POTENZIALE TRANSITORIO

TRPPOTENZIALE TRANSITORIO

Transient receptor potential (TRP) channelsCOSTITUISCONO UNA GRANDE E DIVERSIFICATAFAMIGLIA DI PROTEINEESPRESSE IN DIVERSI TIPI DI CELLULEE TESSUTI SIA DEI VERTEBRATI CHEDEGLI INVERTEBRATIThe TRP superfamily INCLUDE ATTUALMENTE 56PROTEINE CLAASIFICATE I7 SOTTOFAMIGLIE

POLYCYSTINMUCOPOLINANKTM1NOMPCSONO PIU’ STRETTAMENTE RELATE AI CANONICITRP

DATA LA ENORME QUANTITA’ DI FUNZIONIDI QUESTO TIPO DI MOLECOLE, QUESTE VENGONOCLASSIFICATE IN BASE ALLE OMOLGIEDI STRUTTUR E NON PER SOMIGLIANZE DI FUNZIONE

TUTTE LE TRPS HANNO UNA STRUTTURAA SEI DOMINI TRANSMEMBRANASI RITIENE CHE IL TM5 TM6 abbiano un ruolo fondamentaleNella formazione del poro

COME ALTRE PROTEINE CANALEPOSSONO FUNZIONARE COME OMO O ETERO MULTIMERI

GRAN PARTE DELLE PROTEINE TRP PRESENTANORIPETIZIONI DI ANKYRIN ALL’N TERMINALEANKYRIN DOMAINmotivo forcina seguito da elica loop elica. Questo diminioe’ importante per l’interazione con altre proteina

TRPC SONO CANALI Ca2+ non selettivi PCa2+:Pna= 110:1Le proteine di questa famiglia presentano tutte 3-4 Ankyryn N-terminaleEd un dominio molto conservato TRP box C-terminale

La prima proteina che da il nome alla famiglia TRP (TRPC)Venne identificata in drosophila.Nella Drosophila la trasduzione del segnale visivoavviene grazie ad un recettore GPCR associato alla rodopsinaIl quale per via di una PLC detrmina l’attivazione di TRP…

Generazione di mutanti di DrosophilaAnalisi:Potenziale elettrico in risposta a stimoli visivi hapermesso di identificare un mutante caratterizzato dapotenziale transitorio detreminato da una mancanzad’ingresso di Ca 2+ .L’dentificazione del gene responsabile il clonaggionella su forma funzionale e la reintroduzione nelleDrosophile mutanti ha dimostrato il ruolo di questeproteine Canale nel processo visivo di Drosophila

Le classic TRP TRPC sono suddivise in7 sottofamiglie C1--->C7VERTEBRATIINVERTEBRATIINVERTEBRATI

Le TRPL formano multimeri ed hannoUna permebilità meno specificaPCa2+:PNa+ 4:1

TRPVSONO ATTIVATE DASTIMOLI FISICITEMPERATURA, pH, STRESS MECCANICO, OSMOTICOMA ANCHE, NON TUTTE, DA LIGANDI (capsaicina,mentolo…..)LA PERMEABILITA’ IN QUEST FAMIGLIAL’ARCHETIPO DI QUESTA FAMIGLIA E TRPV(VANILLOID)DI QUESTA FAMIGLIA FANNO PARTE OSM-9PCa2+:PNa+ 100:1

DELLE TRPV FANNO PARTE RECETTORI CAPACIDI DARE RISPOSTE A STIMOLI NOCICETTIVI CHIMICIE TERMICI TRPV1 TRPV2TRPV4 DEI VERTEBRATI COME OSM-9 NEGLI INVERTEBRATIHA UN RUOLO NELLA OSMO-CEZIONE

TRPMTRPM

TRPP

TPRN TPRA

NATURE DECEMBER 2003

OSM-9OTRPCOSM-9 e una TRP fondamentalePer :OlfattoOsmotensioneChemoMeccano stimoliIn C.ElegansLe proteine TRPV1 (VR1)TPRV4Appartengono alla STESSA famiglia delle

Trutte le OTRPC hanno in comune 3 ripetizioni di AnkyrinNell’N-terminale , sei domini transmembrana, una lungaCoda intracitoplasmatica C terminaleOSM-9 ha un ruolo chiave nella percezione di stimoli nociviCaratteristica comune ai TRPV mammiferi (caldo, acido..)Le diverse TRPV sono espresse da neuroni sensoriali di diversoDiametro. La coesistenza di piu’ TRPV nelle stesse cellulepuo’ detreminare la capacità di risposta ad un piu’ ampiospettro di stimoli nocivi

Partendo da OSM-9 sono andati acercare per omologia di sequenzaaltri possibili recettori TRP coinvoltinella Nocicezione in C. ElegansIdentificano e clonanoOCR1OCR2OCR3OCR4OSM/Capsaicin receptor Related

OCR1:GFPAWAL chemotassiOCR2 :GFPAWA chemotassiASH nocicezioneOCR3 :GFPOCR4 :GFPOLQ Tatto

Realizzano KO OCR1 OCR2distruggendo Ankyrin e dominitransmembrana

OCR1 KO non ha difetti in chemocezione o nell’adattamento

OCR2 KO ha difettiIn CHEMOCEZIONEREPULSIONETATTOAVOIDANCE OSMOTICO

Lavori su OSM-9 avevano messo in evidenza il suoRuolo nella modulazione dell’espressione genicaDi recettori Olfattivi in C elgans.

Ocr1Ocr2Hanno anch’essi un ruolo nellaModulazione dei geni olfattivi

OSM-9 KOOCR2 KOHANNO FENOTIPI MOLTO SIMILIPUO’ ESISTERE UNA RELAZIONE TRAQUESTE DU EPROTEINE?

OCR2:GFPOSM9 KO/OCR2:GFPCELL BODYSENSORY CILIACELL BODYIN MANCANZA DI OSM-9 LA LOCALIZZAZIONE DIOCR2 VIENE ALTERATA

OSM9:GFPOSM9:GFP/OCR2 KOPHA PHB SENSORY CILIAPHA PHB SENSORY CILIAANCHE LA MANCANZA DI OCR2 ALTERA LALOCALIZAZIONEDI OSM-9

QUESTI RISULTATI EVIDENZIANO UNASTRETTA RELAZIONE FUNZIONALE TRADIVERSE TRPs,E’QUINDI POSSIBILECHE QUESTE PROTEINE SI ORGANIZZINOA FORMARE MULTIMERI FUNZIONALIE CHE SOLO INQUESTE FORMEPOSSANO RAGGIUNGERELOCALIAZZZAZIONI SUBCELLULARISPECIFICHE

LA SOMIGLIANZA STRUTTURALE DI OSM-9CON TRPV1 HA SUGGERITO POTESSEROAVERE FUNZIONI SIMILIMA FACENDO ESPRIMERE TRPV1 A C ELGANSOCR2/OSM9 KO NON SI HA RESCUE OSMOTICO

L’ESPRESSIONE DI TRPV1 IN OSM-9 KORENDE I C ELEGANS SENSIBILI ALLACAPSAICINA E DETERMINA UNACLASSICA RISPOSTA DI AVOIDANCE

TRPV4VENNE IDENTIFICATO COME NUOVOTRP NEL 2000E INDICATO COME POSSIBILE RECETTORE OSMOTICODEI VERTEBRATI.

ALTERAZIONI NELLA REGOLAZIONEOSMOTICA DEL SANGUE

I NEURONI ASH COSTITUISCONO NEURONISENSORIALI POLIMODALICAPACI DI GENERAREREPULSIONE AD UN’AMPIAGAMMMA DI STIMOLI NOCIVI:TATTILIOSMOTICICHEMOCETTIVI

COME ABBIAMO PRECEDENTEMENTE OSSERVATOOSM-9 RESPONSABILE DELLA PERCEZIONE OSMOTICA

COSA PUO’ SUCCEDERE SE TRPV4 VIENEINTRODOTTO A VICARIARE OSM-9IN NEURONI SENSORIALI ASH?INTRODUCONO IN ASHTRPV4 O TRPV4:GFP

OSM-9 PER FUNZIONARE NECESSITA DELLA PRESENZADI OCR-2….VALE LO STESSSO PER TRPV4?TRPV4 NON RIESCEA DARE RESCUE DI:1 OCR2 KO2 ODR 33 OSM101 2 3 1 2 3

TRPV4 RIPRISTINA LA RISPOSTA ASTRESS OSMOTICO E MECCANICOMA NON A STIMOLO CHEMOCETTIVOTRPV4 E’ UN’ORTOLOGO DI OSM-9L’ESPRESSIONE, LA FUNZIONALITA’,E LA RELAZIONE CON LE ALTRE COMPONENTINECESSARIE AL FUNZIONAMENTO DI OSM-9(ocr-2 odr-3 osm-10)CONFERMANO UN’ALTO LIVELLO DI CONSRVAZIONEFILOGENETICA

TATTO e UDITOSono determinati dalla trasduzione di stimoli meccanici inStimoli elettriciLa ricerca degli elementi molecolari coinvolti in questoTipo di percezioni ha fortemente beneficiatoDell’approccio genetico su vertebrati e invertebrati

Quando recettori meccanosensoriali vengonostimolati iniziano correnti inwardChe portano alla depolarizzazione della cellula

La trasduzione Meccanosensoriale includeun’ampia gamma di sensiPropicezioneTattoEquilibrioUditoBenchè note da diverso tempo le diverse strutture cellularicoinvolte in questo tipo di percezione fino alla fine degliAnni novanta ben poco si sapeva, e ancora si sa, delle diversecomponenti molecolari coinvolte

La DROSOPHILA è un buon modello per lo studio eL’identificazione di molecole coinvolte nella percezione meccanica,Su questi animali è possibile associare studi di mutagenesi aRegistrazioni di tipo elettrofisiologicoDROSOPHILA è dotata diPropicezioneTattoEquilibrioUdito

Al fine di comprendere quali potessero essere componentiMolecolari coinvolte nella percezione meccanica sono statePrese in esame Drosophilae appartenenti a ceppiMutanti con diversi gradi di insensibilità al tattoNompC (No Mechanoreceptor Potential C)

WTLa Drosophila percepisce il tatto attraverso delle SETOLE (Bristle)

Analizzando le risposte eletro-fisiologiche ai diversispostamenti nello spazio e stato deteminato che questo tipodi struttura sensoriale (Bristle) è sensibile a specifici spostamentianche dell’ordine di pochi A°.Sono inoltre capaci di dare risposta elettricain SUBMILLISECONDI (µsec).

L’analisi di diversi ceppi mutanti ha messo in evidenzaQuattro ceppi di particolare interesse: nomp C1,C2,C3,C4Caratterzzati da diversi livelli di risposta elletro-fisiologicaal tatto e comportamento anomalo nel volo

Per analisi genetica il gene nompC èStato “mappato” in posizione 25D7 sulBraccio sinistro del secondo cromosomaIl sequenziamento genico dei geni nompC dei vari mutanti haPermesso di rilevare MUTAZIONI PUNTIFORMI (1 base)MISSENSE o NONSENSE

NompC è una proteina a 6 domini trans MembranaCaratterizzata dalla presenza di 29 ripetizioni Ankyrin (ANK)E alto livello di omologia con le proteine TRP20% d’identità40% similarity

Analisi per Ibridazione in-Situ ha confermato l’espressioneDi NompC a livello delle setole sensoriali

La introduzione di nompC WT nei diversi mutantidetermina il rescue del fenotipo insensibile

Analisi comparative di sequenze hanno permesso diidentificare l’alto livello di omologia di nompC diDrosophila con un gene precedentemente identificatoin C. Elegans Ce-NompC.Al fine di detreminare se il CNompC fosse espresso in distrettiSensoriali di C.Elegans è stato modificato il gene CnompCCreando una proteina di fusione con GFP

NompC in C. Elegans è espresso in cellule ciliate sensoriali

Nonostante la distanza evolutivaIl gene nompC mantiene CaratteristicheconservateSia in struttura che nella Funzione….

Assunti:La maccanocezione in Drosphila e C.Elegans dipendedalla presenza dei TRP NompCApproccio: Genome databank searching

Identificazione di un gene codificante una proteina di 1614 aaCon struttura e domini analoghi a quelli degli invertebrati45% di identità62% di similaritycon C.ELEGANSMilioni di anni

nompC è espresso in un singola copiaNel genoma di moscerino, vermi e pesciNon si è (ancora?) trovato l’ortologo in uomo

In zebrafish nompC è espresso

Knock-out per silenziamento postrascrizionaleAntisenso (morpholin)Zebrafish nompC gtMo : sordipresentano difetti nel nuotoGirano in tondo, difetti diBALANCE

Nompc è il primo meccanorecettore coinvoltoCon la percezione meccano-sonora trovatoNei vertebrati.

NOMPCE’ ALTAMENTE CONSERVATOPER STRUTTURA E FUNZIONEMANTIENE NELLE SPECIELA CARATTERISTICA DELLE29 RIPETIZIONI DI ANKYRIN ALL’N TERMINALEANK HELIX

SI RITIENE CHE ALMENO QUATTRO NOMPCSI UNISCANO A FORMARE IL POROE CHE LE ANK ELIX POSSANOFUNGERE DA “GATING SPRING”OSSIA DA “interruttore”INTRACELLULAREANKYRIN POSSONODETERMINARE INTERAZIONI CON ILCITOSCHELETRO