18 Aquaporines een alternatieve oplossing voor de waterproblematiek

AQUAPORINES
Membraaneiwitten
die voorkomen bij
veel maar niet alle
organismen. Ze
staan in voor het
selectief transport
van water.
Aquaporine-gebaseerde membranen voor waterfiltratie
AQUAPORINES: EEN ALTERNATIEVE OPLOSSING
VOOR DE WATERPROBLEMATIEK?
Omwille van waterschaarste winnen waterhergebruik en –zuivering steeds meer aan belang. De
zoektocht naar nieuwe, verbeterde technieken voor waterzuivering blijft zo een boeiende uitdaging.
Dit onderzoek richtte zich op het ontwikkelen van een geheel nieuw materiaal voor verregaande
waterzuivering met behulp van membranen.
W
ater is van levensbelang in de wereld.
Alledaagse activiteiten zoals wassen, koken
en drinken vereisen water. Ook voor
verschillende economische activiteiten speelt water
een belangrijke rol, bijvoorbeeld proces- of koelwater
en in medische toepassingen. Gezien de toename in
verbruik per hoofd, de bevolkingsgroei en de stijgende
vervuiling van de watervoorraden neemt het belang
van waterzuivering en -hergebruik almaar toe. Het
ontwikkelen van nieuwe technieken voor het zuiveren
van water is dan ook een must.
De vereiste waterkwaliteit is afhankelijk van het doel
waarvoor het water aangewend wordt. In sommige
gevallen volstaat een basiskwaliteit, in andere dient
een verregaande zuivering te gebeuren vooraleer aan
de kwaliteitseisen voldaan is. Voorbeelden waar een
verregaande zuivering nodig is, zijn legio: het gebruik
van ultrazuiver water in de wetenschap, het
doorgedreven waterhergebruik tijdens lange
ruimtevaartmissies en de bereiding van drinkwater uit
brak water of zeewater (zie kader 1).
Dit onderzoek handelt over de ontwikkeling van een
waterzuiverend membraan en situeert zich in de
nano(bio)technologie. De biologie biedt immers de
mogelijkheid om de klassieke
membraantechnologieën voor waterzuivering nog
drastisch te verbeteren.
In biologische systemen staan kanalen en
transporteiwitten in voor het transport van bepaalde
moleculen over een biologisch membraan. Het
Figuur 1: Schematische voorstelling van
waterfiltratie op basis van waterselectieve
aquaporines. De waterstroom is van boven naar
beneden gericht. Enkel de watermoleculen
kunnen doorheen het aquaporine migreren, de
overige moleculen niet.
transport kan soms zeer snel en selectief verlopen. Het voorgestelde waterzuiverend membraan
omvat een synthetisch membraan waarin waterselectieve biologische moleculen, AQUAPORINES
genaamd, werden ingebouwd. Dit totaal nieuwe concept vormt het startpunt voor de ontwikkeling
van een waterzuiverend membraan (Figuur 1) dat hoge fluxen combineert met hoge selectiviteit.
Hiernaast toont het aangemaakt membraan voor het eerst het succesvol gebruik van een biologische
molecule in een synthetisch membraan aan. Dit nieuwe concept vormt het startpunt voor de
ontwikkeling van een waterzuiverend membraan (Figuur 1) dat hoge fluxen combineert met hoge
selectiviteit. Hiernaast toont het aangemaakt membraan het succesvol gebruik van een biologische
molecule in een synthetisch membraan aan. Ook in combinatie met andere biologische moleculen,

OVEREXPRESSIE-
CONSTRUCT
Een door de mens
aangemaakt DNAmolecule
dat zorgt
voor een sterke
productie van een
gewenst eiwit.
FILTRATIETEST
Een test waarbij
een vloeistof
doorheen een
membraan wordt
geperst om de
karakteristieken
zoals bijvoorbeeld iontransporters, biedt dit voor andere membraanscheidingen interessante
perspectieven.
Kader 1: Verregaande waterzuivering, een must voor wetenschap en techniek
Zowel in de halfgeleiderindustrie als in de farmaceutische industrie zijn ultrazuiver water, en dus
een verregaande waterzuivering, onontbeerlijk. De toepassingsdomeinen van het ultrazuiver
water lopen sterk uiteen. Waar de halfgeleiderindustrie ultrazuiver water gebruikt als
spoelmiddel, dient het in de farmaceutische industrie niet enkel als deel van het productieproces
maar ook als component van het eindproduct.
Een onderwerp dat misschien meer tot de verbeelding spreekt is de ruimtevaart. Om een
langdurig verblijf in de ruimte mogelijk te maken is de aanvoer of de recyclage van water
broodnodig. Waar de aanvoer van drinkbaar water nog tot mogelijkheden behoort voor
ruimtemissies dichter bij de aarde, is het drinken van gerecycleerde urine een conditio sine qua
non om langere ruimtevaartmissies, bijvoorbeeld naar Mars, mogelijk te maken. In het
internationaal ruimtestation, waar zich op dit moment onze landgenoot Frank De Winne bevindt,
werd in mei 2009 voor het eerst gerecycleerde urine gedronken. Het ‘Water Recovery System’
dat 250 miljoen dollar kostte zorgt voor een aanzienlijke vermindering van de hoeveelheid water
die naar het ruimtestation moet. Daarenboven verhoogt het systeem de capaciteit voor een
langdurig verblijf in het ruimtestation van drie naar zes personen [1, 2].
Overzicht vaOverzicht van het onderzoek
Het ontwerp van een waterzuiverend membraan op basis van aquaporines begint bij de keuze van
een geschikt aquaporine. Eenmaal het goede aquaporine gekozen is, is de volgende stap de aanmaak
van een OVEREXPRESSIECONSTRUCT. Dit construct staat in voor een voldoende hoge productie van
het aquaporine. De overexpressie gebeurt in een geschikte gastheer. Wanneer de parameters voor
een optimale overexpressie bepaald zijn, dient overgegaan te worden tot opzuivering van het
aquaporine uit de gastheer. Door het inbouwen van het opgezuiverde aquaporine in een polymeer
wordt vervolgens een waterzuiverend membraan bekomen. Het beoordelen van de performantie
van dit membraan gebeurt door gebruik te maken van FILTRATIETESTEN. Een overzicht van de
gevolgde stappen is weergegeven in Figuur 2.
Figuur 2: Overzicht van de gevolgde stappen in de aanmaak van een waterzuiverend membraan.
Keuze van een geschikt aquaporine
Om het waterzuiverend membraan zo selectief en efficiënt mogelijk te maken is het gebruik van de
geschikte biologische molecule noodzakelijk. In de biologische wetenschappen staan de
waterspecifieke kanalen bekend als aquaporines.
Biologische membranen vormen een barrière voor de diffusie van bepaalde moleculen in en uit
levende cellen. Transport van deze moleculen is bijgevolg een noodzakelijk proces voor cellen, dat
uitgevoerd wordt door kanalen en transporteiwitten in het celmembraan. Water daarentegen is tot
op zekere hoogte in staat om doorheen lipidedubbellagen te diffunderen en bijgevolg zijn alle
membranen gedeeltelijk waterdoorlatend. Lange tijd werd dan ook aangenomen dat eenvoudige
diffusie het enige mechanisme was voor watertransport over het celmembraan. Echter, in 1992 werd
het aquaporine 1 beschreven als het eerste moleculaire waterkanaal [3]. De uitreiking van de

HOMOLOGE
EXPRESSIE
Het tot expressie
brengen van een
organisme-eigen
eiwit in een
organisme.
Nobelprijs scheikunde van 2003 aan Peter Agre illustreert de impact van deze ontdekking op de
wetenschap.
Leden van de familie van de aquaporines zijn terug te vinden in zeer veel verschillende levensvormen
waaronder zoogdieren, amfibieën, insecten, planten en allerhande micro-organismen. Zo zijn alleen
al in de mens minstens dertien verschillende aquaporines gekarakteriseerd in verschillende organen
zoals de nieren, het oog en de hersenen.
Aquaporines zijn membraaneiwitten die gekenmerkt worden door een hoge transmembranaire
waterpermeabiliteit. De structuur van de leden van de aquaporinefamilie is gelijkaardig en leidt tot
het ontstaan van een centrale porie. Het is doorheen deze porie dat het watertransport plaatsvindt.
Niet alle aquaporines zijn echter even geschikt voor watertransport. Bepaalde leden van de familie
van de aquaporines transporteren ook andere moleculen zoals bijvoorbeeld glycerol of bepaalde
ionen. Bij de keuze van het meest geschikte aquaporine voor de inbouw in een synthetisch
membraan is het waterselectieve karakter van het aquaporine dan ook zeer belangrijk. Hiernaast zijn
de transmembranaire waterpermeabiliteit, wetenschappelijke gekendheid en produceerbaarheid
van het aquaporine-eiwit belangrijke selectiecriteria. Deze voorwaarden in acht genomen, lijkt het
aquaporine Z (AqpZ) (kader 2) van Escherichia coli het meest geschikt voor dit onderzoek.
Incorporatie van het AqpZ in een synthetisch membraan zou theoretisch instaan voor de productie
van een membraan met een extreem hoge permeabiliteit en selectiviteit.
Kader 2: AqpZ van E. coli
4 karakteristieken van AqpZ van E. coli (Figuur 3) maken het eiwit de geschikte kandidaat voor de
aanmaak van een waterzuiverend membraan:
1. Waterselectiviteit: verschillende studies hebben aangetoond dat AqpZ, in tegenstelling tot
een aantal andere aquaporines, een zeer selectief waterkanaal is. Transport van ionen en
moleculen zoals ureum, glycerol en sucrose werd niet waargenomen [4].
2. Waterpermeabiliteit: de osmotische waterpermeabiliteit of het volume water dat bij een
gegeven osmotische druk per tijdseenheid doorheen het kanaal migreert, is zeer hoog [4].
3. Wetenschappelijke gekendheid: het AqpZ van E. coli is reeds het onderwerp geweest van tal
van wetenschappelijke studies.
4. Produceerbaarheid: de mogelijkheid tot HOMOLOGE EXPRESSIE van het AqpZ van E. coli in E.
coli biedt interessante perspectieven voor de eiwitproductie.
Figuur 3: ‘Cartoon’-voorstelling van AqpZ van E. coli in zij-aanzicht. De figuur toont de positionering van
het AqpZ in de binnenste membraan van de gram-negatieve bacterie E. coli. De acht α-helices die instaan
voor het ontstaan van de centrale porie (M1-M8) zijn weergegeven. De twee grijstinten geven de
tweevoudige symmetrie van het eiwit weer.

GEÏMMOB.
METAAL-
AFFINITEITS-
CHROMATOGRAFIE
Een methode voor
het scheiden van
mengsels op basis
van de specifieke
interactie van
bepaalde
aminozuren met
metaalionen.
‘POLYMERASE
CHAIN REACTION’
Een moleculaire
techniek om een
klein aantal DNAmoleculen
sterk te
vermenigvuldigen.
Aanmaak van een overexpressieconstruct
Overexpressie van een eiwit is een ideale manier om een bepaald eiwit in voldoende hoeveelheid te
bekomen. De aanmaak van een overexpressieconstruct is de eerste stap in de overexpressie. In deze
stap worden de DNA-sequentie van het op te zuiveren eiwit en de DNA-sequentie van een
affiniteitslabel voor opzuivering samengebracht achter een geschikte promotor.
Overexpressie van aqpZ van E. coli werd in de literatuur reeds beschreven. De gebruikte
overexpressieconstructen zorgden telkens voor de aanwezigheid van een histidinelabel zodat de
opzuivering na overexpressie kon gebeuren via GEÏMMOBILISEERDE
METAALAFFINITEITSCHROMATOGRAFIE [5].
In dit onderzoek werd echter gebruik gemaakt van het ‘Flexi® system’ (Promega). Het aangemaakte
overexpressieconstruct, pCMPG9442 genaamd, voorziet het AqpZ van een N-terminale Halotag TM (zie
kader 3). Deze Halotag TM maakt de opzuivering van het AqpZ met behulp van een Halolink TM -matrix
mogelijk.
Kader 3: pCMPG9442, een overexpressieconstruct voor aanmaak van AqpZ van E. coli
Voor de aanmaak van pCMPG9442, het gebruikte overexpressieconstruct (Figuur 4), werd de
coderende sequentie van aqpZ van E. coli met een ‘POLYMERASE CHAIN REACTION’ (PCR)
geamplificeerd. Na opzuivering van het PCR-product werden het PCR-product en een Flexi®vector,
pFN18K, geknipt met de ‘Flexi® enzyme blend’. Het bekomen ‘insert’ en de vector werden
geligeerd. Het resultaat is pCMPG9442, een overexpressieconstruct waarbij het aqpZ-gen Cterminaal
van de Halotag is gekloneerd. De expressie staat onder controle van een T7 RNApolymerase
afhankelijke promotor.
Figuur 4: Schematische weergave van pCMPG9442. pCMPG9442 is een afgeleide van de Flexi®-vector
pFN18K. Het aqpZ-gen is C-terminaal gekloneerd van de Halotag TM . Een T7 RNA-polymerase afhankelijke
promotor staat in voor de aanmaak van het eiwit. Een knipplaats voor het TEV-protease (EDLYFQS) zorgt
dat het AqpZ geïsoleerd kan worden van de Halotag TM .

LYSOZYME
Enzymfamilie die de
afbraak van de
bacteriële celwand
katalyseert.
SONICATIE
Het gebruik van
geluidsenergie voor
het openbreken van
cellen.
Overexpressie van het aquaporine
Het overbrengen van het overexpressieconstruct naar een geschikte gastheer is de volgende stap in
de overexpressie. Voor het tot overexpressie brengen van een bacterieel eiwit is E. coli vaak een
interessant systeem. E. coli is vaak gebruikt omwille van zijn eenvoud, cultivatie tot hoge celdensiteit,
gekende genetica en compatibiliteit met vele beschikbare werktuigen uit de biotechnologie [6].
Het overexpressieconstruct werd getransformeerd naar E. coli KRX, een stam waarbij de aanmaak
van het T7 RNA-polymerase, benodigd voor de aanmaak van het aquaporine, kan geïnduceerd
worden door toevoeging van rhamnose.
Opzuivering van het aquaporine
Na de overexpressie bevindt het aangemaakte eiwit (Halotag TM + aquaporine) zich in de
binnenmembraan van de E. coli cellen. De opzuivering staat in voor de isolatie van het aquaporine uit
deze complexe omgeving en steunt op de interactie tussen de Halotag TM en een Halolink TM -matrix.
Toevoeging van het TEV-protease knipt het aquaporine los van de Halotag TM , dat zelf gebonden blijft
aan de Halolink TM -matrix. Kader 4 gaat dieper in op de technische details van de opzuivering.
Kader 4: De opzuivering van AqpZ van E. coli met de Halotag TM -technologie
Een overexpressiecultuur van E. coli werd gelyseerd door toevoeging van LYSOZYME en
vervolgens gesoniceerd. Na SONICATIE werd het cellysaat gecentrifugeerd en de bekomen
celpellet geëxtraheerd met een buffer met een detergent. Na centrifugatie werd het supernatans
toegevoegd aan een Halolink TM -matrix. Gedurende de hieropvolgende incubatie ontstond een
covalente binding tussen de met het aquaporine verbonden Halotag TM enerzijds en de Halolink TM -
matrix anderzijds (Figuur 5). Na een aantal wasstappen werd het TEV-protease toegevoegd,
waarvoor een knipplaats aanwezig was tussen het aquaporine en de Halotag TM . Het AqpZ van E.
coli werd opgevangen in het eluaat.
Figuur 5: Moleculair model van A) de interactie tussen de Halotag TM met een Halotag TM ligand en B) de
Halolink TM -matrix. A) Rechts is de eiwitstructuur van de Halotag TM weergegeven waaraan het Halotag TM
ligand covalent gebonden is. De covalente binding is uitvergroot links onderaan en toont de binding van het
ligand aan een aspartaat nucleofiel. B) In de Halolink TM -matrix is het ligand hetzelfde als in A) maar is dit
gebonden op een Sepharose®-drager [7, 8].

RETENTIE
De verhouding van
de concentratie
opgeloste stof in
het permeaat en in
de voedingstroom
tijdens een
filtratie.
Inbouw van het opgezuiverde aquaporine in een membraan
De laatste stap voor het bekomen van een waterzuiverend membraan is de inbouw van het
opgezuiverde AqpZ in een synthetisch membraan. Het AqpZ werd hiertoe gebruikt als hydrofiele
vuller in een eveneens hydrofiele polyvinylalcoholmatrix (PVA) (Figuur 6). Het AqpZ staat in voor een
verhoging van de waterpermeabiliteit en dit op zeer selectieve wijze. Een steunlaag voorziet het
dunne membraan van voldoende stevigheid. De resultaten van de filtratietesten (kader 5) tonen aan
dat een waterzuiverend membraan werd bekomen waarvan de permeabiliteit een factor 3 tot 4
verhoogd was en de RETENTIE even hoog bleef als in controlemembranen.
Figuur 6: AqpZ in een PVA-matrix bovenop een steunlaag. Schematische voorstelling van een synthetisch
membraan met AqpZ als hydrofiele vuller in een PVA-matrix. Een poreuze steunlaag voorziet het geheel van
stevigheid.
Wat brengt de toekomst?
De succesvolle opzuivering op basis van de Halotag TM -technologie was een eerste stap in de goede
richting. Het in de toekomst economisch haalbaar maken van het voorgestelde concept vergt echter
het opzetten van een geslaagde opzuiveringsprocedure op basis van de veel goedkopere
geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. Dergelijke procedure is reeds beschreven in de
literatuur en op het einde van dit onderzoek werd ook een gelijkaardige procedure succesvol
ontwikkeld. Het voordeel van de geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie is zowel de
lagere kostprijs van de matrix als de regenereerbaarheid van de matrix hetgeen de kostprijs nog
verder drukt.
In het kader van de aanmaak van de waterzuiverende membraan zijn nog verschillende
optimalisaties mogelijk. Zo kan de concentratie AqpZ in de PVA-matrix verder geoptimaliseerd
worden. Een vervanging van de PVA-matrix door een ander polymeer behoort ook tot de
mogelijkheden, evenals het gebruik van een ander type steunlaag.
Ook de productie van systemen die nog korter bij de natuurlijke oorsprong aanleunen en dus
vermoedelijk nog performanter zullen zijn, is mogelijk. Het inbrengen van een aquaporine in
lipidedubbellagen die bovenop een poreuze steunlaag aangebracht kunnen worden, is bijvoorbeeld
één van de opties.
Tot slot biedt de aanmaak van een waterzuiverend membraan waarbij de selectiviteit ontstaat door
het gebruik van het AqpZ van E. coli niet enkel interessante perspectieven voor waterzuivering maar
ook voor andere membraanscheidingen. Naast aquaporinen heeft de natuur immers nog een hele
waaier aan specifieke transporteiwitten met hoge selectiviteit in petto.

CDe
permeabiliteit van de membranen werd berekend na filtratie van gedestilleerd water (Figuur
7). Drie aangemaakte waterzuiverende membranen werden vergeleken met 3
ocontrolemembranen
waarbij in de PVA-matrix geen aquaporines aanwezig waren. De
npermeabiliteit
van de waterzuiverende membranen na het tot evenwicht komen van de
membraanflux was voor alle drie de membranen hoger dan die van de controlemembranen. De
c
retentie na filtratie van een Bengaal roos oplossing was gelijkaardig aan die van de
l controlemembranen voor twee van de drie membranen (Tabel 1). De lagere retentie in het derde
umembraan
(AqpZ-PVA-2) wijst mogelijk op de aanwezigheid van defecten. De sterke verhoging
van de permeabiliteit in AqpZ-PVA-1 in vergelijking met de controlemembranen samen met het
sbehoud
van de retentie doen vermoeden dat de verhoogde permeabiliteit in dit membraan wel
i degelijk het gevolg is van een goede incorporatie van het selectieve AqpZ. Deze resultaten
werden in bijkomende proeven reeds bevestigd met meerdere membranen (niet gepubliceerde
e
resultaten).
I
n
d
i
t
Kader 5: Resultaten filtratietesten
o
n
d
e
r
z Figuur 7: Hoge doorvoer filtratietoestel voor drukgedreven filtraties. Het boven- (links) en het zij-aanzicht
o(rechts)
zijn weergegeven. Dergelijk performante hoge-doorvoer toestellen voor filtraties zijn enkel aan de
e K.U.Leuven beschikbaar, als gevolg van eerdere ontwikkelingen,
k
Tabel 1: Permeabiliteit en retentie van waterzuiverende en controlemembranen. De permeabiliteit (l.m-
2.h-1.bar-1) van de membranen na het tot evenwicht komen van de membraanflux is weergegeven. Ook de
w
retentie (%) van de membranen is weergegeven.
e
r
AqpZ-PVA-1 AqpZ-PVA-2 AqpZ-PVA-3 PVA
d
Permeabiliteit 0,14 0,14 0,06 0,04
Retentie 99,3 94,5 99,1 99,8
h
Conclusie
In dit onderzoek werd het AqpZ van E. coli succesvol opgezuiverd, gebruik makend van de Halotag TM -
technologie. Het opgezuiverde AqpZ van E. coli werd gebruikt als hydrofiele vuller zodat een
waterzuiverend membraan gevormd werd met een verhoogde permeabiliteit en gelijkaardige
retentie ten opzichte van controlemembranen. Dit onderzoek toont voor de eerste keer het gebruik
aan van een biologische molecule als vuller in een synthetisch membraan en staat zo mogelijk aan
het begin van een heel nieuw domein in de membraantechnologie. Dit onderzoek toont het gebruik
aan van een biologische molecule als vuller in een synthetisch membraan en staat zo mee aan het
begin van een heel nieuw domein in de membraantechnologie

Referenties
[1] www.water-technology.net, geconsulteerd op 17/09/2009
[2] www.deredactie.be, geconsulteerd op 17/09/2009
[3] Preston, G. M., Carroll, T. P., Guggino, W. B., and Agre, P. (1992). Appearance of water
channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein, Science 256, 385-387.
[4] Borgnia, M. J., Kozono, D., Calamita, G., Maloney, P. C. en Agre, P. Functional reconstitution
and characterization of AqpZ, the E. coli water channel protein. The Journal of Molecular Biology,
1999. 291: 1169-1179.
[5] Mohanty, A. K. en Wiener, M. C. Membrane protein expression and production: effects of
polyhistidine tag length and position. Protein Expression and Purification, 2004. 33: 311-325.
[6] Sorensen, H. P. en Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein
expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology, 2005. 115: 113-128.
[7] Los, G. V. et al. Halotag interchangeable labeling technology for cell imaging and protein
capture. Cell notes, 2005. 11: 2-6
[8] www.promega.com, geconsulteerd op 23/03/2009
Dankwoord
De auteur dankt zijn promotor prof. dr. ir. I. Vankelecom (Centrum voor Oppervlaktechemie en
Katalyse, K.U.Leuven) en prof. dr. ir. J. Vanderleyden (Centrum voor Microbiële en Plantengenetica,
K.U.Leuven) voor het mogelijk maken van dit eindwerk en dr. ir. M. Van Guyse voor de
wetenschappelijke begeleiding.
De auteur
Toon Nicolay studeerde in 2009 af aan de K.U.Leuven als Master in de bio-ingenieurswetenschappen:
cel- en genbiotechnologie. Hij promoveerde met de masterproef ‘Aquaporine-gebaseerde
membranen voor waterfiltratie’. De auteur doctoreert nu aan de faculteit Bioingenieurswetenschappen
waar hij werkt aan het proefschrift ‘…’.