MKMTR 1 (Z) MTR Antigens Blot - Milenia Biotec GmbH

- 8 -Short Instruction: M TR Antigens Blot(all sample volumes are given in µl)Steps Solution Sample Controls:negative/positive/cut-offPipet to the strips Wash Buffer 1000 µlIncubate for 5 min at room temperature(18-28 °C) on a shaker; do not aspiratethe solution!Addcontrol(undiluted)(500 µl forCSF)1000 µl- 10 µlAddsample(undiluted)10 µl -or add CSF(undiluted) 500 µl -Aspirate; wash the strips with 1000 µl washbuffer by mixing gently and aspirate againAdd 1000 µl of wash buffer to each stripand incubate for 5 min at RT on a shaker;aspirateRepeat this step onceAddIncubate for 60 min at RT on a shakerAspirate; wash the strips with 1000 µl washbuffer by mixing gently and aspirate againAdd 1000 µl of wash buffer to each stripand incubate for 5 min at RT on a shaker;aspirateRepeat this step onceAddIncubate for 5 – 15 min at RT on a shakerDecant and wash the strips twice with1000 µl destilled waterRemove the strips with tweezers and airdryon adsorbent paper for about 30 minAnalyze the band pattern using theevaluation sheetEnzymeConjugateSubstrateSolution1000 µl 1000 µl1000 µl 1000 µlFor a detailed description of the procedure see also page 5.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 9 -MTR Antigens BlotDot Blot for the qualitative detection of paraneoplasticMa-1, Ta, and Recoverin specific IgG autoantibodiesEnglish: Page 1-8Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von paraneoplastischenMa-1, Ta und Recoverin-spezifischen IgG AutoantikörpernDeutsch: Seite 9-14Dot Blot per la determinazione qualitativa di autoanticorpi IgG specificiper gli antigeni paraneoplastici Ma-1, Ta e RecoverinaItaliano: Pagine 15-20Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps IgG antiantigènes paraneoplastics Ma-1, Ta et RecoverineFrançais : Page 21-28REF:MKMTR 1 (Z)24 (8)Privates Institut für Immunologieund Molekulargenetik GmbHKriegsstraße 99D-76133 Karlsruhe, Germany:Distribution/Service:Vertrieb/Service:Distribuzione/Assistenza:Distribution/Service:Milenia Biotec GmbHHohe Straße 4-8D-61231 Bad Nauheim, GermanyTel.: +49-(0)6032-8040-0Fax: +49-(0)6032-8040-80E-Mail: info@milenia-biotec.deDistribution/Service:http://www.milenia-biotec.deMTR Antigens Blot (MKMTR)

- 10 -Kitbestandteile, Lagerung und StabilitätKomponente Art.-Nr. Inhalt Vorbereitung Lagerung bei HaltbarkeitMTR Dot-Blot Streifen(MTR Dotblot Strips),Nitrozellulose-Streifenbeschichtet mit rekombinantenonkoneuralenAntigenen Ma-1, Ta undRecoverinMMTRDS 24 (8) gebrauchsfertig 2 - 8 °CVor Feuchtigkeitschützen!Zusammen mitTrocknungsmittelin dem RöhrchenaufbewahrenNicht mit denFingern anfassen!Bis zumVerfallsdatumMTR Kontroll-Seren(MTR Control Sera),NegativkontrollePositivkontrolleCut-off KontrolleMTR Enzym-Konjugat (MTREnzyme Conjugate),polyklonaler (Ziegen) antihu-IgGAntikörper, markiertmit alkalischer PhosphataseMTR Waschpuffer (MTRBuffered Wash Solution),Konzentrat (5x)Substrat-Lösung (SubstrateSolution),enthält 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat und 4-Nitro-BlautetrazoliumchloridMPMTR1/2/3MEMTRMWBMTRMSMTR1 Set3 Fl. à 100 µl2 (1) Fl.à 15 ml1 Fl.50 ml2 (1) Fl.à 15 mlEinweg-Inkubationswannen MMTRP 3 (1)Auswertebogen MTRA 1 (1)gebrauchsfertig 2 – 8 °C 30 Tage nachdemVerdünnenbzw. bis zumVerfallsdatumgebrauchsfertig 2 - 8 °C 30 Tage nachdemVerdünnenbzw. bis zumVerfallsdatumVor Gebrauchverdünnen: z.B.zu 10 mlWaschpuffer-Konzentrat40 ml dest.Wasserzugebengebrauchsfertig 2 - 8 °CVor Lichtschützen!2 - 8 °C 30 Tage nachdem Öffnen, 5Tage nach demVerdünnen,bzw. bis zumVerfallsdatum30 Tage nachdem Öffnenbzw. bis zumVerfallsdatumSicherheitsdatenblätter sind auf Anfrage erhältlich (siehe auch unter www.milenia-biotec.de).Erforderliche Hilfsm ittel Horizontal-Schüttler Wirbelmischer (Vortex) destilliertes Wasser Messzylinder für 250 ml; Plastikgefäße zur Aufbewahrung des Waschpuffers Mikropipetten für 10, 50 und 1000 µl Reaktionsgefäße zur Probenverdünnung Optional: Westernblot ProzessorMTR Antigens Blot (MKMTR)

- 11 -Probenentnahm e und -vorbereitungAls Probenmaterial können Serum und Plasma (EDTA, Citrat, Heparin) und Liquor cerebrospinalisverwendet werden.Alle Patientenproben sowie die im Kit befindlichen Kontrollen sind 1:100 endverdünnt; dazu wird beider Testdurchführung 10 µl Probe zu 1000 µl Wasch-Puffer gegeben. Liquor kann 1:2 verdünnteingesetzt werden.Für den Transport kann das Untersuchungsmaterial bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur gelagertwerden. Die Proben können gekühlt bei 2-8 °C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längereLagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei < -18 °C tiefgefroren werden. WiederholteEinfrier- und Auftauzyklen sind zu vermeiden.Hinw eise und Vorsichtsm assnahm enAlle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-Diagnostik verwendet werden.Die Anwendung sollte durch Personal erfolgen, das speziell in Verfahren von in vitro-Diagnostikaunterrichtet und ausgebildet wurde. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführungdes Tests ist unbedingt erforderlich.Untersuchungsmaterial von Patienten ist stets als potentiell infektiös einzustufen und sollten stets ineiner Sicherheitswerkbank weiterbearbeitet werden.M ethodik und TestprinzipDer MTR Antigens Blot Test ist ein Immunoassay im Dot-Blot-Verfahren zur qualitativen Bestimmungvon humanen IgG-Autoantikörpern gegen die neuronalen Antigene Ma-1, Ta und Recoverin. Dierekombinanten humanen Proteine von Ma-1, Ta und Recoverin sind auf einer Nitrozellulose-Membranan fixen Stellen aufgetragen; zusätzlich sind anti-human-IgG-Antikörper als Funktionskontrolleaufgetragen.Die unverdünnte Patientenprobe wird zu der Antigen-beladenen Trägermembran pipettiert. Währendder ersten Inkubation (90 Minuten) binden die in der Patientenprobe vorhandenen Autoantikörperentsprechend ihrer Antigen-Spezifität. Im nächsten Schritt werden ungebundene Serumbestandteileweggewaschen. Während der nächsten Inkubation (60 Minuten) werden die gebundenenImmunkomplexe mit anti-human-IgG, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, markiert.Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen der Streifen entfernt. Schließlich werden dieImmunkomplexe sichtbar gemacht, indem sich durch Zugabe von farblosem Enzymsubstrat (BCIP)eine blaue Präzipitat-Linie bildet. Die Antikörper-Typen der Probe werden durch den Vergleich derPositionen mit denen der Referenzbanden auf der Auswerteschablone identifiziert.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 12 -TestdurchführungWichtige Hinweise Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke dürfen nicht ausgetauschtwerden. Kitbestandteile nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums dürfen nicht benutzt werden. Alle Komponenten müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18-28 °C) erwärmt werden. Die Konzentrate müssen mindestens 30 Minuten vor Gebrauch verdünnt werden. Gut mischen,Schaumbildung vermeiden. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden Flüssigkeiten vorsichtig absaugen; das gilt vor allem fürdie Patientenproben-haltigen Flüssigkeiten!1. Mit einer Pinzette die benötigte Anzahlan Streifen in die Inkubationswannenlegen (Beschriftung nach oben).2. Streifen mit 1000 µl Waschpuffer (500 µlfür Liquor) überschichten und 5 Minutenbei Raumtemperatur (18-28 °C) aufeinem Schüttler inkubieren. NichtAbsaugen, Waschpuffer verbleibt inden Reservoirs!3. 10 µl Serum/Plasma (unverdünnt) undKontrollen (unverdünnt) oder 500 µlLiquor (unverdünnt) zugeben.90 Minuten auf einem Schüttlerinkubieren.4. Absaugen und die Streifen mit 1000 µl Waschpuffer waschen. Dabei vorsichtig schwenken unddann wieder absaugen.5. 1000 µl Waschpuffer hinzugeben, 5 Minuten schütteln. Waschpuffer absaugen. Diesen Schritteinmal wiederholen.6. 1000 µl Enzymkonjugat-Lösung zupipettieren und 60 Minuten auf einem Schüttler inkubieren.7. Absaugen und die Streifen mit 1000 µl Waschpuffer waschen. Dabei vorsichtig schwenken unddann wieder absaugen.8. 1000 µl Waschpuffer hinzugeben, 5 Minuten schütteln. Waschpuffer absaugen. Diesen Schritteinmal wiederholen.9. 1000 µl Substrat-Lösung zupipettieren und 5 - 15 Minuten unter Schütteln inkubieren (abhängigvon der Raumtemperatur). Nach 5 Minuten die Farbentwicklung kontrollieren. DieFunktionskontrolle sollte auf allen Streifen als intensive Bande sichtbar sein. Insbesondere solldie Positivkontrolle fünf deutlich sichtbare Banden aufweisen.10. Substratlösung absaugen und Streifen zweimal mit 1000 µl dest. Wasser waschen.11. Streifen mit einer Pinzette der Wanne entnehmen und für ca. 30 Minuten auf Filterpapierlufttrocknen.12. Das Bandenmuster mit dem im Kit vorhandenen Auswertebogen interpretieren.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 13 -Ausw ertung der ErgebnissseDie komplett getrockneten Streifen werden anhand der Funktionskontrolle auf dem Auswertebogen(siehe Auswertebeispiel) mit der Nummerierung nach oben ausgerichtet und mit Tesafilm an ihrenEnden befestigt. Die Position der Antigene auf den Streifen kann chargenabhängig geringgradigvariieren, sie liegen aber stets in dem Bereich, der auf dem Auswertebogen befindlichenMarkierungen. Die blaue Färbung der Antigen-Banden verblaßt, wenn die trockenen Streifen Luft undLicht für längere Zeit ausgesetzt sind.M: Positionsmarker der Antigene1. Negativ-Kontrollserum2. Positiv-Kontrollserum3. Cut-off- Kontrollserum4-8. Beispiele für PatientenserenAntigen M 1 2 3 4 5 6 7 8Ma-1TaRecoverinFunktionskontrolleDie Testergebnisse werden anhand von Lokalisation und Farbintensität der Banden mit der Cut-off-Kontrolle aus dem Kit verglichen und entsprechend ausgewertet.Positives ErgebnisNegatives ErgebnisNur Proben mit einer stärkeren Bandenintensität Keine oder ganz schwache Bandenintensitätenals die der Cut-off-Kontrolle sind eindeutig (schwächer als die der Cut-off-Kontrolle), sind alsAntikörper-positiv.Antikörper-negativ zu interpretieren.Prinzipiell sollten die Ergebnisse des Immunoblots zur Diagnosestellung nur im Zusammenhang mitdem klinischen Bild und anderen diagnostischen und epidemiologischen Daten interpretiert werden.Q ualitätskontrolleDie auf jedem Streifen vorhandene Funktionskontrolle (interne Reaktionskontrolle) muß kräftig gefärbtsein. Die Negativ-Kontrolle darf nur die Färbung der Funktionskontrolle aufweisen; in wenigenseltenen Fällen treten sehr schwache Banden auf, denen keine Bedeutung zukommt.Die Positiv-Kontrolle muß immer eine kräftige Färbung der drei Antigene (Ma-1, Ta und Recoverin)und der Funktionskontrolle aufweisen; falls nicht, muß der Test wiederholt werden.TestcharakteristikaProbenmaterial:Zeit zur Testdurchführung:Spezifität:humanes Serum, Plasma, Liquor cerebrospinalis3,5 StundenBei der Testung von 100 gesunden Blutspendern wurde für keines deruntersuchten Seren ein positives Ergebnis gefundenMTR Antigens Blot (MKMTR)

- 14 -Kurzanleitung: M TR Antigens Blot(alle Volumenangaben in µl)Schritte Lösung Probe Kontrollen:negativ/positiv/Cut-offZu den Streifen pipettieren Waschpuffer 1000 µl5 min bei Raumtemperatur (18-28 °C) aufeinem Schüttler inkubieren;die Lösungen nicht absaugen!ZugebenZugebenoder zugeben von90 min bei Raumtemperatur (RT) auf einemSchüttler inkubierenAbsaugen; die Streifen mit 1000 µl Waschpufferdurch vorsichtiges Mischen waschen und wiederabsaugen1000 µl Waschpuffer zu jedem Streifen zugebenund für 5 min bei RT auf einem Schüttlerinkubieren; absaugenDiesen Schritt einmal wiederholenZugeben60 min bei RT auf einem Schüttler inkubierenAbsaugen; die Streifen mit 1000 µl Waschpufferdurch vorsichtiges Mischen waschen und wiederabsaugen1000 µl Waschpuffer zu jedem Streifen zugebenund für 5 min bei RT auf einem Schüttlerinkubieren; absaugenDiesen Schritt einmal wiederholenZugeben5 – 15 min bei RT auf einem SchüttlerinkubierenAbsaugen und zweimal mit 1000 µl dest.Wasser waschenDie Streifen mit einer Pinzette entfernen und aufeinem Papier ca. 30 min lufttrocknen lassenDie Bandenmuster anhand des AuswertebogensanalysierenKontrolle(unverdünnt)Probe(unverdünnt)Liquor(unverdünnt)Enzym-KonjugatSubstrat-Lösung(500 µl fürLiquor)1000 µl- 10 µl10 µl -500 µl -1000 µl 1000 µl1000 µl 1000 µlVergleiche auch Seite 12 für eine detaillierte Beschreibung der Testdurchführung.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 16 -M ateriale Fornito, Conservazione e StabilitàComponenti Cat.-No. Contenuto Preparazione Conservare a StabilitàMTR Dotblot Strisce(MTR Dotblot Strips),strisce di nitrocellulosa rivestitecon antigeni ricombinantiparaneoplastici Ma-1, Ta eRecoverinaMTR Sieri di Controllo(MTR Control Sera),controllo negativocontrollo positivocontrollo cut-offMTR Coniugato con Enzima(MTR Enzyme Conjugate),anticorpi policlonali (pecora) antih-IgG,marcati con fosfatasialcalinaMTR Soluzione di lavaggiotamponata(MTR Buffered Wash Solution),Concentrata (5x)Soluzione Substrato(Substrate Solution),contiene 5'Bromo-4'Cloro-3'Indolil-Fosfato e Cloruro di4'Nitro-TetrazolioContenitori disposable perl’incubazioneMMTRDS 24 (8) Pronte all’uso 2 - 8 °CProteggeredall’umidità!Conservare neltubo conl’essiccante!Non toccarecon le dita!MPMTR1/2/3 1 set3 flaconi da100 µlMEMTRMWBMTRMSMTR2 (1) flacone(i)da 15 ml1 flacone50 mlMMTRP 3 (1)Schema di valutazione MTRA 1 (1)2 (1) flacone(i)da 15 mlFino alla data discadenzaPronto all’uso 2 - 8 °C 30 giorni dopola diluizione ofino alla data discadenzaPronto all’uso 2 - 8 °C 30 giorni dopola diluizione ofino alla data discadenzaDiluire primadell’uso, ad es.aggiungendo 40ml acqua dist. a10 ml tamponelavaggioPronta all’uso 2 - 8 °CProteggere dallaluce!Le schede di sicurezza sono disponibili a richiesta (consultare www.milenia-biotec.de).2 - 8 °C 30 giorni dopol’apertura, 5giorni dopodiluizione30 giorni dopol’apertura o finoalla data discadenzaM ateriale richiesto Agitatore orizzontale Vortex mixer acqua distillata cilindro graduato per 250 ml; contenitori per il tampone di lavaggio pipette da 10, 50 e 1000 µl provette per la prediluizione dei campioni opzionale: Processore automatico per Western-blotMTR Antigens Blot (MKMTR)

- 17 -Raccolta e preparazione dei cam pioniSiero e plasma (EDTA, citrato, eparinato) e liquido cerebrospinale (CSF) possono essere utilizzaticome materiale campione.Tutti i campioni di pazienti e i controllo forniti con il kit sono diluiti con una diluizione finale di 1:100;ciò significa che nel corso del procedimento analitico, 10 µl di campione vengono mescolati con1000 µl di tampone lavaggio. I campioni di CSF possono esser utilizzati diluiti 1:2.Durante il trasporto i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 24 ore. Icampioni refrigerati at 2-8 °C si conservano fino a 5 giorni. Per periodi più lunghi i campioni vannoaliquotati e congelati a < -18°C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti del campione.Avvertim enti e precauzioniTutti I reattivi di questo kit sono tassativamente da intendersi solo per uso diagnostico in vitro. Il kit vautilizzato esclusivamente da personale addestrato all’uso di metodologie diagnostiche in vitro.Preghiamo di seguire alla lettera lo schema di pipettaggio indicato in questa procedura.I campioni dei pazienti sono sempre da considerarsi come potenzialmente infetti. I campioni dipazienti potenzialmente infetti vanno maneggiati in banchi di lavoro con cappe a flusso laminare.M etodo e principio del testIl test MTR Antigens Blot è un immunoassay in formato “dot blot” per la determinazione qualitativa diautoanticorpi IgG umani anti antigeni neuronali Ma-1, Ta e Recoverina. Proteine umane ricombinantidi Ma-1, Ta e Recoverina sono fissate su posizioni prestabilite su una membrana di nitrocellulosa;inoltre anticorpi anti-IgG umane sono fissati sulla membrana come controllo funzionale.Il campione non diluito è pipettato sulla membrana di supporto su cui sono fissati gli antigeni. Nelcorso della prima incubazione gli autoanticorpi presenti nel campione del paziente si legano secondola loro specificità agli antigeni.Nel passaggio successivo i componenti del campione non legati sonoeliminati col lavaggio. Durante il periodo di incubazione seguente gli immunocomplessi legati vengonomarcati con anticorpi anti-IgG umane, coniugati con fosfatasi alcalina. L’eccesso di coniugato èrimosso con il lavaggio delle strisce. Infine aggiungendo una soluzione di substrato incolore (BCIP), gliimmunocomplessi vengono visualizzati, con la formazione di una banda di precipitato blu.Confrontando con le bande di riferimento sul foglio di valutazione gli autoanticorpi presenti neicampioni vengono identificati in base alla loro posizione.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 18 -Esecuzione del testImportant notes: Non mescolare componenti di lotti e dosaggi differenti. Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza. Tutti i componenti devono essere portati a temperatura ambiente (18 – 28°C) prima dell’ uso. Diluire I concentrati almeno 30 minuti prima dell’ uso Mescolare bene, evitando la formazione dischiuma. Per evitare contaminazione da trascinamento aspirare i liquidi con cura, particolarmente i liquidicontenenti il campione!1. Usando le pinzette, collocare il numero distrisce richiesto nel contenitore perreazione (l’etichettatura deve apparireverso l’alto).2. Ricoprire le strisce con 1000 µl tamponelavaggio (500 µl per CSF) e incubare per5 minuti a temperatura ambiente (18-28°C) su un agitatore. Non aspirare; iltampone rimane nelle cellette!3. Aggiungere 10 µl di siero/plasma delpaziente e dei controlli non diluito ou500 µl di liquido cerebrospinale nondiluito.Incubare per 90 minuti su agitatore.Zona diAspirazioneCamera di reazioneAggiunta reattivi4. Aspirare e lavare le strisce con 1000 µl tampone lavaggio. Mescolare e aspirare con molta cura.5. Aggiungere 1000 µl di tampone lavaggio e agitare per 5 minuti. Aspirare il tampone lavaggio.Ripetere questo lavaggio per una volta.6. Pipettare 1000 µl di soluzione Coniugato e incubare per 60 minuti su agitatore.7. Aspirare e lavare le strisce con 1000 µl tampone lavaggio. Mescolare e aspirare con moltacura.8. Aggiungere 1000 µl tampone lavaggio e agitare per 5 minuti. Aspirare il liquido. Ripeterequesto lavaggio per una volta.9. Pipettare 1000 µl soluzione Substrato e incubare 5-15 minuti su agitatore. Controllare dopocirca 5 minuti lo sviluppo del colore. La linea del controllo funzionale deve essere chiaramentevisibile in tutte le strisce. In particolare il controllo positivo deve presentare cinque bande benvisibili.10. Aspirare la Soluzione Substrato e lavare due volte con 1000 µl di acqua distillata.11. Rimuovere le strisce dal contenitore usando le pinzette. Asciugare con aria calda su cartaassorbente per circa 30 minuti.12. Interpretare le bande presenti confrontandole con il foglio di valutazione fornito col kit.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 19 -Interpretazione dei RisultatiDopo che le strisce sono completamente asciugate, le stesse vengono posizionate sul foglio divalutazione a partire dalla posizione del controllo di funzionamento (v. esempio di interpretazione) coni numeri in cima alla parte terminale della striscia fissata con pellicola adesiva. La posizione dellebande degli antigeni può variare leggermente da lotto a lotto, ma le stesse si trovano sempre incorrispondenza della posizione indicata sul foglio di valutazione. La colorazione blu delle bande tendea sbiadire se le strisce asciutte sono esposte all’aria e alla luce per un periodo prolungato.M: posizione delle bande di antigeni.1. controllo negativo.2. controllo positivo.3. controllo cut-off4-8. sieri dei pazienti.Antigeni M 1 2 3 4 5 6 7 8Ma-1TaRecoverinaControllo funzionaleI risultati si ottengono confrontando la posizione e l'intensità del colore delle bande del campione conquelle del controllo "cut-off" fornito con la confezione.Risultati positiviRisultati negativiSolo campioni con una intensità di colore piùelevata del controllo cut-off sono chiaramentepositivi all'anticorpo.In caso di assenza di bande o intensità di coloremolto debole (più debole del controllo cut-off) ilrisultato è da considerarsi negativo.In linea di principio, i risultati di questo immuno dot blot dovrebbero essere tenuti in considerazioneper una diagnosi solo insieme ad un quadro clinico ed altri dati diagnostici ed epidemiologici.Controllo di qualitàIl controllo di funzionalità su ciascuna striscia (controllo di reazione interno) deve mostrare un coloreintenso. Il controllo negativo deve mostrare solamente la banda di controllo interno; in casi molto raripossono essere osservate bande molto deboli, senza nessun valore.Il controllo positivo deve presentare sempre una colorazione intensa per i 3 antigeni (Ma-1, Ta eRecoverina) e per la banda di controllo; altrimenti il test deve essere ripetuto.Caratteristiche del testCampione:Tempo di esecuzione:Specificità:siero umano, plasma, liquido cerebrospinale3,5 oreil test eseguito su 100 donatori sani non ha dato alcun risultato positivoMTR Antigens Blot (MKMTR)

- 20 -M etodica breve: M TR Antigens Blot(quantità espresse in µl)Operazioni Soluzioni Campione Controllonegativo/positivo/cut-offPipettare sulle strisce Tampone lavaggio 1000 µlIncubare per 5 min. a temperaturaambiente (TA) 18-28° su un agitatore,non aspirare le soluzioni!AggiungereAggiungereou aggiungereIncubare per 90 min. a TA su unagitatoreAspirare il liquido. Lavare le strisce con1000 µl di tampone lavaggio , mescolaredelicatamente e aspirare di nuovoAggiungere 1000 µl tampone lavaggio adogni striscia e incubare per 5 min. su unagitatore.Ripetere una seconda voltaControllo(non diluito)Campione(non diluito)CSF (non diluito)(500 perCSF)1000 µl- 10 µl10 µl -500 µl -Aggiungere Coniugato 1000 µl 1000 µlIncubare per 60 min. a TA su unagitatoreAspirare. Lavare con 1000 µl di tamponelavaggio. Mescolare delicatamente.Aspirare ancoraAggiungere 1000 µl di tampone lavaggioincubare per 5 min. a TA su un agitatore.Ripetere una seconda voltaAggiungereIncubare per 5-15 min. a TA e su unagitatoreVuotare e lavare due volte con 1000 µl diacqua distillataRimuovere le strisce con una pinzetta elasciarle asciugare su carta da filtro peralmeno 30 min.Confrontare le bande ottenute con ilfoglio di valutazioneSoluzioneSubstratoPer una descrizione dettagliata della procedura vedi anche alle pagine 18.1000 µl 1000 µlMTR Antigens Blot (MKMTR)

- 21 -MTR Antigen BlotDot Blot for the qualitative detection of paraneoplasticMa-1, Ta, and Recoverin specific IgG autoantibodiesEnglish: Page 1-8Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von paraneoplastischenMa-1, Ta und Recoverin-spezifischen IgG AutoantikörpernDeutsch: Seite 9-14Dot Blot per la determinazione qualitativa di autoanticorpi IgG specificiper gli antigeni paraneoplastici Ma-1, Ta e RecoverinaItaliano: Pagine 15-20Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps IgGanti antigènes paraneoplastics Ma-1, Ta et RecoverineFrançais : Page 21-28REF:MKMTR 1 (Z)24 (8)Privates Institut für Immunologieund Molekulargenetik GmbHKriegsstraße 99D-76133 Karlsruhe, GermanyDistribution/Service:Vertrieb/Service:Distribuzione/Assistenza:Distribution/Service:Milenia Biotec GmbHHohe Straße 4-8D-61231 Bad Nauheim, GermanyTel.: +49-(0)6032-8040-0Fax: +49-(0)6032-8040-80E-Mail: info@milenia-biotec.deDistribution/Service:http://www.milenia-biotec.deMTR Antigens Blot (MKMTR)

- 22 -MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 23 -Contenu du kit, stockage et stabilitéComposants Cat.-No. Quantité Préparation Conservation Durée de vieBandelettes Dotblot MTR(MTR Dotblot Strips),Bandelettes de nitrocellulosecoatées avec des antigènesparaneoplastics recombinantsMa-1, Ta et RecoverineMMTRDS 24 (8) Prêt à l’emploi 2 - 8 °CProtéger desmoisissures !Stocker avec dudessicant !Ne pas toucheravec les doigts!Voire date depéremptionSérum de contrôle MTR(MTR Control Sera),contrôle négatifcontrôle positifcontrôle valeur seuilConjugué enzymatique MTR(MTR Enzyme Conjugate),Anticorps polyclonal (dechèvre) anti-IgG humaines,marqué à la phosphatasealcalineSolution de lavage MTR(MTR Buffered WashSolution),Concentrée (5x)Solution de substrat(Substrate Solution),Substrat : 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate and 4-NitrobluetetrazoliumchlorideMPMTR1/2/3 3 flacons de50 µlMEMTR 2 (1)flacon(s)à 15 mlMWBMTR1 flacon50 mlMSMTR 2 (1)flacon(s)à 15 mlBac d’incubation MMTRP 3 (1)Fiche d’évaluation MTRA 1 (1)Prêt à l’emploi 2 – 8 °C 30 jours aprèsouverture oujusqu'à la datede péremptionPrêt à l’emploi 2 - 8 °C 30 jours aprèsouverture oujusqu'à la datede péremptionDiluer avantusage : 10 mlde solution delavageconcentréedans 40 mld’eau distilléePrêt à l’emploi 2 - 8 °CProtéger de lalumière !2 - 8 °C 30 jours aprèsouverture, 5jours aprèsdilution30 jours aprèsouverture oujusqu'à la datede péremptionLes fiches de sécurité sont disponibles sur demande (voir également sur www.milenia-biotec.de).M atériel requis Agitateur horizontal Vortex Eau distillée Eprouvette graduée de 250 ml; flacon pour stocker la solution de lavage Pipettes de 10, 50 et 1000 µl Tubes à essais pour la pré-dilution des échantillons Optionnel: Automate de western-blotMTR Antigens Blot (MKMTR)

- 24 -Prélèvem ent et préparation des échantillonsLe sérum et le plasma (sous EDTA, citrate, héparine) et le liquide cérébrospinal (CSF) peuvent êtreemployés pour ce test.Tous les échantillons de sérum et de plasma ainsi que les contrôles fournis dans le kit doivent êtredilués au 1:100, ce qui correspond à la dilution finale; ex: 10 µl d’échantillon mélangé à 1000 µl desolution de lavage. Le CSF peut être utilisé dilué au1 :2.Pendant le transport, les échantillons peuvent être stockés à température ambiante pendant 24heures. Pour le stockage à court terme (5 jours maximum), les échantillons peuvent être conservés à2-8°C. Pour une conservation à plus long terme, aliquotez les échantillons et congelez les à < -18°C.Evitez des cycles de congélation / décongélation répétitifs.Avertissem ent et précautions d’em ploiTous les réactifs de ce kit sont strictement prévus pour un usage diagnostic in vitro. Le personnel, doitêtre formé et exercer les bonnes pratiques de laboratoire nécessaires au diagnostic in vitro. Respecterrigoureusement l'ordre des étapes de pipetage du protocole.Les prélèvements humains sont toujours considérés comme étant potentiellement infectieux et doiventêtre manipulés sous une hotte à flux laminaire.M éthode et principe du testLe test MTR Antigens Blot est un immuno-test, sous forme de dot blot, pour la détection qualitativedes auto-anticorps humains IgG anti antigènes neuronaux Ma-1, Ta et Recoverine. Les protéineshumaines recombinantes Ma-1, Ta et Recoverine sont fixées sur une membrane de nitrocellulose,chacun à un endroit précis. Des anticorps anti IgG humaines sont également fixés sur la membrane etservent de contrôle interne.L'échantillon non dilué est déposé à la pipette sur la membrane porteuse des antigènes. Pendant lapremière période d'incubation (90 minutes) les auto-anticorps présents dans l’échantillon du patient sefixent à leur antigène spécifique. Le lavage permet d’éliminer les éléments de l’échantillon non liés.Lors de l’incubation suivante (60 minutes), un conjugué anti-IgG humaines couplé à de laphosphatase alcaline est ajouté et se fixe sur les immunocomplexes liés à la membrane. L'excédentde conjugué est éliminé par le lavage. En phase finale, les immunocomplexes sont visualisés parl'addition d’un substrat incolore (BCIP) qui forme un précipité bleu en leur présence. Les typesd'anticorps présents dans l'échantillon sont alors identifiés en comparant leur position aux bandes deréférence sur la fiche d'évaluation.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 25 -Réalisation du testImportant : Ne pas échanger les composants de tests ni de lots différents. Ne pas utiliser après la date de péremption. Tous les composants doivent être à température ambiante (18 – 28 °C) avant usage. Diluer les concentrés au-moins 30 minutes avant usage. Bien mélanger, mais éviter la formation demousse. Pour éviter les contaminations par transfert, éliminer soigneusement les solutions par pipetage,surtout celles qui contiennent des prélèvements de patients.1. En utilisant des pincettes, placer le nombrerequis de bandelettes sur le plateau d’incubation(marquage vers le haut).2. Recouvrir les bandelettes de 1000 µl de solutionde lavage (500 µl pour CSF) et incuber5 minutes à température ambiante (18-28°C)sous agitation. Ne pas aspirer; la solution delavage reste dans les barquettes !3. Ajouter 10 µl d’échantillon non dilué(sérum/plasma) ainsi que les contrôles positif,négatif et valeur seuil non dilués, ou 500 µl deliquide cérébrospinal non dilué.Incuber 90 minutes sous agitation.RéservoirAspirerChambre d´incubationAdjonction de réactifs4. Aspirer la solution et laver les bandelettes avec 1000 µl de solution de lavage. Mélanger avecprécaution et aspirer soigneusement.5. Ajouter 1000 µl de solution de lavage et agiter 5 minutes. Aspirer la solution de lavage.Répéter l’opération de lavage encore une fois.6. Ajouter 1000 µl de solution de conjugué enzymatique et incuber 60 minutes sous agitation.7. Aspirer la solution et laver les bandelettes avec 1000 µl de solution de lavage. Mélanger avecprécaution et aspirer soigneusement.8. Ajouter 1000 µl de solution de lavage et agiter 5 minutes. Aspirer le solution de lavage.Répéter l’opération de lavage encore une fois.9. Ajouter 1000 µl de substrat et incuber 5-15 minutes sous agitation (en fonction de latempérature ambiante). Vérifier le développement de la couleur après 5 minutes. Le contrôleinterne doit être très coloré sur chaque bandelette. La bandelette contrôle positif doit présenter5 lignes colorées nettement visibles.10. Aspirer le substrat et laver deux fois avec 1000 µl d’eau distillée.11. Retirer les bandelettes du portoir en utilisant des pinces. Laisser sécher à l’air sur du papierabsorbant pendant 30 minutes.12. Interpréter le profil des bandelettes en vous référant à la fiche d’évaluation fournie avec le kit.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 26 -Interprétation des RésultatsAprès séchage complet, placer les bandelettes sur la feuille d’évaluation, numérotation vers le haut,en alignant le contrôle interne. Fixer les extrémités des bandes avec du ruban adhésif (voir l'exempled'interprétation). La position des bandes d'antigènes peut légèrement varier d’un lot à l’autre, maiselles sont toujours placées les zones indiquées sur la fiche d'évaluation. La couleur bleue des bandesd'antigène peut pâlir si les bandelettes sont exposées trop longtemps à l'air et à la lumière.M: Marqueur de position pour les antigènes.1. contrôle négatif2. contrôle positif3. contrôle valeur seuil4-8. exemples de sérums de patient.Antigen M 1 2 3 4 5 6 7 8Ma-1TaRecoverineContrôle interneLes résultats du test sont interprétés en comparant les localisations et les intensités de couleur desbandes à celles du contrôle valeur seuil fourni avec le kit.Résultat positifSeuls les échantillons ayant une intensité plusforte que celle du signal obtenu avec le contrôlevaleur seuil du kit sont clairement positifs.Résultat négatifPas de coloration ou une coloration plus faibleque le contrôle valeur seuil est interprétéecomme un résultat négatif.Par principe, les résultats de cet immuno-dot blot doivent être interprétés uniquement en fonction del’état clinique du patient et des autres données diagnostiques et épidémiologiques.MTR Antigens Blot (MKMTR)

- 27 -Contrôle Q ualitéLe contrôle interne de chaque bande doit être de couleur intense. Le contrôle négatif doit seulementprésenter une coloration au niveau du contrôle interne ; dans de très rare cas des lignes de trèsfaibles intensités peuvent être visibles, sans aucune incidence sur le résultat.Le contrôle positif doit toujours présenter des colorations intenses pour les 3 antigènes (Ma-1, Ta etRecoverine) et pour le contrôle interne ; dans le cas contraire, le test doit être répété.Caractéristiques du testEchantillons :Temps de manipulation :Spécificité :sérum, plasma, liquide cérébrospinal (CSF)3 h 30 minSur 100 donneurs sains testés aucun n’est apparu positif.MTR Antigens Blot (MKMTR)