Map - IZS della Lombardia e dell'Emilia Romagna

Roma, 29 maggio 2008
“La diagnostica di laboratorio in sanità animale”
Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis: : caratteristiche
biologiche e genotipiche
N. Arrigoni, R. Taddei
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna
Centro di Referenza Nazionale della Paratubercolosi - Piacenza

Tassonomia
• “Mycobacterium enteritidis chronicae pseudotuberculosis bovis Johne” Twort e Ingram 1912
• "Mycobacterium enteritidis" Lehmann in Lehmann e Neumann 1927
• "Bacterium paratuberculosis" (Bergey et al. 1923) Miessner & Berge in Kolle e Wasserman 1929
• "Bacillus paratuberculosis" (Bergey et al. 1923) Krasil'nikov 1941
• "Mycobacterium johnei" Francis 1943
• “Mycobacterium paratuberculosis” Bergey et al. 1923 (Approved Lists 1980)
• “Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis”
(Bergey et al. 1923) Thorel et al. 1990
16S rDNA

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map)
• Bacillo di piccole dimensioni (0,5 - 1 µm )
• Aerobio, immobile,
non produce flagelli,
capsule o spore
• Gram positivo,
Alcool-acido
resistente
Acidi micolici
Aggregato o “clump”
• Parete ricca
di lipidi e
polisaccaridi
Arabinogalattani
Peptidoglicani
Membrana
plasmatica

SOPRAVVIVENZA NELL’AMBIENTE
Map può sopravvivere
• 163 gg in acqua di fiume
• 336 gg in acqua stagnante
•1.210 ggnel suolo
• 330 gg nelle feci
• 7 gg nelle urine

SOPRAVVIVENZA NEL LETAME
98 gg a 15°C
28 gg a 30°C

SOPRAVVIVENZA DI Map NELL’AMBIENTE

SOPRAVVIVENZA NELL’AMBIENTE
Resistente a:
alte temperature
comuni disinfettanti
la clorazione dell’acqua non
è in grado di inattivare Map
Sensibile a:
formalina 5%
fenolo 2,5%

CRESCITA E SVILUPPO
• Lenta crescita (4-16 settimane)
• Colonie piccole (1-2 mm)
lisce, lucide, solitamente non
pigmentate
CEPPI OVINI
•Crescita molto lenta (fino a 40 settimane)
•Colonie molto piccole e a volte pigmentate

QUANTE FORME VITALI PUO’ ASSUMERE Map
Vegetativa
Sferoplasto
Dormiente

CRESCITA E SVILUPPO
• Parassita obbligato

ACQUISIZIONE DEL FERRO NEI MICOBATTERI
Fe-esocheline
Fe-mycobactin
Fe
Fe
mycobactin
reduttasi
esocheline
mycobactin
Esterno Parete cellulare Interno

…E E IN Map
• Mycobactin dipendente in vitro
Fe
Fe + Mycobactin
Citoplasma
Assunzione del ferro “in vitro” da parte di Map
• La Mycobactin dipendenza non è patognomonica per Map
• Meccanismo di assunzione di ferro in vivo sconosciuto

IL GENOMA DI Map
• 4,83 mbp di cui 4,54 mostrano il 96-100% di omologia con Maa
• 6% (289 kb) del genoma esclusivo di Map
• G+C 69.3%
• ∼ 4.350 geni codificanti proteine
• Non ci sono plasmidi
• 1.5% del genoma è composto da DNA ripetuto
Li, Lingling et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 12344-12349

SEQUENZE DI INSERZIONE
• Le sequenze di inserzione (IS) sono piccoli segmenti di DNA
(

UTILIZZO DIAGNOSTICO DELLE
SEQUENZE DI INSERZIONE
Sequenza
d’inserzione
organismo n°
copie/genoma
utilizzo
tecnica
IS900
Map,
ma non solo!
17-20 Diagnosi Map PCR
ISMav2 Map
almeno 3 Diagnosi Map PCR
IS_Map02 Map
6 Diagnosi Map PCR
IS1311 Map, Maa, 7-10 Distinzione
M.intracellula
ceppi
re
ovini/bovini
PCR-REA

TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI Map: : IS900
RFLP
•Digestione enzimatica
•Separazione elettroforetica
dei frammenti di restrizione
Sonda marcata
1 1 2 3
•Analisi dei fingerprint
•Ibridazione con sonda
•Southern blotting

COME POSSONO ESSERE SPIEGATI I DIVERSI PROFILI DI
RESTRIZIONE OSSERVATI
b
a
b
a
b
c
a
a b c
b
a
a b d
d
sito di restrizione Sequenza d’inserzione (IS) Sonda

IS900
RFLP: RISULTATI
Ospite
I
S
Ovini, Caprini, Ruminanti selvatici
Ovini, Caprini, Ruminanti selvatici
C
Bovini, Ovini, Caprini, Ruminanti
selvatici, Uomo

TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI Map:
PFGE (Gel Elettroforesi in Campo Pulsato)
Digestione con enzima di restrizione
“rare cutter”
Corsa in campo pulsato che
permette la risoluzione
di frammenti >20Kb

PCR 1311 - REA
HinfI = cambio di base in posizione 223
presente in alcune copie di IS1311 di Map Bovino
distingue tra ceppi B/S di Map
MseI = cambio di base in posizione 442
presente in IS1311 di Maa
distingue tra Map e Maa

PCR 1311 - REA
HinfI+MseI
HinfI
Lane 1: Marker
Lane 2: M.avium
Lane 3: Map Bovino
Lane 4: Map Ovino
Lane 1: Marker
Lane 2: Map Bovino
Lane 3: Map Ovino
1 2 3 4 1 2 3

Tipizzazione di Map attraverso PFGE:
Risultati
Tipo I
Tipo II
Tipo III
IS900-RFLP
S C I
Crescita Molto lenta lenta Molto lenta
Pigmentazione presente assente assente
Preferenza d’ospited
pecore assente capre
Distribuzione geografica limitata globale Spagna
IS1311-PCR REA Ovino Bovino Ovino
Maa Tipo I Tipo III Tipo II

Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis strains
from cattle and sheep can be distinguished by a PCR
test based on a novel DNA sequence difference
Desmond M. Collins et All., J.Clin.Microb.(2002): 40, 12, 4760-4762
Prodotti PCR da ceppi bovini
e ovini di Map amplificati
con DMC529, DMC531,
DMC533
Lane 1 e 11: Marcatori di PM
Lane 2-3-4-5: Ceppi bovini
Lane 6-7-8-9: Ceppi ovini
Lane 10: Controllo negativo
Vantaggi:
Processo 1 step invece che 3 steps
Svantaggi:
Minore sensibilità
(1 copia invece che 17-20)

PFGE: SVANTAGGI
• Applicabile solo a ceppi coltivabili
• Lento
• Indaginoso
• Analisi dei pattern complessa
• Basso potere discriminatorio

New variable-number tandem-repeat markers for typing
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and
M.avium strains: comparison with IS900 and IS1245
restriction fragment length polymorphism typing
Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410
Analisi della sequenza genomica del ceppo
Map K10 per la presenza di sequenze TR
minisatelliti (10-100 bp)
Identificazione di 8 loci TR e MIRU che
dimostrano polimorfismi dimensionali dopo PCR

New variable-number tandem-repeat markers for typing
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and
M.avium strains: comparison with IS900 and IS1245
restriction fragment length polymorphism typing
Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410

Potere discriminatorio di
IS900 RFLP e MIRU-VNTR
Typing Method
Discriminatory
Index
RFLP 0,483
MIRU-VNTR 0,751
RFLP + MIRU-
VNTR
0,855
Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410