duração da imunidade vacinal na leishmaniose visceral canina ...

Material e Métodosminutos a 4ºC. O sobrenadante contendo o antígeno solúvel de Leishmania foicoletado e transferido para membrana de diálise, e então dialisado contra PBS(0,15M, pH 7,2) a 4ºC, sob agitação constante, durante 24 horas. Por fim, o antígenofoi filtrado em filtros estéreis descartáveis, de 0,22 µm em condições de fluxolaminar.Uma alíquota foi retirada para dosagem da concentração de proteínas pelométodo de LOWRY(1951). Alíquotas do antígeno com a concentração protéica de1000 µg/mL foram feitas e mantidas congeladas a -70ºC, até o momento do uso.7- Ensaio da imunofenotipagem celular e marcação de citocinasintracitoplasmáticasForam coletados aproximadamente 5mL de sangue periférico, utilizando-seseringas plásticas estéreis e tubos de ensaio heparinizados.Em 3 tubos de polipropileno estéreis numerados sequencialmente, foramadicionados respectivamente 500 µL do sangue coletado e diluídos 1:1 com RPMI1640. O tubo 1 foi determinado como cultura controle. No tubo 2, determinado comcultura estimulada, foi adicionado nas 4 últimas horas de incubação, 25 µL de PMA(estímulo pan-leucocitário) diluído previamente 1:1000 da solução estoque (solução1mg/mL) e 2 µL de Ionomicina (solução 1mg/mL). No tubo 3, com cultura sobestimulo com ASL, foi adicionado 25 µL de ASL na concentração de 1mg/mL.Os tubos foram incubados em estufa de CO 2 a 37ºC e 5% de umidade por 48horas. Nas 4 últimas horas de incubação foram adicionados em todos os tubos 10µL de Brefeldina A (solução 1mg/mL).Foram adicionados 110uL de EDTA (20mM) em cada tubo, para obter umaconcentração final de 2mM. O EDTA foi preparado no momento do uso diluindo umasolução estoque de 200mM (diluição 1:10 em PBS 1X). Os tubos foramhomogeneizados suavemente em vórtex e incubados por 10 minutos, a temperaturaambiente. Após incubação, os tubos foram centrifugados a 400 x g por 7 minutos, atemperatura ambiente. Foram adicionados 3mL de PBS-W (solução salinatamponada com fosfato-PBS = 0,15M, 8g/L de NaCl, 2g/L de KCl, 2g/L de KH 2 PO 4 e1,15g/L de Na 2 HPO 4 , pH 7,2 com 0,5% de albumina bovina sérica (BSA) e 0,1% deazida sódica) em cada tubo, homogeneizados manualmente e centrifugados por 749