morfologiske studier av en farlig spirochet - BIO

Recommendations

Info

fi ns mange feilkilder. Artefakters strukturlikhet med Borrelia kan være stor, så omfattende undersøkelser må til før man eventuelt kan bruke denne teknikken til sykdomspåvisning. Mikroskopi av «levende blodprøver». Mikroskopiske studier av «levende», ubehandlet blod uten til setninger kan i fasekontrast avsløre mange interessante fenomener. F. eks. er det mulig for kort tid å utføre time-lapse fi lming av bevegelsesfenomener i blodfi lmen. Borrelia kan imidlertid være vanskelig å påvise. Antakelig gjelder her de samme optiske forhold som for syfi lis-spirocheten (Treponema pallidum) som har om lag samme brytningsindeks som blodplasma (Carleton 1967). I blodfi lmer vil spirocheter derfor være vanskelige å se, både ved fasekontrast og mørkefeltmikroskopi. Tilstede værelse av spirocheter ved våtblodsmikroskopi røpes vanligvis ved uregelmessige bevegelser av de røde blodcellene. Bevegelsesmønsteret er ulikt de vanlige Brownske bevegelsene. Vi er også kjent med at perlekjedeliknende strukturer kan bli synlige etter en tid i «levende» blodfi lmer, muligens som følge av økt brytningsindeks under omdannelse til perlekjede-stadiet. Spirochetliknende tråder med egenbevegelse kan fore komme. Med moderne digital teknikk kan bevegelsesmønsteret nå fi lmes i sann tid eller med tidsforkortning («time-lapse») og eventuelle misoppfatninger oppklares. Før lot dette seg kun gjøre med særs kostbart analogt fi lmutstyr, eller spesialbygde videokameraer som i praksis kun var forbeholdt spesialinstitutter (se Laane 2006). Koagulasjonsfenomener og celleforandringer inntrer imidlertid etter kort tid. Også Brownske bevegelser og væskestrømninger i preparatet kan gi opphav til feiltolkninger. Time-lapse fi lming av hvite blodceller i næringsmedium som infi seres med Borrelia vil lett kunne utføres, og kan gi viktige opplysninger om infeksjonsmekanismen. BOKS 1. Artikkelen bygger på følgende materiale: 1) Levende prøver av tallrike spirochetarter (andre enn Borrelia) hos termitter i forbindelse med cellulære evolusjonsstudier (se Laane & Yu 2000). 2) Klassiske histologiske preparater fra andre blodsykdommer undersøkt i mikroskop for å vinne erfaring, - herunder malaria (Plasmodium vivax), sovesyke (Trypanosoma gambiense), Babesia, og mikrofi larier (Dirofi laria immitis). 3) Kulturer av nematoden Chaenorhabditis elegans, som er blandet med blod til utstryk for å simulere det optiske bildet ved nematodeinfeksjon i blod. Husk: Det er kjent at både nematoder og fl agellater (trypanosomer) også kan overføres ved fl åttbitt. 4) Bomullsfi bre og andre vanlig forekommende (også syntetiske) fi bre, som kan forveksles med nematoder. Disse fi ns som støvpartikler og er blandet i blodutstryk for å utrede forskjeller i optiske egenskaper, som gjør det mulig å skille dem fra biologiske partikler i reelle infeksjoner. 5) Levende fl ått (nymfer og voksne) (Ixodes ricinus) er innsamlet i Vestfold, Marker i Østfold og i områder ved Lindesnes. Flått ble dissekert i saltløsning og mageinnholdet mikroskopert for forekomst av spirocheter, cyster og granulære former. Et mer omfattende materiale er under bearbeidelse. 6) Humant materiale (se også pkt. 8) som omfatter bl.a. utstryk av EDTA-blodprøver fra alvorlig syke pasienter, som mistenkes for å ha kronisk Lyme-borreliose (CLB) eller infeksjoner med Babesia. Det humane materialet vil bli presentert i en senere artikkel. 7) Eget materiale er sammenliknet med kultivert Borrelia-materiale av sikker type innkjøpt fra Carolina Biological i USA. 8) To tuber med levende Borrelia-cyster på destillert vann sendt oss fra Øystein Brorson, Vestfold Sentralsykehus. Prøvene er studert med ulike teknikker. Borrelia har en komplisert livssyklus I termittene inngår spirocheter i et naturlig og nødvendig symbioseforhold (se Fig. 6). I fl ått, pattedyr og fugler fi ns Borreliabakterien i naturlige reservoarer og lever på grensen mellom en parasitt og en symbiont; hos menneske er bakterien et patogen som gir sykdom. Borrelia-bakteriens utvikling og livssyklus som symbiont (eks. fl ått-tarmen) og patogen (eks. human borreliose) i ulike organismer er ufullstendig kjent. Likevel har vi gjennom egne under søkelser og henvisning til en rekke nye arbeider (Brorson & Brorson 1997, Brorson & Brorson 1998a, 1998b, Miklossy 2008, Miklossy et al. 2008) etter hvert dannet oss et bilde av Borreliabakteriens livssyklus og dens ulike morfo logiske former. Dette er oppsummert i Fig. 3. Borreliabakterien kan opptre i ulike former både in vitro og in vivo. Den kanadiske forskeren Judith Miklossy og hennes forskergruppe har nylig påvist cyster og granu- biolog, nr. 2 2009 39
lære former av Borrelia i infi sert, infl ammert hjernevev hos pasienter med langtkommet nevroborreliose, tilsvarende det man ser hos enkelte syfi lispasienter infi sert med Treponema-spirochet en (Miklossy 2008, Miklossy et al. 2004, 2008). Ved hjelp av forfi nete immunohistokjemiske metoder har de kunnet påvise pleomorfe former av Borrelia in vivo, i overveiende grad cyster og granulære former i hjernevevet. Denne forskergruppen har også studert bakterien og infl ammasjonsprosessen ved infeksjon av vevskulturer og gjort interessante komparative funn. Trekk fra morfologisk syklus (Fig. 3 og 4) Vegetative korketrekkerformete spirocheter av Borrelia med «kappe» (Fig. 3, stadium 1; Fig. 4 d-l), deler seg ofte i to på tvers av lengdeaksen (Fig. 3, st. 2; Fig. 4 k). Tynnere, trådformete til svakt korketrekkerformete spirocheter uten kappe er vist i Fig. 4 h. Noen ganger har vi observert utviklingen av et såkalt «cluster» (Fig. 3, st. 3; Fig. 4 n), andre ganger omdannes den spiralformete cellen til små fragmenter ved tverrdelinger, og inntar en granulær form, gjerne ordnet i rekke som et perlekjede (Fig. 3, st. 4; Fig. 4 h). Spirocheter og ikke minst perlekjedestadiet og granulerte enkeltfragmenter av Borr elia er ørsmå strukturer med enkle geometriske former (Fig. 3, st. 5; Fig. 4 j). Disse minste formene, som kan opptre som løsrevne enkeltfragmenter (granulae), synes nå godt dokumentert både in vitro og in vivo (Miklossy 2008, Miklossy et al. 2008). Vi vet også med sikkerhet at Borrelia og mange andre spirocheter kan danne cyster, en form for hvilestadier som oppstår så snart de sterkt bevegelige og aktive bakteriene får suboptimale leveforhold (Fig. 3, st. 6; Fig. 4 a-c). Cystedannelsen kan oppfattes som et forsvar mot brå miljøendringer, og selve prosessen kan lett følges i mikroskopet. Disse cystene kan sprenges (Fig. 3, 40 biolog, nr. 2 2009 BOKS 2 Mikroskopiske metoder og teknikker 1) Det er under arbeidet anvendt et bredt register av mikroskopiske instrumenter og metoder. De fl este mikrofotografi ene er tatt i et Zeiss Photomicroscope III med apokromatisk optikk og ombygd for digitalfotografi . Lupebilder av fl ått (voksne og nymfer) er fotografert med Zeiss Tessovar fotolupe tilpasset et Bresser digitalkamera. Blodfi lmer er farget med en variant av standard Giemsa fargeteknikk for blodutstryk. 2) Til fl uorescensmikroskopi ble det brukt et Leica Diavert mikroskop (inverst mikroskop) med spesialoptikk utstyrt med kvikksølvhøytrykksbelysning HBO 100W, og Lagner-Voss LED 1000 Lumen fl uorescens tilsats (Ploemsystem). Det ble brukt Leica spesialobjektiv 40x/1.30, eller Zeiss neofl uar 100x/1.30 og et spesialtilpasset Olympus Camedia 5050 digitalkamera med infrarød utløser. 3) Akridin-orange (AO), (Merck) ble løst i vann, - alternativt med tilsats av 0,9 prosent NaCl i forholdet 1:10 000. Vi har også utprøvd Bisbenzimid H 33258 (Riedel-de Haen) og prober fra «Dig DNAlabeling kit» (Boehringer) som begge ga svært spesifi kk DNA-fl uorescens i cyster og hvite blodceller. Ikke uventet fi kk vi likevel de mest informative fl uorescensbildene med (AO). I visse tilfeller kan (AO) også skille tydelig mellom DNA (grønn fl uorescens) og RNA (rød fl uorescens). Dette klassiske fl uorochrom fortjener en renessanse i moderne mikroskopi. 4) Borrelia-cyster i destillert vann ble dryppet på forvarbelagte enkelthullsgrids og farget i 1% uranylacetat for transmisjons-elektronmikroskopi. Preparatene ble digital-fotografert i et Philips CM 100 elektronmikroskop. 5) Bildene er etterbehandlet i Adobe Photoshop. Enkelte bilder med spesiell høy digitaloppløsning er produsert fra digitale «bildestabler» i z-aksen eller fremstilt ved «panoramafotografering» ved bruk av programmene «Combine-Z» eller «Autostitch». For detaljer vedrørende generelle mikroskopiske teknikker og metoder for digitalfotografi henvises til mer omfattende fremstillinger (Laane & Lie 2007, Laane 2007). st. 7; Fig. 4 d-h). Både cyster og enkeltfrag menter kan spire og produsere nye, korketrekkerformete spirocheter når leveforholdene igjen begunstiges. I cystene ses ofte «parallelle» bakterie rekker, hvor fl ere individer er posisjonert tett sammen i sentrum. Vi mistenker derfor at det i cystestadiet også kan forekomme seksuelle prosesser, uten at dette har vært utredet. Mye er fortsatt omdiskutert Nyere, svært omdiskutert forskning, antyder at det også kan være en sammenheng mellom multippel sklerose (MS) og spirochet-infeksjon (Mattman 1993). Nylig er det også påvist spirochet-infeksjon i hjernevev hos pasienter med langt fremskreden Alzheimers sykdom (MacDonald & Miranda 1987, Miklossy et al. 2004, MacDonald 2008, online; se også MacDonald web-page), uten at det nødvendigvis er noen indikasjon på hva som er årsaken til sykdommen (!). Utvilsomme spirocheter er imidlertid påvist i hjernevev, sannsynligvis Borrelia.
Page 1 and 2: Borrelia og Lyme-borreliose - morfo
Page 3 and 4: kommensaler, eller som parasitter (
Page 5 and 6: 34 biolog, nr. 2 2009 a d g j b e h
Page 7 and 8: dekkglass i bunnen. Etter 2-3 timer
Page 9: ugunstige vekstbetingelser. Det kan
Page 13 and 14: Fig. 7 (a-b). Levende celler utdiss
Page 15 and 16: ner til infeksjons- og utviklingsm

morfologiske studier av en farlig spirochet - BIO

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?