時計遺伝子によるPPARのプロモーターへのコアクチ ... - 埼玉医科大学

埼 玉 医 科 大 学 雑 誌 第 34 巻 第 1 号 平 成 19 年 10 月27報 告 書平 成 16 年 度 丸 木 記 念 特 別 奨 学 研 究 費 A 研 究 実 績 報 告 書時 計 遺 伝 子 によるPPARのプロモーターへのコアクチベーター CBP/p300およびSRC-1を 介 する 作 用 究 明受 賞 者 井 上 郁 夫 ( 埼 玉 医 科 大 学 内 科 学 内 分 泌 ・ 糖 尿 病 内 科 部 門 )共 同 研 究 者中 村 浩 一1) 2), 池 田 正 明はじめにペ ル オ キ シ ゾ ー ム 増 殖 因 子 活 性 化 受 容 体 ,peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)はステロイド/ 甲 状 腺 ホルモン 受 容 体 スーパーファミリーのひとつで,ペルオキシゾームが 増 殖 する 際 の 主 要な 転 写 因 子 として 作 用 し,さまざまな 遺 伝 子 を 調 節する. 加 えて,PPARは, 最 近 注 目 されているメタボリックシンドロームとの 関 連 性 に 興 味 がもたれている核 内 受 容 体 でもある. 特 に, 齧 歯 動 物 ,ヒト, 両 生 類において,3 種 類 のPPAR,PPARα,PPARβまたはPPARδ,PPARγが 確 認 されている.PPARαは, 肝臓 内 で 最 も 大 量 に 発 現 され,ミトコンドリアとペルオキシソームのβ 酸 化 と 関 係 している.PPARβ/δは広 く 発 現 されるが,その 機 能 的 役 割 の 解 明 は 今 後 の課 題 となっている.PPARαの 活 性 化 は, 脂 肪 酸 のβ酸 化 を 介 して 細 胞 中 の 脂 肪 酸 含 有 量 を 減 少 させるが,PPARγの 活 性 化 は 脂 肪 組 織 に 選 択 的 に 発 現 される 転写 因 子 であり, 脂 肪 細 胞 の 分 化 と 関 係 しているものと思 われる.PPARは,デキサメタゾン 等 のステロイドホルモンによっても 調 節 されていると 言 われ,ステロイドの 日内 変 動 の 影 響 を 受 けることはよく 知 られている.さらに, 最 近 の 成 績 によれば, 光 刺 激 とは 関 係 なく, 摂 食周 期 が 末 梢 時 計 を 調 節 する 可 能 性 があることも 示 唆 されている. 相 互 に 作 用 する 正 と 負 の 転 写 ・ 翻 訳 フィードバックループが,ショウジョウバエと 哺 乳 動 物 の両 方 における 概 日 発 振 を 形 成 していることも 報 告 されている.マウスにおける 最 も 特 徴 的 なフィードバックループには,3つのPeriod 遺 伝 子 (mPER1-3)と2つのcryptochrome 遺 伝 子 (mCRY1, 2)が 含 まれていて,現 在 では,mPERとmCRYの 転 写 は, 交 互 にコンセンサス 配 列 であるEボックス 配 列 と 結 合 するCLOCK/1) 埼 玉 医 科 大 学 生 化 学 教 室 ,2) 埼 玉 医 科 大 学 生 理 学 教 室BMAL1のヘテロ 二 量 体 を 蓄 積 することによって 形 成されると 考 えられている.最 近 ,Peter McNamaraらは,レチノイド 受 容 体 であるレチノールX 受 容 体 (RXR)とRARが 時 計 遺 伝 子 であるMOP4およびCLOCKと 相 互 作 用 することを 報 告した.RXRはPPARと 結 合 し,ペルオキシソーム 増 殖因 子 応 答 配 列 (PPRE)と 結 合 するヘテロ 二 量 体 を 形 成する 転 写 因 子 である.そこで, 我 々は,PPREを 有 する,acyl-CoAオキシダーゼのプロモーター 遺 伝 子 , 細 胞内 レチノール 結 合 蛋 白 質 II(CRBPII)のプロモーター遺 伝 子 ,3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル- 補 酵 素 A(HMG-CoA)シンターゼのプロモーター 遺 伝 子 などが,CLOCK/BMAL1によって,それらの 転 写 活 性 がどのように 調 節 されるかどうか,さらには, 逆 に,PPAR/RXRによる,Period 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 に 存 在するEボックス 配 列 への 作 用 を,それぞれ 検 討 した.材 料 と 方 法DNA 配 列 決 定自 動 シーケンサー (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer;Perkin Elmer, Foster City, CA)を 使 用 し,PCR 産 物 の直 接 配 列 決 定 を 行 った. 全 DNA 配 列 は, 両 DNA 鎖 を読 み 取 って 確 認 した.ウエスタンブロッティング蛋 白 発 現 量 はウエスタンブロッティングにて 評 価した. 特 異 的 免 疫 活 性 は,Amersham ECLキットで測 定 し,その 後 に, 処 理 済 みサンプルを10%ポリアクリルアミドゲル 電 気 泳 動 (PAGE)にアプライし,セミドライブロッティングによってニトロセルロース膜 (Millipore)にトランスファーした.ヒト 時 計 遺 伝子 (PER1,PER2,CYR1,CRY2)の 蛋 白 質 に 対 する 抗体 は,Santa Cruzから 入 手 し,ニトロセルロース 膜は,TBS-Tween/5%ドライミルクで 一 晩 処 理 し,ヒトPER1, PER2, CRY1, CRY2 抗 体 に 対 するヤギ 抗 蛋 白 質

時 計 遺 伝 子 によるPPARのプロモーターへのコアクチベーター CBP/p300およびSRC-1を 介 する 作 用 究 明29図 1 . CRBPPII-Lucプラスミドの 欠 失 .Lucプラスミドは3つの 反 復 配 列 (5’-AG(G/T)TCA-3’)が 含 まれている.また,del-4-CRBPII-Lucプラスミドは4つの 反 復 配 列 (5’-AG (G/T)TCA-3’)が 含 まれているコンストラクトである.統 計 解 析3 回 の 実 験 に 加 え, 単 独 実 験 を4 回 実 施 した.パラメーターデータは, 平 均 ±SDで 表 示 し, 群 間 差 はScheffeのF 検 定 で 評 価 した.結 果 と 考 察293T 細 胞 におけるレポーター 遺 伝 子 アッセイにより,fenofibric acid( 図 2A)およびトログリタゾン( 図 2B)がacyl-CoAオキシダーゼの 転 写 活 性 を 用 量 依存 性 に 増 加 させ,50 ng のCLOCK/BMAL1 遺 伝 子 の 同時 トランスフェクションによって,その 活 性 が 有 意 に減 少 した( 図 2A,2B).また,acyl-CoAオキシダーゼのPPREを 介 する 転写 活 性 が, 活 性 炭 未 処 理 培 地 に お い て,CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 導 入 によって 減 少 し,50 ng のCLOCK/BMAL1 遺 伝 子 量 で 最 低 値 となった( 図 3A-C).さらに,CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 のトランスフェクトする遺 伝 子 量 をさらに 増 大 させると,CLOCK/BMAL1 遺伝 子 によるacyl-CoAオキシダーゼのPPREを 介 する転 写 活 性 が 再 び 増 大 し,80 ngのCLOCK/BMAL1でピーク 値 に 達 した( 図 3A-C).そしてその 転 写 活 性は,PPARα/RXRα 遺 伝 子 ( 図 3B),PPARαリガンド/アクチベーターであるfenofibric acid( 図 3C)を 加えることにより 増 大 した.なお, 使 用 した 培 地 を 活 性炭 (Charcoal/Dextran Treated FBS, HyCLone)で 処 理することで, 培 地 から 内 因 性 PPARs/RXRαリガンド/アクチベーターを 完 全 に 除 去 することが 可 能 となるが, 培 地 から 内 因 性 PPARs/RXRαリガンド/アクチベーターを 完 全 に 除 去 した 場 合 ,その 転 写 活 性 の 最 高値 と 最 低 値 となるCLOCK/BMAL1 遺 伝 子 量 がそれぞ図 2 . ヒト 腎 臓 293T 細 胞 におけるCLOCK/BMAL1 遺 伝 子 によるacyl-CoAオキシダーゼのPPARα/RXRαを 介 する 転 写活 性 の 抑 制 (A)とPPARγ1/RXRαを 介 する 転 写 活 性 の 抑 制(B).pAOX-Lucのルシフェラーゼ 活 性 はpRL-TKのルシフェラーゼ 活 性 に 対 して 標 準 化 した.3 回 の 実 験 に 加 え,4 回の 単 独 実 験 を 実 施 した. 全 てのデータは, 平 均 ±SDで 表 示した.CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 によって 処 理 されていない 細胞 と 比 較 し,0.05 未 満 を 有 意 とした(*p

30 井 上 郁 夫 , 他れ,30 ng( 最 高 値 ),80 〜 90 ng( 最 低 値 )と 変 化 した( 図 3D-F).さらに,これらの 変 動 は,CBP,SRC-1,SRC-2,SRC-3,PGC-1α,PGC-1βなどの 様 々なコアクチベターの 種 類 により, 大 きく 変 化 することも 明 らかになった(データ 未 発 表 ).以 上 の 我 々 の 成 績 か ら,PPARα/RXRα 遺 伝 子あるいはPPARαリガンド/アクチベーターの 両 方または 一 方 が,CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 によるPPREの転 写 活 性 に 作 用 していることを 示 している.さらに,それらの 変 動 が, 再 び 減 少 するという, 新 たな 制 御機 構 の 存 在 の 可 能 性 が 示 唆 された.また, 結 果 に 示 していないが, 各 量 のCLOCK/BMAL1 遺 伝 子 でトランスフェクトした293T 細 胞 でのヒト 時 計 遺 伝 子 (PER1,PER2,CYR1,CRY2)の 蛋 白 発 現 分 析 を 行 ったところ,実 際 ,それらの 蛋 白 発 現 変 動 が 明 らかに 認 められ,CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 によるPPREの 転 写 活 性 への作 用 の 機 序 に,これらの 時 計 遺 伝 子 の 蛋 白 発 現 変 動 がそれぞれ 関 与 している 可 能 性 が 考 えられた.次 に,CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 の mPERの 転 写 に 対する 作 用 が,PPARα/RXRαによって, 変 動 するかどうかを 検 討 するため,239T 細 胞 ,COS-1 細 胞 ,NIH33細 胞 において,PER 遺 伝 子 の 転 写 に 対 するCLOCK/BMAL1 遺 伝 子 の 作 用 を 評 価 した.mPER1 遺 伝 子 の転 写 活 性 は,CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 によって, 添 加したCLOCK/BMAL1 遺 伝 子 量 に 依 存 して 活 性 化 され( 図 4),PPARα/RXRαを 添 加 すると,mPERの 転 写活 性 が 有 意 に 低 下 する 結 果 が 得 られた( 図 4).結 論 として, 本 研 究 の 結 果 から,CLOCK/BMAL1遺 伝 子 とPPAR 群 /RXRαによる,PPREとEボックスとの 間 にクロストークが 存 在 するという, 新 たな 調節 機 序 の 存 在 が 示 唆 された.また,それらのCLOCK/BMAL1 遺 伝 子 に よ るPPREの 転 写 活 性 は,PPAR 群/RXRα 遺 伝 子 およびそれらのリガンド/アクチベーターの 両 方 または 一 方 によって 調 節 されている 可 能 性も 示 された( 図 5). 今 後 ,メタボリックシンドロームと 時 計 遺 伝 子 がどのように 関 り, 最 近 , 我 々が 注 目 している 腸 管 粘 膜 での 脂 質 代 謝 にも, 時 計 遺 伝 子 がどのように 関 与 するか,さらに 検 討 を 加 える 予 定 である.図 3 . ヒト 腎 臓 293T 細 胞 における 用 量 依 存 性 CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 (0 〜 220 ng)によるacyl -CoAオキシダーゼ(AOX)のPPARα/RXRαを 介 する 転 写 活 性 の 変 動 . 活 性 炭 未 処 理 培 地 (A 〜 C)と 活 性 炭 処 理 培 地 (D 〜 F)における結 果 .pAOX-Lucのルシフェラーゼ 活 性 は,pRL-TKのルシフェラーゼ 活 性 に 対 して 標 準 化 した. 測 定 は3 回 実 施 し,4 回 の 単 独 実 験 を 実 施 し, 全 てのデータは, 平 均 ±SDで 表 示 した.

時 計 遺 伝 子 によるPPARのプロモーターへのコアクチベーター CBP/p300およびSRC-1を 介 する 作 用 究 明31参 考 文 献図 4 . ヒ ト 腎 臓 293Tに お け るPPARα/RXRα 遺 伝 子 の,CLOCK/BMAL1 遺 伝 子 によるPeriodic (PER)プロモーターの 活 性 化 の 抑 制 作 用 .pPER-Lucのルシフェラーゼ 活 性 は,pRL-TKのルシフェラーゼ 活 性 に 対 して 標 準 化 した. 測 定 は3回 実 施 し,4 回 の 単 独 実 験 を 実 施 し, 全 てのデータは, 平 均 ±SDで 表 示 した.PPARα/RXRα 遺 伝 子 によって 処 理 されていない 細 胞 と 比 較 し,0.05 未 満 を 有 意 とした(*p

32 井 上 郁 夫 , 他in the liver of patients with Wilson disease: hepaticmanifestation in Wilson disease as a consequenceof augmented oxidative stress. Pediatr Res 2006;60:472-7.5) Inoue I, Shinoda Y, Nakano T, et al. Acarboseameliorates atherogenecity of low-density lipoproteinin patients with impaired glucose tolerance.Metabolism 2006;55:946-52.6) Shinoda Y, Inoue I, Nakano T, et al. Acarboseimproves fibrinolytic activity in patients withimpaired glucose tolerance. Metabolism. 2006;55:935-9.7) Nakano T, Miyazaki S, Shinoda Y, Inoue I, etal. Proposed reference material for human freeimmunoglobulin light chain measurement. JImmunoassay Immunochem 2006;27:129-37.8) Nakano T, Shimanuki T, Matsushita M, Koyama I,Inoue I, et al. Involvement of intestinal alkalinephosphatase in serum apolipoprotein B-48 level andits association with ABO and secretor blood grouptypes. Biochem Biophys Res Commun 2006;341:33-8.9) Inoue I. Hyperlipidemia and peroxisome proliferatoractivatedreceptor (PPAR)-regulation of the PPARαgene by CLOCK: BMAL1 Nippon Rinsho 2005;63:643-56. Review.10) Inoue I, Shinoda Y, Ikeda M,et al. CLOCK/BMAL1is involved in lipid metabolism via transactivationof the peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR) response element. J Atheroscler Thromb2005;12:169-74.11) Shimazu T, Inoue I, Araki N, et al. A peroxisomeproliferator-activated receptor γ agonist reducesinfarct size in transient but not in permanentischemia. Stroke 2005;36:353-9.12) Nakajima T, Matsunaga T, Kawai S, Hokari S, InoueI, et al. Characterization of the epitopes specific forthe monoclonal antibody 9F5-3a and quantification ofoxidized HDL in human plasma. Ann Clin Biochem2004;41(Pt 4):309-15.13) Inoue I, Katayama S. The possible therapeuticactions of peroxisome proliferator-activated receptorα(PPARα) agonists, PPARγ agonists, 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductaseinhibitors, angiotensin converting enzyme (ACE)inhibitors and calcium (Ca)-antagonists on vascularendothelial cells. Curr Drug Targets CardiovascHaematol Disord. 2004;4:35-52. Review.© 2007 The Medical Society of Saitama Medical University http://www.saitama-med.ac.jp/jsms/