poi, attraverso uno specifico meccanismo di signalizzazione intracellulare, potrebbero
controllare la trascrizione genica e quindi l’espressione di specifiche subunità del recettore. Gli
steroidi neuroattivi come l’allopregnanolone (AP), un metabolita del progesterone (PROG),
esercitano diversi effetti sulla plasticità del recettore in diverse popolazioni neuronali, questo
potrebbe spiegare alcune delle azioni fisiologiche esercitate da questi composti.
Per queste ragioni lo scopo del nostro studio è stato quello di verificare se l’esposizione cronica al
PROG o all’AP e la loro brusca interruzione, fossero in grado di modificare l’espressione genica
della subunità delta del recettore GABA A nelle cellule di ippocampo di ratto in coltura.
I recettori GABA A contenenti le subunità delta sembrerebbero localizzati solo in posizione
extrasinaptica e possiedono un’alta affinità l’agonista 4,5,6,7-tetraidroisoxazolo-[5,4-c]piridina-3-
olo (THIP) e per i neurosteroidi. Per cui le variazioni nell’espressione genica di questa subunità
potrebbero contribuire allo sviluppo di quelle alterazioni dello stato mentale associate a fluttuazioni
sia fisiologiche che farmacologiche dei livelli dei neurosteroidi.
Per questo studio sono stati utilizzati neuroni ippocampali di ratto in cultura. Il trattamento su
queste cellule è stato iniziato 6 giorni dopo l’inizio della coltura e sono state trattate per 1,2,4,6
giorni con AP (1 µM) o con PROG (1 µM) da solo o associato alla finasteride (1 µM). Nei gruppi in
cui il trattamento è stato interrotto, le cellule sono state trattate per 6 giorni con AP o PROG,
successivamente il medium contenente gli ormoni è stato sostituito con medium privo di ormoni e
le cellule sono state processate dopo un’incubazione di altre 3-24 ore.
Il saggio dell’RNA protetto da RNasi (RPA) e gli studi di immunocitochimica utilizzando degli
anticorpi specifici per la subunità delta hanno mostrato che dopo 24 ore di trattamento con PROG si
ha un aumento significativo del mRNA e della proteina delta, mentre dopo 2 giorni sino a 6 giorni
di trattamento si osserva una diminuzione sia del mRNA che della proteina delta. Al contrario 3 o 6
ore dopo la sospensione del trattamento i livelli rispettivamente di mRNA e di proteina delta sono
ancora bassi ed aumentano significativamente, rispetto ai livelli di controllo, dopo 9 ore per
l’mRNA e 12 ore per la proteina. I livelli di entrambi, mRNA e proteina per la delta, ritornano ai
valori di controllo rispettivamente dopo 12 e 24 ore. Questi effetti sono stati osservati anche dopo
trattamento con AP. Inoltre la modulazione della subunità delta indotta dal PROG è bloccata dalla
somministrazione di finasteride, inibitore della 5alpha-riduttasi, un enzima che converte il PROG in
AP. Le variazioni molecolari osservate sono accompagnate anche da variazioni nella funzione del
recettore GABA A .
Nel loro insieme questi risultati indicano che l’esposizione prolungata e la successiva brusca
interruzione modulano sia l’espressione genica della subunità delta che la funzione del recettore
GABA A e che questi effetti sono mediati dall’AP. Questi risultati sono consistenti con l’idea che
questo ormone abbia un ruolo importante nella modulazione delle correnti toniche.

STEROIDI NEUROATTIVI E NEUROPATIA PERIFERICA
Ilaria Roglio, Silvia Giatti, Marzia Pesaresi, Roberto Cosimo Melcangi
Istituto di Endocrinologia e Centro di Eccellenza per lo Studio delle Malattie Neurodegenerative,
Università degli studi di Milano, Via Balzaretti 9, Milano.
E’ ormai stato chiaramente dimostrato che i nervi del sistema nervoso periferico sono un bersaglio
dell'azione di alcuni steroidi neuroattivi in quanto possiedono sia i classici recettori steroidei (es.
recettore del progesterone, PR, recettore degli androgeni, AR) sia quelli definiti come non classici
recettori steroidei (es. recettore GABA-A e GABA-B, recettore sigma 1, recettore NMDA, etc.)
[vedi review Melcangi et al. Brain Res. Rev. 48:328-338, 2005]. Il lavoro svolto negli ultimi anni
ha avuto come obiettivo quello di valutare l’effetto neuroprotettivo di alcuni steroidi neuroattivi in
diversi modelli di neuropatia periferica tra cui quella legata al diabete, all’invecchiamento o al
trauma del nervo (taglio o schiacciamento). I risultati finora ottenuti sono molto promettenti in
quanto hanno indicato che gli steroidi neuroattivi, come il progesterone, il testosterone e i loro
metaboliti (come il diidroprogesterone, il tetraidroprogesterone, il diidrotestosterone e il 5alfaandrostan-3alfa,
17beta-diolo) esercitano importanti effetti protettivi a livello di diverse componenti
del nervo periferico alterate da eventi neurodegenerativi. Infatti, a seconda del modello considerato,
questi steroidi neuroattivi si sono dimostrati essere in grado di ripristinare in modo significativo i
parametri morfologici del nervo, la densità delle fibre nervose intraepidermiche, l’espressione di
importanti proteine della mielina, l’attività della pompa Na + -K + -ATPasi, la soglia di percezione del
calore e la velocità di conduzione nervosa [Melcangi et al. J. Neurocytol., 29:327-339, 2000;
Leonelli et al. Neuroscience, in press, 2006, doi:10.1016/j.neuroscience.2006.11.014]. Queste
osservazioni suggeriscono che gli steroidi neuroattivi in quanto tali o i ligandi sintetici dei loro
recettori possono rappresentare un interessante approccio terapeutico per le neuropatie periferiche
acquisite. Negli ultimi anni, diversi studi hanno indicato che un’alternativa a questa strategia
terapeutica potrebbe essere rappresentata dai ligandi del recettore periferico delle benzodiazepine
(PBR). Questa è una proteina localizzata prevalentemente nella membrana mitocondriale esterna e
gioca un ruolo importante nella steroidogenesi e nella neurosteroidogenesi nonché nella regolazione
della sopravvivenza e proliferazione cellulare. Infatti, recenti osservazioni hanno indicato che i
ligandi del PBR possono essere considerati agenti protettivi per la neuropatia periferica [Leonelli et
al. Mech.Ageing Dev. 126:1159-1163, 2005].

DIFFERENT INFLUENCES OF OVARIAN AND NON-GONADAL ESTROGEN
ON SPATIAL NAVIGATION
Leonida Fusani
Dipartimento di Fisiologia, Università di Siena
The decline of circulating estrogen after menopause has been put in relation with decreasing
performances in a number of cognitive functions including spatial navigation. However, several
peripheral tissues including the brain, and in particular the hippocampus, produce considerable
amounts of estrogen that is likely to act locally to regulate hormone-dependent functions. We
started investigating the different roles of ovarian and non-gonadal estrogen in modulating spatial
navigation in rats. Young and aged female rats were either ovariectomized, treated with an
aromatase inhibitor, or both, and were then tested with a Morris Water Maze protocol to study
the effects of the treatment on spatial reference memory. Our results show that both
ovariectomy and aromatase inhibition can affect retention of spatial information, however the
direction of the effects can be opposite depending on the age of the animals. These studies show
that the effects of ovariectomy go beyond the removal of circulating estrogen and caution should
be taken in making parallels between ovariectomy and menopause. In addition, non-gonadal
estrogen and probably neuroestrogen appear to play an important role in the regulation of
cognitive functions even in the presence of substantial amounts of ovarian estrogen.

MODERATE INCREASE IN MATERNAL CORTICOSTERONE REDUCES WITHIN-GROUP
VARIATION IN BEHAVIOURAL, ENDOCRINE AND IMMUNE PARAMETERS IN ADULT
MOUSE OFFSPRING
Simone Macrì and Giovanni Laviola * .
Section of Behavioural Neuroscience, Department of Cell Biology & Neuroscience,
Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena 299, 00161 Roma, Italy
The significance of behavioural neuroscience and the validity of its animal models of
human pathology largely depend on the possibility to replicate a given finding across
different facilities. However, when several mouse strains are tested on highly
standardised behavioural test batteries in different laboratories, significant strain x lab
interactions can be readily observed (Crabbe et al., 1999; Wolfer et al., 2004). Withingroup
variation explains most of the variation observed in behavioural data, thus
pointing at inter-individual variation as the major source of limited experimental
reproducibility (Wolfer et al., 2004). Here we show that moderate doses of neonatal
corticosterone supplementation through maternal drinking water (low, L-CORT,
33µg/ml or high, H-CORT, 100µg/ml) during the first lactation week, induce a
significant reduction in inter-individual variation in adult male offspring in pain
response, novelty preference, corticosterone response and immune competence. Our
data demonstrate that a pharmacological simulation of increased neonatal
environmental demands (Catalani et al, 1993) reduces experimental noise in adult
laboratory rodents. Additionally, in spite of its effects on inter-individual variation,
early corticosterone treatment did not affect normal (Gaussian) data distribution.
Quite the opposite, whereas control subjects’ frequency distribution showed a mild
yet significant deviation from normality, both L-CORT and H-CORT adult offspring
showed a normal distribution. These results will foster new studies aimed at
modifying the neonatal environment such as to induce moderate levels of stimulation
and in turn reduce experimental noise (Macrì and Wuerbel, 2006). Importantly, rather
than being limited to a specific variable, reduced variation was observed in a number
of parameters, thus suggesting that these results may apply to a relatively broad
spectrum of behavioural and physiological systems. Primarily, this study will lead to a
reconsideration of the basic principles of neonatal housing systems, and ultimately,

this effort should induce more stable experimental models of human disorders.
Finally, these studies will lead to a substantial reduction in the number of mice used
in laboratory experiments.
Reference list
1. J.C. Crabbe, D. Wahlsten, B.C. Dudek. Genetics of mouse behavior: interactions
with laboratory environment. Science. 284 (1999) 1670-2.
2. D.P. Wolfer, O. Litvin, S. Morf, R.M. Nitsch, H.P. Lipp, H. Wurbel. Laboratory
animal welfare: cage enrichment and mouse behaviour. Nature 432 (2004) 821-2.
3. A. Catalani, P. Casolini, S. Scaccianoce, F.R. Patacchioli, P. Spinozzi, L.
Angelucci, Maternal corticosterone during lactation permanently affects brain
corticosteroid receptors, stress response and behaviour in rat progeny.
Neuroscience. 100 (1993) 319-25.
4. S. Macrì, H. Würbel, Developmental plasticity of HPA and fear responses in rats:
A critical review of the maternal mediation hypothesis. Horm. Behav. 50 (2006)
667-80.

INVOLVEMENT OF NERVE GROWTH FACTOR (NGF) AND BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC
FACTOR (BDNF) IN NEUROENDOCRINE REGULATIONS AND VULNERABILITY TO STRESS IN ANIMAL
MODELS
Francesca Cirulli and Enrico Alleva
Behavioural Neurosciences Section, Department of Cell Biology and Neurosciences,
Istituto Superiore di Sanità, Rome Italy (cirulli@iss.it)
Nerve Growth Factor (NGF) and Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) are key molecular players in
brain growth and differentiation. Most importantly, numerous data indicate that neurotrophins can
orchestrate interactions between the nervous, endocrine and immune system, and are involved in important
regulations of sleep/wake cycles and of circadian secretion of hypothalamic hormones which might pave the
way to increased vulnerability to psychiatric disorders. Research conducted by our group, in collaboration
with the group led by Rita Levi-Montalcini, has clearly indicated an involvement of NGF in emotionally
arousing situations in animal models of psychosocial stress, such as male mice intraspecific fighting.
Furthermore, we have shown that, in humans, highly arousing situations, such as the uncertainty caused by
the anticipation of the first jump with a parachute by army soldiers, result in increased blood levels of NGF,
underlying the relative independence of this neurotrophin from other neuroendocrine effectors, and its
sensitivity to environmental variables having a social nature. In another series of studies we have shown that
exposure to stressful experiences in rodents can have important short- and long-term effects on neurotrophin
levels in the central nervous system, leading to an increased risk for vulnerability to stress at adulthood. In
collaboration with the NIMH (Prof. S. Suomi, Laboratory of Comparative Ethology, USA), we are currently
investigating, in a primate model, whether exposure to early life stress can have short- and long- term effects
on neuroendocrine regulations, with a special emphasis on NGF and BDNF levels assessed in the peripheral
circulation and in the cerebrospinal fluid of rhesus macaques.

Effetti degli xenoestrogeni sul differenziamento del comportamento e dei relativi
circuiti nervosi
Elena Mura, Mariangela Martini, Carla Viglietti-Panzica, GianCarlo Panzica
Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale
Università di Torino, corso M. D’Azeglio 52, 10126 Torino
Gli xenoestrogeni sono molecole di origine naturale (come i fitoestrogeni) o
industriale (come il bisfenolo A), che sono in grado di legarsi, con diversa efficienza
ai recettori degli estrogeni. Questi composti si trovano negli alimenti e possono
essere assunti in dosi variabili a seconda del tipo di dieta a cui sono sottoposti gli
individui.
Gli effetti potenzialmente dannosi degli xenoestrogeni sono particolarmente
importanti nel corso dello sviluppo embrionale o postnatale ove possono interferire
con il differenziamento di circuiti e comportamenti sessualmente differenziati.
Il nostro gruppo utilizza due modelli sperimentali, il sistema a vasotocina ed il
comportamento sessuale maschile della quaglia giapponese, ed il sistema nitrinergico
ed il comportamento riproduttivo nel topo. In queste indagini abbiamo dimostrato che
la somministrazione durante il periodo embrionale di DES o genisteina (un
fitoestrogeno) ha un effetto demascolinizzante sul sistema a vasotocina e sul
comportamento sessuale maschile della quaglia, mentre il bisfenolo A somministrato
durante la gravidanza e nei primi giorni di vita ha un effetto demascolinizzante sul
sistema nitrinergico del nucleo preottico mediale e del nucleo della stria terminale,
due regioni coinvolte nella regolazione del comportamento riproduttivo del topo.
Ringraziamenti. Questa ricerca è finanziata da Regione Piemonte, Università di Torino,
Fondazione CRT.

Geni bersaglio dei bifenilipoliclorurati: influenze dell’inquinamento
ambientale sulla differenziazione cerebrale
Alessandra Colciago, Antonia Pravettoni, Lavinia Casati, Ornella Mornati, Paola
Negri-Cesi e Fabio Celotti
Istituto di Endocrinologia, Università degli Studi di Milano, via Balzaretti 9, Milano
I bifenilipoliclorurati (PCB) sono inquinanti, di derivazione industriale,
ampiamente diffusi nell’ambiente e facilmente riscontrabili nel latte
materno, nel siero e nella maggior parte dei tessuti di numerose specie
animali compreso l’uomo. Attraversano facilmente sia la barriera
placentare che quella emato-encefalica, accumulandosi con molta facilità
nei tessuti fetali e soprattutto nel cervello. Sebbene il loro meccanismo
d’azione non sia ancora del tutto noto, i PCB sono in grado di influenzare
la differenziazione sessuale del cervello che si realizza durante l’ultima
settimana della vita fetale e da cui dipende il normale comportamento
sessuale dell’animale adulto; nel ratto, sono l’aromatasi ipotalamica e le
due isoforme della 5alfa-riduttasi, i principali enzimi che metabolizzano il
testosterone, a svolgere un ruolo cruciale nel periodo critico della
differenziazione sessuale.
Lo scopo dei nostri studi è stato quello di verificare se una miscela
ricostituita di PCB, composta dai congeneri più ampiamente distribuiti
nel cibo e nel latte materno, fosse in grado di interferire con gli enzimi
chiave della differenziazione cerebrale, aromatasi e 5alfa-riduttasi. Ratte
gravide sono state trattate s.c., dal 15° giorno di gestazione (GD15) al
GD19, e dal parto fino allo svezzamento; l’espressione degli enzimi di
interesse è stata valutata mediante Real-time PCR al GD20 e nei giorni
post-natali (PN) 11, 21 e 60. I risultati ottenuti mostrano che i PCB hanno
un effetto dimorfico sugli enzimi del metabolismo del testosterone: il
profilo tipicamente dimorfico dell’espressione dell’aromatasi sembra
essere annullato; l’espressione della 5alfa-R1 sembra essere inibita nelle
femmine; l’espressione della 5alfa-R2 è modificata solo in età adulta con
un’ulteriore amplificazione della differenza esistente già in condizioni
fisiologiche. I dati da noi ottenuti sono quindi indicativi di
un’interferenza dei PCB sui processi della differenziazione sessuale negli
animali di entrambi i sessi.

Interazioni neuroendocrino-immunologiche nello stress chirurgico.
Paola Sacerdote
Dipartimento di Farmacologia Chemioterapia e Tossicologia Medica , Università degli
Studi di Milano
Durante un intervento chirurgico è ben noto che l’ attivazione dell’ asse HPA e del
sistema simpatico inducono anche immunosoppressione, che ha un impatto negativo
sulla capacità dell’individuo di rispondere alle infezioni e a combattere la diffusione di
metastasi tumorali.
La presenza del dolore nel periodo peri-operatorio è uno dei fattori di stress che
possono portare alla modulazione del sistema immunitario: quindi un adeguato
trattamento del dolore peri e post operatorio dovrebbe essere utile per diminuire le
conseguenze dell’immunosoppressione.
E’ stato dimostrato che alcuni farmaci oppioidi comunemente utilizzati per il
trattamento del dolore, quali la morfina, possiedono un’attività immunosoppressiva
intrinseca, e quindi non sono i più indicati per il trattamento del dolore postoperatorio.
Alcuni farmaci oppioidi però sembrano avere un profilo di attività più
favorevole di altri sul sistema immune. Alcune evidenze indicherebbero che alla base
di queste differenze ci sia una diversa capacità dei farmaci oppioidi di attivare l’asse
HPA e il sistema simpatico.
Noi stiamo indagando queste interazioni in un modello sperimentale di stress
chirurgico, dolore e sviluppo di metastasi.

Studio della secrezione di Arg-Vasopressina indotta per infusione
intracerebroventricolare di soluzioni ipertoniche durante le fasi del
ciclo veglia-sonno nel ratto.
M. Luppi, D. Martelli, R. Amici, F. Baracchi, M. Cerri, E. Del Sindaco, D. Dentico, C.A. Jones,
E. Perez, G. Zamboni
Laboratorio di Neurochimica, Dip.di Fisiologia umana e generale, Università degli Studi di
Bologna.
La regolazione ipotalamica dell’omeostasi dei parametri fisiologici si modifica durante il ciclo
veglia-sonno (VS), che nel ratto è distinto in tre fasi: veglia, sonno REM (SREM) e sonno non-
REM. Esempio di ciò è la sospensione della termoregolazione che si verifica durante gli episodi di
SREM (Parmeggiani & Morrison, 1990). Per meglio definire tali modificazioni, è stato studiato il
controllo dell’equilibrio idrico-salino durante il ciclo VS, perché esso, come accade per la
termoregolazione, è attuato prevalentemente dall’ipotalamo.
Gli animali sono stati infusi per via intracerebroventricolare con soluzioni a differente
osmolalità (una isotonica e tre ipertoniche), durante le fasi del ciclo VS. Quindi, è stata determinata
la concentrazione ematica dell’ormone neuroipofisario Arg-Vasopressina, indotta da tale
stimolazione.
I risultati mostrano che il sistema osmoregolatorio centrale rimane ugualmente attivo in tutte
le fasi del ciclo VS.
Tali dati possono essere interpretati sulla base del modello anatomo-funzionale
dell’ipotalamo proposto da Thompson e Swanson (2003), che prevede la distinzione di una zona
periventricolare “generatrice di pattern visceromotori” da una paraventricolare “neuroendocrina”;
pertanto, la sospensione della termoregolazione negli episodi di SREM potrebbe essere dovuta ad
una modificazione funzionale limitata alla zona periventricolare dell’ipotalamo, mentre quella
neuroendocrina rimarrebbe normalmente attiva in tutte le fasi del ciclo VS. Inoltre, i risultati di
questo studio suggeriscono l’esistenza di uno stretto legame funzionale tra omeotermia e SREM,
come farebbe supporre anche la loro relazione filogenetica.
Parmeggiani P.L. and Morrison A.R. In: Loewy A.D. and Spyer K.M. (eds) Central regulation of autonomic functions.
Oxford University Press, Oxford, 1990.
Thompson R.H. and Swanson L.W. Brain Research Reviews, 41, 2003.

INDIVIDUAL DIFFERENCES IN CARDIAC AUTONOMIC AND SYMPATHETIC-
ADRENOMEDULLARY RESPONSES TO SOCIAL CHALLENGE
Andrea Sgoifo, Francesca Mastorci, M. Angeles Pico’ Alfonso
Stress Physiology Lab, Department of Evolutionary and Functional Biology, University of
Parma, Parco Area delle Scienze 11/A, 43100 Parma, Italy
Social stressors play a significant role in the onset and progression of cardiovascular diseases
such as hypertension, atherosclerosis and cardiac arrhythmias. Human and animal data suggest
that an important determinant of cardiocirculatory stress reactivity and morbidity is the
individual behavioral strategy of coping with environmental challenge. This paper summarizes
the results of a number of studies that we performed in rodents and humans, aimed at shedding
further light on the relationship between individual aggression levels and associated
dominance/subordination status and short- and long-term neuroendocrine and cardiovascular
stress reactivity. Our data suggest that: (i) individuals belonging to the 'aggressive tail' of a
wild-type rat population are characterized by a higher sympathetic-adrenomedullary activation
during both social and non-social stress episodes; (ii) in rats, cardiovascular habituation takes
place when social challenge is an intermittent victory experience, whereas no habituation is
observed across repeated defeat episodes; (iii) when social dominance is challenged, rats
exhibit long-term alterations of heart rate circadian rhythmicity, such changes being
modulated by the individual level of aggression; (iv) in mice, chronic subordination induces
transient alterations of heart rate circadian rhythmicity and permanent myocardial damage, the
latter consisting of scattered foci of fibrosis; (v) in humans, subjects with higher scores of
submissive behavior are prone to larger cardiac accelerations and parasympathetic suppression
during and after a laboratory stressor. Altogether, these data underline how important it is to
carefully consider individual differences in trait and state aggression, as well as the context in
which aggression is expressed, when studying acute and long-term autonomic and
neuroendocrine effects of social interactions.

L'isolamento sociale altera la plasticità e la funzione del recettore GABA
M. Giuseppina Pisu a , Mariangela Serra abc e Giovanni Biggio abc
a Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Neuroscienze, Sezione di Cagliari; b Dipartimento di
Biologia Sperimentale, Sezione di Neuroscienze, c Centro di Eccellenza per la Neurobiologia delle
Dipendenze, Università di Cagliari, Cagliari.
L’isolamento sociale nel ratto, un modello animale di stress cronico, determina una riduzione dei
livelli cerebrocorticali e plasmatici dei metaboliti del progesterone, allopregnanolone e THDOC, i
più potenti ed efficaci modulatori positivi della trasmissione GABAergica. I ratti socialmente isolati
mostrano un comportamento aggressivo verso lo sperimentatore, uno stato conflittuale ed un
maggior stato d’ansia rispetto agli animali stabulati in gruppo. Questi animali mostrano, inoltre, una
maggiore sensibilità all’effetto steroidogenico indotto dall’etanolo, effetto più pronunciato nel
cervello rispetto al plasma.
In accordo, l’isolamento sociale potenzia l’effetto dell’EtOH sui livelli cerebrali della steroidogenic
acute regulatory protein (STAR); inoltre, la capacità dell’EtOH nell’inibire le convulsioni indotte
dall’isoniazide è maggiore negli animali socialmente isolati rispetto ai controlli e questo effetto è
revertito dal pretrattamento con finasteride, un inibitore della sintesi di allopregnanolone e THDOC.
Gli animali isolati mostrano inoltre un aumento dell’espressione genica per le subunità alfa4 e delta
del recettore GABA A determinando verosimilmente un aumento dei recettori GABA A extrasinaptici
che mediano l’inibizione tonica dell’eccitabilità neuronale. In accordo, le correnti toniche inibitorie
mediate dal GABA nelle cellule granulari del giro dentato dell’ippocampo degli animali isolati è
aumentata rispetto a quella registrata negli animali di controllo. L’isolamento sociale potenzia
inoltre l’effetto dell’EtOH sull’ampiezza delle mIPSCs mediate dal recettore GABA A , registrate nei
neuroni piramidali della CA1, un effetto inibito dalla finasteride. L’assunzione volontaria di EtOH
negli animali socialmente isolati abolisce la riduzione dei livelli cerebrocorticali e plasmatici di
allopregnanolone e THDOC e l’aumentata potenza dell’EtOH sulle mIPSCs registrate nei neuroni
della CA1, mentre induce un ulteriore aumento delle correnti toniche inibitorie.
Nel loro insieme i risultati indicano che lo stress cronico indotto dall’isolamento sociale è associato
ad una alterazione della struttura e della funzione del recettore GABA A e suggerisce che i livelli
endogeni dei metaboliti del progesterone possano essere cruciali nel regolare l’eccitabilità
neuronale.

REGOLAZIONE NEUROENDOCRINA ED AMBIENTALE DI PATOLOGIE
METABOLICHE E COMPORTAMENTALI
Alessandro Bartolomucci, Paola Palanza, Stefano Parmigiani
Dipartimento di Biologia Evolutiva e Funzionale, Università di Parma
Patologie metaboliche quali l’obesità e la cachessia sono spesso in comorbidità con disturbi immunitari e
psicopatologie. Ad esempio, l’obesità può essere causata dal malfunzionamento di numerosi pathway
metabolici ed essere aggravata da perturbazioni ambientali quali l’esposizione a stimoli stressanti.
Similmente, la cachessia è associata di frequente con disordini dovuti ad iperattivazzione del sistema
nervoso autonomo e a psicopatologie quali depressione o ansia. Un approccio sperimentale integrato che
includa, l’utilizzo di appropriati modelli animali, l’analisi funzionale di specifici regolatori
neuroendocrini, l’identificazione di nuovi mediatori delle funzioni neuroendocrine-autonomiche, è
pertanto necessario per lo studio dei meccanismi sottostanti i disturbi metabolici e comportamentali. In
relazione a questo, gli obiettivi della nostra ricerca sono:
1) Fornire una cornice sperimentale congruente ed etologicamente rilevante per sviluppare modelli
animali che permettano di discriminare il contributo relativo di fattori genetici, neuroendocrine ed
ambientali sottostanti tali patologie. In particolare la nostra ricerca si incentra sull’utilizzo di modelli
animali di stress psicosociale cronico, modulazione ambientale capace di determinare l’insorgenza di
stati simil-depressivi, obesità e disordini immuno-endocrini (Bartolomucci et al., 2005; 2003;
Palanza, 2001; Parmigiani et al., 1999). L’utilizzo di animali geneticamente modificati permette poi
di determinare le basi genetiche della vulnerabilità individuale allo sviluppo di tali stati patologici.
2) Determinare il contributo dei mediatori neuroendocrini a livello centrale (melanocortine/peptidi VGFderivati
ecc.) e periferico (innervazione dei tessuti adiposi, proteine mitocondriali disaccoppianti)
degli effetti metabolici risultati dall’esposizione a stress cronico (Bartolomucci et al., 2005);
3) Caratterizzare il meccanismo d’azione e il ruolo neuroendocrine e metabolico di neuropeptidi di
recente scoperta (Bartolomucci et al., 2006).
Citazioni:
Bartolomucci A, et al., TLQP-21, a VGF-derived peptide, increases energy expenditure and prevents the
early phase of diet-induced obesity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 103(39):14584-9.
Bartolomucci A, et al., Social factors and individual vulnerability to chronic stress exposure. Neurosci
Biobehav Rev. 2005 29(1):67-81.
Bartolomucci A, Palanza P, Sacerdote P, Ceresini G, Chirieleison A, Panerai AE, Parmigiani S.
Individual housing induces altered immuno-endocrine responses to psychological stress in male mice.
Psychoneuroendocrinology. 2003 May;28(4):540-58.
Palanza P. Animal models of anxiety and depression: how are females different Neurosci Biobehav Rev.
2001 25(3):219-33.
Parmigiani S, et al., Selection, evolution of behavior and animal models in behavioral neuroscience.
Neurosci Biobehav Rev. 1999 23(7):957-69.

ASPETTI NEUROENDOCRINI NELL’ANORESSIA NERVOSA
Rita Berardelli, Andreea Picu, Giovanni Abbatedaga, Roberta Giordano, Marcella Balbo, Lorenza
Bonelli, Secondo Fassino, Ezio Ghigo, Emanuela Arvat, Laura Gianotti
Div. Endocrinologia e Malattie del Metabolismo, Dip. Medicina Interna, Università di Torino
L’anoressia nervosa (AN) è una patologia caratterizzata da diverse alterazioni endocrinologiche. La
nostra ricerca è stata dedicata in particolare allo studio delle alterazioni dell’asse somatotropo e
dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA). Nell’AN, l’attività dell’asse somatotropo si caratterizza per
un’ ipersecrezione di GH sia basale sia stimolata, associata a ridotte concentrazioni di IGF-I,
espressione di una ridotta sensibilità periferica al GH indotta dall’iponutrizione. Nostri precedenti studi
hanno suggerito l’esistenza di primitive alterazioni ipotalamiche e/o sovraipotalamiche responsabili
dell’iperesecrezione di GH in questa condizione patologica. In particolare, è stata dimostrata
un’alterazione del controllo colinergico e _-adrenergico sulla secrezione di GH. D’altra parte, la
sensibilità somatotropa all’infusione di somatostatina risulta essere preservata mentre sembra essere
alterato il controllo da parte delle IGF-I. Tra i fattori metabolici coinvolti nell’alterazione della
secrezione somatotropa è stato studiato il ruolo degli acidi grassi liberi (FFA), noti per avere un effetto
inibitorio sulla liberazione di GH, che nell’AN sono spesso aumentati. I risultati ottenuti hanno
indicato che, nonostante nell’AN l’ipersecrezione di GH si realizzi accanto all’aumento della lipolisi,
la cellula somatotropa mantiene una normale sensibilità all’effetto inibitorio degli FFA. Nonostante
l’AN si caratterizzi per una generale ipersecrezione somatotropa, nostri recenti studi hanno dimostrato
una ridotta risposta secretoria a ghrelina, un ormone gastrico con importante effetto GH-secretagogo, a
fronte di elevati livelli circolanti dell’ormone presenti in questa patologia, a suggerire una
desensitizzazione all’effetto dell’ormone.
Più recentemente i nostri studi sono stati indirizzati ad indagare l’attività dell’asse HPA nell’AN. E’
stata dimostrata un’iperattivazione dell’asse solo in parte modulabile da fattori metabolici e
farmacologici. Abbiamo valutato la risposta surrenalica alla somministrazione di ACTH esogeno a
dosi sia massimali che submassimali dimostrando una preservata sensibilità all’ACTH in tali pazienti.
Inoltre, nell’ipotesi di correlare l’ipersecrezione di cortisolo ad un mancato feedback inibitorio degli
FFA, abbiamo studiato le risposte di ACTH e cortisolo ad un carico lipidico. E’ infatti noto che nei NS
la somministrazione di FFA inibisce la secrezione di ACTH e cortisolo. I risultati dello studio hanno
mostrato una preservata inibizione della secrezione corticotropa associata ad un’iperattivazione
surrenalica solo parzialmente modulabile dalla somministrazione di FFA, probabilmente correlabile ad
una diretta attività stimolatoria che gli FFA esercitano a livello surrenalico. Sono stati quindi studiati
gli effetti neuroendocrini di psicofarmaci quali gli inibitori del reuptake della serotonina. In condizioni
fisiologiche, il citalopram, uno dei più selettivi SSRI, presenta un effetto acuto stimolatorio sull’attività
HPA e sulla secrezione lattotropa. Nell’AN, la somministrazione di citalopram ha indotto un aumento
dei livelli di ACTH e PRL, associato ad una risposta surrenalica ridotta, suggerendo l’esistenza di una
alterazione della sensibilità serotoninergica nella regolazione dell’attività surrenalica in questa
condizione. Dai dati di queste ricerche e da quelli in letteratura emerge che nell’AN sono presenti
importanti alterazioni neuroendocrine sostenute non solo dalle modificazioni nutrizionali ma anche
verosimilmente da una primitiva compromissione del controllo ipotalamico.
Sulla base di questi dati, le prossime ricerche saranno indirizzate a valutare in pazienti con AN: 1) gli
effetti neuroendocrini di un trattamento cronico con citalopram, che nel soggetto normale risulta essere
in grado di spegnere l’attività HPA; 2) gli effetti dell’alprazolam, una benzodiazepina che nei NS
inibisce nettamente l’attività dell’asse HPA, al fine di descrivere se l’effetto neuroendocrino indotto
dall’attivazione GABA-ergica sulla secrezione corticotropa sia preservato o meno in questa condizione
patologica; 3) gli effetti della somministrazione acuta di canrenoato, un antagonista dei recettori per i
mineralcorticoidi. E’ infatti noto che i MR localizzati a livello ippocampale rivestono un importante
ruolo nella mediazione del feed-back inibitorio glucocorticoide e che gli antagonisti di tali recettori
stimolano la secrezione di ACTH e cortisolo; inoltre vi è evidenza che in condizioni di cronica
stimolazione dell’asse il feed-back inibitorio mediato da tali recettori è alterato. Tale condizione
potrebbe essere presente anche nell’AN determinando un ridotto effetto del canrenoato in queste
pazienti.

Calcium channels-secretion coupling in isolated adrenal chromaffin cells
Andrea Marcantoni, Valentina Carabelli, Valentina Comunanza & Emilio Carbone
Department of Neuroscienze, NIS Centre of Excellenze, CNISM Research Unit,
Corso Raffaello 30, Torino
Adrenal chromaffin cells represent an ideal system for studying the biophysics of voltage-gated
Ca 2+ channels and their role on catecholamine secretion. Cat, rat and mouse chromaffin cells
express mainly high-threshold Ca 2+ channels (L, N, P/Q and R-types) [1,5] and under chronic
hypoxic conditions (3% O2) [2] or following long-term β-adrenergic modulation [3] they also
express low-threshold T-type channels. High-threshold Ca 2+ channels are strictly coupled to the
membrane receptors that are activated by the material released from the cells themselves and, thus,
their functioning (degree and time course of activation) are conditioned by cell activity (autocrine
modulation) [4]. Indeed, chromaffin cells possess high densities of opioidergic, purinergic and
adrenergic receptors that are effectively activated by the released content of vesicles (0.5-1 M
adrenaline, 100-200 mM ATP and 1-2 mM opioids). Activation of autoreceptors can either produce
fast inhibition of Ca 2+ flowing through L-, N- and P/Q-type channels (direct modulation) [5, 6] or
slow up-regulation of L-type currents through a cAMP/PKA pathway (remote modulation) [7] that
auto-regulate hormone release depending on whether the cells are at rest, mildly stimulated or
activated by sustained sympathetic stimuli. Besides controlling the release of catecholamines,
voltage-gated Ca 2+ channels shape the action potential profile and through their coupling to “big”
K + channels control the “pace-maker” current underlying the autorythmic firing activity of the cells
[8].
Recently, we measured fast secretory events using high-resolution methods such as
“capacitance changes” and electrochemical detection of secretory events. Through the capacitance
changes we are now able to measure fast secretion in the order of 10 to 30 fF (corresponding to the
fusion of 10-30 vesicles) following applications of brief pulses of Ca 2+ (100-200 ms) capable of
saturating the readily-releasable pool of vesicles and determine the probability of vesicle release
under different physiological and pathological conditions [9, 10]. Electrochemical detection
(amperometry) using carbon fibers of 5 µm diameter located close to the cell surface allows to
reveal vesicle fusion and the release of catecholamines associated to single secretory events
(quantal units). Off-line analysis of the time course of quantal events and of their frequency of
occurrence [2] enable detailed studies of the molecular mechanisms, which are at the basis of Ca 2+ -
dependent neurosecretion.
Bibliography
1 – Albillos et al. 1994. J Physiol 477:197-213
2 – Carabelli et al. 2007. (submitted)
3 – Novara et al. 2004. J Physiol 558:433-449
4 – Carabelli et al. 1998. Neuron 20:1255-1268
5 – Hernàndez Guijo et al. 1999. Eur J Neurosci 11:3574-3584
6 – Albillos et al. 1996. Eur J Neurosci. 8:1561-1570
7 – Cesetti et al., 2003. J Neurosci 23:73-83
8 – Marcantoni et al. 2007. (submitted)
9 – Carabelli et al. 2003. Biophys J 85:1326-1337
10 – Giancippoli et al. 2006. Biophys J 90:1830-1841

LA COMPARSA PRECOCE DELLA TOLLERANZA ALL’EFFETTO IPOFAGIZZANTE
DELL’ANTAGONISTA DEL RECETTORE DEI CANNABINOIDI SR141716 NON
ANNULLA IL BLOCCO DELL’EFFETTO ORESSIGENICO DI HEXARELINA, UN
AGONISTA DEL RECETTORE DELLA GHRELINA
Gloria Bigi
Dipartimento di Farmacologia, Chemioterapia e Tossicologia Medica, Università degli
Studi di Milano
La ghrelina, un peptide di 28 aminoacidi, prodotto principalmente a livello gastrico, è un
potente stimolo oressigenico per molti animali, tra cui l’uomo. Il peptide, attivando il
recettore dei GH secretagoghi (GHS-R), stimola specifiche aree ipotalamiche implicate nel
controllo dell’assunzione di cibo, in particolar modo il nucleo paraventricolare. Più
precisamente, la ghrelina agirebbe stimolando la via oressigenica del neuropeptide Y
(NPY), dell’oressina e del peptide correlato all’Agouti (AgRP) e, contemporaneamente,
inibendo il sistema anoressigenico propomelanocortinico. Non si esclude il coinvolgimento
di altri sistemi neuropeptidergici e/o neurotrasmettitoriali.
È noto che l’assunzione di cibo è modulata anche dal sistema degli endocannabinoidi. La
somministrazione di composti derivati dalla cannabis come il _ 9 -tetraidrocannabinolo (_ 9 -
THC) stimola l’assunzione di cibo, mentre l’antagonista del recettore dei cannabinoidi di
tipo 1 (CB 1 ) SR141716 (Rimonabant) esercita un’azione anoressigenica.
Analogamente agli effetti della ghrelina, i neuroni del nucleo paraventricolare sono
estremamente sensibili anche alle azioni dei cannabinoidi esogeni ed endogeni, come
dimostrato dall’induzione dell’espressione di c-fos dopo somministrazione di un agonista.
Anche se l’SR141716 riduce in modo dose-dipendente sia l’assunzione di cibo che il peso
corporeo nelle fasi iniziali di un trattamento cronico nel ratto, entro 5 giorni si sviluppa un
fenomeno di tolleranza all’effetto ipofagizzante. Ciononostante, il peso corporeo rimane
marcatamente ridotto per l’intera durata del trattamento.
Attualmente non si conoscono le ragioni del mantenimento della riduzione del peso
corporeo indotta da SR141716, anche se sono stati proposti diversi meccanismi centrali
e/o periferici.
Lo scopo del presente lavoro di tesi era quello di valutare se nel ratto, reso tollerante
all’effetto ipofagizzante di SR141716, il composto fosse ancora capace di bloccare la
spiccata attività oressigenica di hexarelina, un agonista di GHS-R. Parallelamente, si è

voluto verificare se differenti schemi di somministrazione di SR141716 (per esempio,
somministrazione a giorni alterni) fossero capaci di contrastare/ritardare il fenomeno della
tolleranza all’effetto ipofagizzante del farmaco.
Nell’esperimento acuto, ciascuna dose di SR141716 (1, 5 e 10 mg/Kg, i.p.) riduceva
significativamente l’assunzione di cibo rispetto ai ratti trattati con veicolo; al contrario,
hexarelina (160 _g/Kg, s.c.) stimolava marcatamente l’assunzione di cibo.
Interessantemente, tutte le dosi di SR141716 erano capaci di ridurre l’effetto oressigenico
dell’agonista di GHS-R somministrato acutamente.
La somministrazione di SR141716 per 15 giorni (10 mg/Kg, i.p.) riduceva sia l’assunzione
di cibo che il peso corporeo. Come atteso, entro 5 giorni, si sviluppava tolleranza all’effetto
ipofagizzante dell’antagonista del recettore CB 1 , ma, al contrario, il peso corporeo
rimaneva al di sotto di quello del gruppo controllo per l’intera durata del trattamento.
Nonostante lo sviluppo della tolleranza all’effetto ipofagizzante, l’elemento più interessante
era che SR141716 era capace di sopprimere l’effetto oressigenico di prove di stimolazione
acuta con hexarelina ripetute durante l’intero esperimento cronico.
Infine, la somministrazione di SR141716 a giorni alterni (10 mg/Kg, i.p.), per 10 giorni, non
era in grado di ridurre il peso corporeo a causa di un aumento a “rimbalzo” dell’assunzione
di cibo nell’intervallo che precedeva la successiva somministrazione dell’antagonista del
recettore CB 1 .
In conclusione, i risultati del presente lavoro di tesi confermano l’esistenza di
un’interazione funzionale tra ghrelina ed endocannabinoidi nel controllo dell’assunzione di
cibo e dimostrano la capacità di un antagonista del recettore CB 1 di sopprimere l’iperfagia
conseguente a un potente stimolo oressigenico. Perché l’SR141716 possa ridurre
efficacemente il peso corporeo, è necessario che il sistema endocannabinoide sia
costantemente soppresso.

EFFETTI DI GHRELIN IN FORMA ACILATA E NON
SPONTANEA E STIMOLATA DI GONADOTROPINE
ACILATA SULLA SECREZIONE
Lorenza Bonelli, Fabio Lanfranco, Matteo Baldi, Marcella Balbo, Rita Berardelli, Andreea Picu, Roberta
Giordano, Emanuela Arvat, Ezio Ghigo
Div. Endocrinologia e Malattie del Metabolismo, Dip. Medicina Interna, Università di Torino
Ghrelin è un peptide acilato di 28 aminoacidi recentemente isolato dallo stomaco di ratto e dallo stomaco
umano, dotato di una potente attività GH-liberatrice mediata dai recettori ipotalamo-ipofisari per i GHsecretagoghi
(GHS-R). È stato dimostrato che ghrelin è molto più di un semplice GH secretagogo naturale
poichè agisce anche su altri recettori centrali e periferici esercitando numerose azioni, quali la stimolazione
della secrezione lattotropa e corticotropa. Ghrelin stimola inoltre l’introito di cibo e provoca un aumento di
peso, suggerendo che ghrelin giochi un ruolo modulatorio sul comportamento alimentare e sul bilancio
energetico.I livelli plasmatici di ghrelin sono elevati durante digiuno prolungato, una condizione che si
associa ad una ridotta attività riproduttiva. Elevati livelli di ghrelin sono infatti riscontrati nell’anoressia
nervosa. Dati recenti indicano che ghrelin può partecipare alla modulazione dell’asse ipotalamo-ipofisigonadi
con un effetto prevalentemente inibitorio sulla funzione riproduttiva in primati, pecore e ratti.
Nell’animale è stato dimostrato che ghrelin inibisce la secrezione di ormone luteinizzante (LH) in vivo, e
diminuisce la risposta di LH a GnRH in vitro; la somministrazione ripetuta di ghrelin ha indotto un parziale
ritardo di sviluppo puberale in ratti maschi. Infine, il trascritto di ghrelin e del suo recettore è stato identificato
nelle gonadi di ratto e umane, ed è stato descritto che ghrelin inibisce la secrezione stimolata di testosterone a
livello testicolare. Dati preliminari nell’uomo hanno indicato che la somministrazione acuta a bolo di
differenti dosi di ghrelin (0.2 – 1 – 5 – 10 µg/kg) in maschi normali non modifica la secrezione di LH e FSH.
Sulla base di queste premesse abbiamo valutato gli effetti della somministrazione prolungata e.v. di ghrelin
acilato in soggetti normali eugonadici sulla secrezione pulsatile delle gonadotropine e sulla secrezione degli
steroidi gonadici. E’ stato evidenziato che l’infusione di ghrelin acilato ha soppresso la pulsatilità di LH in
tutti i soggetti, mentre non si sono osservate variazioni significative della secrezione di FSH. I livelli di
testosterone nei maschi e di 17-beta-estradiolo nelle femmine sono risultati significativamente ridotti al
termine dell’infusione di ghrelin acilato. I risultati di questo studio dimostrano che l’infusione prolungata di
ghrelin acilato esercita un ruolo inibitorio sulla secrezione pulsatile di LH in soggetti normali, suggerendo che
ghrelin possa agire direttamente a livello ipofisario e/o ipotalamico. Al fine di valutare se l’azione inibitoria di
ghrelin fosse esplicata a livello ipofisario o sovraipofisario, abbiamo valutato l’effetto di ghrelin sulla
secrezione stimolata di gonadotropine in un gruppo di soggetti di sesso maschile. Le risposte di LH e FSH al
GnRH durante salina sono risultate simili a quelle registrate durante infusione di ghrelin acilato indicando che
tale ormone inibisce la secrezione pulsatile di LH ma non la risposta di LH a GnRH. Dunque ghrelin, per lo
meno nella sua forma acilata, esercita un effetto inibitorio sull’asse gonadico nei maschi attraverso un’azione
ipotalamica. Per discriminare se l’azione si svolga a livello ipotalamico o sovraipotalamico abbiamo in
progetto la valutazione degli effetti di ghrelin sulla secrezione di gonadotropine in risposta al naloxone.
Un recente studio ha documentato la capacità di grelin des-acilato (UAG) di riprodurre gli effetti inibitori di
ghrelin sui livelli sierici di LH in ratti maschi adulti. Iniezioni giornaliere di ghrelin acilato o UAG a ratti
maschi durante la pubertà hanno ridotto in modo simile i livelli sierici di LH e hanno parzialmente ritardato
l’avvio dello sviluppo puberale. Analogamente, l’infusione continua di ghrelin acilato o UAG in ratti maschi
adulti ha determinato una significativa riduzione dei livelli medi di LH e FSH. Questi dati indicano per la
prima volta la capacità di UAG, considerata inizialmente una forma inerte della molecola, di mimare le azioni
di ghrelin acilato sulla secrezione di LH. Stiamo attualmente valutando gli effetti nell’uomo di un’infusione
prolungata di UAG sulla secrezione di gonadotropine.

SISTEMA SEROTONINERGICO E REGOLAZIONE NEURO-ORMONALE
Marcella Balbo, Andreea Picu, Rita Berardelli, Lorenza Bonelli, Roberta Giordano, Ezio Ghigo,
Emanuela Arvat
Div. Endocrinologia e Malattie del Metabolismo, Dip. Medicina Interna, Università di Torino
Uno dei principali indirizzi di ricerca in questo ambito ha per oggetto la neuroregolazione dell’asse
ipotalamo-ipofisi-surrene ed, in particolare, il ruolo complesso del sistema serotoninergico nella
modulazione di tale asse. Le premesse di questa linea di studi si fondano sul noto, e non secondario, ruolo
della serotonina come mediatore, a livello centrale, di differenti funzioni endocrine e non endocrine. Sono
stati dimostrati, infatti, plurimi effetti sulla secrezione delle tropine ipofisarie: un effetto prevalentemente
stimolatorio sul GH e sulla PRL, inibitorio sul TSH, duplice (sia stimolatorio, sia inibitorio) sulle
gonadotropine. Il ruolo del sistema serotoninergico sulla regolazione dell’asse HPA e sulla modulazione
di sue importanti caratteristiche (secrezione basale, ritmo circadiano, risposta allo stress, feedback
negativo dei glucocorticoidi), sembra essere prevalentemente eccitatorio, mediato dall’azione di diversi
tipi recettoriali presenti sia a livello ipotalamico sia a livello ipofisario, sebbene sia stato riportato anche
un effetto inibitorio della serotonina sui livelli di ACTH e cortisolo. Il sistema serotoninergico, è stato
ipotizzato essere coinvolto nella genesi di varie patologie psichiatriche, quali la depressione maggiore e i
disturbi del comportamento alimentare oltre che in svariate condizioni di alterazione funzionale dell’asse
HPA, quali gli stati di ipercortisolismo funzionale (invecchiamento, obesità). Lo studio dell’assetto del
sistema serotoninergico si è poi ritenuto poter essere di notevole interesse anche in modelli patologici in
ambito più strettamente metabolico. Recenti evidenze hanno, infatti, dimostrato, in pazienti affetti da
diabete mellito tipo 2 trattati nell’ambito di gruppi di educazione ‘Group Care’, un miglioramento del
compenso glico-metabolico significativamente superiore rispetto a pazienti trattati individualmente,
associato ad un miglioramento di parametri della qualità di vita, dello stato di soddisfazione personale e
del grado di conoscenza di malattia. Tali evidenze possono suggerire, quindi, il coinvolgimento di un
diverso assetto neuro-ormonale nella genesi delle differenze metaboliche dimostrate nei due gruppi di
pazienti.
Sulla base di tali premesse si è dato avvio ad una serie di studi che indagassero, tramite somministrazione
di citalopram, inibitore selettivo del reuptake della serotonina, la funzione serotoninergica nell’uomo in
condizioni fisiologiche ed in diversi modelli patologici (diabete mellito, anoressia nervosa).
Gli studi relativi alla risposta neuroendocrina alla somministrazione acuta di citalopram, condotti in
uomini e donne sani divisi per fasce d’età (giovani-adulti, 20-30 anni, middle-aged, 50-60 anni) hanno
permesso di evidenziare significative differenze età e sesso correlate. I dati preliminari mostrano, a fronte
di livelli basali di ACTH e cortisolo sostanzialmente sovrapponibili nei due gruppi, la presenza, nei
soggetti middle-aged, di livelli di DHEA già significativamente ridotti, in accordo con il declino etàdipendente
dell’attività della zona reticolare surrenalica. Il citalopram mostra la tendenza a determinare
una risposta più spiccata di ACTH e cortisolo nei soggetti middle-aged rispetto ai giovani, in accordo con
una generale ipereccitabilità età-dipendente dell’asse. Peraltro, l’aumentata capacità stimolatoria del
citalopram nei soggetti middle-aged è chiaramente presente nei maschi ma, sorprendentemente, assente
nelle femmine. La condizione di ipoestrogenismo che caratterizza le donne in questa fascia di età
potrebbe giocare un ruolo cruciale nella perdita della capacità modulatrice del sistema serotoninergico
sull’asse HPA. I dati relativi ai pazienti diabetici hanno permesso di evidenziare la perdita della
modulabilità dell’asse HPA in pazienti trattati con terapia individuale convenzionale, ma il mantenimento
di una risposta corticotropa e surrenalica, sovrapponibile a quella dei soggetti sani di pari età, nei soggetti
trattati nell’ambito di gruppi educazionali “Group Care”. Tale dato sembrerebbe, dunque confermare
l’ipotesi iniziale di una importante correlazione tra asse serotoninergico, assetto neuro-ormonale e
compenso glico-metabolico.
Sulla base di questi dati, le prossime ricerche saranno indirizzate a: 1) estendere lo studio degli effetti
sesso- ed età-dipendenti del citalopram valutando la risposta in soggetti in età geriatrica e l’influenza di
un trattamento sostitutivo estrogenico in donne post-menopausali; 2) valutare gli effetti neuroendocrini
del citalopram in altri modelli patologici, al fine di chiarire ulteriormente il ruolo del sistema
serotoninergico sulla modulazione neuro-ormonale, in termini fisiopatologici ed in relazione a possibili
implicazioni cliniche.

VGF protein as precursor of different biological active peptides.
Roberta Possenti*+, Cinzia Severini* and Andrea Levi*.
*INMM-CNR Rome and +Dept Neuroscience Univ Tor Vergata Rome
The vgf gene encodes for the VGF (non-achronymic name) precursor protein of 617 amino
acids in rat and 615 in human with 85% homology. The protein is expressed in subpopulations of
cells in central and periferical nervous systems, and in endocrines tissues as pituitary, adrenal
medulla gastroenteric tract etc.
MKTFTLPASVLFCFLLLIRGLGAAPPGRSDVYPPPLGSEHNGQVAEDAVSRPKDDSVPEVRA
ARNSEPQDQGELFQGVDPRALAAVLLQALDRPASPPAVPAGSQQGTPEEAAEALLTESVRS
QTHSLPASEIQASAVAPPRPQTQDNDPEADDRSEELEALASLLQELRDFSPSNAKRQQETA
AAETETRTHTLTRVNLESPGPERVWRASWGEFQARVPERAPLPPSVPSQFQARMSENVPLP
ETHQFGEGVSSPKTHLGETLTPLSKAYQSLSAPFPKVRRLEGSFLGGSEAGERLLQQGLAQ
VEAGRRQAEATRQAAAQEERLADLASDLLLQYLLQGGARQRDLGGRGLQETQQERENER
EEEAEQERRGGGEDEVGEEDEEAAEAEAEAEEAERARQNALLFAEEEDGAEDKRSQEEAP
GHRRKDAEGTEEGGEEDDDDEEMDPQTIDSLIELSTKLHLPADDVVSIIEEVEEKRKRKKN
APPEPVPPPRAAPAPTHVRSPQPPPPAPARDELPDWNEVLPPWDREEDEVFPPGPYHPFPNY
IRPRTLQPPASSRRRHFHHALPPARHHPDLEAQARRAQEEADAEERRLQEQEELENYIEH
VLLHRP
The VGF protein is sorted into the secretory pathway (signal peptide italics) where it is
proteolytically processed by the prohormon convertases (cleavage residues bold characters). The
processing of the VGF precursor molecule gives rise to several low molecular weight species. We
have studied a range of neuroendocrine and neuronal cells and we have pointed out that the
prominent VGF-processing products are NAAP-162 and TLQP-62 and HFHH-50 (C-terminal
underlined sequences).
A peptide of 30aa (AQEE-30) has been also purified by bovine pituitary gland. N-terminal
derived fragments (APPG-38/41) and an internal peptide (GGGE-43) have been extracted from
human cephalo-rachidial fluid (underlined sequences) and they appear as new markers of
pathological conditions as Dementia, A.D., ALS and others.
Several VGF derived peptid,s using the specific antibodies raised against the C-terminal
region, were purified from rat brain. Some of these peptides were studied in vivo and in vitro:
TLQP-62 and AQEE-30 induce synaptic charge in rat hippocampus neurons, while AQEE-30 and
LQEQ-19 induce penile erection in male rats. Chronic (14 days) administration of TLQP-21 by icv
injection is able to increase energy expenditure. This peptide shows also modulatory pronociceptive
effect on an in vivo model of formalin inflammation.
The activity of most peptides was investigated in different organs using in vitro assays.
TLQP-30 and TLQP-21 peptides are able to induce a dose-dependent contraction of rat isolated
gastric fundus and TLQP-21 shows uterus contraction in a specific hormonal cycle state.
C-terminal derived peptides have also protective anti-apoptotic action on primary culture of
cerebellar granule cells, and they also show a prolactin stimulatory effect on GH3 cell line.
Other physiological activities are under investigation.

Patologie endocrino-metaboliche e alterazioni qualitative e quantitative del sonno. Risultati
preliminari di studi actigrafici nell’uomo.
Fabrizio Riganti, Elena Gramaglia, Marcella Balbo, Lorenza Bonelli, Roberta Giordano, Emanuela
Arvat, Ezio Ghigo, Fabio Broglio
Divisione di Endocrinologia e Metabolismo, Dipartimento di Medicina Interna, Università di
Torino.
E’ ormai nozione consolidata che il sonno non è un rallentamento passivo di funzioni biologiche,
ma è invece caratterizzato dall’attivazione di specifiche aree cerebrali e profondamente influenza
numerose funzioni biologiche centrali e periferiche. Tra queste, particolare interesse è stato rivolto
alle variazioni di funzioni endocrino-metaboliche in rapporto alla ciclicità sonno-veglia. In
particolare il sonno ad onde lente è stato documentato svolgere un ruolo stimolatorio di per sè sulle
secrezioni somatotropa e lattotropa, e modulatorio sulla circadianità intrinseca delle attività degli
assi corticotropo e tireotropo. Come le funzioni endocrine, anche il metabolismo glicidico appare
essere profondamente influenzato dal ritmo sonno-veglia e tale relazione, come suggerito da recenti
studi sperimentali, potrebbe rivestire un importante significato clinico. Infatti, in accordo con
l’evidenza che la restrizione di sonno sia acuta sia prolungata induce una significativa
compromissione della tolleranza glucidica, recenti studi epidemiologici sembrano suggerire un
possibile ruolo della progressiva riduzione della quantità di sonno dichiarata nel corso dell’ultimo
secolo nei paesi occidentali quale concausa dell’incremento dell’incidenza della sindrome
metabolica. A fronte tuttavia delle numerosi dati presenti sul ruolo modulatorio del sonno su
funzioni endocrino-metaboliche, assai poche informazioni sono invece disponibili sugli effetti di
alterazioni endocrino-metaboliche sul sonno. Sulla base di tale premessa, scopo dei nostri studi è
stato pertanto di fornire una valutazione qualitativa e quantitativa del sonno in pazienti affetti da
patologie endocrino-metaboliche. A tal fine sono stati studiati 47 pazienti affetti da Diabete Mellito
tipo 2, 16 pazienti affetti da Morbo di Addison, 4 pazienti affetti da Sindrome di Cushing e 6
pazienti affetti da Morbo di Basedow. La comorbidità con patologie note per influenzare di per sè
qualità e/o quantità del sonno è stata considerata criterio di esclusione alla partecipazione allo
studio. La valutazione del sonno è stata effettuata mediante actigrafia al polso (Actiwatch, Mini
Mitter Co., Inc.; Bend, OR, USA) per tre giorni consecutivi infrasettimanali standard. I risultati
sono stati confrontati con quelli ottenuti in un gruppo di soggetti di controllo di pari età, sesso e
peso corporeo. I risultati ottenuti hanno mostrato nei pazienti affetti da diabete mellito, in assenza di
complicanze d’organo e/o comorbidità confondenti, una riduzione significativa dell’efficienza di
sonno e della percentuale di sonno effettivo, parallelamente a un netto incremento degli indici di
frammentazione del sonno, di attività totale notturna e della percentuale di tempo notturno in
movimento. Tali alterazioni non sono risultate correlare significativamente con lo stato di compenso
glico-metabolico. Analogamente, seppur con i limiti indotti dalla limitata numerosità del campione
studiato, nei pazienti affetti da Sindrome di Cushing (3 ACTH-dipendente e 1 ACTH-indipendente)
di nuova diagnosi è stata osservata una significativa riduzione della percentuale di sonno effettivo
ed un incremento della frammentazione del sonno e degli indici di movimento notturno. Al
contrario, nessuna alterazione statisticamente significativa dei parametri actigrafici è stata invece
riscontrata nei pazienti affetti da morbo di Addison in terapia sostitutiva. Infine, in accordo con il
frequente riporto anamnestico, i pazienti affetti da ipertiroidismo franco secondario a Morbo di
Basedow hanno mostrato una significativa riduzione della percentuale di sonno effettivo ed un
incremento della frammentazione del sonno e degli indici di movimento notturno. In conclusione, i
risultati di questi studi, seppur talora preliminari, mostrano la presenza di alterazioni qualitative e
quantitative del sonno in diverse condizioni di alterata funzione endocrino-metabolica. In
considerazione del noto impatto cardio-metabolico della compromissione quali/quantitativa del
sonno, tale riscontro appare meritevole di ulteriore approfondimento.

GLUTEN EXORPHIN B5: UN PEPTIDE OPPIOIDE ALIMENTARE
IN CERCA DI AZIONI BIOLOGICHE
Alessandro Delitala, Giuseppe Fanciulli, Giuseppe Delitala
Istituto di Clinica Medica, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università di Sassari
Agli inizi degli anni 90, un gruppo di farmacologi dell’Università di Tokio identificò,
mediante frammentazione enzimatica del glutine, dei piccoli peptidi (tetra e pentapeptidi)
dotati di azione oppioide in vitro. Tali peptidi vennero chiamati, per la loro origine
alimentare e la loro analogia strutturale con alcuni peptidi oppioidi endogeni, Gluten
Exorphins.
Nei 10 anni successivi alla loro scoperta furono pubblicati due soli altri lavori relativi alle
Gluten Exorphins: un primo studio sulla azione della Gluten Exorphin A5 (Gly-Tyr-Tyr-
Pro-Thr) sul Sistema Nervoso Centrale (SNC) e un secondo sull’azione della A5 e della B5
(Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu, un analogo strutturale della Leu-Encefalina) sulla secrezione
insulinica.
Nonostante l’esiguità della letteratura scientifica sull’argomento, le divulgazioni non
scientifiche sulle “proprietà” delle Gluten Exorphins ebbero in tale decennio una
larghissima diffusione in alcuni Paesi, in particolare negli Stati Uniti e in Norvegia;
sull’asserto che l’assunzione di glutine determinasse anche in vivo rilascio di sostanze
oppioidi, e che tali oppioidi avessero un impatto negativo sul SNC, si tentarono, proprio in
Norvegia (Università di Oslo) dei trial sulla instaurazione di una dieta gluten-free in
popolazioni con patologie psichiatriche; nel contempo aziende statunitensi lanciarono sul
mercato proteasi (in formulazioni orali) “in grado di indurre il breakdown delle Gluten
Exorphins assunte con il cibo”, allo scopo di “evitarne il loro assorbimento e i loro effetti
tossici”.
A partire dal 2002 il nostro gruppo di ricerca ha pubblicato alcuni studi in vivo sull’azione
delle Gluten Exorphins: in particolare la B5 si è dimostrata in grado di determinare un
incremento dei livelli di Prolattina (PRL) nel ratto (azione mediata da stimolazione di
recettori oppioidi localizzati esternamente alla Barriera Emato-Encefalica); è stata inoltre
identificata la porzione di molecola necessaria alla estrinsecazione della sua attività sulla
secrezione di PRL in vivo.
Parallelamente agli studi sulla loro azione farmacologica, il nostro gruppo ha proceduto alla
messa a punto del dosaggio delle Gluten Exorphins nei liquidi biologici: attualmente si
dispone di metodiche di Spettrometria di Massa in grado di quantificare nel Liquido
Cerebrospinale concentrazioni di A5 e B5 inferiori al ng/ml.
Infine, la recentissima identificazione (2007) della B5 nel plasma di soggetti con alterazioni
della permeabilità intestinale (Intolleranza al Glutine) potrebbe aprire nuovi scenari nella
ricerca sulle Gluten Exorphins, in particolare sul loro (possibile) ruolo sul SNC.

RETINOIDS AND DOPAMINE RECEPTOR SUBTYPE 2 EXPRESSION IN HUMAN
SECRETING AND NON SECRETING ADENOMAS
Bondioni S., A.R.Angioni, G. Mantovani, M.Locatelli * , P. Rampini * , S. Ferrero § , E.Ferrante,
P.Beck-Peccoz, A.Spada, A.G.Lania.
Dept. of Medical Sciences, Endocrine-Metabolic Unit, University of Milan, Fondazione Ospedale
Maggiore IRCCS Milano, *Dept.of Neurosurgery, Fondazione Ospedale Maggiore IRCCS Milano;
§ Pathology Unit, Dept of Medicine, Surgery and Dentistry, A. O. San Paolo, Milan.
It has been demonstrated that dopamine receptor subtype 2 (DR2) promoter contains a functional
retinoic acid response element possibly involved in the control of DR2 expression as demonstrated
by the low DR2 protein levels in animal models lacking this regulatory domain. Aim of the study
was to evaluate the effect of 9-cis-retinoic acid (RA) treatment on DR2 expression in 16 human
secreting and non-secreting pituitary adenomas (9 NFPA, 5 GH-omas, 2 PRL-omas). In basal
conditions, variable levels of D2R protein were detected by immunoblotting in most tumors,
without significant differences between NFPA and GH-omas. Conversely, the signal was absent in
the two PRL-omas investigated. Cell exposure to RA (100 nM) increased DR2 protein levels in 5/9
NFPA and 3/5 GH-omas, while no modification were observed in PRL-omas. These data were
further confirmed at the mRNA levels since in non-responder tumors, RA treatment did not affect
DR2 mRNA levels. Immunohistochemistry showed a homogeneous pattern of retinoic acid receptor
RXRα, RXRβ and RXRγ isoforms expression without any correlations with the induction of DR2,
thus suggesting that the absent D2R induction by RA in individual tumors was not related to RA
receptor deficiency. Finally, RA did not significantly modify in vitro GH release from 3 cultured
GH-omas, while induced a 67% stimulation of PRL release from the prolactinoma. In conclusion,
the study showed that D2R was induced by RA in a consistent number of pituitary tumors,
suggesting the existence of interaction between RA and D2R in human pituitary cells. However, the
main goal of the study, i.e. the induction of D2R expression in prolactinomas, the tumor type that
recognizes loss of D2R as a major cause of unresponsiveness to medical therapy, was not achieved.

The third intracellular loop of human SST5 is crucial for receptor internalization after SS28
stimulation
Erika Peverelli 1 , Giovanna Mantovani 1 , Andrea Lania 1 , Davide Calebiro, Andrea Doni 2 , Sara
Bondioni 1 , Paolo Beck-Peccoz 1 , Anna Spada 1
1-Unità di Endocrinologia, Dipartimento di Scienze Mediche, Fondazione Policlinico IRCCS,
Università di Milano, Milano; 2-Istituto Clinico Humanitas, Rozzano (MI)
Somatostatin (SS) is a widely distributed polypeptide that exerts inhibitory effects on hormone
secretion and cell proliferation by interacting with five different receptors (SST1-SST5), that
display important differences in tissue distribution, coupling to second messengers, affinity for SS
and intracellular trafficking. SS analogues currently used in the treatment of acromegaly inhibit
hormone secretion and cell proliferation by binding to SST2 and 5. Beta-arrestins have been
implicated in regulating SST internalization but the structural domains mediating this effect are
largely unknown. The aim of this study was to characterize the intracellular mechanisms
responsible for internalization of human SST5 in the rat pituitary cell line GH3. To this purpose we
evaluated by fluorescence microscopy SS28-mediated trafficking of receptor fused to DsRed2 and
beta arrestin-1 or -2 fused to EGFP. To identify the SST5 structural domains involved in these
processes, we evaluated progressive C-terminal truncated proteins, SST5 mutants in which serine,
threonine or acidic residues within the third cytoplasmic domain were mutated (S242A, T247A and
E243A) and a naturally occurring R240W mutant in the third intracellular loop previously found in
one acromegalic patient resistant to somatostatin analogues. We tested the ability of these mutants
to associate with beta arrestin and to internalize under agonist stimulation. The truncated mutants
are comparable to the wild-type receptor with respect to beta arrestin recruitment and
internalization, whereas third cytoplasmic loop mutants show a significantly reduced internalization
and arrestin translocation upon SS28 stimulation. Our results indicate SST5 third intracellular loop
as an important mediator of beta arrestin/receptor interaction and receptor internalization, while the
role of the C-terminal tail would be to sterically prevent beta-arrestin/receptor interaction in basal
conditions.

SOMATOSTATIN ANALOGUES AND GHRH ANTAGONISTS INHIBIT ECTOPIC
ENDOMETRIAL CELL PROLIFERATION AND SURVIVAL
Marta Annunziata, Letizia Trovato, Fabio Settanni, Cristina Grande, Marco Camanni*, Francesco
Deltetto*, Ezio Ghigo, Riccarda Granata.
Molecular and Cellular Endocrinology Laboratory, Department of Internal Medicine, University of
Turin. *Valdese Hospital, Turin.
Endometriosis, the presence of endometrial cells outside the uterus, is a common estrogendipendent
disorder that results in pelvic pain and infertility. Ectopic endometrium (outside the
uterus) shows increased proliferation, impaired sensitivity to apoptosis, and different gene
expression profiling with respect to eutopic endometrium (inside the uterus). Somatostatin (SS) and
growth hormone-releasing hormone (GHRH) are hypothalamic hormones that respectively inhibit
and stimulate pituitary GH secretion. In addition, in peripheral tissues somatostatin and its
analogues inhibit while GHRH stimulates both normal and cancer cell growth and survival. These
extra-pituitary effects are mediated by a family of five somatostatin receptor subtypes (SSTR1 to 5)
and by the GHRH receptor (GHRH-R), particularly the splice variant 1 (SV1). Moreover GHRH
antagonists act as antiproliferative molecules in normal and tumoral cells. Interestingly, both
SSTR2 and GHRH expression have been shown in normal human endometrium.
Aim of this study was to investigate the expression of GHRH, SS and their receptors in ectopic
endometrium of patients with endometriosis. Moreover, to test whether SS analogues and GHRH
antagonists would exert inhibitory effect on ectopic endometrial cell proliferation and survival. RT-
PCR results showed SSTR2 and 5 mRNA and GHRH-R SV1 in ectopic endometrium (n=14).
Further, by real- time PCR, we found that SSTR2 and SSTR5 were significantly more expressed in
ectopic than in eutopic tissues. Importantly, the SS analogues Lantreotide and Octreotide dosedependently
reduced ectopic endometrial stromal cell (ESC) growth and survival. Noteworthy, also
GHRH antagonist JV-1-36 showed potent inhibitory effect on ESC proliferation and viability.
In conclusion, these findings suggest that SS analogues, as well as GHRH antagonists may be
useful molecules for preventing proliferation and survival of ectopic endometrial cells in patients
with endometriosis.