7.012 Conjunto de Problemas 5 - MIT

Nome _____________________________ Seção _________
7.012 Conjunto de Problemas 5
Pergunta 1
Enquanto estudava um problema de infertilidade, você tentou isolar um gene hipotético de coelho
que seria responsável pela prolífica reprodução desses animais. Após muito esforço, você
finalmente conseguiu mapear um gene no cromossomo Y de alguns animais que pode ser
responsável pela grande fertilidade dos coelhos. Você chama esse gene de Gene de Alta
Reprodução Cromossomo – Y, ou apenas hrgY.
Você deseja testar o efeito da expressão do gene hrgY dos coelhos em camundongos. Você injeta o
fragmento linear de DNA para o gene hrgY dos coelhos em óvulos fecundados de camundongo
ainda no estágio unicelular. Esse DNA é aleatoriamente inserido no genoma dos camundongos. Os
animais resultantes das injeções bem-sucedidas possuem o gene hrgY integrado na mesma posição
do genoma em cada uma das células. Esses camundongos são chamados de “transgênicos”.
a) A seguir, qual dos dois fragmentos do genoma dos coelhos você escolheria para injetar nos
camundongos? Por quê?
DNA genômico de coelho
Fragmento 1
Fragmento 2
promotor
gene hrgY

Pergunta 1 cont.
Você injetou com sucesso o gene de coelho hrgY de 2200 bp em óvulos fertilizados de
camundongo em estágio unicelular. Desses óvulos nasceram filhotes de camundongos e você
realiza um PCR para confirmar que esses animais carregam o gene hrgY de coelhos. Suas reações
de PCR possuem como molde uma amostra do DNA genômico de cada um dos filhotes de
camundongo. Com os iniciadores adequados, você consegue amplificar um fragmento de 380 bp
dentro de um íntron do gene hrgY de coelhos. O DNA amplificado é submetido a uma eletroforese
em gel.
b) Na faixa 1 do gel a seguir, ilustre a(s) banda(s) de DNA, caso existam, que poderiam ser
visualizadas se o DNA fosse amplificado de um camundongo portador do gene hrgY de coelhos.
Na faixa 2 do gel, ilustre a(s) banda(s), caso existam, que poderiam ser visualizadas se o
camundongo não fosse portador do gene de coelhos.
Marcadores
MW Faixa 1 Faixa 2
c) Após realizar as reações de PCR, você encontra um camundongo portador do DNA hrgY de
coelhos. Isso é suficiente para mostrar que o gene é expresso? Caso a resposta seja negativa,
quais são as outras moléculas que você deve procurar e por quê?
d) Você procura por expressões do hrgY em diversos tipos de tecidos dos camundongos
transgênicos e descobre que ele é expresso apenas em um órgão desses animais – o testículo.
Mas você sabe que o gene hrgY está presente em todas as células do animal. O que pode ser
encontrado nas células testiculares que pode ser considerado como a expressão tecidual muito
específica do gene hrgY?
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Pergunta 2
Usando a seqüência conhecida de DNA do hrgY, é possível derivar a seqüência de aminoácidos da
proteína HrgY para obter pistas sobre a sua função. Considerando a polaridade, carga e ordem da
posição dos aminoácidos em HrgY, é possível observar a presença de um domínio transmembrana e
sítios para a glicolização.
a)
i) Quais são as principais características do domínio transmembrana? Inclua o tipo de
aminoácidos que serão encontrados em um domínio transmembrana.
ii) Onde é possível encontrar proteína com domínios transmembrana?
iii) Relacione duas funções de uma proteína de membrana em uma célula.
iv) O que é glicolização?
v) Em qual organela a glicolização ocorre?
b) Se houver a possibilidade de a Partícula de Reconhecimento de Sinal estar ausente em uma
célula, poderíamos esperar….
Circule uma opção
1 que as proteínas transmembrana dessa célula sejam glicolizadas? SIM NÃO
2 que as proteínas transmembrana sejam completamente traduzidas ? SIM NÃO
3 que os genes que codificam as proteínas transmembrana sejam transcritos? SIM NÃO
4 que as seqüências de sinais sejam clivadas? SIM NÃO
5 que as proteínas secretadas sejam exportadas? SIM NÃO
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Pergunta 3
Ao comparar a seqüência de aminoácidos de HrgY com outras proteínas conhecidas, é possível
observar que a proteína de HrgY apresenta uma homologia surpreendente em relação a outros
receptores de tirosina quinases.
a) Qual é a função do domínio da tirosina quinase (TK)?
b) Para determinar se o domínio TK é significativo ou não para a proteína HrgY, crie uma versão
mutante do gene hrgY que codifique um domínio tirosina quinase ativo constitutivamente dentro
da proteína HrgY. Essa proteína mutante não é mais acessível as fosfatases. A proteína mutante
poderia ser encontrada em um estado
fosforilado ou não-fosforilado? (Circule uma opção).
Para descobrir o efeito que a proteína ativa HrgY pode apresentar, realize a clonagem do gene
mutante hrgY em um vetor de mamífero (um plasmídeo que pode ser replicado em células de
mamíferos). Faça a “transfecção” (semelhante á “transformação” em bactérias) das células
testiculares de camundongo normais em cultura de tecido com as construções de seu vetor.
Compare as células murinas transfeccionadas que contém o vetor portador do hrgY mutante com um
grupo controle de células de camundongo que foram transfeccionadas apenas com o vetor ou com o
vetor portador do gene hrgY tipo selvagem (veja a seguir). É possível observar que as células de
camundongo que sintetizam a proteína HrgY mutante mostram um impressionante aumento nos
níveis de uma outra proteína, que recebe o nome de “Proteína X”.
Transfecção
apenas com o
vetor
Medir a
produção de
proteína
baixos
níveis de Proteína X
células normais de testículo de camundongos
Transfecção com o
vetor portador do
gene hrgY selvagem
Medir a
produção de
proteína
baixos
níveis de Proteína X
Transfecção com o
vetor portador do
gene hrgY
codificando um
domínio ativo de TK
na proteína HrgY
Medir a
produção de
proteína
altos
níveis de Proteína X
c) Explique, em termos gerais, como uma tirosina quinase ativa na membrana plasmática poderia
causar o aumento da Proteína X dentro da célula. Certifique-se de incluir transcrição “ em sua
resposta.
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Pergunta 4
Finalmente você consegue determinar que o gene hrgY incluído não possui nenhum efeito na
fertilidade dos camundongos. Apesar de ter aprendido pouco a respeito do hrgY com a sua linhagem
de camundongos transgênicos, você decide continuar seu estudo pois, nessa etapa, você já investiu
um ano de pesquisa sobre esse gene e não se sente à vontade para dar início a um projeto
completamente novo.
Em um experimento longo, você cultiva em meio de cultura células isoladas dos testículos de
camundongos transgênicos portadores do tipo selvagem do gene hrgY e mede a síntese da Proteína
X. A produção de Proteína X nessas células é bastante baixa. Entretanto, quando essas células são
cultivadas em um meio enriquecido com o soro de coelhos, você descobre que a expressão do nível
de Proteína X aumenta de forma impressionante. (Veja figura a seguir). Observação: células
normais de testículos de camundongo cultivadas em soro de coelhos não demonstram aumento nos
níveis de Proteína X (dados não fornecidos).
a) Como você explica isso?
Isolar células de testículo de camundongos
transgênicos expressando o gene hrgY.
Crescem na presença
do soro de coelho
Alta produção de Proteína X
células de testículo de camundongos
Dividir em duas placas de Petri
Medir a produção de proteína X
Crescem sem o soro de coelho
Baixa produção de Proteína X
b) Você já determinou que o gene hrgY está sendo expresso nos testículos dos camundongos.
Considerando o experimento descrito acima, por que motivo esse gene pode não estar afetando a
fertilidade dos camundongos?
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Pergunta 4 cont.
Após mais alguns anos de estudo (você está agora no quarto ano do UROP), você finalmente
conseguiu purificar um componente do soro de coelhos que é capaz de induzir a expressão da
Proteína X nas células transgênicas. Você determinou que o componente é uma proteína secretada à
qual dá o nome de SecC.
c) A proteína SecC purificada do soro teria uma seqüência de sinal anexa? Por quê?
d) Você acredita que a proteína SecC possui uma seqüência de sinais em qualquer etapa da síntese?
Se sua resposta for sim, quando?
Curioso em relação ao efeito da proteína SecC nos camundongos transgênicos vivos, você insere o
gene codificando o SecC no genoma de um vírus. Você infecta o camundongo transgênico com esse
vírus, que irá se integrar ao DNA (inclusive o gene secC) no genoma de qualquer uma das células
do camundongo que ele venha a infectar.
Surpreendentemente, os camundongos transgênicos infectados com o vírus portador do gene secC
estão apresentando um aumento de fertilidade.
e) O vírus portador do gene secC precisa infectar as células dos testículos dos camundongos
transgênicos para aumentar a fertilidade? Explique sua resposta.
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