B ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA ... - BD

B ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP)
Amplified DNA Assay
Amerikanske patentnr. 5,270,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,311; 5,846,726; 5,851,767;
5,866,336; 5,919,630; 5,928,869; 5,958,700; 6,054,279; 6,090,552; 6,117,635;
6,251,609; 6,316,200; 6,656,680; 6,743,582.
Se liste over symboler nederst i bilaget.
BRUKSOMRÅDE
BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay, til bruk med BD ProbeTec ET System,
bruker SDA-teknologi (trådforskyvningsamplifisering) for direkte, kvalitativ påvisning av Legionella
pneumophila-DNA (serogrupper 1 – 14) i spyttprøver fra pasienter med klinisk mistanke om pneumoni.
Den er ment til hjelp i diagnostikk av legionærsyke sammen med dyrkning og andre metoder.
SAMMENDRAG OG FORKLARING
U
8010960
2006/04
Legionærsyken kan man pådra seg ved inhalering av aerosoler som inneholder Legionella eller ved
mikroaspirasjon av forurenset vann. I studier fra Europa og Nord-Amerika, er det rapportert at Legionella
forårsaker 2 – 15 % av tilfellene av pneumoni i befolkningen (CAP) som krever sykehusinnlegging.
Dødelighetsraten for pasienter med legionellose er 5 – 30 %, hvor eldre eller pasienter med svekket
immunforsvar har større risiko for død. 1 Førti forskjellige Legionella-arter er identifisert, halvparten av
disse er knyttet til sykdom hos mennesker. Legionella pneumophila forårsaker 90 % av alle diagnostiserte
kasus av legionellose. Selv om fjorten serogrupper av L. pneumophila er kjent, er 80 % av L. pneumophilainfeksjoner
forårsaket av serogruppe 1. 2
Det er viktig å stille diagnosen pneumoni og avklare etiologien, ikke minst på grunn av økende bekymring
for overforbruk av antibiotika. Diagnostiske resultater for L. pneumophila må være tilgjengelige for
legen raskt, fordi det er vist at dødeligheten øker dersom adekvat behandling forsinkes. Tradisjonelle
dyrkningsmetoder tar minimum to dager for å dyrke Legionella-organismer fra positive spyttprøver og
totalt sju til ti dager for å fastslå et negativt resultat. Som et tillegg til dyrkning, er enzymimmunanalysekit
kommersielt tilgjengelige for påvisning av antistoffer fra L. pneumophila serogruppe 1 i urinprøver. 3
Imidlertid er det fortsatt begrenset med diagnostiske tester for legionellainfekjsoner som gir raske
resultater med god sensitivitet og spesifisitet.
PRINSIPPER FOR PROSEDYREN
BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay er basert på samtidig amplifisering
og påvisning av mål-DNA ved hjelp av amplifiseringsprimere og fluorescensmerket detektorprobe.
SDA-reagensene blir tørket i to separate, engangsmikrobrønner. Den behandlede prøven tilføres i
priming-brønnen som inneholder amplifiseringsprimerne, fluorescensmerket detektorprobe og andre
reagenser som er nødvendige for amplifiseringen. Primerne amplifiserer et 68-basepar-område av
det L. pneumophilas-makrofaginfeksiøse potensiatorgenet (mip), som er bevart i alle serogrupper
av legionella. Etter inkubasjon blir reaksjonsblandingen overført til amplifiseringsbrønnen, som
inneholder to enzymer (en DNA-polymerase og en restriksjonsendonuklease) som er nødvendige
for SDA. Amplifiseringsbrønnene blir forseglet for å hindre kontaminering og deretter inkubert i en
temperaturregulert, fluorescensavleser som overvåker hver reaksjon med hensyn til produksjon av
amplifiserte produkter. Hver reaksjon koamplifiserer og påviser en intern amplifiseringskontroll (IAC).
Hensikten med denne er å bekrefte at adekvate forhold for amplifisering er til stede og for å redusere
muligheten for å rapportere et falsk negativt resultat på grunn av tilstedeværelse av analysehemmere.
Tilstedeværelse eller fravær av L. pneumophilia-familie-DNA bestemmes ved å beregne PAT-verdi (Passes
After Threshold) for prøver basert på forutbestemte terskelverdier. Instrumentet rapporterer automatisk
resultater som positive, negative eller ubestemte.
Norsk
REAGENSER OG MATERIALER
Hver BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay-reagenspakke inneholder:
Legionella pneumophila (LP) priming-brønner, (1 x 24)
6 Oligonukleotider ≥ 7,5 pmol, dNTP ≥ 15,2 nmol, 2 detektorprober ≥ 22,5 pmol
Syntetisk oligonukleotid ≥ 1 500 kopier
Legionella pneumophila (LP) amplifiseringsbrønner, (1 x 24)
Restriksjonsenzym: ≥ 33 enheter, DNA-polymerase ≥ 14 enheter
10 priming-deksler, 16 selvklebende forseglere (1/2), 8 avfallsposer
BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF*/LP/MP**):
Innhold: Respiratory and Media Diluent: Bicin, natriumfosfat, natriumhydroksid, DMSO og Proclin;
10 (CF/LP/MP) positive kontroller: ≥ 1 050 ng laksesperm-DNA, ≥ 47,3 µg Tris, ≥ 9,0 µg EDTA, ≥ 3 600 kopier
CF-plasmid, ≥ 4 800 kopier LP-plasmid, ≥ 5 400 kopier MP-plasmid; 10 (CF/LP/MP) negative kontroller:
≥ 1 050 ng laksesperm-DNA, ≥ 47,3 µg Tris, ≥ 9,0 µg EDTA; 100 2-mL rør med lokk
* Refererer til BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay
** Refererer til BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay

Instrument, utstyr og forbruksvarer: BD ProbeTec ET Instrument and Instrument Plate (instrument og
instrumentbrett), BD ProbeTec ET Lysing Heater (lysator), BD ProbeTec ET Priming & Warming Heater,
BD ProbeTec ET Pipettor (pipette), stativ og Power Supply (strømforsyning), 2 mL stativ for prøverør,
BD ProbeTec ET Accessories Kit (tilbehørskit), BD ProbeTec ET Pipette Tips (pipettespisser).
Nødvendige materialer som ikke følger med: Klasse II biologisk sikkerhetskabinett (BSC), vortexmixer,
-20 °C og/eller -70 °C (eller kaldere) stabil ikke-temperaturs-syklusfryser, mikrosentrifuge som klarer
16 000 x g, vannbad, digitalt termometer, vannbadsstativ med påskrudd lokk, annet passende
stativ for prøverør, QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kits, 96 – 100 % etanol, BBL CultureSwab EZ
Swabs, BD ProbeTec ET 2 mL prøverør og lokk, engangshansker, alkoholbestandige markeringstusjer,
mikropipeetter som kan levere volum på 25 – 1 000 µL, aerosolresistente pipettespisser, destillert vann, L.
pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1), bovint albumin (fraksjon V) 0,2 % (w/v) i 0,85 % (w/v) saltvann,
1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconox.*
*Løs opp 7,5 g Alconox i 1 L 1 % (v/v) natriumhypoklorittoppløsning og bland. Lages nytt daglig.
Oppbevarings- og håndteringsanvisninger: BD ProbeTec ET LP-reagenspakker kan oppbevares
ved 2 − 33 °C. Uåpnede reagenspakker skal ikke brukes etter utløpsdato. Når en pose er åpnet, er
mikrobrønnene stabile i 12 uker hvis de er ordentlig forseglet eller til utløpsdatoen, ettersom hva som
kommer først. Skal ikke fryses.
BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP) kan oppbevares ved 2 − 33 °C.
Reagensene skal ikke brukes etter utløpsdato. Skal ikke fryses.
Advarsler og forsiktighetsregler:
Til in vitro-diagnostisk bruk.
1. Patogene mikroorganismer, blant annet hepatittvirus og humant immunsviktvirus, kan være til stede
i kliniske prøver. ”Standard forsiktighetsregler” 4-7 og institusjonelle retningslinjer skal følges ved
håndtering av alt materiale kontaminert med blod og andre kroppsvæsker.
2. Håndtering og behandling av prøver fra nedre luftveier forut for inkubering ved 70 °C, skal foretas i et
klasse II biologisk sikkerhetskabinett.
3. Under trinnet med inkubering ved 70 °C, bruk et vannbadsstativ med skrulokk for å sørge for ekstra
isolering av potensielt smittefarlige prøver fra nedre luftveier.
4. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent inneholder dimetylsvoveloksid (DMSO). DMSO er
skadelig ved innånding, hudkontakt eller svelging. Unngå kontakt med øynene, og bruk alltid hansker
ved håndtering. Dersom det kommer i kontakt med øynene, skyllumiddelbart med rikelige mengder
vann i åpne øyne, og søk medisinsk hjelp hvis symptomene vedvarer. Dersom det kommer i kontakt
med huden, vask umiddelbart med rikelige mengder såpe og vann.
5. Se håndboken for QIAamp DNA Stool Mini Kit for sikkerhetsinformasjon om QIAGEN-reagenser
som brukes i denne prosedyren. Ikke legg QIAGEN-reagenser i blekemiddeloppløsninger. Utsett ikke
QIAGEN-reagenser for blekemidler.
6. Det har forekommet rapporter som antyder at QIAGEN DNA-ekstraksjonskit ikke er egnet for
Legionella-PCR (polymerasekjedereaksjon) på grunn av muligheten for at reagensene er kontaminert
med Legionella-DNA. 8,9 Selv om sannsynligheten for dette er lav, og andre Legionella-arter enn
L. pneumophila ble identifisert i disse studiene, skal brukere kontrollere ytelsen til hver ny levering av
QIAGEN-reagenser før de brukes på pasientprøver.
7. Selv om egne arbeidsområder ikke er nødvendig fordi BD ProbeTec ETs design reduserer muligheten
for ampliconkontaminering i testomgivelsene, er det nødvendig med andre forholdsregler for å
kontrollere kontamineringen, særlig for å hindre kontaminering under prosessen.
8. Reagensposer som inneholder ubrukte priming-brønner og amplifiseringsbrønner MÅ forsegles godt
igjen etter åpning. Kontroller at en tørkepose er til stede før reagensposen forsegles på nytt.
9. Platen som inneholder amplifiseringsbrønner, MÅ forsegles ordentlig med den selvklebende
forseglingen før platen flyttes fra BD ProbeTec ET Priming & Warming Heater til BD ProbeTec
ET Instrument. Forseglingen sørger for en lukket reaksjon for amplifiseringen og påvisning,
og er nødvendig for å unngå kontaminering av instrumentet og arbeidsområdet med
amplifiseringsprodukter. Forseglingen skal ikke på noe tidspunkt fjernes fra mikrobrønnene.
10. Priming-brønner med gjenværende væske (etter overføring av væske fra priming-brønnene til
amplifiseringsbrønnene) utgjør en kilde til målkontaminering. Forsegl priming-brønnene godt med
den selvklebende platen før de kastes.
11. For å forhindrekontaminering av arbeidsområdet med amplifiseringsprodukter, bruk avfallsposene
som leveres i reagenspakken ved kasting av testede amplifiseringsbrønner. Pass på at posene er godt
lukket før de kastes.
12. SKIFT HANSKER ved spesifiserte trinn under behandling av prøvene og analyseprosedyren for å unngå
krysskontaminering av prøver. Hvis hansker kommer i kontakt med prøven, skal hanskene straks skiftes
for å hindre kontaminering av andre prøver.
13. I tilfelle kontaminering av arbeidsområdet eller utstyret med prøver eller kontroller, rengjør
det kontaminerte området grundig med 1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconox og skyll
grundig med vann. La overflaten tørke fullstendig før videre testing. Før fjerning av noen
QIAGEN-prøveprosessreagenser, tørk av alle affiserte områder med vann før bruk av 1 % (v/v)
natriumhypoklorittoppløsning som inneholder Alconox.
14. Bruk bare BD ProbeTec ET Pipettor og BD ProbeTec ET Pipette-spisser til overføring av
behandlede prøver til priming-brønnene og overføring av prøvene fra priming-brønnene til
amplifiseringsbrønnene.
2

15. Følg etablert laboratoriepraksis når brukte pipetter, prøverør, priming-brønner og annet
engangsutstyr skal kasseres. Kasser engangsutstyr forsvarlig. Forsegl og kast avfallsbeholdere når de er
¾ fulle eller daglig (det som skjer først).
16. Ikke bland eller bytt mikrobrønner, kontroller eller behandlingsreagenser fra kit med forskjellige
partinumre (lot).
17. Kontakt den lokale BD-representanten i tilfelle en uvanlig situasjon, slik som søl i BD ProbeTec ETinstrumentet
eller DNA-kontaminering som ikke kan fjernes ved rengjøring.
PRØVETAKING OG TRANSPORT
1. Prøveinnsamling
Prøver skal samles inn som anbefalt av Clinical Microbiology Procedures Handbook10 eller ditt
laboratoriums prosedyrehåndbok.
2. Oppbevaring og transport av prøver
• Prøvene kan oppbevares/transporteres ved 18 − 33 °C i maksimalt 6 timer.
• Prøver kan kjøles ned ved 2 − 8 °C i maksimalt 3 dager.
• Prøver kan oppbevares ved -20 °C eller lavere i maksimalt 14 uker.
TESTPROSEDYRE
Se brukerhåndboken for BD ProbeTec ET System for spesifikke anvisninger om bruk og vedlikehold av
systemkomponentene.
A. Forberedelse av instrumentene:
1. Strømmen må være slått på og instrumentene må få tid til å varmes opp før analysen starter.
a. Priming & Warming Heater trenger omtrent 90 min til oppvarming og stabilisering.
Settpunktet for priming-komponenten i Priming & Warming Heater er 72,5 °C.
Settpunktet for varmekomponenten i Priming & Warming Heater er 54 °C.
b. BD ProbeTec ET-instrumentet er under programvarekontroll og trenger omlag 30 min. til
oppvarming.
2. Temperaturen på varmere må kontrolleres før målingen starter. Noter temperaturene i BD ProbeTec ET
System Maintenance Log (systemvedlikeholdslogg).
a. Priming & Warming Heater
Priming Heater-termometeret skal vise mellom 72 og 73 °C.
Warming Heater-termometeret skal vise mellom 53,5 og 54,5 °C.
3. Kontroller temperaturen som vises på skjermen på BD ProbeTec ET. Temperaturen skal være
mellom 47,5 og 55,0 °C. Noter temperaturene i BD ProbeTec ET System Maintenance Log
(systemvedlikeholdslogg).
B. Pipettor:
Se brukerhåndboken for BD ProbeTec ET System for å få detaljert forklaring av tastaturfunksjonene
på BD ProbeTec ET Pipettor. I tillegg må BD ProbeTec ET Pipettor rengjøres etter hver bruk. Kontakt
den lokale BD-representanten for veiledning om hvordan BD ProbeTec ET Pipettor skal rengjøres og
vedlikeholdes.
Følgende programmer er nødvendige for å utføre BD ProbeTec ET LP Assay. Program 1 overfører væske fra
de behandlede prøvene til LP-priming-brønnene. Program 5 overfører væske fra LP-priming-brønner til
LP-amplifiseringsbrønner. Programmer pipetten som følger:
Program 1:
1. Slå PÅ pipetten. Pipetten piper en gang, blinker ”ZERO”, blinker Software Version #
(programvareversjonsnr.) og piper en gang til.
2. Trykk på den blå ”Prog”-knappen (program). Trykk på ”Vol”-knappen (volum) til ”1” vises på skjermen
for å velge program 1. Trykk på ”Enter”.
3. Gå inn i programmeringsmodus ved å trykke på og holde ”Prog”-knappen inne. Mens du trykker på
”Prog”-knappen, trykk samtidig på spesialfunksjonsknappen med en pipettespiss eller enden på en
binders.
4. Trykk på ”Fill” (fyll). Trykk på pil opp inntil 200 vises på skjermen. Trykk på ”Enter”.
5. Trykk på ”Disp” (dispenser). Trykk på pil opp inntil 150 vises på skjermen. Trykk på ”Enter”.
6. Trykk en gang til på ”Enter” for å lagre programmet og avslutte. Da skal du høre et pip som indikerer
at programmeringen er fullført.
7. Kontroller programmet ved å trykke på utløserknappen for å gå gjennom hvert trinn. Mens du
går gjennom hvert trinn, sett farten på aspirasjon/fylling med ”Vol”-knappen. Ved hvert trinn vil
fartsindikatoren vises. Bruk ”Vol”-knappen til å justere fartsindikatoren til å vise 2 firkanter for ”Fill”og
”Disp”-trinnene.
Program 5:
1. Trykk på ”Prog”-knappen. Trykk på ”Vol”-knappen til ”5” vises på skjermen for å velge program 5.
Trykk på “Enter”.
2. Gå inn i programmeringsmodus ved å trykke på og holde ”Prog”-knappen inne. Mens du trykker på
”Prog”-knappen, trykk samtidig på spesialfunksjonsknappen med en pipettespiss eller enden på en
binders.
3

3. Trykk på ”Fill” (fyll). Trykk på pil opp inntil 100 vises på skjermen. Trykk på ”Enter”.
4. Trykk på ”Disp”. Trykk på pil opp inntil 100 vises på skjermen. Trykk på ”Enter”.
5. Trykk på ”Mix” (bland). Trykk på pil opp inntil 50 vises på skjermen. Trykk på ”Enter”.
6. Trykk en gang til på ”Enter” for å lagre programmet og avslutte. Da skal du høre et pip som indikerer
at programmeringen er fullført.
7. Kontroller programmet ved å trykke på utløserknappen for å gå gjennom hvert trinn. Mens du går
gjennom hvert trinn, sett farten på aspirasjon/fylling/blanding med ”Vol”-knappen. Ved hvert trinn
vil fartsindikatoren vises. Bruk ”Vol”-knappen til å justere fartsindikatoren til å vise 2 firkanter for
aspirasjons- og dispenseringsfunksjonene. Bruk ”Vol”-knappen til å justere farten på blandingen så
den viser 3 firkanter.
Programgjennomgang
Programmene skal gjennomgås før prosedyren startes. Gå gjennom programmet ved å skru PÅ
pipetten. Trykk på den blå ”Prog”-knappen (program). Trykk på ”Vol”-knappen (volum) til det riktige
programnummeret (1 eller 5) vises. Trykk på ”Enter”-knappen. Bruk pipetteutløseren til å gå gjennom
programmet skritt for skritt.
Program 1: Dette programmet aspirerer 200 µL, og dispenserer 150 µL i LP-mikrobrønnen. Pipettorskjermen
skal vise følgende:
Fill 200 µL – S II
Dispense 150 µL – S II
Program 5: Dette programmet aspirerer 100 µL; fyller 100 µL; og mikser 50 µL tre ganger. Pipettorskjermen
skal vise følgende:
Fill 100 µL – S II
Dispense 100 µL – S II
Mix 50 µL – S III
Zero (blinker av og på)
C. Plate Layout
Rapport om layout på platen blir generert fra BD ProbeTec ET-instrumentet etter at analysetype,
identifikasjon av prøver, kontrollpartinumre (lot) og kitpartinumre (lot) er logget inn i systemet.
Platelayoutrapporten viser den fysiske layouten til prøver og kontroller for hver plate som skal testes.
Denne organiseringen brukes både i priming-platen og amplifiseringsplaten. For LP-analysen er Primingbrønnene
ensfarget grå stripser med brønner. Amplifiseringsbrønnene er grå stripete stripser med
brønner.
D: Behandling av prøver fra nedre luftveier:
Notater om prosedyren:
• Se håndboken for QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kit for viktig informasjon om prosedyren og
forholdsregler før oppstart.
• Fyll et vannbad med destillert vann og varm opp til 70 °C (± 5 °C) før behandling av prøvene starter.
• Bruk alkoholresistente tusjer til å merke beholdere og rør.
• Skift pipettespiss mellom alle væskeoverføringer. Det anbefales å bruke aerosol-barrierespisser.
• La BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) komme til romtemperatur og bland ved å
snu den forsiktig før bruk.
• Fyll nødvendig mengde BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) i en ren beholder.
For å vurdere mengden som trengs, bruk 0,4 mL til hver prøve og legg til 1 – 2 mL ekstra for lettere
pipettering. Unngå kontaminering av Diluent ved å la være å helle tiloversbliven væske tilbake på
flasken.
1. Klargjør QIAGEN-reagenser ( se ”Preparation of Reagents” (klargjøring av reagenser) i håndboken for
QIAmp DNA Stool Mini Kit).
2. La prøvene nå romtemperatur.
3. Merk et 2 mL rør med lokk for hver prøve som skal testes.
Følgende trinn skal gjøres i et biologisk sikkerhetskabinett (BSC):
4. Pulsvortex prøvene i 5 – 15 s for å blande godt.
5. Pipetter 350 µL av prøven i det merkede røret.
MERK: Spyttprøver kan det være vanskelig å pipettere nøyaktig. Dersom dette skjer, bruk graderingene på
siden av røret som hjelp til å sikre at røret tilføres riktig volum. Alternativt, bruk et rør hvor det er tilsatt
350 mL vann som en veiledning.
6. SKIFT HANSKER etter tilsetting av prøver.
7. Pipetter 150 µL QIAGEN ASL-buffer i hvert prøverør.
8. Pipetter 25 µL QIAGEN Proteinase K i hvert prøverør.
9. Pipetter 500 µL QIAGEN AL-lyseringsbuffer i hvert prøverør.
10. Sett lokk på hvert rør og pulsvortex i 5 s. Plasser rørene i et vannbadsstativ med skrulokk.
Følgende trinn kan gjøres utenfor et biologisk sikkerhetskabinett (BSC):
11. Inkuber rørene i vannbad ved 70 °C (± 5 °C) i 15 min.
4

12. Etter 15 min, fjern rørene fra vannbadet og sentrifuger (16 000 x g ) i omtrent 5 s.
13. Fjern rørene fra sentrifugen. Åpne hvert rør og tilsett 500 µL 96 – 100 % etanol.
14. Sett korken på igjen, og pulsvortex i 5 s.
15. Sentrifuger prøvene (16 000 x g) i om lag 5 s.
16. Merk en QIAGEN-sentrifugeringskolonne og oppsamlingsrør for hver prøve.
17. Overfør 700 µL prøve til den riktig merkede QIAGEN-sentrifugeringskolonnen.
18. Sentrifuger rørene (16 000 x g) i 1 min.
19. Overfør kolonnene til nye QIAamp-oppsamlingsrør. Kast rørene som inneholder filtrat.
20. Overfør forsiktig 700 µL mer av prøven til den riktige kolonnen.
21. Sentrifuger rørene (16 000 x g) i 1 min.
22. Overfør kolonnene til rene QIAamp-oppsamlingsrør. Kast rørene som inneholder filtrat.
23. Åpne QIAmp-kolonnene og tilsett 500 µL QIAGEN AW1-vaskebuffer i hver.
24. Sentrifuger rørene (16 000 x g) i 1 min.
25. Overfør kolonnene til nye QIAamp-oppsamlingsrør. Kast rørene som inneholder filtrat.
26. Åpne QIAmp-kolonnene og tilsett 500 µL QIAGEN AW2-vaskebuffer i hver.
27. Sentrifuger rørene (16 000 x g) i 3 min.
28. Overfør kolonnene til endelig merkede QIAmp-oppsamlingsrør. Kast rørene som inneholder filtrat.
MERK: Oppsamlingsrørene skal være merket på dette stadiet.
MERK: Pass på at det ikke er igjen noe væske i bunnen av kolonnen. Dersom gjenværende vaskemiddel
overføres til rørene, kan det påvirke resultatene.
29. Åpne kolonnene og tilsett 225 µL QIAGEN AE-elusjonsbuffer i hver.
30. Inkuber ved romtemperatur i 1 min.
31. Sentrifuger rørene (16 000 x g) i 1 min.
32. Kast kolonnene.
33. Merk et 2 mL rør med skrukork for hver prøve.
34. Overfør 400 µL Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) til hvert prøverør med skrukork.
MERK: Fyll et vannbad med destillert vann, og bring det til kokepunktet før bruk i trinn 38.
35. Overfør 200 µL av oppløsningen til det riktig merkede røret som inneholder 400 µL Respiratory and
Media Diluent (CF/LP/MP).
36. Sett korken på igjen, og pulsvortex i 5 s.
37. Gjør i stand kontrollene. Se Klargjøring av kontroll nedre luftveier (avsnitt E).
38. Overfør prøvene og kontrollene til et vannbadstativ.
39. Plasser vannbadstativet i kokende vann i 5 min.
40. Etter 5 min, fjern vannbadstativet og la rørene avkjøles ved romtemperatur i 15 min.
ADVARSEL: Pass på å unngå brannskader fra det kokende vannet, vannbadstativet eller overflatene på
vannbadet som kan være varme.
41. Etter avkjøling, sentrifuger (16 000 x g) i om lag 5 s.
MERK: Etter at prøvene er kokt:
a. De kan oppbevares ved 18 – 33 °C i opptil 6 t og kan testes uten ny koking.
b. De kan oppbevares i opptil 3 dager ved 2 – 8 °C. Prøvene må vortexes og kokes på nytt før testing.
c. De kan oppbevares i opptil 14 dager ved ≤ -20 °C. Prøvene må tines ved romtemperatur, vortexes og
kokes på nytt før testing.
42. Prøvene er nå klare for Testprosedyre for BD ProbeTec ET LP-analyse (avsnitt F).
E. Klargjøring av kontroll for nedre luftveier:
1. For hver runde (plate) som skal testes, gjør i stand et negativt kontrollrør (CF/LP/MP) og et positivt
kontrollrør (CF/LP/MP). Hvis en plate inneholder mer enn et reagens-partinummer (lot), må kontroller
testes for hvert parti (lot).
2. Vend QIAGEN-buffer-AE og Respiratory and Media Diluent forsiktig før bruk.
3. Fjern korken fra det negative kontrollrøret (CF/LP/MP).
4. Bruk en ny pipettespiss for hvert kontrollrør og tilsett 200 µL QIAGEN-buffer-AE.
5. Bruk en ny pipettespiss for hvert kontrollrør og tilsett 400 µL Respiratory and Media Diluent.
6. Sett korken tett på.
7. Fjern korken fra det positive kontrollrøret (CF/LP/MP).
8. Bruk en ny pipettespiss for hvert kontrollrør og tilsett 200 µL QIAGEN-buffer-AE.
9. Bruk en ny pipettespiss for hvert kontrollrør og tilsett 400 µL Respiratory and Media Diluent.
10. Sett korken tett på.
11. Vortex kontrollrørene i 5 s.
12. Kontrollene er nå klare til koking. Se Behandling av prøver fra nedre luftveier (avsnitt D).
5

F. Testprosedyre for BD ProbeTec ET LP Assay:
MERK: Før testprosedyren utføres, sett de behandlede prøvene og kontrollene i et stativ som kan håndtere
2 mL prøverør, slik som BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tube Rack, kompatibelt med BD ProbeTec ET Pipettor.
1. Fjern og kast lokkene fra de avkjølte prøvene og kontrollene.
2. SKIFT HANSKER før du fortsetter, for å hindre kontaminering.
3. Gjør i stand Priming-brønnplaten ved hjelp av platelayoutrapporten – se Platelayout (avsnitt C).
4. Gjenforsegle mikrobrønnposene som følger:
a. Plasser posen på et plant underlag. Hold den åpne enden flatt med en hånd.
b. Mens du trykker, la fingeren gli langs det ytre seglet fra en ende av posen til den andre.
c. Inspiser for å være sikker på at posen er forseglet.
5. Velg Program 1 på BD ProbeTec ET Pipettor.
6. Ta opp pipettespissene. Åpne BD ProbeTec ET Pipettoren ved å trekke avstandsknappen helt ut.
MERK: Pass på at spissene er satt godt på pipetten for å forhindre lekkasje.
7. Aspirer 200 µL fra den første kolonnen av prøver.
8. Utløs pipetten forsiktig, la spissen berøre sidene av brønnene og dispenser 150 µL i den
korresponderende kolonnen med priming-brønner (1 A – H).
MERK: Utløs ikke pipetten over prøver eller mikrobrønner, da dette kan forårsake kontaminering. Brå
bevegelser kan forårsake dråpe- eller aerosoldannelse.
9. Kast spissene. Trykk på pipettens utløser for å tilbakestille pipetten.
MERK: Kast spissene forsiktig for å unngå dråper eller aerosoler som kan kontaminere arbeidsflaten.
10. Ta opp nye spisser, utvid pipetten og aspirer 200 µL fra andre kolonne med prøver.
11. Utløs pipetten forsiktig, la spissen berøre sidene av brønnene og dispenser 150 µL i den
korresponderende kolonnen med priming-brønner (2 A – H).
12. Kast spissene.
13. Fortsett å overføre resten av prøvene for kjøringen.
14. Dekk til priming-platen med engangsplastlokk og inkuber platen ved romtemperatur i minst 20 min
(kan inkuberes i opptil 6 t). MERK: Sett nye lokk på de behandlede prøvene. SKIFT HANSKER.
15. På slutten av priming-inkubasjonstiden gjøres amplifiseringsplaten i stand. Konfigurer
amplifiseringsbrønnene på en plate som samsvarer med platelayoutrapporten (på samme måte som
priming-platen). Forsegle mikrobrønnposen på nytt som beskrevet i trinn 4.
16. Fjern plastlokket fra priming-platen og plasser platen på Priming Heater. Plasser STRAKS
amplifiseringsplaten i fremste posisjon i Warming Heater for å forvarme denne.
17. Sett tidsuret på 10 min. (MERK: Dette trinnet er kritisk med hensyn til tid.)
18. Etter 10 min (+/- 1 min) lang inkubering velg Program 5 på pipetten.
19. Ta opp pipettespisser og overfør 100 µL fra kolonne 1 på priming-platen til kolonne 1 på
amplifiseringsplaten. La pipettespissen berøre sidene av brønnene når væsken has i. Etter dispensering
la pipetten automatisk blande væsken i brønnene. Løft pipetten forsiktig fra platen. Unngå berøring
av andre brønner.
20. Kast spissene. Ta opp nye spisser og fortsett å overføre reagensblanding fra priming-brønnene til
amplifiseringsbrønnene, kolonne etter kolonne, med nye spisser for hver kolonne.
21. Når siste kolonne er overført, fjern baksiden fra en selvklebende forsegler (en amplifiseringsforsegler
[1/2] vil dekke opp til 6 kolonner. Hvis platen inneholder mer enn 6 kolonner MÅ det brukes et fullt
forseglingsark). Hold forseglingen i kantene og legg den over mikrobrønnene. Bruk rammen på
Warming Heater til å hjelpe deg med å legge på forseglingen. Trykk ned forseglingen for å sikre at
alle mikrobrønnene er fullstendig forseglet.
22. Ved BD ProbeTec ET-brukerpanelet skal du flytte transportvognen ut og åpne døren. Flytt STRAKS
(innen 30 s), den forseglede amplifiseringsplaten til BD ProbeTec ET-instrumentet og start kjøringen.
(Se brukerhåndboken for BD ProbeTec ET System for detaljerte anvisninger.)
23. Etter at kjøringen er startet fortsett med følgende del av rengjøringsprosedyren:
a. Forsegle priming-brønnene med en selvklebende forsegling og fjern platen fra Priming & Warming
Heater. ADVARSEL: Temperaturen er over 70 °C. Bruk beskyttelseshansker når platen fjernes.
b. La platen kjøles ned på benken i 5 min.
c. Fjern de forseglede priming-brønnene fra platen ved å holde i forseglingen på begge sider, og løft
brønnene rett opp som en enhet. Plasser de forseglede mikrobrønnene i en avfallspose og forsegle.
d. Rengjøring av metallbrettet:
Skyll brettet med 1 % (v/v) natriumhypokloritt – Alconox-oppløsning.
Skyll brettet med vann.
Pakk brettet i et rent papirhåndkle og la det tørke fullstendig før det brukes på nytt.
24. Når kjøringen er ferdig, genereres det en utskrift av testresultatene.
25. Kjør transportvognen frem, åpne døren og fjern platen. Lukk døren og kjør transportvogna tilbake i
instrumentet.
26. Fjern de forseglede amplifiseringsbrønnene fra platen. ADVARSEL: Ikke fjern forseglingsmaterialet fra
mikrobrønnene. De forseglede mikrobrønnene kan lett fjernes som en enhet ved å holde forseglingen
6

i topp og bunn og løfte rett opp og ut fra brettet. Plasser de forseglede mikrobrønnene i avfallsposen.
Forsegle posen.
27. Rengjøring av metallbrettet:
Skyll brettet med 1 % (v/v) natriumhypokloritt – Alconox-oppløsning.
Skyll brettet med vann.
Pakk brettet i et rent papirhåndkle og la det tørke fullstendig før det brukes på nytt.
28. Etter dagens siste kjøring utføres følgende rengjøringsprosedyre:
a. Fukt papirhåndklær eller gaskompresser med 1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconoxoppløsning
og påfør benkeplater og de ytre overflatene på Priming & Warming Heater, 2 mL
stativ for prøverør, vannbad, sentrifuge og BD ProbeTec ET-instrumentet. La oppløsningen
forbli på overflatene i 2 – 3 min. Fukt papirhåndklær eller gaskompresser med vann og fjern
rengjøringsmidlet. Skift håndklær eller gaskompress ofte når rengjøringsmiddelet påføres og når
det skylles med vann. Fukt papirhåndklær eller gaskompresser med 1 % (v/v) natriumhypokloritt
med Alconox, og tørk av pipettehåndtaket (BARE HÅNDTAKET). Etter 2 – 3 min tørkes håndtaket av
med papirhåndklær eller gaskompresser fuktet med vann.
b. Dypp vannbadstativet og brettene i 1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconox i 1 – 2 min. Skyll
grundig med vann og la dem lufttørke.
c. Gjenopplad pipetten.
d. Kast den forseglede avfallsposen og posen med biologisk avfall i henhold til etablerte prosedyrer
for avfallsbehandling av smittefarlig, biologisk avfall.
29. Minst en gang i uken utføres følgende prosedyre:
a. Kast vannet i vannbadene.
b. Skyll vannbadene med 1 % (v/v) natriumhypokloritt – Alconox-oppløsning. Skyll med vann og la
dem tørke.
c. Fyll på destillert vann.
Kvalitetskontroll
Kvalitetskontroll må utføres i henhold til lokale og/eller nasjonale retningslinjer eller akkrediteringskrav
og ditt laboratoriums standard kvalitetskontrollprosedyrer. Det anbefales at brukeren refererer til aktuelle
CLSI-retningslinjer (tidligere NCCLS) og CLIA-bestemmelser for egnede kvalitetskontrollprosedyrer.
Respiratory and Media Diluent and controls leveres sammen i Respiratory and Media Diluent and
Control Kit (CF/LP/MP). En positiv og en negativ kontroll må inkluderes i hver kjøring for hvert nytt
reagenspartinummer (lot). Kontrollene kan plasseres tilfeldig. Den positive kontrollen overvåker for
betydelig reagenssvikt. Den negative kontroll overvåker for kontaminering av reagensene og/eller miljøet.
De positive og negative kontrollene må teste respektivt positivt og negativt, for å kunne rapportere
prøveresultatene. Hvis kontrollene ikke oppfører seg som ventet, må analysene anses for ugyldige,
og pasientresultatene blir ikke rapportert av instrumentet. Hvis kontrollene ikke oppnår forventede
resultater, skal du gjenta hele prosedyren med et nytt sett kontroller, nye mikrobrønner og de behandlede
prøvene. Hvis inadekvate, behandlede prøver er igjen for en gjentatt prøve, behandle på nytt en ny
fortynning av primærprøven. Hvis gjentatte kontroller ikke gir forventede resultater, kontakt den lokale
BD-representanten (se ”Tolkning av testresultater”).
En intern amplifiseringskontroll (IAC) er tørket inn i priming-brønnen. IAC inneholder nukleinsyremål
som er amplifisert i nærvær av prøveblandingen. IAC er designet for å bekrefte verdien av
amplifiseringsreaksjonen og identifisere potensiell hemming av den behandlede prøven.
Prøveprosesskontroller:
Kontroller av prøveprosessen kan testes i samsvar med kravene fra de relevante
godkjenningsmyndighetene. En positiv kontroll skal teste hele analysesystemet. Av denne grunn kan
kjente, positive prøver tjene som kontroller ved å behandles sammen med og testes i tilknytning til
ukjente prøver. Prøver som brukes som behandlingskontroller, må oppbevares, behandles og testes i
henhold til pakningsvedlegget. Prøvebehandlingskontroller, som simulerer prøver fra nedre luftveier, kan
også klargjøres som beskrevet nedenfor:
1. Ta ut en flaske med frysetørket L. pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1) fra lager ved -20 °C eller
under.
2. Rehydrer med 1 mL 0,85 % (w/v) saltvann som inneholder 0,2 % (w/v) bovint albumin (Fraksjon V).
3. Fortynn rehydrert L. pneumophila til 1:100 000 med 0,85 % (w/v) saltvann som inneholder 0,2 % (w/v)
bovint albumin (Fraksjon V).
4. Pipetter 350 µL fortynnet L. pneumophila i et rør med lokk.
5. Behandles som beskrevet i Behandling av prøver fra nedre luftveier (avsnitt D).
Overvåkning av forekomst av DNA-kontaminering
Minst en gang i måneden skal følgende testprosedyre gjennomføres for å overvåke arbeidsplassen og
utstyret med henblikk på forekomst av DNA-kontaminering. Miljøovervåkning er avgjørende for å påvise
kontaminering før det utvikler seg til et problem.
1. For hvert område* som skal testes, bruk BBL CultureSwab EZ-pensel.
2. Merk et 2 mL rør med skrukork for hvert område som skal testes. Pipetter 600 µL av respiratorisk
og mediafortynner i hvert rør og tilsett 300 µL QIAGEN-buffer-AE eller destillert vann av molekylær
gradering. Vortex i 5 s for å blande.
7

3. Dypp den første penselen i diluenten klargjort i trinn 2, og stryk over det første området med en bred,
penslende bevegelse.
4. Vri penselen i diluenten og klem ut mot sidene i røret. Sett korken på røret igjen, og vortex i 5 s. Kast
penselen.
5. Gjenta prosedyren for hvert område som skal testes.
6. Plasser rørene i et vannbadsstativ og varm i kokende vann i 5 min. Fjern stativet fra det kokende
vannbadet og la prøvene kjøles ned i 15 min ved romtemperatur før du fortsetter.
7. Etter avkjøling sentrifuger (16 000 x g) i om lag 5 s.
8. Mens rørene varmes opp, bruk rene håndklær fuktet i vann for å fjerne gjenværende bufferblanding
fra de testede overflatene.
9. Så snart prøvene er avkjølt, fortsett med Testprosedyre for BD ProbeTec ET LP Assay (avsnitt F).
* Anbefalte områder å teste omfatter: Overflater på vannbadstativ, mikrosentrifuge, Priming & Warming
Heater, svarte metallplater, pipettehåndtak, instrumentknapper, instrumenttastatur, tørre overflater på
vannbad, overflater på prøvestativ og arbeidsbenker inkludert prøvebehandlingsområder.
Hvis et område viser positivt resultat, skal du rengjøre området med nylaget 1 % (v/v) natriumhypokloritt
med Alconox. Sørg for at hele området vætes med rengjøringsoppløsningen, og la den forbli på overflaten
i minst 2 minutter, eller til den er tørr. Om nødvendig, skal du fjerne overflødig rengjøringsoppløsning
med et rent håndkle. Tørk av området med et rent håndkle dyppet i vann, og la overflaten tørke. Test
området på nytt. Gjenta inntil et negativt resultat oppnås. Hvis kontamineringen ikke forsvinner, skal du
kontakte den lokale BD-representanten for ytterligere informasjon.
TOLKNING AV PRØVERESULTATER
Tilstedeværelse eller fravær av L. pneumophilia-familie-DNA bestemmes ved å beregne PAT-verdi (Passes
After Threshold) for prøver basert på forutbestemte terskelverdier. PAT-verdien er et mål som brukes
til å vurdere størrelsen på signalet som genereres som resultat av reaksjonen. For denne målingen,
indikerer større tall at terskelvedien ble nådd i tidlig fase av amplifiseringen, mens mindre tall betyr at
terskelverden ble nådd seinere under reaksjonen. Størrelsen på PAT-verdien er ikke indikativ på nivået av
L. pneumophila-DNA i prøven.
Hvis prøvekontrollresultatene ikke er som ventet, skal pasientresultatene ikke rapporteres. Se
kvalitetskontrollavsnittet for forventede kontrollverdier. Rapporterte resultater bestemmes som følger.
PAT-verdi
LP-mål IAC-mål Resultat Tolkning Rapport
> 0 > 0 eller = 0 Positiv L. pneumophila-
DNA påvist ved
SDA.
= 0 > 0 Negativ L. pneumophila-
DNA ikke påvist ved
SDA.
8
Positivt for organismer som tilhører
L. pneumophila-serogrupper 1 – 14, noe som
antyder aktuell infeksjon. Tilleggstesting er
nødvendig for å identifisere serogruppen,
dersom dette kreves for epidemiologiske formål.
Antatt negativ for L. pneumophila-serogrupper
1 – 14, noe som tyder på at det ikke foreligger
aktuell eller nylig infeksjon. Infeksjon med
Legionella kan ikke utelukkes fordi: 1) andre
serogrupper enn 1 – 14 og andre arter
av Legionella kan forårsake sykdom og,
2) nivået av DNA som finnes, kan være under
påvisningsgrensen for testen.
= 0 = 0 Ubestemt Amplifiseringskontroll hemmet. Tilleggstesting
er nødvendig for å tolke resultatet. a
a Gjenta BD ProbeTec ET LP Assay fra det behandlede prøverøret. Dersom det er utilstrekkelig volum
igjen av den behandlede prøve, gjenta fra originalprøven. Hvis det gjentatte resultatet er enten positivt
eller negativt, skal du tolke det som beskrevet ovenfor. Hvis resultatet gjentas som ubestemt, skal det
rekvireres en ny prøve.
Bestemmelse av LP- og IAC-terskel:
Terskelverdiene for L. pneumophila-mål-DNA og -IAC ble opprinnelig fastslått med
mottakeroperatorkarakteristiske kurveanalyser av data som er samlet inn fra positive og negative
kontroller. Disse terskelverdiene ble verifisert ved kliniske studier og med retrospektive L. pneumophilapositive
og -negative prøver fra nedre luftveier. Disse terskelverdiene ble deretter validert i ytterligere
kliniske studier.
PROSEDYRENS BEGRENSNINGER
1. BD ProbeTec ET LP Assay er bare spesifikk for L. pneumophila-serogrupper 1 – 14. Andre
L. pneumophila-serogrupper har ikke blitt testet.
2. BD ProbeTec ET LP Assay vil ikke påvirke infeksjoner med andre Legionella-arter.
3. Ytelsesegenskaper for BD ProbeTec ET LP Assay er bare fastslått for spyttprøver. Resultater med andre
prøvetyper er ikke vurdert.
4. BD ProbeTec ET LP Assay er bare evaluert for pasienter som er minst 13 år gamle.
5. Som med mange diagnostiske tester skal resultatene av BD ProbeTec ET LP Assay tolkes i sammenheng
med andre laboratoriemessige og kliniske data som er tilgjengelige for legen.

6. Et negativt resultat utelukker ikke muligheten for infeksjon fordi testresultatene kan påvirkes av
feil prøvetakingsprosedyre, teknisk feil, forbytting av prøver, samtidig antibiotikabehandling eller
mengden L. pneumophila-DNA i prøven kan være under prøvens sensitivitet.
7. BD ProbeTec ET LP Assay kan ikke brukes til å vurdere om behandlingen er vellykket eller mislykket
siden nukleinsyrer fra L. pneumophila kan vedvare etter antimikrobiell behandling.
8. BD ProbeTec ET LP Assay er ikke vurdert med miljøprøver (f.eks drikkevann, aller vannkvalitetstesting).
9. Optimale testresultater forutsetter adekvat prøveinnsamling og -håndtering.
10. Bruk av BD ProbeTec ET LP Assay skal begrenses til personale som har opplæring i analyseprosedyrene
og BD ProbeTec ET System.
11. BD ProbeTec ET LP Assay gir kvalitative resultater. Det kan ikke trekkes noen sammenheng mellom
størrelsen på PAT score og mengden L. pneumophila-DNA i prøven.
FORVENTEDE RESULTATER
A. Prevalens
Positivitetsraten som observeres ved L. pneumophila testing vil variere, avhengig av testmetoden som
brukes, alderen på pasienten, underliggende risikofaktorer, geografisk lokalisasjon, og viktigst – lokal
sykdomsprevalens inkludert mulige utbruddssituasjoner.
B. Frekvensdistribusjon for PAT score
Totalt 83 retrospektive spyttprøver ble samlet inn fra fire kliniske steder innenfor USA, Europa og Canada
og testet med BD ProbeTec ET LP Assay. En frekvensdistribusjon av initiale LP PAT score sammenlignet med
dyrkningsresultatene er vist i figur 1.
Frekvens
60
50
40
30
20
10
C. Kontroller
0
Figur 1: LP PAT score frekvensdistribusjon sammenlignet med dyrkning
52
2
(-) (+)
0
0
9
4
2
4
0 1 - 19 20 - 39 40 - 60
LP PAT Score
Kulturresultat 0 1 – 19 20 – 39 40 – 60 Total
Negativ 52
0
4
4
60
Positiv 2
0
2
19 23
Total 54 0 6 23 83
19
Kultur –
Kultur +
Ved den kliniske evalueringen, ble det sett kontrollsvikt for BD ProbeTec ET LP Assay i en av 46 kjøringer
(dvs. en kjøring hadde en prosedyrefeil). LP PAT score for de gjenværende 45 kjøringene er oppsummert i
tabell 1.
Tabell 1: LP PAT score distribusjon for respiratoriske og mediakontroller
Kontroll N Variasjonsområde 5. persentil Gjennomsnittlig Median 95. persentil
LP negativ 45 0 – 0 0 0 0 0
LP positiv 45 29,4 – 50,7 40,1 46,7 47,6 49,7
FUNKSJONSEGENSKAPER
Prospektiv studie
BD ProbeTec ET LP Assay ble evaluert prospektivt ved sju kliniske steder innenfor USA og Canada i løpet
av 2002-2003 sesongen. En sputumprøve og en urinprøve ble samlet inn fra hver pasient. Spyttprøver ble
testet med BD ProbeTec ET LP Assay, Legionella dyrkning og en direkte fluoriserende antistoff-analyse
(DFA). Urinprøver ble testet med en kommersielt tilgjengelig urinantistoffanalyse for L. pneumophila.
Totalt 118 pasienter tilfredsstilte kriteriene for inklusjon i studien (dvs. radiografiske tegn på
pneumoni, pasienter ≥ 13 år gamle, på antibiotika ≤ 14 dager, godkjente prøvetyper samlet inn,
adekvate referansemetoder anvendt etc.). Fra de 118 pasientene var det 114 godkjente BD ProbeTec LP
Assayresultater. Resultatene fra sputumprøvene ble sammenlignet med sputumdyrkingsresultatet for å
vurdere egenskapene ved ytelsen. En prøve ble ansett som positiv hvis dyrkningsresultatet var positivt. Et
resultat ble ansett som negativt hvis dyrkningsresultatet var negativt.

Alle ubestemte resultater skulle gjentas fra den behandlede prøven, eller fra den originale prøven
(dersom det var for lite av den behandlede prøven tilgjengelig). En prøve som ga et ubestemt resultat
både i utgangspunktet og ved gjentatt (endelig) testing, ble ikke inkludert i egenskapene ved utførelsen.
En prøve som ga et ubestemt resultat i utgangspunktet og ga et positivt eller negativt resultat
ved gjentagelse ble inkludert i egenskapene ved utførelsen. En prøve som ga et ubestemt resultat
i utgangspunktet, men som ikke kunne gjentas på grunn av for lite prøvevolum forble et ”initialt
ubestemt” resultat og ble ikke inkludert i egenskapene ved utførelsen.
BD ProbeTec ET LP Assayresultater fra spyttprøver sammenlignet med kultur er oppsummert i Tabell 2.
Tabell 2: BD ProbeTec ET LP Assay – prospektive sputumresultater sammenlignet med dyrkning
Sted
Sensitivitet
(95 % Kl)
1 NA
2 NA
3 NA
6 NA
7 NA
Til sammen NA
Mot dyrkning
Spesifisitet
(95 % Kl)
100 % (17/17)
(80,5 % – 100 %)
100 % (2/2)
(15,8 % – 100 %)
100 % (31/31)
(88,8 % – 100 %)
100 % (33/33)
(89,4 % – 100 %)
100 % (31/31)
(88,8 % – 100 %)
100 % (114/114) a
(96,8 % – 100 %)
10
Ubestemt
Initial/Endelig
a Alle de 114 dyrknings-negative prøvene var negative ved direkte fluoriserende antistoff (DFA). Åttisju av
de 114 pasientene ble også testet med en urin-antistoff analyse og funnet å være negative.
b En prøve var negativ ved ny testing og ble inkludert i spesifisitetsberegningen. En prøve hadde for lite
volum for ny testing.
c To prøver forble ubestemte ved ny testing. En prøve hadde for lite volum for ny testing.
NA= Passer ikke
Retrospektiv studie
BD ProbeTec ET LP Assay ble også vurdert med 83 retrospektive spyttprøver samlet inn fra klinikker i USA,
Europa og Canada. Disse retrospektive prøvene hadde vært lagret frosne i opptil seks år, men de fleste av
prøvene (65,1%, 54/83) var lagret mindre enn to år.
Hver klinikk journalførte det originale dyrkningsresultatet for hver av de retrospektive prøvene.
Hver klinikk testet sputumprøvene med BD ProbeTec ET LP Assay og sammenlignet resultatene med
dyrkningsresultatene. En prøve ble ansett som positiv hvis dyrkningsresultatet var positivt. En prøve
ble ansett som negativ hvis dyrkningsresultatet var negativt. BD ProbeTec ET LP Assayresultater fra
retrospektive spyttprøver sammenlignet med kultur er oppsummert i Tabell 3.
Tabell 3: BD ProbeTec ET LP Assay – retrospektive sputumresultater sammenlignet med dyrkning
Kultur - Prosent anslått overensstemmelse (95 % Kl)
Sted LP resultat Positiv Negativ Total Positiv Negativ Til sammen
6 Positiv 1 0 1
Negativ 0 0 0
Total 1 0 1
8 Positiv 16 5 21
Negativ 1 24 25
Total 17 29 46
9 Positiv 1 3 4
Negativ 0 22 22
Total 1 25 26
10 Positiv 3 0 3
Negativ 1 6 7
Total 4 6 10
Til sammen Positiv 21 8 a 29
Negativ 2 b 52 54
Total 23 c 60 83
100 % (1/1)
(2,5 % – 100 %)
94,1 % (16/17)
(71,3 % – 99,9 %)
100 % (1/1)
(2,5 % – 100 %)
75 % (3/4)
(19,4 % – 99,4 %)
91,3 % (21/23)
(82 % – 98,9 %)
0/0
0/0
0/0
2/0 b
3/2 c
5/2
NA
82,8 % (24/29)
(64,2 % – 94,2 %)
100 % (1/1)
(2,5 % – 100 %)
87 % (40/46)
(73,7 % – 95,1 %)
88 % (22/25) 88,5 % (23/26)
(68,8 % – 97,5 %) (69,8 % – 97,6 %)
100 % (6/6)
(54,1 % – 100 %)
86,7 % (52/60)
(75,4 % – 94,1 %)
90 % (9/10)
(55,5 % – 99,7 %)
88 % (73/83)
(79 % – 94,1 %)
a Åtte prøver var negative ved kultur, men positive ved BD ProbeTec ET LP Assay. Alle åtte prøvene var
positive ved urin antistoff analyse. PRC testing ble utført på seks av de åtte prøvene, alle seks var positive
ved PCR.

Toe prøver var positive ved kultur, men negative ved BD ProbeTec ET LP Assay. Begge prøvene var
negative ved urin antistoff analyse. PRC testing ble utført på begge prøvene, den ene prøven var positiv
ved PCR.
c De 23 dyrkningspositive prøvene var fordelt på følgende serogrupper: 47,8 % (11/23) Serogruppe 1;
17,4 % (4/23) Serogruppe 3; 13,0 % (3/23) Serogruppe 4; 4,3 % (1/23) Serogruppe 5; 4,3 % (1/23)
Serogruppe 6 og 13 % (3/23) Serogruppe informasjon ikke tilgjengelig.
NA= Passer ikke
MERK: PCR metoden som ble brukt til å teste avvikende resultater for dyrkning og BD ProbeTec ET LP
Assay er ikke godkjent av FDA.
Analytiske Studier
BD ProbeTec ET LP Assay amplifiseringsreaksjonsvolum er 100 µL av behandlet prøve.
Analytisk sensitivitet
Den analytiske sensitiviteten til BD ProbeTec ET LP Assay over 14 forskjellige serogrupper av L.
pneumophila ble vurdert ved å fortynne bakterielle suspensjoner til 0, 150, 300 og 450 kolonidannende
enheter (CFU) pr reaksjon. Prøver ble behandlet og målt i tre eksemplarer. Basert på 100 % positivitet er
analytisk sensitivitet for serogrupper 2 – 10 og 12 var 150 CFU/reaksjon. Grense for påvisning (LOD), kan
imidlertid være lavere enn det laveste nivået som er testet. Basert på 100% positivitet var den analytiske
sensitiviteten for serogruppe 1 og 11 300 CFU/reaksjon, serogruppe 13 var 450 CFU/reaksjon og serogruppe
14 var 700 CFU/reaksjon.
Den analytiske sensitiviteten for BD ProbeTec ET LP Assay ved tilstedeværelse av vev fra nedre luftveisprøver
ble vurdert ved å tilsette et makrofaginfisert stoff av L. pneumophila serogruppe 1 til sputum ved nivåer
på 0, 150 ,300 og 450 CFU pr reaksjon. Prøvene ble behandlet og målt i tre eksemplarer. Basert på 100 %
positivitet er analytisk sensitivitet for prøver fra nedre luftveier med tilsetning, 150 CFU/reaksjon. Grense
for påvisning (LOD), kan imidlertid være lavere enn det laveste nivået som er testet.
Analytisk spesifisitet
Totalt 79 mikroorganismer (69 bakterier, en gjærsopp og 9 vira) ble vurdert med BD ProbeTec ET LP Assay.
Bakterielle isolater ble testet ved konsentrasjoner som varierte fra 1 x 106 CFU/mL til 1 x 108 CFU/mL. Vira
ble testet ved en konsentrasjon på 1 x 106 viruspartikler/mL. Coccidioides immitis ble klargjort som en
mycelsuspensjon ekvivalent til en McFarland Standard på 5. Ingen av mikroorganismene som ble testet ga
et positivt resultat eller hemmet IAC (Tabell 4).
Tabell 4: BD ProbeTec ET LP Assayresultater- analytisk spesifisitet
Acinetobacter
calcoaceticus
Actinomyces israelii
Adenovirus-5
Aeromonas hydrophila
Blastomyces dermatitidis
Bordetella
bronchiseptica
Bordetella parapertussis
Bordetella pertussis
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia trachomatis,
sero L2
Chylamydophila
pneumoniae, AR-39
Citrobacter freundii
Coccidioides immitis
Corynebacterium
diphtheriae
Corynebacterium
jeikeium
Cryptococcus
neoformans
Cytomegalovirus
Eikenella corrodens
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterovirus (Echovirus)
Escherichia coli
Fusobacterium
nucleatum
Haemophilus influenzae
Haemophilus
parainfluenzae
Herpes simplex virus-1
Histoplasma capsulatum
Influenza virus A
Influenza virus B
Kingella kingae
Klebsiella pneumoniae
subsp. ozaenae type 4
Klebsiella pneumoniae
subsp. pneumoniae
Lactobacillus acidophilus
Legionella anisa
Legionella bozemanii
Legionella cherrii
Legionella
cincinnatiensis
Legionella dumoffii
Legionella erytha
Legionella fairfieldensis
Legionella feeleii
Legionella gormanii
Legionella hackeliae
Legionella jordanis
Legionella longbeachae
Legionella maceachernii
Legionella oakridgensis
Legionella sainthelensi
Legionella spiritensis
Legionella worsleiensis
Moraxella osloensis
Mycobacterium
tuberculosis
Mycoplasma
pneumoniae
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Neisseria mucosa
Parainfluenza I virus
Peptostreptococcus
anaerobius
Porphyromonas
asaccharolytica
11
Prevotella oralis
Pseudomonas aeruginosa
Respiratorisk syncytialt virus,
lang stamme
Rhinovirus
Salmonella choleraesuis
serotype Enteritidis
Salmonella choleraesuis
serotype Typhi
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus,
protein A-producerende
Staphylococcus aureus, nonprotein
A-producerende
Staphylococcus epidermidis
Stenotrophomonas
maltophilia
Streptococcus Gruppe B
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Tatlockia (Legionella)
micdadei
Veillonella parvula

Forstyrrende stoffer
Potensielt forstyrrende substanser som kan finnes i prøver fra nedre luftveier ble testet med BD ProbeTec
ET LP Assay i fravær av målet eller med tilstedeværelse av 750 celler/reaksjon (halspensler uten
transportmedium) av L. pneumophila . Ved fravær av målet, var det ingen av substansene som ble testet
som produserte et positivt resultat eller hemmet IAC ved konsentrasjonene som er listet opp i tabell 5. Når
målet var til stede sammen med substansene ved konsentrasjonene som er listet opp i tabell 5, produserte
alle testene et positivt resultat.
Tabell 5: BD ProbeTec ET LP Assay – Stoffer testet for påvirkning
Prøver fra nedre luftveier
Stoffer testet Konsentrasjon
Helblod (heparin) 2,65 %
Lidokain (2 %) 0,21 %
Sputuminduserende oppløsning (3 % NaCl) 0,32 %
Azitromycin 0,42 µg/mL
Penicillin G 17 µg/mL
Tetracyclin 2,3 µg/mL
Doxycyclin 26,5 µg/mL
Ciprofloxacin 4,88 µg/mL
Mycoplasma pneumoniae 5 x 106 celler/mL
Chlamydophila pneumoniae 1,06 x 107 EBs/mL
Mycoplasma pneumoniae og Chlamydophila
pneumoniae
Henholdsvis 1,06 x 107 celler/mL og 1,06 x 107 EBs/mL
Reproduserbarhet
Reproduserbareheten ved BD ProbeTec ET LP Assay ble vurdert ved tre laboratorier ved å teste et panel
spm bestod av 24 prøver tilstatt PBS/BSA Panelet bestod av 12 prøver som var negative L. pneumophila,
tre lave (300 CFU/reaksjon) og tre høye (500 CFU/reaksjon) positive prøver av L. pneumophila; og tre lave
(30 Elementærpartikler (EB)/reaksjon, 300 CFU/reaksjon, 900 celler/reaksjon, henholdsvis) og tre høye
(50 EB/reaksjon, 500 CFU/reaksjon, 1 500 celler/ reaksjon, henholdsvis) positive prøver som hver inneholdt
Chlamydophila pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP), og Mycoplasma pneumoniae (MP). En operatør på
hvert sted testet panelet en gang om dagen i tre dager. Resultatene er oppsummert i tabell 6.
Tabell 6: Anslag for reproduserbarhet for prøvenivå fra nedre luftveier
Mellom dager
Innenfor sted Mellom steder
Panelmedlem N % Riktig
Gjennomsnittlig
PAT SD % CV SD % CV
LP-HØY 27 100,0 % 47,2 0,94 2,00 1,42 3,02
LP-LAV 27 100,0 % 44,8 0,44 0,98 2,06 4,59
CP/LP/MP-HØY 27 100,0 % 46,2 1,13 2,45 1,79 3,88
CP/LP/MP-LAV 26a 100,0 % 43,0 0,00 0,00 2,59 6,01
Negativ 108 100,0 % 0,0 – – – –
IAC med LP-negative prøver 108 100,0 % 47,8 0,43 0,91 0,34 0,70
a En prøve ble ekskludert fra analysen på grunn av en prosedyrefeil.
TILGJENGELIGHET
Følgende BD ProbeTec ET-produkter er tilgjengelige:
Kat. nr. Beskrivelse
440728 BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay
440731 BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit
440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (10 Primer-deksler, 16 Amplifiseringsforseglere 1/2 og
8 avfallsposer)
440458 BD ProbeTec ET Pipette Tips, 6 x 120.
440661 BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tubes and Caps, 200
440679 BD ProbeTec ET 2 mL Caps, 100
440477 BD ProbeTec ET Instrument, utenfor USA
440478 BD ProbeTec ET Instrument, USA og Canada
440479 BD ProbeTec ET Priming & Warming Heater, 220 V
440480 BD ProbeTec ET Priming & Warming Heater, 120 V
440487 BD ProbeTec ET Pipettor
440502 BD ProbeTec ET Lysing Rack
12

REFERANSER
1. Cloud J.L., Carroll K.C., Pixton P., Erall M., Hillyard D.R. (2000) Detection of Legionella species in
respiratory specimens using PCR with sequencing confirmation. J Clin Micro 38:1709-1712.
2. Stout, J.E., Yu, V.L. 2000. Legionellosis. N. Engl. J. Med. 337: 682-687.
3. Bartlett, J.G., Dowell, S.F., Mandell, L.A., File, T.M., Musher, D.M., Fine, M.J. 2000. Guidelines from
the Infectious Diseases Society of America - Practice guidelines for the management of communityacquired
pneumonia in adults. Clin.Infect. Dis. 31:347-82.
4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection
of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.
5. Garner. J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health
and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in
hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: 53-80.
6. `U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical
laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.
7. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the
protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual
directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000,
p. 0021-0045.
8. Van der Zee, A., Peeters, M., de Jong, C., Verbakel, H., 2002. QIAGEN DNA extraction kits for sample
preparation for Legionella PCR are not suitable for diagnostic purposes. J. Clin. Microbiol. 40 (3): 1126.
9. Evans, G.E. et al. 2003. Contamination of QIAGEN DNA extraction kits with Legionella DNA. J. Clin.
Microbiol. 41 (7): 3452-3453.
10. Isenberg, H.D. (ed.) 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol. 1. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.
13

Manufacturer / Výrobce / Producent / Fabrikant / Tootja / Valmistaja / Fabricant / Hersteller /
ÊáôáóêåõáóôÞò / Gyártó / Ditta produttrice / Gamintojas / Producent / Fabricante / Výrobca / Tillverkare /
Производител / Producãtor / Üretici
Use by / Spotøebujte do / Anvendes før / Houdbaar tot / Kasutada enne / Viimeinkäyttöpäivä / A utiliser
avant / Verwendbar bis / Çìåñïìçßá ëÞîçò / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Naudokite iki /
Brukes før / Stosowaæ do / Utilizar em / Použite do / Usar antes de / Använd före / Използвайте до / A se
utiliza pânã la / Son kullanma tarihi
YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) /
RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec mìsíce)
ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) /
JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand)
AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp)
VVVV-KK-PP / VVVV-KK (kuukauden loppuun mennessä)
AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) /
JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) /
ÅÅÅÅ-ÌÌ-ÇÇ / ÅÅÅÅ-ÌÌ (ÌÌ = ôÝëïò ôïõ ìÞvá) /
ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja)
AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) /
MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mënesio pabaiga)
ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden)
RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesi¹ca)
AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) /
RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca)
aaaa-mm-dd / aaaa-mm (mm = fin del mes) /
ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet på månaden) /
ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) /
AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârºitul lunii) /
YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu)
Catalog number / Katalogové èíslo / Katalognummer / Catalogusnummer / Kataloogi number /
Tuotenumero / Numéro catalogue / Bestellnummer / Áñéèìüò êáôáëüãïõ / Katalógusszám / Numero di
catalogo / Katalogo numeris / Numer katalogowy / Número do catálogo / Katalógové èíslo / Número de
catálogo / Каталожен номер / Numãr de catalog / Katalog numarası
Authorized Representative in the European Community / Autorizovaný zástupce pro Evropskou unii /
Autoriseret repræsentant i EU / Erkend vertegenwoordiger in de Europese Unie / Volitatud esindaja
Euroopa Nõukogus / Valtuutettu edustaja Euroopan yhteisössä / Représentant agréé pour la C.E.E. /
Autorisierte EG-Vertretung / ÅîïõóéïäïôçìÝíïò áíôéðñüóùðïò óôçí ÅõñùðáúêÞ Êïéíüôçôá / Hivatalos
képviselet az Európai Unióban / Rappresentante autorizzato nella Comunità europea / Ágaliotasis atstovas
Europos Bendrijoje / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo w Unii Europejskiej /
Representante autorizado na União Europeia / Autorizovaný zástupca v Európskom spoloèenstve /
Representante autorizado en la Comunidad Europea / Auktoriserad representant i EU / Оторизиран
представител в ЕU / Reprezentant autorizat în Uniunea Europeanã / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi
Consult
In Vitro Diagnostic Medical Device / Lékaøské zaøízení urèené pro diagnostiku in vitro / In vitro
diagnostisk medicinsk anordning / Medisch hulpmiddel voor in vitro diagnose / In vitro diagnostika
meditsiiniaparatuur / Lääkinnällinen in vitro -diagnostiikkalaite / Dispositif médical de diagnostic in
vitro / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro äéáãíùóôéêÞ éáôñéêÞ óõóêåõÞ / In vitro diagnosztikai
orvosi eszköz / Dispositivo medico diagnostico in vitro. / In vitro diagnostikos prietaisas / In vitro
diagnostisk medisinsk utstyr / Urz¹dzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Dispositivo médico de diagnóstico
in vitro / Medicinsk anordning för in vitro-diagnostik / Медицински уред за диагностика ин витро /
Aparaturã medicalã de diagnosticare in vitro / In Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz
Temperature limitation / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperatuurlimiet / Temperatuuri
piirang / Lämpötilarajoitus / Température limite / Zulässiger Temperaturenbereich / ¼ñéï èåñìïêñáóßáò /
Hõmérsékleti határ / Temperatura limite / Laikymo temperatûra / Temperaturbegrensning / Ograniczenie
temperatury / Limitação da temperatura / Ohranièenie teploty / Limitación de temperatura /
Temperaturbegränsning / Температурни ограничения / Limitare de temperaturã / Sıcaklık sınırlaması
Instructions for Use / Prostudujte pokyny k použití / Læs brugsanvisningen / Raadpleeg
gebruiksaanwijzing / Lugeda kasutusjuhendit / Tarkista käyttöohjeista / Consulter la notice d’emploi /
Gebrauchsanweisung beachten / Óõìâïõëåõôåßôå ôéò ïäçãßåò ÷ñÞóçò / Olvassa el a használati utasítást /
Consultare le istruzioni per l'uso / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Se i bruksanvisningen / Zobacz
instrukcja u¿ytkowania / Consulte as instruções de utilização / Pozri Pokyny na používanie / Consultar las
instrucciones de uso / Se bruksanvisningen / Направете справка в инструкциите за употреба / Consultaþi
instrucþiunile de utilizare / Kullanım Talimatları’na başvurun
Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle BENEX Limited
Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate
Sparks, Maryland 21152 USA Shannon, County Clare, Ireland
800-638-8663 Tel: 353-61-47-29-20
Fax: 353-61-47-25-46
ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection.
Alconox is a trademark of Alconox, Inc.
QIAamp is a trademark of QIAGEN Inc.
CultureSwab is a trademark of Difco Laboratories, subsidiary of Becton, Dickinson and Company.
BD, BD Logo, BBL and ProbeTec are trademarks of Becton, Dickinson and Company. © 2006 BD