La telomerasi: introduzione

LA TELOMERASI

La scoperta della telomerasi in Tetrahymena e il concetto emergente che l’accorciamento deitelomeri è connesso con il numero di replicazioni ha condotto a cercare un’attività telomerasicanelle cellule neoplastiche, dove fu trovata per la prima volta nel 1989. Tuttavia, fu solo nel 1994che Jerry Shay e Woodring Wright in collaboratione con scienziati della Geron Corporation,dimostrarono che la telomerasi poteva essere evidenziata in circa il 90% di tutti i tumoriesaminati. Gli scienziati della Geron hanno clonato la componente RNA della telomerasi umana(hTR) e, in collaborazione con il laboratorio di Tom Cech, hanno clonato la porzione proteicadell’enzima (hTERT). Mentre hTR è espressa in tutte le cellule, hTERT è presente solo nellecellule con attività telomerasica.Circa 40 anni fa, Leonard Hayflick scoprì che le cellule umane normali hanno una limitata capacitàa dividersi, alla fine della quale vanno incontro a un arresto della crescita (diventano senescenti).Questo fenomeno è noto come "Hayflick Limit". Le cellule normali invecchiano e contano unnumero finito di divisioni cellulari, come noi contiamo l’invecchiamento con gli anni. La questioneimportante erano le basi molecolari del "replicometro."Gli studi genetici pioneristici di Hermann Muller nel 1938 e di Barbara McClintock nel 1941avevano dimostrato che le estremità dei cromosomi devono essere incapsulate da una strutturaspeciale chiamata il telomero che protegge le estremità dei cromosomi e ne previene la fusione.Una volta definita la struttura dei cromosomi degli eucarioti come molecole lineari con delleestremità chiamate telomeri e definite le caratteristiche e il meccanismo di funzionamento dellaDNA polimerasi, sorgeva il problema di come questo enzima potesse portare a compimento lasintesi del DNA alle estremità dei cromosomi.The end replication problem: Durante la replicazione del DNA il filamento leader (o veloce) èsintetizzato come una molecola continua che può replicare dall’inizio alla fine di uno stampolineare. Il filamento ritardato (o lento) è sintetizzato sotto forma di un set discontinuo di cortiframmenti Okazaki, ciascuno dei quali richiede un nuovo primer disteso sul templato, che devonoessere poi uniti per fare un filamento continuo. Il filamento lento non può replicare dall’inizio allafine del cromosoma lineare, poichè non c’è DNA oltre la fine per il primer (l’innesco) necessarioper sintetizzare l’intervallo tra l’ultimo frammento di Okazaki e l’estremità. Questo lascia un 3′sporgente. Al 5’ del filamento lento quindi resterebbe un tratto di sequenza non duplicata cheporterebbe al progressivo accorciamento dei telomeri, e quindi dei cromosomi, a ogni ciclo direplicazione. Alexy Olovnikov suggerì che l’accorciamento dei telomeri poteva essere alla base dellimite di Hyflick. Tuttavia, quest’idea languì per almeno due decenni.

Molti scienziati interessati alla replicazione del DNA si sono applicati a risolvere questo problema,utilizzando organismi unicellulari. Elizabeth Blackburn, lavorando con il protozoo ciliatoTetrahymena thermophila, identificò nel 1978 che le sequenze dei telomeri di Tetrahymena eranocostituite di centinaia e centinaia di basi di sequenze ripetute TTGGGG. Poi, Carol Greider, ungraduate student nel laboratorio della Blackburn, scoprì che l’attività enzimatica che sintetizza lesequenze ripetute dei telomeri è la telomerase, in T. thermophila. La Telomerasi è un enzimaribonucleoproteico che usa la sua componente RNA come templato per aggiungere DNAal’estremità 3′ dei telomeri. Quindi la telomerasi risolve il problema della “ end-replication”allungando i telomeri e contrastando l’accorciamento delle estremità.

Quando Carol Greider, entra come Ph.D. nel laboratorio della Blackburn, cercano di mettere apunto un saggio dell’attività di sintesi dei telomeri perfezionando:l’estratto, in genere derivante dalla Tetrahymena termophila, un organismo che contiene numerositelomeri e quindi una gran quantità dell’enzima che li sintetizza, almeno secondo la Blackburn;il substrato, che doveva mimare i telomeri;il saggio, che fondamentalmente consisteva nell’incubare estratto e substrato con oligonucleotidimarcati, per vedere eventuali incorporazioni di marcatura tramite autoradiografia di un gel diagaroso su cui la reazione veniva fatta correre.L’obiettivo era quello di vedere l’aggiunta di desossinucleotidi radioattivi a frammenti di restrizione(uno centrale e i due estremi) derivanti da un unico frammento di DNA con ad un’estremità unasequenza telomerica, all’altra una sequenza non telomerica (il substrato). Quello che peròosservarono fu un gran numero di bande su gel di agaroso che non dava alcuna informazione. Ilpasso successivo fu di utilizzare , come substrati, un frammento di restrizione più piccolo consequenze telomerica all’estremità e successivamente un oligonucleotide sintetico costituito da 4ripetizioni della sequenza TTGGGG, appunto la sequenza dei telomeri di Tetrahymena. I piccoliframmenti poterono essere analizzati su un gel di quelli per sequenziamento (di acrilammide). Il 25dicembre del 1984 ebbero finalmente il primo risultato di un’attività enzimatica, ovvero unaperiodicità di sei basi aggiunta de novo all’oligont, e quindi la conferma che erano sulla buonastrada.Prima di farsi prendere da eccessivo entusiasmo però occorreva verificare che quello che stavanoosservando non derivasse da artefatti o altro ancora. Per esempio, come aveva scoperto un

icercatore sempre nel laboratorio della Blackburn, le sequenze telomeriche erano in grado diripiegarsi su se stesse con della interazioni fra basi di tipo non Watson-Crick, quindi potevatrattarsi ancora una volta della DNA polimerasi normale che vedeva queste sequenze ripiegatecome primers per la sua attività. Occorreva quindi fare una serie di esperimenti che coprirono tuttoil 1985.In particolar modo rilevarono che:• Estratti cellulari incorporano solo dGTP e dTTP con una periodicità di circa 6 nt• L’addizione di queste sequenze è indipendente dal DNA endogeno e dalla DNA polimerasidi tipo α della Tetrahymena (aphidicolina, un potente inibitore della DNA polimerasi di tipo αdella Tetrahymena , non aveva effetti)• I 6 nt aggiunti sono: TTGGGG• L’attività ha proprietà enzimatiche:– Rapido aumento dell’incorporazione della marcatura– Alta affinità col substrato– Suscettibilità alla temperatura e alla proteinasi KQuesti risultati, pubblicati nell’importante lavoro del 1985, portarono alla conclusione che esiste unenzima, una terminal transferasi del telomero poi da loro chiamata telomerasi, che addizionaesanucleotidi ai telomeri dei cromosomi. (N.B. L’aphidicolina è)Secondo la Blackburn quindi era tutto merito di un enzima simile ad una terminal transferasi.Proponeva quindi che la vita della cellula, dipendente dalla lunghezza dei cromosomi, derivasse daun equilibrio tra il progressivo accorciamento dei telomeri dovuto al mal funzionamento della DNApolimerasi e l’aggiunta delle sequenze ripetute da parte di questo nuovo enzima.Sempre la Blackburn e la Greider sono in seguito riuscite a dimostrare la natura di questo enzima.Il problema infatti era: chi o cosa dice alla telomerasi di sintetizzare le sequenze ripetute alleestremità dei telomeri? Poiché in quel periodo erano noti diversi meccanismi coinvolgenticomplessi ribonucleoproteici (sintesi proteica, processamento dell’rRNA, inizio della repilicazionedel DNA mitocondriale, packaging del DNA fagico) la Greider ipotizzò che potesse anch’essaessere ribonucleoproteina. Infatti il complesso era sensibile ai Sali ed era di grossa taglia (200-500kD); era sensibile alle MNAsi, all’RNAsi (quindi aveva in sé una componente a RNA) e allaproteinasi K; in più piccoli RNA copurificano col complesso, in particolare un RNA di 159 bp. Tuttiquesti risultati (pubblicati nel 1987) portarono alla conclusione che effettivamente poteva essereuna ribonucleoproteina.Una volta clonata la sequenza dell’RNA dell’enzima, ipotizzarono che la sequenza CAACCCCAAcontenuta al suo interno servisse alla telomerasi sia per riconoscere le sequenze ripetute deitelomeri che per fungere da stampo. Con un meccanismo di elongazione-traslocazione quindiaggiunge gli esanucleotidi in tandem. SINTESI (Elongation): La telomerasi sintetizza un primomodulo di DNA complementare al RNA della telomerasiTRASLOCAZIONE: Ibrido DNA-RNA si denatura e il DNA neosintetizzato retrocedelasciando disponibile il templato per la sintesi del modulo successivo

Sempre a loro spetta la determinazione della funzione in vivo. Osservarono infatti che faresprimere alla cellula telomerasi con la sequenza CAACCCCAA mutata porta alla senescenzadelle cellule, avvalorando definitivamente anche il meccanismo dello stampo.Le sequenze ripetute dei telomeri sono altamente conservate; tutti i vertebrati hanno lastessa semplice sequenza TTAGGGLe prime evidenze che i telomeri umani potevano accorciarsi apparvero nel 1986, quando fudimostrato che la lunghezza dei telomeri non era la stessa in tutti i tessuti. Quando fu pubblicata lasequenza telomerica umana, TTAGGG, nel 1988, divenne molto più facile misurare la lunghezzadei telomeri umani. Nel 1989 venne dimostrata l’attività telomerasica anche in cellule umanetramite esperimenti del tutto simili a quelli usati dalla Blackburn e dalla Greider.Questi studi culminarono nel lavoro di Calvin Harley che dimostrò che i telomeri si accorciavanoquando i fibroblasti normali si dividevano in coltura, a causa della mancanza della telomerasi nellecellule normali, confermando che l’accorciamento dei telomeri limita il numero di dupliazioni dellecellule normali in coltura.

Sin dagli anni 1970s, l’invecchiamento replicativo era considerato un freno contro la formazionedel cancro. Le cellule neoplastiche devono accumulare un gran numero di mutazioni per diventaremaligne, e questo richiede probabilmente almeno 20-30 duplicazioni perché una cellula che recauna mutazione per crescere im una popolazione abbastanza grande da favorire un’altramutazione. Le cellule normali raggiungerebbero quindi la senescenza prima di accumulareabbastanza mutazioni per diventare maligne, poiche l’invecc

Una questione fondamentale che resta da essere provata è se queste osservazioni sulla biologiadei telomeri nelle cellule propagate in coltura sono rilevanti anche per l’invecchiamentodell’organismo. Il potenziale replicativo delle cellule umane potrebbe essere regolato a un puntosufficiente per consentire una crescita, uno sviluppo , un riparo e un mantenimento normali, manon così grande da permettere il gran numero di divisioni necessarie per accumulare le moltemutazioni necessarie perché una cellula diventi maligna. L’accorciamento dei telomeri può essereconsiderato un meccanismo che limita il potenziale mitotico di ogni tipo cellulare, e quindi lasenescenza cellulare essere considerata un potente meccanismo soppressivo del tumore. Noi oggiviviamo ben oltre i 30-40 anni dei nostri antenati dell’età della pietra. Poiché il numero di divisionirichieste per il mantenimento e il riparo cellulare durante 40 anni di vita potrebbe non esseresufficiente nell’arco di 80-100 anni di vita, la senescenza cellulare potrebbe contribuire al declinonell’omeostasi tessutale associato con l’invecchiamento.Nelle cellule umane, come nel lievito, esiste un "telomere position effect" (TPE). TPE dipendedalla lunghezza del telomero e dalla posizione del gene in relazione al telomero. Consente allacellula di sapere quanto è vecchia (tenere la traccia del suo numero di divisioni) e di modificareconseguentemente l’espressione genica (il comportamento) durante il tempo di vita della cellula.Il telomero, p53 e la senescenzaLa divisione cellulare delle cellule che sono telomerasi-negative (cellule normali) provocal’accorciamento dei telomeri che si accompagna all’invecchiamento della cellula continua finchè iltelomero raggiunge una lunghezza finita. A quel punto, la cellula smette di dividersi. Questoarresto nella crescita è innescato da p53, che viene di solito attivato in risposta a un danno al DNA.Più importante dell’accorciamento del telomero è probabilmente la perdita del cappello deltelomero. Le estremità del DNA cromosomiale sono quindi esposte e riconosciute dalla cellulacome una rottura del doppio filamento, che viene percepito come un danno al DNA, scatenando ilcheckpoint mediato da p53, che causa un arresto della crescita e l’ingresso in senescenza. Seperò una rara cellula nella popolazione ha acquistato una mutazione in p53 o in checkpoints delciclo-cellulare può ignorare questo segnale e continuare a dividersi entrando in un ciclo di rotturafusioneponte che causa un massiccio danno cromosomiale /instabilità cromosomica. Alcunecellule possono sopravvivere a questo periodo di catastrofe genetica riattivando la telomerasi, chearresta il ciclo catastrofico e ripristina una sufficiente stabilità cromosomica per la sopravvivenzacellulare. Queste cellule danneggiate possono accumulare ulteriori mutazioni e condurre al cancro.

Telomerasi e longevitàNell’uomo ci sono 92 telomeri che indicano la durata della vita. Le cellule nella maggior parte deitessuti umani gradualmente rallentano la loro crescita, in proporzione all’accorciamento deitelomeri. Alcuni Studi hanno mostrato che le cellule normali di gente vecchia perdono la capacità didividersi a un tasso veloce rispetto alle cellule di un giovane e che le cellule senescenti aumentanocon l’età.Mentre l’accorciamento del telomere fornisce la storia replicativa- un orologio che ricorda allacellula quante volte si è divisa e quanto tempo le resta da vivere- l’allungamento del telomerofornisce longevità alla cellula. Questo avviene ovviamente alle cellule del cancro grazie allatelomerasi che le rende "immortali,". Se uno blocca l’azione della telomerasi in una cellulaneoplastica il telomero comincia ad accorciarsi a ciascuna divisione, come nelle cellule normali e lacellula smette di dividersi e muore.Nelle cellule normali che non sono le germ cells, la telomerasi è spenta a stadi precoci dellosviluppo. I telomeri non si allungano più e la cellula va incontro a un limitato numero di divisionicellulari. Se si introduce la Tert in cellule normali ne si allunga la vita.