CELLEDYRKING

Emne SIF4070 Cellebiologi, Vår2001 Labøving nr 2: Celledyrking
Oppgavens formål:
Labøving nr. 2
CELLEDYRKING
Gi studentene ett innblikk i hvordan celler kan dyrkes i kultur (in vitro) i laboratoriet.

Emne SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr 2: Celledyrking
Dyrking av celler i kultur
Enkelte celletyper kan dyrkes i kultur i laboratorier. Normale celler kan vanligvis dyrkes bare en
kort periode fra noen dager til uker. Kreftceller kan på grunn av sin ukontrollerte cellevekst dyrkes i
det uendelige. En forutsetning for å kunne dyrke celler utenfor kroppens naturlige miljø er at cellene
er omgitt av et vekstmedium med nødvendige næringsstoffer, og at de dyrkes ved riktig pH og
temperatur. Dette oppnås ved å dyrke cellene i spesielle celledyrkingsflasker plassert i en CO2 -
inkubator med temperatur 37°C. CO2 konsentrasjonen er vanligvis på 5% og dette gir en fysiologisk
pH på ca 7.2 dersom vekstmediet inneholder riktig mengde uorganiske salter (NaCl, Na HCO3.
NaHPO4 CaCl2, Kcl, MgSO4) som fungerer som buffer. I tillegg til saltene inneholder mediet
nødvendige næringsstoffer og vekstfaktorer som glukose, aminosyrer, vitaminer, og blodserum.
Når cellene gror i kultur vil de vanligvis gjennomløpe 3 vekstfaser. Først inntreffer lag-fasen, som
typisk varer 1-2 dager. I denne perioden deler ikke cellene seg. De tilvenner seg sin nye tilværelse
og cytoskjelettet endres seg slik at cellene kan feste seg på bunnen av celledyrkingsflasken (såkalte
monolagsceller). Celler som vokser i suspensjon har en kortere lag-fase. Deretter følger en log-fase,
der celletallet øker eksponentielt. Tilslutt følger platå- fasen der celletallet er konstant. Cellene deler
seg ikke lengre fordi celleflaskens dyrkingsareal er helt full (såkalt konfluent), og cellene er såkalt
kontakt inhibert.
En vekstkurve er vist på følgende internettadresse:
http://www.gac.edu/~cellab/chpts/chpt12/Images/fig12_2.gif
Oppgaven vil demonstrere:
-cellens miljø ( temperatur, pH, vekstmedium)
-krav til sterilitet
-ulike former for hvordan celler gror, monolag/suspensjon/muliticellulære sfæroider
-hvordan celler som gror som monolag løsnes fra celledyrkningsflasken
-hvordan celletallet bestemmes ved bruk av hemocytometer/Bürkerkammer.
Oppgave:
Grupper på 8-9 skal bestemme vekstkurve og doblingstid for en bestemt cellelinje.
Første dag kommer hver gruppe og får en demonstrasjon av hvordan celler dyrkes i laboratoriet. De
får så en av følgende cellelinjer som de skal dyrke videre:
-lymfom cellelinje U698M, vokser i suspensjon. Cellelinjen stammer fra en pasient i Sverige
-rhabdomyosarcom cellelinje BAHAN C, vokser som monolag. Cellelinjen stammer en kjemikalieindusert
svulst i rotte.
-ostosarcom cellelinje OHS, vokser som monolag. Cellelinjen stammer fra en pasient med beinkreft
ved Radiumhospitalet
- melanom cellelinje FME, vokser som monolag Cellelinjen stammer fra en pasient med hudkreft ved
Radiumhospitalet.
Deretter skal to og to fra hver gruppe komme tilbake de påfølgende dagene for å løsne cellene og
telle dem. På bakgrunn av telletallene skal gruppen på 8-9 tegne en vekstkurve.
2

Emne SIF 4070 Cellebiologi, vår2001 Labøving nr 2: Celledyrking
Fremgangsmåte ved demonstrasjon og eget arbeid:
1.Cellene løsnes fra celledyrkningsflasken.
For celler som gror som monolag (BAHAN C, OHS og FME)
- Sug av vekstmediet med pasteurpipette.
- Tilsett 3ml PBS (fosfat-buffret saltvann) og vipp celledyrkningsflasken litt frem og tilbake.
- Sug av PBS.
- Tilsett 1.5ml Trypsin. Trypsin er et enzym som bryter ned proteiner på overflaten av cellene.
Disse proteinene har som funksjon å binde cellen til celledyrkningsflasken. Ved nedbrytning av
disse proteinene løsner cellene fra flasken.
- Inkuber cellene med trypsin ved 37° C i 3-5 minutter, inntil cellene har løsnet.
- Tilsett 2ml vekstmedium for å stoppe enzym-reaksjonen.
- Bland godt med en pasteurpipette.
For celler som gror som suspensjon (U698M)
- Bland cellene godt ved å kakke forsiktig i flasken og etterpå vippe frem og tilbake. Bruk en
pipette og pipeter forsiktig i suspensjonen og overfør cellesuspensjonen til et sentrifugerør.
Videre fremgangsmåte er felles for alle cellelinjene.
2. Telling av celler.
- Fest et dekkglass til bürkerkammeret og legg så en liten dråpe av cellesuspensjon på hver side
av dekkglasset slik at dråpen trekker seg inn under dekkglasset.
Bürkerkammeret har 5x5 felter og 5 av disse bør telles.
- Bestem så cellekonsentrasjonen ved å telle i mikroskop.
- Dersom dekkglasset er riktig festet til bürkerkammer er volumet av cellesuspensjonen pr felt 0.1
μl. Cellekonsentrasjon (antall celler /ml) er da:
N/(NR⋅ 0.1μl) =N⋅10 4 / NRml
N= antall talte celler
NR= antall talte ruter
Ved demonstrasjonen blir det sådd ut 2x4 flasker celler med en cellekonsentrasjon som avhenger av
når cellene skal løsnes og telles.
Cellekonsentrasjonen som blir funnet ved de fire tellingene skal brukes til å bestemme vekstkurven
og cellelinjens doblingstid.
Rapport (felles for hele gruppen på 8 studenter)
1. Beskriv kort hva dere har gjort.
2. Framstil vekstkurven på semilogaritmisk papir (antall celler langs log-skala). Lag en fullstendig
figur med tekst langs aksene og figurtekst. Bruk Excel, Sigmaplot eller et annet program for grafiske
framstillinger.
3. Diskuter resultatene:
Er veksten eksponentiell?
Angi doblingstiden.
Sammenlikn vekstkurvene og doblingstidene for de forskjellige cellelinjene, og kommenter
forskjellene.
3