利用门多萨假单胞菌NK-01 合成中长链聚羟基脂肪酸酯(PHAMCL)

微 生 物 学 通 报 MAY 20, 2008, 35(5): 782~787Microbiology© 2008 by Institute of Microbiology, CAStongbao@im.ac.cn研 究 报 告利 用 门 多 萨 假 单 胞 菌 NK-01 合 成 中 长链 聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 (PHA MCL )陶剑1,2郑 承 纲1张斌斌1郭 文文 斌斌1王 淑 芳2宋 存 江1, 2*(1. 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院 分 子 微 生 物 学 与 技 术 教 育 部 重 点 实 验 室 天 津 300071)(2. 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院 生 物 活 性 材 料料 教 育 部 重 点 实 验 室 天 津 300071)摘要 : 从 土 壤 中 分 离 到 1 株 能 够 合 成 中 长 链 聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 (PHA MCL ) 的 细 菌 , 经 分 类 鉴 定 命 名为 Pseudomonas mendocina NK-01。 对 于 该 菌 株 在 氮 源 限 制 的 情 况 下 , 利 用 葡 萄 糖 合 成 的 PHA MCL进 行 了 结 构 分 析 。 同 时时 , 获 得 了 该 菌 株 PHA 合 成 酶 基 因 phaC1, 利 用 大 肠 杆 菌 表 达 载 体 pBluescriptSK — 构 建 了 重 组 载 体 pBSphaC1, 并 在 E.coli JM109 中 成 功 表 达 。 以 所 构 建 的 工 程 菌 株 进 行 了 发 酵合 成 。关 键 词 : 中 长 链 聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 , 门 多 萨 假 单 胞 菌 , PHA 合 成 酶Synthesis of Medium-chain-length Polyhydroxyalkanoate(PHA MCL ) by Pseudomonas mendocina NK-01TAO Jian 1,2 ZHENG Cheng-Gang 1 ZHANG Bin 1 GUO Wen-Bin 1 WANG Shu-Fang 2SONG Cun-Jiang 1,2*(1. The Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071)(2. The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071)Abstract: A strain which can synthesize medium-chain-length polyhydroxyalkanoate (PHA MCL ) was isolatedfrom soil. It was named as Pseudomonas mendocina NK-01 through classification and identification. ThePHA MCL was synthesized by P. mendocina NK-01 from glucose in the condition of limited nitrogen source.The structure of it was characterized. In order to construct a recombined plasmid pBSphaC1, an expressingplasmid of E.coli, after phaC1 gene encoding PHA synthase was cloned from Pseudomonas mendocinaNK-01 by PCR amplification, it was linked into pBluescript SK — . PhaC1 gene was expressed successfully inE.coli JM109. Fermentation synthesis was also investigated by recombined E.coli.Keywords: Medium-chain-length polyhydroxyalkanoate (PHA MCL ), Pseudomonas mendocina, PHA synthase基 金 项 目 : 国 家 “863 计 划 ” 目 标 探 索 类 课 题 (No. 2007AA06Z323); 天 津 市 科 技 攻 关 项 目 (No. 06YFGZSH06800)* 通 讯 作 者 :Tel: 022-23503866; : songcj@nankai.edu.cn收 稿 日 期 :2007-12-24; 接 受 日 期 : 2008-02-20

陶 剑 等 : 利 用 门 多 萨 假 单 胞 菌 NK-01 合 成 中 长 链 聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 (PHA MCL ) 783聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 (polyhydroxyalkanoate, PHA)是是 微 生 物 在 失 去 营 养 平 衡 的 条 件 下 , 即 碳 源 丰 富 、氮 或 磷 缺 失 时时 , 在 体 内 积 累 的 细 胞 碳 源 或 能 源 贮 存颗 粒 , 环 境 营 养 条 件 恢 复 时时 这 些 颗 粒 可 被 微 生 物 分解 利 用 。 这 些 高 分 子 聚 合 物 颗 粒 就 是是 PHA。 据 报 道已 有 300 余 种 微 生 物 能 够 合 成 和 积 累 PHA [1] 。 由 于这 类 物 质 具 有 生 物 降 解 性 、 生 物 相 容 性 、 压 电 性 等特 征 , 已 成 为 生 物 材 料料 的 研 究 热 点 。PHA 含 有 不 同 长 度 碳 链 的 单 体 侧 链 基 团 , 根 据单 体 碳 原 子 数 的 不 同 , PHA 被 划 分 为 两 个 大 类 , 即 :由 3~5 个 碳 原 子 的 单 体 组 成 短 链 PHA (Short-chain-length Polyhydroxyalkanoate, PHA SCL ) 和 由 6~18 个 碳原 子 的 单 体 组 成 中 长 链 PHA (Medium-chain-lengthPolyhydroxyalkanoate, PHA MCL ) [2] 。PHA MCL 往 往 以 多 种 单 体 组 成 , 使 得 该 类 聚 合物 拥 有 了 独 特 的 高 分 子 性 能 。 基 于 PHA MCL 的 生 物降 解 性 、 疏 水 性 和 不 透 氧 的 特 性 , PHA MCL 可 以 用 于各 种 生 物 降 解 包 装 材 料料 。PHA MCL 在 一 次 性 清 洁 用 品方方 面 的 应 用 在 经 济 上 也 是是 可 行 的 。 在 海 洋 环 境 ( 可 降解 渔 网 等 材 料料 )、 建 材 ( 胶 黏 剂 、 泡 沫 塑 料料 和 橡 皮 ) 和农 业 中 , 都 有 新 型 生 物 可 降 解 材 料料 的 很 大 的 市 场 潜力 。PHA MCL 在 生 物 医 药 方方 面 的 应 用 潜 力 更 具 前 景景 。例 如 用 作 医 用 缝 合 线 、 药 物 释 放 载 体 等 [2] 。 在 组 织工 程 中 , 需 要 将 细 胞 接 种 于 骨 架 材 料料 上 , 骨 架 材 料料不 仅 需 要 良 好 的 生 物 相 容 性 和 生 物 降 解 性 , 而 且 还要 诱 导 细 胞 的 吸 附 及 随 后 的 组 织 生 长[3] , 因 此 ,PHA MCL 在 组 织 工 程 领 域 应 用 的 潜 力 也 相 当 巨 大 。PHA 合 酶 是是 PHA 合 成 体 系 中 影 响 PHA 合 成的 关 键 酶 [4] , 它 对 于 PHA 单 体 类 型 和 组 成 起 着 决定 性 作 用 [2] 。PHA 合 成 途 径 和 相 关 酶 类 已 经 被 进行 了 深 入 的 研 究 , 目 前 认 为 细 菌 PHA 合 酶 分 为3 类 , 即 : 第 1 类 以 R. eutropha 为 代 表 的 PHA SCL合 成 酶 phaC; 第 2 类 以 P. oleovorans 和 P. aeruginosa为 代 表 的 PHA MCL 的 合 成 酶 phaC1 和phaC2 [5−11] ; 第 3 类 以 Chromatium vinosum 和Thio-capsia violacae 为 代 表 的 PHA 合 成 酶 phaC 和phaE [3] 。实 验 规 模 PHA 的 微 生 物 合 成 方方 法 包 括 两 类 ,即 : 一 步 法 是是 在 限 制 氮 源 培 养 基 中 进 行 发 酵 ; 两 步法 是是 先 大 量 繁 殖 菌 体 , 再 通 过 无无 菌 离 心 , 接 种 至 无无氮 源 的 培 养 基 中 进 行 发 酵 [12] 。本 研 究 利 用 所 分 离 的 P. mendocina NK-01 进 行了 PHA MCL 的 发 酵 合 成 研 究 , 确 立 了 产 物 PHA MCL 的结 构 组 成 , 并 对 其 性 质 进 行 了 研 究 。 通 过 PCR 扩 增得 到 了 phaC1 基 因 , 以 pBluescript SK — 构 建 表 达 质粒 , 在 大 肠 杆 菌 中 成 功 表 达 。 以 丙 烯 酸 作 为 基 因 工[13]程 菌 脂 肪 酸 β 氧 化 抑 制 剂 进 行 了 PHA MCL 发 酵 。1 材 料料 与 方方 法1.1 菌 种 分 离 鉴 定 和和 质 粒实 验 菌 株 系 本 室 采 用 尼 尔 红 (Nile Red) 荧 光 染色 法 分 离 自 天 津 市 西 青 区 付 村 农 田 土 壤 。 取 0 cm~10 cm 的 土 壤 , 以 无无 菌 生 理 盐 水 稀 释 为 10 1 ~10 8 , 以不 同 稀 释 度 的 土 壤 悬 浊 液 0.5 mL 涂 布 于 PHA 合 成菌 分 离 培 养 基 , 于 30℃ 培 养 4 d~5 d, 菌 落 出 现 后 ,以 ZF-2 型 三 用 紫 外 分 析 仪 312 nm 波 长 照 射 , 呈 现橘 红 色 荧 光 菌 落 者 即 为 PHA 合 成 菌 [14] 。16S rRNA基 因 序 列 分 析 的 方方 法 是是 : 首 先 提 取 细 菌 总 DNA, 然后 利 用 16S rRNA 基 因 的 特 异 扩 增 引 物 27F 和 1492R进 行 PCR 扩 增 。大 肠 杆 菌 JM109 购 自 于 商 业 公 司 ; 质 粒pBluescript SK — 由 江 南 大 学 王 正 祥 教 授 提 供 。1.2 工 具 酶 和和 生 化 试 剂限 制 性 内 切 酶 , Taq 酶 , T4 DNA 连 接 酶 均 购 自大 连 宝 生 物 公 司 。 其 它 化 学 试 剂 为 国 产 分 析 纯 化 学试 剂 。1.3 培 养 基PHA 合 成 菌 分 离 培 养 基 : 蒸 馏 水 1000 mL, 牛肉 膏 10 g, 蛋 白 胨 10 g, NaCl 5 g, 葡 萄 糖 20 g, 琼 脂粉 15 g, pH 7.0, 0.1 MPa 灭 菌 15 min。 冷 却 至 45℃~50℃, 加 入 尼 尔 红 (Nile Red) 2 mL/L (0.25 mg Nilehttp://journals.im.ac.cn/wswxtbcn

784 微 生 物 学 通 报 2008, Vol.35, No.5Red 溶 于 100 mL 二 甲 基 亚 砜 ), 无无 菌 条 件 下 倒 入 培养 皿 , 冷 却 后 备 用 [15] 。富 营 养 培 养 基 : 蒸 馏 水 1000 mL, 酵 母 粉 10 g,蛋 白 胨 10 g, 牛 肉 浸 粉 5 g, (NH 4 ) 2 SO 4 5 g, pH 7.0。P. mendocina NK-01 一 步 法 发 酵 培 养 基 (g/L):蒸 馏 水 1000 mL, Na 2 HPO 4 3.8 g, KH 2 PO 4 2.65 g,MgSO 4 0.2 g, 葡 萄 糖 10 g, NH 4 Cl 0.36g, 微 量 元 素液 1 mL, pH7.0。 微 量 元 素 液 (0.1 mol/L HCl 1000 mL,CoCl 2·6H 2 O 0.218 g, CaCl 2 7.8 g, CrCl 3·6H 2 O 0.105 g,NiCl 2 0.118 g, CuSO 4·5H 2 O 0.156 g, FeCl 3 9.7 g)。P. mendocina NK-01 培 养 和 发 酵 温 度 为 30℃。P. mendocina NK-01 两 步 法 发 酵 培 养 基 : 无无 氮源 的 一 步 法 发 酵 培 养 基 。磷 酸 盐 缓 冲 液 的 配 制 : 蒸 馏 水 1 0 0 0 m L ,Na 2 HPO 4·12H 2 O 8.95 g, KH 2 PO 4 1.5 g, pH 7.0;0.1 MPa 高 压 蒸 汽 灭 菌 , 15 min~20 min, 备 用 。基 因 工 程 菌 富 集 培 养 为 LB 培 养 基 , 发 酵 培 养基 为 添 加 0.25% 辛 酸 的 LB 培 养 基 , 以 丙 烯 酸 作 为 基因 工 程 菌 脂 肪 酸 β 氧 化 抑 制 剂 , 必 要 时时 加 入 50 µg/L的 氨 苄 青 霉 素 ; 培 养 温 度 为 37℃。1.4 P. mendocina NK-01 发 酵 及 PHA 的 提 取1.4.1 一 步 法 发 酵 : 前 培 养 是是 在 L- 试 管 中 , 以 无无 菌操 作 加 入 5 mL 富 营 养 培 养 基 , 以 无无 菌 牙 签 接 入NK-01 菌 株 的 单 菌 落 , 30℃、120 r/min 培 养 12 h。将 前 培 养 物 0.5 mL 接 种 至 含 有 100 mL 富 营 养 培 养基 的 500 mL 三 角 瓶 中 , 30℃、150 r/min 振 荡 培 养24 h。4℃, 6000×g 无无 菌 离 心 10 min, 弃 上 清 , 在 离心 管 中 以 无无 菌 磷 酸 盐 缓 冲 液 振 荡 混 匀 , 然 后 在 4℃,6000×g 无无 菌 离 心 12 min, 弃 上 清 。 将 不 含 富 营 养 培养 基 的 菌 体 无无 菌 接 入 可 控 氧 搅 拌 式 1 L 发 酵 装 置 ,装 置 内 含 有 1L C/N 为 5~40、50、60、70、80、90的 一 步 法 PHA 发 酵 培 养 基 , 加 入 微 量 元 素 溶 液 1 mL,30℃ 通 气 培 养 72 h。1.4.2 两 步 法 发 酵 : 前 培 养 同 1.4.1, 将 前 培 养 物0.5 mL 接 种 至 含 有 100 mL 富 营 养 培 养 基 的 500 mL三 角 瓶 中 , 30℃、150 r/min 振 荡 培 养 24 h。4℃,6000×g 离 心 10 min, 弃 上 清 , 在 离 心 管 中 以 无无 菌 磷酸 盐 缓 冲 液 振 荡 混 匀 , 再 次 在 4℃, 6000×g 离 心12 min, 弃 上 清 。 分 别 将 不 含 富 营 养 培 养 基 的 菌 体 无无菌 接 入 10 瓶 含 有 100 mL 两 步 法 发 酵 培 养 基 的500 mL 三 角 瓶 中 , 分 别 加 入 微 量 元 素 溶 液 0.1 mL,30℃、150 r/min 振 荡 培 养 36 h。1.4.3 PHA 的 提 取 : 发 酵 结 束 后 , 收 集 菌 体 , 以 无无菌 水 洗 涤 , 冷 冻 干 燥 , 称 重 。 以 索 式 抽 提 器 进 行 PHA提 取 , 以 氯 仿 作 为 提 取 液 , 在 80℃ 水 浴 锅 中 回 流12 h。 以 旋旋 转 蒸 发 仪 浓 缩 回 流 液 , 用 冷 甲 醇 沉 淀 过 夜 ,白 色 沉 淀 即 为 PHA, 干 燥 后 称 重 , 计 算 PHA 占 菌 体干 重 的 百 分 含 量 。 选 择 PHA 百 分 含 量 最 大 的 C/N 来配 置 PHA 合 成 培 养 基 。1.5 P. mendocina NK-01 PHA 合 成 酶 基 因 phaC1的 获 得 与 重 组 质 粒 的 构 建通 过 对 中 长 链 PHA 合 成 酶 phaC1 进 行 序 列 分 析 ,设 计 了 保 守 引 物 [16] : primer-o1f: 5′-CCACGACAGCGGCCTGTTCACCTG-3′, primer-prz: 5′-GTCGTCGTCACCGGCCAGCACCAG-3′, 以 门 多 萨 假 单 胞 菌基 因 组 DNA 为 模 板 扩 增 得 到 一 个 大 的 片 段 , 从 中 分析 得 到 PHA 合 成 酶 基 因 1680 bp 大 小 的 开 放 阅 读 框 ,根 据 获 得 的 序 列 设 计 PHA 合 成 酶 基 因 phaC1 的 扩 增引 物 , 在 上 下 游 分 别 引 入 了 XbaⅠ 和 EcoRⅠ 位 点 :primer-f: 5′-GGGGCTCTAGA AAGCGACTCAGGACATTGGA-3′, primer-r: 5′-CCCCGGAATTCTTCTGCGGTTGAGGTGGATG-3′。 对 pBluescript SK − 和 PCR扩 增 产 物 进 行 XbaⅠ 和 EcoRⅠ 双 酶 切 处 理 , 回 收 后在 T4 DNA 连 接 酶 作 用 下 16℃ 连 接 过 夜 , 以 备 转 化 。1.6 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 的 制 备 与 转 化根 据 《 分 子 克 隆 实 验 指 南 》 钙 法 制 备 大 肠 杆 菌感 受 态 细 胞 并 进 行 转 化 [17] , 转 化 后 接 于 1 mL LB 培养 基 中 37℃、150 r/min 振 荡 培 养 1 h, 均 匀 涂 布 于含 有 氨 苄 青 霉 素 的 LB 平 板 上 筛 选 重 组 大 肠 杆 菌 。筛 选 得 到 的 菌 株 利 用 菌 落 PCR 和 限 制 性 内 切 酶 酶 切重 组 质 粒 验 证 重 组 子 。http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn

陶 剑 等 : 利 用 门 多 萨 假 单 胞 菌 NK-01 合 成 中 长 链 聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 (PHA MCL ) 7851.7 重 组 大 肠 杆 菌 发 酵 生 产 PHA−70℃ 保 藏 的 重 组 大 肠 杆 菌 在 LB 培 养 基 平 板 上活 化 , 以 灭 菌 牙 签 挑 取 单 菌 落 接 于 20 mL LB 培 养 基中 , 37℃ 培 养 过 夜 , 以 2% 的 接 种 量 接 种 于 发 酵 培 养基 中 , 加 入 1 mmol/L 的 IPTG 诱 导 phaC1 的 表 达 , 以0.2 g/L 丙 烯 酸 抑 制 脂 肪 酸 β 氧 化 , 为 PHA 合 成 提 供(R)-3- 羟 基 脂 肪 酸 辅 酶 A 前 体 , 发 酵 培 养 72 h。 由 于该 发 酵 方方 式 中 过 高 的 脂 肪 酸 浓 度 一 定 程 度 上 影 响 大肠 杆 菌 的 生 长 , 所 以 采 取 补 料料 分 批 发 酵 的 方方 式 逐 次加 入 辛 酸 底 物 , 以 期 获 得 更 高 的 菌 体 量 和 PHA 产 量 。1.8 PHA 的 结 构 分 析核 磁 共 振 分 析 :PHA 溶 解 在 重 氯 仿 中 。 用 JEOLEclipse+400 分 光 计 在 400 MHz 测 定1 H 谱 和13 C 谱 ,同 时时 测 定13 C DEPT 谱 , 化 学 位 移 以 ppm 记 录 。红 外 光 谱 测 定 : 将 PHA 置 入 圆 片 模 具 中 , 加 入少 量 KBr, 加 压 成 型 , 得 到 KBr 法 检 测 圆 片 。 使 用FT-IR-8300 Shimadzu 在 400 cm −1 ~4500cm −1 记 录 红外 光 谱 , 进 行 分 析 。气 - 质 联 用 测 定 : 用 酸 水 解 法 将 PHA 水 解 为 单体 。 将 5 mg PHA 与 2 mL 氯 仿 混 合 溶 解 后 加 入1.7 mL 甲 醇 和 0.3 mL 浓 硫 酸 放 入 密 闭 容 器 中 在100℃, 140 min 使 PHA 水 解 为 单 体 , 取 有 机 相 用 气相 色 谱 法 检 测 单 体 成 分 。 利 用 质 谱 MASPEC IIsystem 对 单 体 进 行 扫 描 分 析 , 在 数 据 库 中 进 行 比 对 ,以 最 终 确 定 各 个 单 体 组 分 。2 结 果 与 讨 论2.1 菌 种 的 分 离 及 鉴 定从 Nile Red 荧 光 染 色 培 养 平 板 中 挑 取 了 1 株312 nm 紫 外 下 呈 现 桔 红 色 荧 光 的 菌 落 进 行 分 类 鉴定 。 以 该 菌 株 的 总 DNA 为 模 板 , 利 用 16S rRNA 序列 的 特 异 扩 增 引 物 进 行 PCR, 将 获 得 的 PCR 产 物 送商 业 公 司 进 行 测 序 。 序 列 在 GenBank 进 行 注 册 , 获得 了 序 列 号 :DQ641475。 利 用 DNAstar 软 件 进 行 数据 分 析 建 立 了 基 于 16S rRNA 基 因 的 系 统 进 化 树 。进 而 , 以 Biolog 微 生 物 分 类 鉴 定 系 统 进 行 了 鉴 定 ,该 菌 株 与 Pseudomonas mendocina 的 SIM 值 为 0.67,而 与 其 它 菌 的 S I M 值 很 小 , 所 以 鉴 定 此 菌 为Pseudomonas mendocina, 命 名 其 为 :Pseudomonasmendocina NK-01。 所 构 建 的 16S rRNA 进 化 树 见图 1。图 1 16S rRNA 基 因 进 化 树Fig. 1 Phylogenetic tree of 16S rRNA2.2 利 用 Pseudomonas mendocina NK-01 进 行PHA MCL 的 发 酵图 2 是是 发 酵 结 束 后 门 多 萨 假 单 胞 菌 NK-01 菌 体切 片 透 射 电 镜 照 片 。 其 中 白 色 颗 粒 就 是是 PHA, 图 中标 尺 为 500 nm。 在 不 同 碳 氮 比 的 一 步 法 发 酵 实 验 中 ,发 现 C/N=50 的 条 件 下 菌 体 生 长 情 况 和 PHA 产 量 最好 ( 见 表 1)。 我 们 进 而 对 Pseudomonas mendocinaNK-01 菌 株 在 以 葡 萄 糖 为 底 物 合 成 PHA 过 程 中 的 菌体 干 重 , PHA 含 量 和 底 物 消 耗 等 情 况 进 行 了 研 究 。结 果 如 图 3 所 示 。http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn

786 微 生 物 学 通 报 2008, Vol.35, No.5图 2Fig. 2P. mendocina NK-01 菌 体 内 的 PHA MCL 颗 粒The PHA MCL granules in P. mendocina NK-01图 3 发 酵 过 程 中 PHA 合 成 与 底 物 的 变 化 情 况Fig. 3 Changes of PHA content, glucose, bacteria-dry-weightand pH during fermentation表 1 碳 氮 比 对 Pseudomonas mendocina NK-01 菌 体 生 长 和和 PHA 合 成 的 影 响响Table 1 Effect of C/N ratio on the growth and PHA synthesis of Pseudomonas mendocina NK-01C/N(mol/mol) Glucose (g/L) NH 4Cl (g/L) CDW (g/L) PHA dry weight (g/L) PHA content (%, W/W)5∼40 10 3.56∼0.45 1.894∼2.10 0.003∼0.09 0.16∼6.650 10 0.36 1.005 0.540 54.060 10 0.30 0.938 0.424 45.270 10 0.25 0.974 0.409 41.980 10 0.22 0.681 0.081 11.8990 10 0.20 0.811 0.336 41.2C/N: C/N ratio; CDW: Cell dry weight; PHA content: PHA dry weight in CDW2.3 PHA 合 成 酶 基 因 的 克 隆 及 重 组 载 体 的 构 建通 过 设 计 的 保 守 引 物 以 降 落 PCR 扩 增 得 到2.86 kb 大 小 左 右 的 片 段 , 通 过 对 其 序 列 分 析 得 到 一个 1680 bp 大 小 的 开 放 阅 读 框 , 将 该 阅 读 框 在GenBank 上 进 行 比 对 确 定 其 为 Ⅱ 型 PHA 合 成 酶 基因 , 并 登 录 注 册 基 因 序 列 号 DQ316602。 通 过 设 计 扩增 引 物 , PCR 扩 增 获 得 PHA 合 成 酶 基 因 phaC1,酶 切 后 与 pBluescript SK − 连 接 构 建 重 组 质 粒pBSphaC1。 通 过 钙 法 制 备 了 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 并进 行 转 化 。 以 酶 切 的 方方 法 对 筛 选 所 得 到 的 重 组 子 进行 了 鉴 定 。 分 别 以 EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ 与 EcoRⅠ 双 酶切 对 重 组 质 粒 进 行 酶 切 验 证 。 同 时时 , 利 用 菌 落 PCR对 筛 选 所 得 到 的 重 组 子 进 行 了 确 定 ( 图 4)。 明明 显显 的 获得 了 phaC1 基 因 的 条 带 (phaC1 基 因 的 大 小 为 1680bp)。图 4 重 组 大 肠 杆 菌 菌 落 PCR 验 证 电 泳 图Fig. 4 The electrophoresis result for colony-PCR of recombinantE.coliM: Marker; 1: PCR products2.4 门 多 萨 假 单 胞 菌 与 重 组 大 肠 杆 菌 发 酵 生 产PHA 的 检 测 与 分 析2.4.1 核 磁 共 振 分 析 :Pseudomonas mendocinaNK-01 菌 株 合 成 的 PHA 的1 H-NMR 图 谱 显显 示 次 甲 基的 氢 离 子 信 号 位 于 5.20 ppm。 亚 甲 基 C-2 的 氢 离 子的 信 号 位 于 2.58 ppm 和 2.51 ppm。 末 端 甲 基 信 号 位于 0.89 ppm。 亚 甲 基 C-4 的 氢 离 子 的 信 号 位 于1.59 ppm。 饱 和 侧 链 上 的 亚 甲 基 的 氢 离 子 信 号 位 于1.28 ppm。 在 5.52 ppm 处 有 1 个 弱 的 信 号 显显 示 此 为http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn

陶 剑 等 : 利 用 门 多 萨 假 单 胞 菌 NK-01 合 成 中 长 链 聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 (PHA MCL ) 7871 个 含 有 -CH=CH- 序 列 的 含 量 很 小 的 侧 链 。2.4.2 傅 立 叶 红 外 光 谱 分 析 :Pseudomonas mendocinaNK-01 合 成 的 PHA 的 FT-IR 图 谱 显显 示 了 非 常 典型 的 聚 酯 结 构 。 在 1740 cm −1 处 有 一 强 吸 收 带 , 是是 羰基 (C=O) 的 特 征 性 吸 收 带 。 在 2925、2856 cm −1 处 的强 吸 收 带 是是 C-H 的 特 征 性 吸 收 带 。 在 1000 cm −1 −1500 cm −1 范 围 内 有 一 中 等 强 度 的 信 号 带 , 是是 由 于CH 2 、CH 3 、-C-O- 和 -C-C- 的 存 在 。 在 1280 cm −1 −1050 cm −1 之 间 的 信 号 带 是是 对 称 和 不 对 称 的 C-O-C引 起 的 。 在 723 cm −1 处 的 信 号 与 CH 2 在 侧 链 上 的 延伸 分 布 有 关 。2.4.3 气 - 质 谱 联 用 结 果 与 分 析 :Pseudomonas men-docina NK-01 两 步 法 发 酵 所 合 成 PHA 的 单 体 组 成 情况 , 与 数 据 库 比 对 分 析 其 中 含 有 C6、C8、C10 和 C18单 体 , 另 外 还 有 不 饱 和 单 体 , 通 过 进 一 步 分 析 证 明明其 为 C16△7单 体 , 推 测 其 单 体 如 图 5 所 示 ( 此 结 构为 单 体 碳 数 由 小 至 大 的 排 列 , 单 体 间 的 详 细 结 合 情况 有 待 进 一 步 研 究 )。 同 时时 , 利 用 气 - 质 联 用 对 重 组 大肠 杆 菌 所 产 PHA MC L 单 体 也 进 行 了 分 析 , 发 现 其PHA 单 体 以 C8 为 主 而 不 存 在 不 饱 和 单 体 , 推 测 其结 构 如 图 6 所 示 。 由 于 门 多 萨 假 单 胞 菌 以 葡 萄 糖 为碳 源 来 合 成 PHA 时时 , 是是 通 过 脂 肪 酸 从 头 合 成 途 径 来提 供 PHA 合 成 的 前 体 , 所 合 成 的 PHA 中 含 有 C6,C8、C10、C16 和 C18 单 体 说 明明 了 该 菌 的 PHA 合 成酶 对 这 些 单 体 的 偏 好 性 , 其 中 对 C8 和 C10 两 种 单 体的 偏 好 性 最 高 。 重 组 大 肠 杆 菌 以 辛 酸 为 底 物 合 成PHA 时时 , 是是 通 过 脂 肪 酸 β 氧 化 通 路 为 PHA 的 合 成 提供 前 体 , 而 门 多 萨 假 单 胞 菌 是是 一 株 中 长 链 PHA 合 成菌 , 其 PHA 合 酶 只 能 利 用 C6 以 上 的 前 体 来 合 成PHA, 因 此 , 由 工 程 菌 合 成 的 PHA 中 就 只 有 C6 和CH 3CH 2CH7CH 3CH 22O CH CH 2OCmCH 3CH 24O CH CH 2OCnCH 3CH 26O CH CH 2OCCHCH 3CH 2 3 O CH 2 14 OoO CH CH 2 C p O CH CH 2 CqFig.5图 5 门 多 萨 假 单 胞 菌 NK-01 两 步 法 合 成 的 PHA MCL 的 结 构 示 意 图The structure of PHA MCL synthesized by two-step fermentation of Pseudomonas mendocina NK-01CH 3CH 22O CH CH 2OCmCH 3CH 24O CH CH 2图 6 含 质 粒 pBsphaC1 的 重 组 大 肠 杆 菌 合 成 的 PHA MCL的 结 构Fig. 6 The structure of PHA MCL synthesized by recombinedE.coli harboring pBsphaC1C8 单 体 。 对 于 野 生 菌 合 成 的 PHA 中 含 有 不 饱 和 单体 , 分 析 主 要 是是 由 于 Pseudomonas mendocina NK-01以 葡 萄 糖 作 为 底 物 , 以 Ⅲ 途 径 为 PHA 合 成 提 供 前 体 ,由 于 发 酵 条 件 可 能 形 成 了 不 饱 和 单 体 , 而 重 组 大 肠杆 菌 的 PHA 底 物 来 自 于 Ⅱ 途 径 , 以 人 工 添 加 的 辛 酸作 为 初 始 底 物 , 故 不 会 产 生 不 饱 和 单 体 。OCn3 结 论本 研 究 分 离 得 到 的 Pseudomonas mendocinaN K - 0 1 能 够 产 生 在 常 温 下 具 有 良 好 粘 弹 性 的PHA MCL , 通 过 结 构 分 析 表 明明 : 该 PHA MCL 由 3- 羟 基己 酸 、3- 羟 基 辛 酸 、3- 羟 基 癸 酸 、△ 7 -3- 羟 基 十 六 烷酸 、 3 - 羟 基 十 八 烷 酸 5 种 单 体 构 成 。 所 合 成 的PHA MCL 占 菌 体 干 重 的 50% 以 上 。 本 研 究 构 建 的 重组 大 肠 杆 菌 , 通 过 发 酵 合 成 了 PHA MCL , 其 结 构 由 3-羟 基 己 酸 和 3- 羟 基 辛 酸 两 种 单 体 构 成 , 但 是是 产 量 还较 低 , 笔 者 正 试 图 利 用 基 因 重 组 的 方方 法 构 建 组 成 型表 达 的 重 组 大 肠 杆 菌 , 以 期 获 得 高 产 稳 定 的 PHA 合成 工 程 菌 株 。http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn

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