Un nuovo approccio per lo studio delle cellule tumorali ... - Enea

hanno proliferato sia nelle µ-dish sia nellepiastre a 96 pozzetti, anche in presenza disoft agar (Fig. 5A-E)Infine, siamo stati in grado di far crescerepiccoli gruppi (non inferiori a 10) di celluleutilizzando modelli sperimentali dispiking (in sangue intero da donatore sanoun numero controllato di cellule da lineacellulare (A549 LV-16 GFP). (Fig. 5F).Fig. 2. Cellule A549 visualizzate al Cell Browser dopo arricchimentocon Oncoquick®. Anche in questo caso, la marcaturaè stata eseguita con anticorpi anti CK-PE (ficoeritrina) anticorpianti CD45-APC (alloficocianina). Il nucleo è stato marcatocon Hoechst 33342 (DAPI) A549 singole (A) A549 con linfociti(B), linfociti singoli (C) come controllo interno per la negativitàall’anticorpo contro la citocheratina. Con il sistemaOncoquick® il segnale aspecifico dato dall’anticorpo antiCD45-APC è calato drasticamente.Fig. 3. CTC analizzate al Cell Browser da paziente. Cellulatumorale circolante che mostra positività alla citocheratina-PEnegatività al CD45-APC con un nucleo normale (A). CTC chemostra un nucleo atipico, probabilmente con un processo apoptoticoin atto (B). CTC unita a ad un linfocita (negativo allacitocheratina e positivo al CD45) che mostra un nucleo polilobato.Fig. 4. Cellule A549 vive visualizzate al Cell Browser incubatecon colorante nucleare Hoechst 33342 (DAPI).DISCUSSIONEI dati presentati in questo lavoro mostranoche il procedimento messo a punto, basatosul DEPArray®, è in grado di arricchire, analizzare erecuperare con una purezza del 100% cellule rare dispersenel sangue periferico. Gli esperimenti di spiking descrittihanno inoltre permesso di valutare che la percentualemedia di recupero era di circa il 50%, senza contaminazioneda linfociti.L’analisi dei campioni provenienti da pazienti ha mostratola presenza di CTC nel 50% di pazienti con tumore alcolon e nel 20% di pazienti con NSCLC, percentualiparagonabili o superiori a quelleriportate in letteratura in ambiti clinici comparabili[25]. Analizzando i risultati sperimentaliè inoltre emerso che, oltre a CTCconvenzionali, in alcuni pazienti sono stateindividuate cellule citocheratina positive cheall’analisi microscopica evidenziano unamorfologia nucleare simile a quella rilevabilein cellule in apoptosi. Questo dato è in lineacon quanto è riportato in letteratura, ovveroche la maggior parte delle cellule che il tumoreprimario rilascia in circolo è apoptotica [8, 29-30], maal tempo stesso suggerisce l’importanza di non limitarsial solo conteggio delle CTC ma anche di effettuare analisiapprofondite sulla vitalità delle CTC individuate.Il problema dell’apoptosi delle cellule tumorali circolantirappresenta un argomento scientifico di estrema importanzae molti studi riportati recentemente in letteraturavertono proprio su come riconoscere le CTC che mostranoquesto fenotipo e quale significato attribuire loro dalpunto di vista biologico. E’ ancora poco chiaro se la mortedelle CTC sia un fenomeno causato dalla metodica utilizzataper la lo separazione dalle componenti cellulari ematiche,oppure se siano cellule già morenti nel circolo sanguigno.Durante la seconda parte del presente studio èstata investigata la capacità di recovery di cellule vive evitali utilizzando il sistema DEPArray®. Siamo stati ingrado di recuperare bassi numeri di cellule provenienti dalinee tumorali stabilizzate che abbiamo poi seminato sudiverse tipologie di supporti di crescita. I risultati ottenutisuggeriscono che, al momento, solamente gruppi costituitida almeno 10 cellule sono in grado di crescere invitro. Inoltre il sistema di marcatura modificato non hainfluito sulla vitalità cellulare.22 ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 21, Num. 3 - Dicembre 2012