SELECTIA ASISTATĂ DE MARKERI MOLECULARI PENTRU ...

UNIVERSITATEA DE STIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ
VETERINARĂ CLUJ NAPOCA
SCOALA DOCTORALA
FACULTATEA DE AGRICULTURĂ
Biolog DANA M. BOTA (CURTICIU)
SELECTIA ASISTATĂ DE MARKERI
MOLECULARI PENTRU REZISTENŢA GRÂULUI
COMUN (TRITICUM AESTIVUM) LA
SEPTORIOZĂ (SEPTORIA TRITICI)
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
Prof. Univ. Dr. CONSTANTIN BOTEZ
CLUJ-NAPOCA
2010

CUPRINS
INTRODUCERE ............................................................................................................................ 3
CAPITOLUL I ................................................................................................................................ 4
1.1. Agentul patogen şi simptomele bolii ................................................................................. 4
1.2. Metode de combatere a bolilor .......................................................................................... 6
1.3. Determinismul genetic al rezistenţei grâului la septorioză ............................................. 7
CAPITOLUL II .............................................................................................................................. 7
2.1. Clasificarea şi caracteristicile markerilor moleculari .................................................... 7
2.2 Aplicaţiile markerilor moleculari în ameliorarea plantelor ............................................ 8
CAPITOLUL III ............................................................................................................................. 9
3.1. Selecţia asistată de markeri ............................................................................................... 9
3.2. Atribuirea markerilor genelor de interes ......................................................................... 9
CAPITOLUL IV ............................................................................................................................. 9
4.1. Scopul si obiectivele tezei de doctorat .............................................................................. 9
4.2. Materialul biologic utilizat ............................................................................................. 10
4.3. Metode de lucru ................................................................................................................ 10
4.3.1. Izolarea si cuantificarea ADN-ului ............................................................................. 10
4.3.2. Amplificarea ADN-ului cu ajutorul markerilor RAPD ............................................... 10
4.3.3. Amplificarea ADN-ului cu ajutorul markerilor SSR .................................................. 10
4.3.4. Electroforeza fragmentelor de ADN .......................................................................... 11
4.3.5. Preluarea şi analiza imaginilor .................................................................................... 11
4.3.6. Menţinerea, multiplicarea şi conservarea sporilor de Septoria tritici ......................... 11
4.3.7. Metoda Bulk Segregant Analysis ................................................................................ 11
4.3.8. Clonarea ADN-ului din benzile polimorfe .................................................................. 11
4.3.9. Obţinerea materialului segregant F2 în urma hibridării formelor parentale ................ 12
CAPITOLUL V ............................................................................................................................. 12
5.1. Rezultate privind izolarea ADN-ului .............................................................................. 12
5.2. Rezultate privind selecţia pentru rezistenţa grâului la septorioză utilizând tehnica
SSR ............................................................................................................................................ 12
5.2.1 Rezultate privind amplificarea ADN-ului de la liniile parentale ............................... 12
5.2.2. Rezultate privind amplificarea ADN-ului de la liniile dihaploide .............................. 15
5.3. Rezultate privind atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistenţă pe
baza cosegregării ..................................................................................................................... 16
5.3.1 Rezultate privind amplificarea ADN-ului de la liniile parentale ................................ 16
5.3.2. Rezultate privind amplificarea ADN-ului de la liniile dihaploide ............................. 16
5.4. Rezultate privind atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistenţă pe
baza metodei BSA .................................................................................................................... 17
5.4.1. Obţinerea materialului hibrid ...................................................................................... 17
5.4.3. Atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistenta la Septoria tritici pe
baza metodei BSA ................................................................................................................. 17
5.4.4. Stabilirea relaţiilor de linkage dintre markeri RAPD atribuiţi genelor de rezistenţă şi
genele de rezistenţă la STB ................................................................................................... 18
5.5. Rezultate preliminare privind clonarea produşilor de amplificare ............................ 19
CONCLUZII ................................................................................................................................. 20
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ ................................................................................................... 21
3

INTRODUCERE
În cadrul acestei teze de doctoat ne-am propus studierea cu ajutorul tehnicilor de biologie
moleculară, mai ales cu ajutorul markerilor moleculari, a polimorfismului molecular la nivel de
ADN în scopul identificării unor markeri asociaţi cu genele de rezistenţă la septorioză. În
principal s-a realizat testarea markerilor moleculari RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA) şi a markerilor microsatelitici SSR (Simple Sequence Repeat) pentru realizarea selecţiei
asistate de markeri pentru rezistenţa grâului comun (Triticum aestivum) la septorioză.
Grâul este una din cele mai vechi plante de cultură, are o importanţă alimentară deosebită
şi are cea mai largă răspândire pe glob, ocupând circa 90% din suprafaţa mondială cultivată cu
cereale. Această cereală este atacată de numeroase boli dintre care una din cele mai importante
este septorioza, produsă de agentul fitopatogen Mycosphaerella graminicola. În ţara noastră
această boală poate produce, în anii cu toamne şi primăveri ploioase, pagube ce pot ajunge la 10-
15% din producţia de grâu. Interesul faţă de acest agent patogen a fost stimulat de preocuparea
cultivatorilor şi a oamenilor de ştiintă din zonele geografice cu cele mai mari suprafeţe cultivate
cu acestă cereală, unde focarele bolii sunt capabile să reducă randamentul culturilor pană la 30-
40% (Eyal et al., 1987).
Ca metode de combatere ale acestei boli se pot utiliza cultivare rezistente, efectuarea
controlului chimic şi aplicarea practicilor agricole. Una dintre metodele de combatere a bolilor
larg răspândite este combaterea chimică, dar utilizarea fungicidelor este legată şi de o serie de
dezavantaje care nu pot fi trecute cu vederea:
sunt costisitoare, producerea lor necesitând cantităţi importante de materii prime şi un
consum ridicat de energie;
tratamentele chimice trebuie repetate în fiecare an, iar în cazul unor boli de mai multe ori
pe an; unele sunt fitotoxice faţă de unele soiuri ale ale aceleiaşi culturi, etc.
În prezent, în numeroase tări se execută lucrări ample de ameliorare a rezistenţei plantelor
la bolile care se transmit prin seminţe.
Cercetările noastre s-au desfaşurat pe durata a trei ani, 2006-2009, perioadă în care am
efectuat experimente atât în campul experimental, cât şi în laborator.
Departamentul de Genetică şi Ameliorarea Plantelor al USAMV Cluj-Napoca, unde miam
desfăşurat activitatea are o bună colaborare cu Instututul National de Cercetare - Dezvoltare
Agricola (INCDA) Fundulea, institut ce ne-a pus la dispozitie materialul biologic necesar
realizării acestui studiu. O parte din rezultate prezentate în acesta teza au fost publicate de mine
şi de catre conducatorul meu de doctorat sub forma de articole (Botez et al., 2007; Botez et al.,
2009; Dana Curticiu et al., 2009), precum şi sub forma de postere (Botez et al., 2008; Dana
Curticiu et al., 2008; Dana Curticiu et al., 2007).
Pentru realizarea acestui proiect am avut ca suport financiar proiectul CEEX cu titlul
„Construirea unei noi baze genetice pentru cerealele viitorului” şi grantul CNCSIS tip TD, pe
care l-am castigat în anul 2008. În timpul programului de doctorat am beneficiat de o bursă
Socrates-Erasmus la Universitatea din Copenhaga, Facultatea de Ştiinte ale Vieţii, unde, sub
îndrumarea profesorului Sven B. Anderson şi a profesorului asociat Anna Maria Torp am avut
oportunitatea de a-mi îmbunatăţi cunoştinţele teoretice şi practice în domeniul geneticii
moleculare.
Doresc sa adresez mulţumirile cuvenite tuturor care, direct sau indirect, prin sugestiile
oferite au contribuit la finalizarea acestei teze. Pe tot parcursul efectuarii acestei lucrări am
beneficiat de sprijinul permanent al domnului profesor dr. Constantin Botez, conducătorul
ştiinţific al tezei de doctorat, căruia ii aduc, pe acesta cale, cele mai sincere mulţumiri pentru
îndrumarea activităţii mele ştiintifice.
Cu acesta ocazie adresez multumiri conducerii Universităţii de Ştiinţe Agricole şi
3

Medicină Veterinară Cluj–Napoca, conducerii Facultăţii de Agricultură şi colectivului de la
disciplina de Genetică şi Ameliorarea Plantelor pentru asigurarea cadrului academic ştiintific în
care mi-am desfăşurat activitatea pe parcursul anilor de studiu.
Multumesc domnului dr. Nicolae N. Saulescu de la INCDA Fundulea şi doamnei dr.
Rozalia Kadar de la SCDA Turda pentru punerea la dispoziţie a materialului biologic necesar în
experimentele noastre.
Doresc să le mulţumesc colegilor de doctorat: Daniela, Erika, Laura, Raluca, Ioana C.,
Ileana, Stefana, Carmen, Francesca, Ioana P., Tiberia, Alex, Moumen, Paul R. şi Cristi, pentru
sprijinul şi ajutorul acordat. Le multumesc, de asemenea, colegilor de master: Oana şi Paul.
Nu în ultimul rând ţin să mulţumesc familiei, sotului meu şi prietenilor pentru sprijinul
moral şi material, pentru susţinerea şi înţelegerea pe care mi-au acordat-o pe parcursul acestor
ani de studiu.
1.1. Agentul patogen şi simptomele bolii
CAPITOLUL I
Introducere
Septorioza grâului este produsă de mai multe specii ale genului Septoria, dintre care două
sunt mai răspândite: Septoria tritici şi Septoria nodorum. Septoriozele grâului sunt larg
răspândite în toate ţările cultivatoare de cereale păioase, cauzând boli foliare a grâului (figura 1),
ce au un impact mare asupra producţiei de grâu (Eyal, 1999). Amelioratorii urmăresc crearea
unor genotipuri rezistente la boli, care să prezinte calitate, randament, şi să fie stabile într-o gamă
largă de medii de viaţă. Necesitatea rezistenţei durabile este o prioritate pentru amelioratori,
deoarece ameliorarea culturilor pentru a obţine o productivitate ridicată şi stabilă, este practic
imposibil de făcut la cultivare de grâu ce nu prezintă rezistenţă la cele mai importante boli.
Agentul patogen
Agentul fitopatogen, Septoria tritici este o ciupercă bipolară heterotalică (Kema et al.,
1996) care produce septorioza, fiind una din cele mai periculoase boli a grâului comun,
producând importante pierderi economice. În ţara noastră, septorioza apare în fiecare an,
producând pagube mai mari când condiţiile atmosferice favorizează o apariţie timpurie a ei
(Alexandrii et al., 1969).
În România, în prezent, cele mai cultivate soiuri de grâu sunt mai mult sau mai putin
predispuse la Septoria tritici, prin urmare rezistenţa la acest agent patogen este o prioritate în
programele de ameliorare (Mincu, 1999). În ciuda importanţei economice, baza moleculară a
virulenţei şi patogenitatea agentului fitopatogen, nu sunt complet înţelese (Palmer & Skinner,
2002). Ascomicetele care rareori produc spori sexuaţi, sunt cunoscute sub numele dat de
înmultirea asexuată, care este complet diferit de numele dat de înmulţirea sexuată. În cazul
nostru, agentul patogen se înmulţeste atât pe cale sexuată - stadiul pefect sau telomorf, cât şi
asexuată - stadiu imperfect sau anamorf, infecţiile primare fiind iniţiate în principal de ascospori
produsi în pseudotecii (Agrios, 1997).
Procesul de infectie
Sursele primare de inoculul, în ciclul bolii, sunt ascosporii purtaţi de vânt şi
picnidiosporii purtaţi de stropii de ploaie, proveniţi din resturile de plante infectate sau din
seminţele infectate. Ascosporii şi picnidiosporii sunt eliberaşi în condiţii de umiditate ridicată,
ascosporii fiind eliberati din pseudotecile mature pe tot parcursul anului (Palmer & Skinner,
2002). Picnidiosporii pot fi transportaţi vertical de către stropii de ploaie, de la baza plantei spre
frunzele superioare, sau orizontal, spre frunzele din jur. Intervalele lungi fară ploi pot limita
dispersia sporilor, atât pe vertical, cât şi pe orizontal (Eyal et al., 1987).
4

Atacul începe mai întâi pe frunzele de la baza plantei şi apoi treptat pe cele superioare;
când atacul este puternic (pete numeroase), frunzele se uscă de timpuriu, începând cu cele de la
bază; plantele atacate se dezvoltă slab, se maturează forţat şi dau o producţie de boabe inferioară
cantitativ şi calitativ. Atacul se manifestă sub forma unor pete mici, mai puţin evidente, cu puţine
picnidii (Alexandrii et al.,1969). Odată ajunsă pe frunze, ciuperca colonizează mezofilul,
neproducând haustorii; în condiţii optime de temperatură şi umiditate, patogenul produce cloroza
şi necroza ţesutului plantei atacate (Dancer et al., 1999; Kema et al., 1996). Viteza de distrugere
a ţesutului atacat (10 zile de la inoculare), precum şi faptul că celulele plantei sunt afectate, fară
prezenţa miceliului, sugerează faptul că ar putea exista unii compuşi toxici solubili implicaţi în
interactiunea grâu-agent patogen. Cu toate acestea, nici un compus biologic activ, nu a fost izolat
(Eyal, 1999).
Perioada de incubaţie (până la apariţia petelor) este relativ scăzută (6-7 zile), pe când
perioada de fructificare (până la formarea picnidiilor) este de 11-15 zile. Agentul patogen
infectează mai frecvent şi mai puternic limbul (Sivanesan, 1990), mai rar şi mai slab tecile
frunzelor, tulpinile şi spicele, infecţie observaţă doar în condiţii optime de dezvoltare a bolii, în
condiţii naturale (Jones & Cooke, 1969; Brokenshire, 1975; Brokenshire, 1976).
Simptomele bolii
În condiţii optime pe frunzele plantelor tinere se observă pete ovale sau de formă
neregulată, la început de culoare verde pal, apoi brună. Pe frunzele plantelor mai dezvoltate, pe
partea superioară şi mai ales pe cea inferioară, apar pete asemănătoare, dispuse de-a lungul şi
între nervurile frunzei. Petele cresc repede şi i-au o formă alungită, eliptică; uneori se prezintă ca
dungi longitudinale şi au o culoare brună deschis(figura 1-B).Cu timpul, ţesutul din dreptul
petelor se uscă şi se deschide la culoare, mai ales în centrul petei, devenind cenuşiu-albicios,
rămânând înconjurat de o margine brună deschis sau brună-cenuşie. Petele de pe frunze au o
lungime de câţiva milimetrii până la 1 cm.
A
C
Fig. 1. Atac de Septoria tritici pe frunze de grâu
A. sursa: http://www.omafra.gov.on.ca/french/crops/facts/90-008f4.jpg
B. sursa: http://www.freefoto.com/images/07/45/07_45_66-Wheat_web.jpg
C. sursa: http://www.ksre.ksu.edu/library/plant2/EP133.pdf
D. sursa:http://www.hgca.com/hgca/wde/IMAGES/Septoria%202.JPG
B
D
Într-o fază mai avansată a bolii, la suprafaţa petelor apar picnidiile, cufundate uşor în
epidermă, care se văd ca nişte puncte mici, negricioase, dispuse în rânduri paralele de-a lungul
nervurilor (figura 1-A). Boala se transmite de la un an la altul prin resturile de plante atacate
(frunze, tulpini, plevi), astfel ciuperca se poate menţine în viaţă în condiţii nefavorabile o
5

perioadă de timp mai îndelungată (mai mult de 1 an) sub formă de miceliu şi de conidii în
picnidii.
După semănat, în cursul germinării boabelor de grâu, ciuperca trece de pe boabele
contaminate de anul trecut pe plantele tinere ieşite din acestea (figura 2), pe care le infectează
(infecţie germinală). În urma infecţiilor de toamnă, boala apare pe frunzele de grâu prin
simptomele descrise. În frunzele de grâu, miceliul ciupercii rămâne activ chiar la temperaturi
foarte scăzute.
Toamna şi primăvara
cerealele sunt
infectate prin
ascosporii purtaţi de
vânt
Ascospori
Fig. 2. Ciclul de viată al agentului patogen Septoria tritici
(sursa:http://www.hgca.com/minisite_manager.output/3619/3619/Cereal%20Disease%20Encycl
opedia/Diseases/Septoria%20Leaf%20Blotch.mspx?minisiteId=26)
În timpul primăverii şi al verii, ciuperca se înmulţeşte şi se răspândeşte prin picnospori,
care infectează plantele şi produc mai multe serii de infecţii secundare. În afară de grâu, agentul
patogen S. tritici atacă şi culturile de secară, orz şi diferite plante de nutreţ (sp. de Poa, Bromus,
etc.), dar neproducând pagube însemnate (Ao&Griffiths, 1976).
1.2. Metode de combatere a bolilor
Picnidiile ajung pe plante
prin intermediul
picăturilor de ploaie
Peritecii
Formele de rezistenţă sunt miceliul, picnidii
si pseudotecii rămase pe resturile plantelor
Pseudotecile şi
picnidiile se dezvoltă
producând leziuni
Picnidii
Impactul economic al acestui agent patogen cu privire la productivitatea şi calitatea
culturii de grâu a devenit tot mai pronunţat datorită rezistenţei medii sau scăzute a cultivarelor
existente. Distribuţia acestui patogen este dependentă de practicile agricole aplicate, de exemplu
rotaţia culturilor este un factor cheie care afectează obţinerea de viitoare culturi de grâu, de
calitate şi cu o productivitate ridicată (Cook & Veseth, 1991).
Cercetătorii recomandă efectuarea rotaţiei corespunzătoare a culturilor, în combinaţie cu
alte practici agricole pentru a reduce severitatea bolilor, cum ar fi aratul (King et al., 1983),
îndepărtarea şi arderea resturilor vegetale de la cultura precedentă, etc. (Eyal et al., 1987). Pe
langă folosirea de cultivare ce prezintă rezistenţă la boli, se poate apela şi la combatea chimică
prin utilizarea fungicidelor. O varietate de fungicide sunt recomandate şi folosite pentru controlul
septoriozei: Bravo 500 SC, Artea 330 EC, Prosaro 250 EC, Falcon 460 EC, etc.
Combaterea integrată reprezintă combinarea tuturor metodelor de combatere menţionate
mai sus, cu o serie de măsuri agrofitotehnice care au drept scop reducerea la minimum a ratei de
îmulţire a paraziţilor şi întărirea capacităţii de dezvoltare a plantelor şi implicit a rezistenţei
6

naturale a acestora.
Aplicarea tuturor masurilor de igienă culturală, ca de exemplu: îngroparea resturilor
vegetale care au ramas după strânsul paielor şi cocenilor, menţinerea curată a terenului pentru
lucrări corespunzatoare în intervalul de la aratura de vară pană la însămânţare, combaterea
buruienilor în tot cursul vegetaţiei stânjenesc dezvoltarea bolillor (Ceapoiu et al., 1983).
1.3. Determinismul genetic al rezistenţei grâului la septorioză
În ultimii ani s-au facut progrese în ceea ce priveşte nivelul de rezistenţă a grâului la STB
(Septoria trititci blotch), mai mulţi factori influenţând acest progres: creşterea patogenului în
cultură fiind lentă, nevoia de condiţii speciale de mediu pentru efectuarea infecţiilor, precum şi
greutatea întâmpinată la evaluarea simptomelor la plantele infectate (Goodwin et al., 2007).
Gena Stb1 denumită de Wilson în 1985, a fost identificată la cultivarul Bulgaria 88 de
către Rillo si Calswell (1966); genele Stb2 şi Stb3 au fost descoperite în Australia de către
Wilson (1985) la cultivarul Veranopolis şi Israel 493. Gena Stb4 a fost descoperită la cultivarul
Tadorna de Somasco şi colaboratorii în anul 1996, iar gena Stb8 a fost descoperite la varietatea
Synthetic W7984, fiind cartate pe cromozomii 5BL, 3BS, 6DS, 7DS, respectiv 7BL. Aceste gene
au fost identificate prin infecţie naturală, probabil dintr-un amestec de genotipuri patogene. Gena
Stb1 a fost introdusă la cultivarul roşu de iarnă Indiana, Oasis şi Sullivan (Patterson et al., 1975,
1979), această genă a conferit rezistenţa la septorioză în statul Indiana, precum şi în alte părţi ale
vestului Statelor Unite. Gena Stb4 a fost introdusă în California la cultivarul Tadinia şi a conferit
rezistenţa o perioadă de 15 ani (Somasco et al., 1996), dar în anul 2000 acest cultivar nu a mai
fost rezistent şi acum este considerat un cultivarele ce a incorporata aceasta gena sunt
considerate sensibile la septorioză (Jackson et al., 2000).
Celelalte gene: Stb5 (Arraiano et al. 2001b), Stb6 (Brading et al. 2002), Stb7(McCartney
et al. 2003), Stb8 (Adhikari et al. 2003), Stb10, Stb11, Stb12 (Chartrain et al. 2005a, 2005b) şi
Stb15 (Arraiano et al. 2007) au fost identificate la varietăţile: Sinthetic 6x, Flame Hereward,
Estanzuela Federal, graul sintetic W7984, Kavkaz-K4500, TE911, Kavkaz-K4500, respectiv
Arina fiind cartate pe cromozomii 7DS, 3AS, 4AL, 1D, 1BS, 4AL si 6AS (Goodwin et al.,
2007). Distribuţia acestor gene este pe 10 cromozomi ai grâului, aproximativ egală în genomul
A, B şi D .
CAPITOLUL II
2.1. Clasificarea şi caracteristicile markerilor moleculari
Markerii genetici reprezintă forme diferite ale aceleiaşi gene care controlează expresii
fenotipice mutante şi permit identificarea prezenţei unei gene la nivel individual. Markerii
genetici se bazează pe polimorfismul genei la nivelul expresiei fenotipice în relaţie cu condiţiile
de mediu. Există trei tipuri de markeri genetici: morfologici , biochimici şi moleculari Markerii
moleculari sunt cei mai utilizaţi datorită numărului lor nelimitat, aceştia provenind din diferite
tipuri de mutaţii ale ADN-ului: substituţii (mutaţii punctiforme), rearanjamente (inserţii sau
deleţii) sau erori în replicarea ADN-ului în tandem. Aceşti markeri sunt neutrii deoarece sunt
localizaţi în regiuni necodate a ADN-ului, de asemenea, markerii moleculari sunt practic în
număr nelimitat şi nu sunt influenţaţi de condiţiile de mediu sau de stadiul de dezvoltare al
plantelor (Winter & Kahl, 1995). Avantajele şi dezavantajele principalelor tipuri de markeri
moleculari sunt prezentate în tabelul 1.
7

Tabel 1.
Avantajele şi dezavantajele celor mai utilizaţi markeri moleculari pentru analiza QTL
(după Collard et all., 2005)
Marker molecular
RFLP (Restriction
fragment Length
Polymorphism)
RAPD (Random
Amplified
Polymorphic
DNA)
SSR (Simple
Sequences Repeat)
AFLP (Amplified
fragment Length
Polymorphism)
Codominant- C
Dominant -D
C
D
C
Avantaje
Reproductibilitate
Metodă rapidă si
simplă
Ieftină
Necesită cantitati
mici de ADN
Metodă simplă
Repetabilitate
D Polimorfism ridicat
Dezavantaje
Necesită mult timp
Metodă complexă
Necesită cantităţi
mari de ADN
Metodă
nereproductibilă
Necesită mult timp
Metodă complexă
Necesită folosirea
gelurilor de
poliacrilamidă
Necesită cantităţi
mari de ADN
Metodă complexă
Markerii moleculari pot fi clasificaţi în trei clase în functie de metoda lor de detecţie:
(A) markeri moleculari bazaţi pe hibridizare,
(B) markeri moleculari bazaţi pe PCR,
(C) markeri moleculari bazaţi pe secvenţa ADN.
2.2 Aplicaţiile markerilor moleculari în ameliorarea plantelor
În ameliorarea convenţională, rezultatele şi viteza de răspuns obţinute prin aplicarea
selecţiei fenotipice au depins, pe lângă alţi factori, de posibilitatea de a distinge şi capitaliza
variaţiile genetice ţinând cont de faptul că cele mai importante caractere sunt poligenice şi deci
puternic influenţate de mediu. Între modalităţile folosite, de mare interes s-a dovedit posibilitatea
de a identifica caractere fenotipice evidente, cu determinism genetic simplu şi puţin influenţate
de mediu, care să fie asociate cu caractere importante urmărite de ameliorator. Aceste caractere,
numite gene marcatoare sau markeri genetici, au fost folosite de ameliorarea convenţională acolo
unde a fost posibil, pentru a îmbunătăţii eficienţa programelor de ameliorare.
Identificarea unei noi clase de markeri genetici, respectiv a markerilor moleculari,
reprezintă un adevărat eveniment revoluţionar în metodologia de ameliorare a plantelor.
Strategia utilizării markerilor moleculari se bazează pe evidenţierea polimorfismului molecular,
polimorfism care la genomurile plantelor este datorat, în mare parte, variaţiei cantităţii de ADN
repetitiv. Cele mai importante aplicaţii ale markerilor moleculari în ameliorarea plantelor sunt
reprezentate de selecţia asistată de markeri, accelerarea backcrossului, detectarea diversităţii şi
diferenţelor genetice dintre diferite populaţii.
8

3.1. Selecţia asistată de markeri
CAPITOLUL III
Markerii moleculari care sunt strâns linkaţi cu gene importante în sens agronomic sunt
folosiţi ca instrumente moleculare pentru selecţia asistată de markeri în ameliorarea plantelor
(Ribaut & Hoisington, 1998). Cu ajutorul markerilor moleculari se urmăreşte efectuarea unei
selecţii indirecte a caracterelor de interes folosind strânsa legatură (linkage-ul) dintre gena sau
genele care controlează caracterul şi un marker molecular, metodă ce poartă numele de selecţie
asistată de markeri (MAS - Marker Assisted Selection).
Selecţia asistată de markeri constă în identificarea unei legaturi strânse între genele care
controlează caractere agronomice şi markeri moleculari, precum şi utilizarea acestor markeri
pentru a îmbunătaţi linii sau cultivare (Dudley, 1993). Genele sunt moştenite împreună, iar prin
prezenţa uneia (gena marker, la care este cunoscută secvenţa de nucleotide) se confirmă că şi
cealaltă genă ce determină caracterul dorit este prezentă în acel individ.
3.2. Atribuirea markerilor genelor de interes
Pentru a putea fi folositi în munca de selecţie, markerii trebuie să fie atribuiţi genelor de
interes, acest lucru se face prin trei metode:
1. Cosegregare - prin analiza relaţiei de linkage dintre marker şi gena de interes, mai intâi
markerul trebuie asociat genei de interés, iar apoi se face analiza de linkage: dacă distanţa dintre
marker şi genă este mică, markerul se atribuie genei respective.
2. Utilizarea liniilor NIL (Near Izogenic Lines) - obtinute prin metoda backross care constă
în încrucişarea unui soi recurent cu un soi donor. În continuare se face selecţia formelor care
poartă gena de la donor şi care se retroîncrucişează în continuare cu recurentul. Se obţine o linie
NIL asemănătoare cu recurentul, dar care poartă gena de la donor. Urmează a se face o
caracterizare moleculară atât a soiului recurent, cât şi a liniei NIL. Dacă prin analiza fingerprinturilor
de la soiul recurent şi linia NIL se evidenţiază un polimorfism se poate presupune că
markerul molecular ce defineşte acest polimorfism poate fi atribut genei provenite de la donor.
3. Prin utilizarea metodei BSA (Bulk Segregant Analysis)- metodă ce presupune alegerea a
două forme parentale extreme: una rezistentă şi una sensibilă la care s-au dovedit a fi polimorfe
la nivel molecular (Michelmore et al., 1991). Acestea se hibridează, şi în gen F2 segregantă se
face o grupare a indivizilor sensibili şi rezistenţi. Se face extracţia ADN-ului şi în cadrul fiecărei
grupe se amestecă. Urmează amplificarea ADN-ului şi analiza polimorfismului molecular: dacă
între cele două grupe apare un polimorfism molecular (o bandă în plus) la forma rezistentă
înseamnă că markerul molecular respectiv poate fi atribuit genei pentru care s-a făcut selecţia.
Acest sistem funcţionează numai dacă gena pentru care se face selecţia este în faza de cuplare cu
markerul molecular.
4.1. Scopul si obiectivele tezei de doctorat
CAPITOLUL IV
Scopul principal al cercetărilor noastre se referă la testarea şi obţinerea de noi markeri
moleculari în vederea selecţiei asistate de markeri moleculari pentru rezistenţa grâului comun
(Triticum aestivum) la septorioză (Septoria tritici). Utilizarea markerilor moleculari pentru
selecţie oferă avantajul că aceştia nu sunt influenţaţi de condiţiile de mediu, fiind indiferenţi de
expresia genică. În condiţiile în care s-au stabilit relaţii de înlănţuire strânsă între markeri şi
genele de interes se poate face o selecţie indirectă pe bază de markeri vizând ameliorarea
9

caracterului dorit.
Primul obiectiv al acestui proiect este testarea unor markeri de tip microsatelit SSR în
vederea selecţiei pentru rezistenţa grâului la septorioză. Al doilea obiectiv este atribuirea
markerilor moleculari RAPD pe baza cosegregarii. Al treilea obiectiv este atribuirea markerilor
moleculari RAPD pe baza metodei Bulk Segregant Analysis.
Al patrulea obiectiv se refera la clonarea benzilor polimorfe, atribuite genelor de
rezistenta, in vederea convertiri markerilor RAPD polimorfici în markeri specifici SCAR
(Sequence Characterised Amplified Region).
4.2. Materialul biologic utilizat
Materialul biologic utilizat a fost obţinut de la INCDA Fundulea. Pentru acest proiect am
luat în studiu:
22 de cultivare din care 14 soiuri prezintă gene de rezistenţă şi 8 soiuri sensibile la
septorioză considerate forme parentale;
9 linii dihaploide considerate a fi rezistente la septorioză;
23 de linii dihaploide din care 21 linii se consideră a fi rezistente la septorioză şi 2 linii
sensibile la această boală;
material segregant F2 obţinut prin hibridarea formelor parentale.
Utilizarea liniilor dihaploide, obţinute prin dublarea numărului de cromozomi a haploizilor
de grâu rezultaţi dintr-un material hibrid, se justifică prin faptul că liniile dihaploide sunt stabile
în descendenţă, fixând în stare homozigotă recombinarile rezultate în urma hibridărilor. Astfel
este de aşteptat ca în cadrul fiecarei linii să nu existe variabilitate genetică (şi nici segregare) şi în
consecinţă să se poată face o selecţie a liniilor şi nu a plantelor individuale (Botez et al., 2006).
4.3. Metode de lucru
4.3.1. Izolarea si cuantificarea ADN-ului
Izolarea ADN-ului
Metodele de izolare a ADN-ului au ca şi criterii de bază puritatea, integritatea şi
cantitatea de ADN obţinută. S-a demonstrat puritatea ADN-ului este unul dintre cei mai
importanţi factori în reproductibilitatea metodei RAPD. Utilizarea matriţei de ADN cu o
puritatea mare asigură reproductibilitate prin metoda RAPD.
Aceste metode urmăresc eliminarea polifenolilor şi a polizaharidelor care determină
izolarea unor extracte de ADN cu o culoare brună, inaccesibile enzimelor de restricţie.
Cuantificarea ADN-ului
Cuantificarea ADN-ului a fost realizată şi cu ajutorul instrumentului NanoDrop Nd-1000
UV/Vis 1µl Spectrophotometer (Labtech International) conectat la PC.
4.3.2. Amplificarea ADN-ului cu ajutorul markerilor RAPD
Prin amplificarea ADN-ului cu markerii RAPD (Williams et al., 1990) se obţin produşi
de amplficare ce se separă, prin migrare electroforetica în gel de agaroză colorat cu bromura de
etidiu, sub forma unor benzi de dimensiuni diferite. Reacţia de amplificare se realizează automat
în termocyclerul Palm Cycler (Corbett research). Pentru amplificarea probelor noastre de ADN
s-a utilizat un număr de 20 de markeri random.
4.3.3. Amplificarea ADN-ului cu ajutorul markerilor SSR
Secvenţele microsatelit sunt constituite din repetiţii în tandem ale unor secvenţe di, tri
sau tetra nucleotidice, cele mai frecvente fiind secventele dinucleotidice, de exemplu (AC)n.
Markerii SSR utilizaţi în acest studiu au fost selectaţi pe baza literaturii de specialitate, în prezent
10

fiind identificaţi markeri microsatelitici linkati cu o genă sau mai multe gene de rezistenţă la
septorioza grâului comun, astfel au fost testaţi 16 markeri SSR.
4.3.4. Electroforeza fragmentelor de ADN
Electroforeza este un fenomen fizico-chimic de deplasare a particulelor purtătore de
sarcini electrice sub influenţa unui câmp electric. Într-un câmp electric uniform generat de doi
electrozi, particulele încărcate electric se deplasează înspre electrozii de sarcină electrică opusă.
În condiţii standardizate ale mediului de migrare şi ale câmpului electric, mobilitatea
electroforetică depinde în mod esenţial de mărimea şi forma moleculelor.
În condiţii standardizate ale mediului de migrare şi ale câmpului electric, mobilitatea
electroforetică depinde esenţial de mărimea şi forma moleculelor, prin urmare particulele de
mărime mai mică, încărcate electric şi aflate în migrare, se deplassează mai repede decât cele
care au mărime mai mare. În timpul migrării, bromura de etidiu migrează spre catod, în sens
opus faţă de ADN. Dacă migrarea durează prea mult, o cantitate semnificativă de bromură de
etidiu este îndepărtată din gel, făcând dificilă vizualizarea benzilor sărace în ADN (Dordea et al.,
2003).
4.3.5. Preluarea şi analiza imaginilor
După prealabla colorare cu bromura de etidiu produşii de amplificare au fost vizualizaţi
cu ajutorul transluminatorului UV si aparatul BioSpectrum AC Imaging System (Ultra Violet
Products, UVP) si cu ajutorul programului Vision Works LS.
4.3.6. Menţinerea, multiplicarea şi conservarea sporilor de Septoria tritici
Materialul biologic, sporii de Septoria tritici (izolatele IPO 323 şi IPO 94269) au fost
obtinuţi de la Universitatea din Wageningen, Olanda şi au fost utilizaţi pentru infecţia artificială
a unor hibrizi de grâu pentru a evidenţia rezistenţa acestora la acest agent fitopatogen.
În vederea păstrarii şi multiplicării acestui material am folosit două medii de cultură:
mediu solid PDA (Potato Dextrose Agar) şi mediu lichid YGM (Yeast Glucose Medium),
urmând apoi crioconservarea lui pentru utilizările ulterioare.
4.3.7. Metoda Bulk Segregant Analysis
Metoda Bulk Segregant Analysis este utilizată pentru identificarea rapidă a markerilor
linkati de gene specifice sau gene aflate în anumite regiuni genomice (Michelmore et al., 1991)
şi implică compararea a două amestecuri (bulk-uri) de ADN provenit de la mai multi indivizi
apartinând unei populatii segregante generate în urma încrucişării dintre doi părinti. Fiecare
amestec (bulk) conţine indivizi care sunt identici pentru un caracter sau pentru o genă de interes,
dar sunt diferiţi în ceea ce priveşte alte trăsături şi gene. Cele două bulk-uri sunt, prin urmare,
contrastante pentru o trasatură, de exemplu, rezistente şi sensibile la o anumita boală, în cazul
nostru, la septorioză. Aceste bulk-uri sunt analizate pentru a identifica markeri care le deosebesc.
Markerii care sunt polimorfici între bulk-uri vor fi linkati genetic de locusul/loci care determină
caracterul pentru care s-a făcut analiza. Metoda are aplicaţii în alcătuirea hartilor genetice, care
au fost întocmite pentru multe specii (O’Brien, 1990), astfel sunt acoperite regiuni de interes în
care nu sunt cunoscuţi markeri linkati.
4.3.8. Clonarea ADN-ului din benzile polimorfe
În cercetările noastre ne-am propus clonarea ADN-ului din benzile polimorfe obţinute
prin amplificarea ADN-ului cu markeri RAPD. Benzile sunt izolate din gelul de agaroză sau din
gelul de poliacrilamidă, sunt clonate într-un vector în vederea secvenţierii lor, urmând
construirea de primeri specifi, SCAR, pentru fragmentul de la care s-a plecat. Clonarea include
următoarele etape:
11

1. Obţinerea pasagerului - in acest studiu, pasagerul este un produs PCR obţinut din
reamplificarea benzilor izolate din gelul de agaroză 1%.
Obţinerea pasagerului prin amplificare PCR se realizează prin utilizarea unor vectori de
tipul A-T, care poartă la capătul 3 o timină ce este complementară adeninei care se adaugă din
greşală sub acţiunea Taq polimerazei în cadrul procesului de amplificare; vectorul şi pasagerul
vor avea capetele monocatenare adezive A-T.
2. Pregătirea pasagerului, în cazul în care introducerea directă în vector nu este posibilă.
3. Ligarea pasagerului de vectorul de clonare cu ajutorul ADN-ligazei.
4. Introducerea vectorului recombinant în gazdă (transformarea celulelor competente).
Există specii în mod natural competente (Bacillus subtilis) şi specii la care competenţa
este indusă (Escherichia coli), inducerea se face în prezenţa clorurii de calciu şi a temperaturii
ridicate. În cazul de fata am folosit kitul TransformAid TM Bacterial Transformation Kit
(Fermentas).
5. Identificarea şi izolarea celulelor gazdă ce poartă un anumit pasager pe mediu selectiv.
După analiza produşilor PCR, coloniile care au insertul dorit se multiplică pe mediu
lichid LB cu ampicilină în vederea izolării ADN-ului plasmidial. ADN-ul plasmidial astfel
obtinut se trimite la secventiat, pe baza secvenţei construindu-se noi primeri.
4.3.9. Obţinerea materialului segregant F2 în urma hibridării formelor parentale
În cadrul fiecărei specii există un număr mare de gene valoroase şi pentru crearea de
ecotipuri echilibrate amelioraea caută să îmbine cât mai multe gene favorabile. Principala cale de
a realiza aceast lucru o constituie recombinarea, prin hibridare.
Materialul biologic parental a fost semănat în câmpul experimental în toamna anului
2006, în anul următor efectuându-se hibridările după cum urmează: sau folosit toţi parinţii
rezistenţi, precum şi trei parinţi sensibili, notaţi cu: 15 (Farmec), 16 (Delabrad) şi 17 (F96869G1-
108). In acest studiu am incrucisat genitorii materni cu cei paterni in vederea testarii
descendentilor F2 pentru rezistenta lor la agentul patogen Septoria tritici.
În toamna anului 2007, combinaţiile hibride F1 au fost semănate în câmpul experimental.
Generaţia F2 segregantă a fost semănată în câmpul experimental al gradinii agrobotanice (16
combinaţii) în anul următor. In 2009, descendentii F2 au fost recoltaţi, şi prin urmare au fost şi
analizaţi în laborator.
5.1. Rezultate privind izolarea ADN-ului
CAPITOLUL V
La formele parentale concentratia ADN-ului a variat intre 242 ng/µl (proba 5) si 889
(proba 5), iar puritatea a variat intre 1,82 (proba 10) si 1,98 (proba 6). ADN-ul extras a fost
ulterior diluat cu apă ultrapură la o concentraţie finală a soluţiei de lucru de 30 ng/µl.
În urma izolarii ADN-ului la cele 23 de linii dihaploide s-au obtinut concentraţii care au
variat între 434 ng/µl (proba 6) şi 2933 ng/µl (proba 17) şi purităţi între 1,48 (proba 13) şi 2,01
(proba 1), iar prin extracţia ADN-ului din indivizii F2 s-au obţinut concentraţii care au variat între
386 ng/µl (proba 67) si 3830 ng/µl (proba 70) şi puritaăţi de 1,84 (proba 14) şi 2,15 (proba 49).
5.2. Rezultate privind selecţia pentru rezistenţa grâului la septorioză utilizând
tehnica SSR
5.2.1 Rezultate privind amplificarea ADN-ului de la liniile parentale
Pentru realizarea primului obiectiv al acestei teze de doctorat am testat markeri
moleculari de tip microsatelit SSR, cu scopul realizării selecţiei asistate de markeri pentru
rezistenţa grâului la septorioză.
12

În acest studiu am dorit să aflăm ce gene sunt prezente în materialul nostru biologic,
pornind de la testarea moleculară a formelor parentale rezistente, respectiv sensibile la agentul
fitopatogen Septoria tritici, urmând efectuarea evaluarii fenotipice în câmp. Astfel s-au testat
mai mulţi markeri SSR descrişi în literatură ca fiind asociaţi unor gene de rezistenţă la
septorioză, asupra genotipurilor individuale de la toate variantele de material biologic parental.
În figura următoare este reprezentat profilul electroforetic al produşilor de amplificare
obtinuţi prin amplificarea ADN-ului cu markerul Xgwm577, asociat genei de rezistenţă Stb8. În
urma analizei individuale de câte cca. 10 plante, în două repetiţii, s-au obţinut rezultate foarte
diverse. Pentru unele linii parentale s-a confirmat prezenţa benzii de 180 pb, specifică formelor
rezistente, şi deci s-a confirmat prezenţa genei Stb8 (liniile 8, 11, 13 şi 14), pentru alte linii (2, 3,
6 si 9) s-a observat o segregare, la unii indivizi banda de 180 pb fiind prezentă, iar la alte linii (1,
4, 5, 7, 10 si 12) banda respectivă nu a apărut, gena Stb8 fiind, deci, absentă (tabel 2).
L=100pb
11.9 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 13.6 13.7 13.8 13.9
L=100pb
13.10 14.1 14.2 14.3 14.4 14.5 14.6 14.7 14.8 14.9 14.10 15 16 17 21
Figura 3. Polimorfismul identificat de markerul Xgvm577, L- ladder 100pb
Analiza genetică realizată cu ajutorul markerului Xgwm577
Nr Nr. Genotipuri Marker Xgwm577
Observaţii
R I R II RI R II Total
Total
+ - + - + -
1 9 10 19 0 9 0
10
0 19 Rez.neconfirmată
2 8 9 17 1 7 0 9 1 16 Segregare
3 9 8 17 1 8 0 8 1 16 Segregare
4 10 6 16 0 10 0 6 0 16 Rez.neconfirmată
5 10 8 18 0 10 0 8 0 18 Rez.neconfirmată
6 8 8 16 3 5 0 8 3 13 Segregare
7 9 9 18 0 9 0 9 0 18 Rez.neconfirmată
8 2 8 10 2 0 8 0 10 0 Rez.confirmată
9 9 7 16 7 2 7 0 14 2 Segregare
10 9 7 16 0 9 0 7 0
16
Rez.confirmată
11 9 9 18 9 0 9 o 18 0 Rez. confirmată
12 7 5 12 0 7 0 5 0
12
Rez.neconfirmată
13 10 10 20 10 0 10 0 20 0 Rez. confirmată
14 10 10 20 10 0 10 0 20 0 Rez. confirmată
Tabel 2.
13

Rezultatele obţinute în urma testării markerului pSc H20 (F3/R3), marker specific
genomului de secară, sunt prezentate în tabelul 3. Acest marker este asociat introgresiilor
provenite de la secară în genomul grâului, fiind cunoscut faptul că rezistenţa graului la agentul
patogen Septoria tritici provine şi de la secară. La unele linii parentale, considerate rezistente (2,
6, 7, 8, 10, 11, 13 si 14), banda de 1400 pb a fost prezentă, iar la alte linii (1, 5 şi 9) s-a observat
o segregare, confirmând prezenţa genelor de la secară în genealogia liniilor respective. Din
păcate, această observaţie este valabilă şi în cazul a două soiuri considerate sensibile la
septorioză (17 şi 21), banda de 1400 pb fiind prezentă. Se poate concluziona că existenţa
introgresiuniulor de la secară nu constitue o garanţie a prezenţei genelor de rezistenţă la
septorioză.
Tabel 3.
Analiza genetică realizată cu ajutorul markerului pSc H20
Nr
.
Nr. Genotipuri Marker pSc H20 Observaţii
R I R II Total RI R II Total
+ - + - + -
1 9 10 19 - - 5 5 5 5 Segregare
2 8 9 17 - - 9 0 9 0 Rez.confirmată
3 9 8 17 - - 0 8 0 8 Rez.neconfirmată
4 10 6 16 - - 0 6 0 6 Rez.neconfirmată
5 10 8 18 - - 7 1 7 1 Segregare
6 8 8 16 - - 8 0 8 0 Rez.confirmată
7 9 9 18 - - 9 0 9 0 Rez.confirmată
8 2 8 10 - - 8 0 8 0 Rez.confirmată
9 9 7 16 - - 5 2 5 2 Segregare
10 9 7 16 - - 7 0 7 0 Rez.confirmată
11 9 9 18 8 1 8 1 18 0 Rez. confirmată
12 7 5 12 0 7 0 5 0
12
Rez.neconfirmată
13 10 10 20 10 0 10 0 20
0
Rez. confirmată
14 10 10 20 10 0 10 0 20
0
Rez. confirmată
15 Bulk 0
16 Bulk 0
17 Bulk + Banda prezentă
18 Bulk 0
19 Bulk 0
20 Bulk 0
21 Bulk + Banda prezentă
22 Bulk 0
În figura 4 se prezintă polimorfismul identificat cu ajutorul markerului pSc H20 la unele
linii parentale considerate rezistente (6, 7 şi 8) şi sensibile (15 la 22). Acest marker, prin banda
de 1400 pb, specifică genomului de secară, ar putea să fie luat în considerare ca marker pentru
trierea genotipurilor de grâu rezistent/sensibil la septorioză. Afirmăm acest lucru deoarece liniile
parentale ce au prezentat această bandă (8, 11, 13 si 14) au fost confirmate ca purtătoare a unor
gene de rezistenţă şi cu ajutorul markerului OPH20, specific genomului de secară, dar şi
markerului Xgwm577 asociat cu gena de rezistenţă Stb8.
14

Figura 4. Polimorfismul identificat de markerul pSc H20, L- ladder 100 pb
5.2.2. Rezultate privind amplificarea ADN-ului de la liniile dihaploide
Au fost testate genotipic, cu ajutorul markerilor SSR lincati cu gene de rezistenţă la
septorioză, linii dihaploide de grâu, obţinute prin dublarea numărului de cromozomi ai
haploizilor rezultaţi dintr-un material hibrid. Utilizarea liniilor dihaploide se justifică prin faptul
că sunt stabile în descendenţă, fixând în stare homozigotă recombinările rezultate în urma
hibridărilor. Este aşteptat faptul ca în cadrul fiecărei linii să nu existe variablitate genetică, nici
segregare, astfel fiind posibilă efectuarea unei selecţii a liniilor, nu a plantelor individuale.
În figura 5 sunt prezentate rezultatele obţinute cu markerul Xgwm313, banda de 197 pb,
asociată genei de rezistenţă Stb7, a fost prezentă la unele linii dihaploide (5.5 şi 6.2) şi nu a fost
prezentă la celelate linii analizate (5.1, 5.2, 5.4, 5.5, 5.7, 6.1, şi 6.3).
Figura 5. Produşii de amplificare obţinuţi cu markerul Xgwm313, L- ladder 100 pb
La soiurile sensibile (19, 20 şi 21) fiind prezentă alela de sensibiltate (200 pb) la gena
Stb7, excepţie făcând doar soiul 18, la care a apărut bandă de 197 pb. Se poate aprecia deci că
linile 5.3 şi 6.2 poartă gena de rezistenţă Stb7, totodată confirmându-se natura homozigotă a
liniilor dihaploide prin faptul că toate plantele individuale din cadrul liniei 6.2 poartă gena de
rezistenţă şi toate plantele individuale din cadrul liniei 6.3 nu poartă această genă.
Pentru markerul Xgwm493 s-au obţinut produşi de marime asemanatoare între linile
dihaploide considerate a fi rezistente la septorioză şi souirile sensibile. În cazul a două linii
dihaploide (9, 11) produşii au avut o marime diferită, 171 pb, faţă de produşii obţinuţi de la
liniile sensibile, intre 149 pb si 153 pb. Acest fapt poate conduce la încadrarea acestor linii ca
fiind purtătoare a genei de rezistenţă Stb2 (figura 4). Se poate remarcă faptul că valorile obţinute
de noi pentru marimea alelei de rezistenţă (171 pb) diferă de valorile obţinute (125 pb) de către
Adhikari şi colaboratorii lui (Adhikari et al., 2004b).
15

Figura 6. Produşii de amplificare obţinuţi cu markerii Xgwm493 F/R, L- ladder 50 pb
Prin testarea markerului Xgwm577 (figura 7) asociat genei de rezistenţă Stb8, s-a obţinut
un singur produs de amplificare la fiecare linie dihaploidă testată având valori între 140 pb şi 200
pb. La unele linii dihaploide (1 la 17; 20 şi 21) a apărut o bandă cu dimensiuni cuprinse între 160
pb şi 200 pb, considerată a fi alela de rezistenţă a genei Stb8. La două linii dihaploide
considerate rezistente la septorioză (18 şi 19) şi la linia sensibilă (23) a apărut banda de 146 pb,
considerată alela de sensibilitate la septorioză (Adhikari et al., 2003). În urma rezultatelor astfel
obţinute se poate considera că liniile 18 şi 19 nu poartă gena de rezistenţă Stb8, iar liniile
dihaploide notate de la 1 la 17, 20 si 21 sunt purtatoare a genei Stb8.
Figura 7. Produşii de amplificare obţinuţi cu markerul Xgwm577, L-ladder 50 bp
5.3. Rezultate privind atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistenţă pe
baza cosegregării
5.3.1 Rezultate privind amplificarea ADN-ului de la liniile parentale
În acest studiu am testat 14 linii ce prezintă rezistenţă la agentul patogen Septoria tritici,
evidenţiată în câmpul experimental şi 8 soiuri considerate a fi sensibile la acest agent patogen. Al
doilea obiectiv al prezentei teze a fost acela de atribuire a markerilor moleculari RAPD genelor
de rezistenţă Stb pe baza cosegregarii.
Dintre cei 20 primerii random testaţi, 11 primeri au evidenţiat diferenţe între populaţiile
bulk 1-14 a formelor parentale ce prezintă rezistenţă, comparativ cu formele parentale
caracterizate a nu avea rezistenţă la septorioză (15-22).
5.3.2. Rezultate privind amplificarea ADN-ului de la liniile dihaploide
Prin amplificarea ADN-ului provenit de la cele 9 linii dihaploide cu primerul OPH20 s-a
obţinut banda de 1400 pb la unele provenienţe. Banda nu a apărut la 2 linii parentale fără
rezistenţă luate ca referinţă (figura 8).
În cazul amplificarii cu primerii OPAB 18 şi OPB 08 s-a obţinut o bandă de 1200 pb la
liniile dihaploide testate, bandă ce nu apare la forma sensibilă de referinţă. Şi în cazul
amplificării cu primerul Mic14, OPC13 şi OPC10 s-au obţinut, de asemenea, benzi polimorfice
16

între liniile dihaploide şi formele sensibile la septorioză (Curticiu et al., 2007; 2009).
Figura 8. Polimorfismul obţinut cu primerul OPH 20, L= 100 pb
5.4. Rezultate privind atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistenţă pe
baza metodei BSA
5.4.1. Obţinerea materialului hibrid
Pentru realizarea celui de al treilea obiectiv al acestei teze formele parentale rezistente au
fost incrucisate cu unele forme parentale sensibile pela agentul patogen S. tritici, astfel au fost
obtinuti hibrizii F1, care s-au autopolenizat, rezultând generaţia segregantă F2 (tabel 4).
Tabel 4.
Generaţia F2 segregantă obţinută în câmpul experimental
Nr.
Combinaţii
hibride
Genealogie
Părinţi rezistenţi x Părinţi sensibili
1. P1 X P16
ALTAR 84/Aegilopsis squarosa (219)/2 SERI/3/F96869G1-1
x DELABRAD
2. P4 X P16 FARMEC/Aegilopsis squarosa x DELABRAD
3. P5 X P16
CIT 3/ T. Tauschi (T2450)/Boema/3/F95160G1-3
x DELABRAD
4. P6 X P16
CIT3/T.Tauschi(T2460)/229S31202/3/Bucur/4/ Jiana
x DELABRAD
5. P8 X P16
TAM1074/T.Timopheevi(TA870),(KSWGRC36)/Glosa
x DELABRAD
6. P5 X P17
CIT 3/ T. Tauschi (T2450)/Boema/3/F95160G1-3 x F96869G1-108 x
DELABRAD
7. P6 X P17
CIT3/T.Tauschi(T2460)/229S31202/3/Bucur/4/ Jiana
x F96869G1-108
8. P9 X P17 T. Timopheevi/T. Monococum/2 F132/3/2 Crina x F96869G1-108
5.4.3. Atribuirea markerilor moleculari RAPD genelor de rezistenta la Septoria tritici pe baza
metodei BSA
În acest studiu am folosit metoda Bulk Segregant Analysis, metoda ce presupune izolarea
individuală a ADN-ului de la câte cinci-zece plante aparţinând fiecărui grup (sensibil respectiv
rezistent), amestecarea, în cantităţi egale, în cadrul fiecărui grup a ADN-ului obţinut de la
plantele individuale, pentru a obţine cele două bulkuri cu ADN, specifice celor două grupuri de
plante (Michelmore et al., 1991). Urmează amplificarea ADN-ului de la cele două bulk-uri cu
primeri decameri, separarea produşilor de amplificare prin electroforeză în gel de agaroză,
analiza polimorfismului molecular şi atribuirea benzlor polimorfe prezente la forma rezistentă şi
absente la forma sensibilă, genelor de rezistenţă.
În cazul de faţă s-a efectuat izolarea ADN-ului de la cele două grupuri şi în cadrul
fiecarui grup ADN-ul a fost amestecat (bulk). Pasul urmator a fost amplificarea ADN-ului cu
mai mulţi primeri decameri, dintre care 4 au evidenţiat polimorfism între cele două grupuri,
17

polimorfism constând în prezenţa/absenţa uneia sau mai multor benzi. Markerii moleculari
trebuie sa fie linkati în faza de cuplare cu gena de rezistenţă, adică gena şi markerul trebuie să fie
înlanţuiţi în acelaşi cromozom, banda polimorfă trebuie să fie prezentă la forma rezistentă şi
absentă la forma sensibilă.
Astfel de rezultate au fost obţinute în urma testării markerilor OPC04 şi OPA11 şi al
migrării produşilor de amplificare în gel de agaroză. În alte situaţii acesta condiţie nu a fost
indeplinită, adică banda polimorfă a fost prezentă la forma sensibilă şi a lipsit la forma rezistentă.
5.4.4. Stabilirea relaţiilor de linkage dintre markeri RAPD atribuiţi genelor de rezistenţă
şi genele de rezistenţă la STB
În acest studiu am urmărit stabilirea relaţiilor de linkage între markeri moleculari de tip
RAPD şi genele de rezistenţă Stb prin metoda analizei descendenţilor F2. Descendenţii F2 sunt
rezultaţi din diferite încrucuişări între părinţi ce prezintă rezistenţă la septorioză cu parinţi ce
sunt sensibili la acestă boală. Prin testarea markerilor RAPD, produşii de amplificare sunt
migraţi în gel de agaroză, iar genotiparea plantelor individuale pentru rezistenţă poate fi
asigurată de prezenţa sau absenţa benzii marker în gel. La grâu gena de rezistenţă şi markerul au
fost înlanţuite în faza de cuplare:
Tabel 5.
Stabilirea relaţiilor de linkage dintre marker şi genă
TIP PARENTAL TIP
TOTAL
RECOMBINAT
Marker
Combinaţia
hibridă
OPA 11 P9 X P17 50
OPC 13 P9 X P17 61
OPC 04 P6 X P17 38
Plante
Rezistente
cu banda
polimorfă
(x pb)
(1072 pb)
(350 pb)
(510 pb)
Plante
Sensibile
fară
banda
polimorf
ă (x pb)
Plante
Sensibile
cu banda
polimorf
ă (x pb)
Plante
reziste
nte fară
banda
polimo
rfă (x
pb)
28 12 30 120
28 12 19 120
19 9 14 80
1. Pentru combinaţia hibridă P9 X P17 testată cu markerul OPA 11, frecvenţa fenotipului
dublu recesiv este de 21.6% (sau 0.216) De aici rezultă că frecvenţa gameţilor de tip
parental este: 2√0.216 = 0.931, iar frecvenţa gameţilor de tip recombinant este de 1 - 0.931=
0.0690. Aşadar distanţa dintre genă şi markerul OPA11 este de 0.069 unitaţi de recombinare
(6 cM).
2. Pentru combinaţia hibridă P9 X P17, testată cu markerul OPC 13, distanţa dintre genă şi
marker este de 3 cM.
3. Pentru combinaţia hibridă P6 X P17 testată cu markerul OPC 04 s-au obţinut distanţa de 2
cM intre genă si marker.
Odată cu identificarea acestor markeri linkaţi cu rezistenţa la septorioză selecţia asistată
de markeri poate fi realizată din fazele timpurii de dezvoltare a plantelor, înlăturând astfel
18

deficienţele cauzate de timp şi nemaifiind nevoie de realizarea infecţiilor artificiale cu agentul
patogen.
5.5. Rezultate preliminare privind clonarea produşilor de amplificare
Ultimul obiectiv al cercetărilor noastre constă în clonarea ADN-ului din benzile
polimorfe obţinute prin amplificarea ADN-ului cu markeri RAPD, fiind continuarea celui de al
doilea obiectiv propus şi realizat, adică atribirea markerilor RAPD genelor de rezistenţă pe baza
cosegregării. Pentru relizarea acestui obiectiv s-a realizat amplificarea ADN-ului provenit de la
liniile rezistente la septorioză cu markeri RAPD care au fost atribuiţi genei de rezistenţă. Pentru
amplificarea ADN-ului s-au utilizat trei markeri RAPD (OPH20, OPC04 şi OPC13). Produşii de
amplificare PCR obţinuţi au fost introduşi în vectorul de clonare linearizat pGEM-T - Easy
Vector, iar reacţia de ligare s-a realizat peste noapte la temperatura de 4 0 C într-un volum de
reacţie de 10µl (1µl pGEM-T - Easy Vector, 6µl produs PCR, 1µl T4 AND ligază, 1µl tampon
de ligare 10x, 1µl ddH2O). Au fost folosiţi şi vectorii de clonare pJET 1.2/blunt şi PTZ57R/T.
Transformarea bacteriană gazdă a ADN-ului recombinant s-a realizat cu kitul Transform Aid TM
Bacterial kit.
Figura 9. Produşii de amplificare obţinuţi cu markerii RAPD: OPH20, OPC04 şi OPC13
la câteva linii dihaploide de grâu (5.3, 5.7, 6.1, 6.1, 6.3) şi linii parentale de grâu (8,11,13,14) cu
rezistenţă de câmp la Septoria tritici
Coloniile albe apărute au fost verificate prin amplificare PCR într-un amestec de reacţie
ce conţine: 10xTaq buffer, dNTP mix, Forward primer, Reverse primer, Taq polymeraza şi
ddH2O şi au fost subcultivate în continuare pe mediu selectiv. Ca bacterii gazdă am utilizat două
tulpini de E. coli: JM 109 şi GM 2163, rezultatele cele mai bune fiind obţinute folosind tulpina
GM 2163.
În figura urmatoare sunt prezentate coloniile albe (cu insert) şi albastre (fara insert)
rezultate prin folosirea vectorului PTZ57R/T (InsTAclone TM PCR Cloning kit), iar în figura 11
sunt prezentate colonii albe obtinute prin folosirea vectorului pJET 1.2/blunt.
Figura 10. Colonii bacteriene (fără insert - coloniile albastre / cu insert - coloniile albe)
transformate cu vectorul PTZ57R/T (imagine stanga) si cu vectorul pGEM-T (imagine dreapta)
19

Figura 11. Colonii bacteriene albe (cu insert) obţinute cu vectorul pJET 1.2/blunt
Prin folosirea vectorului pJET 1.2/blunt (CloneJET TM Cloning Kit) au fost obţinute
colonii albe ce au pasager integrat în vector. Prin folosirea vectorului pJET 1.2/blunt
(CloneJET TM Cloning Kit) au fost obţinute colonii albe ce au pasager integrat în vector. S-au
recoltat câteva colonii ce au fost multiplicate pe mediu LB cu ampicilină în vederea izolării
ADN-ului plasmidial, urmând amplificarea secventelor clonate cu primerii specifici vectorului,
ce flancheaza aceste secveneţe (pJET1 şi pJET1R).
Clonarea a reuşit la banda de 350 pb pornind de la amplificarea ADN-ului parental
(provenienţa 6) cu primerul OPC03 folosind kitul CloneJET TM Cloning Kit. ADN-ului
plasmidial izolat a fost secvenţiat în laboratoarele firmei Mycrosinth (Elveţia), urmând
construirea de primeri specifici, pentru convertirea markerului molecular RAPD în marker
SCAR.
CONCLUZII
Concluzii privind relizarea primului obiectiv propus în prezenta teză de doctorat -
testarea unor markeri de tip microsatelit - SSR în vederea selecţiei pentru rezistenţa grâului la
septorioză:
Izolarea ADN-ului s-a efectuat conform protocolului care utilizează CTAB, cantitatea şi
puritatea ADN-ului obţinut a fost bună;
Markerii moleculari SSR au fost utilizaţi cu succes pentru selecţia din cadrul unor
descendenţe segregante a indivizilor purtători a unor alele de rezistenţă la Septoria, precum şi
pentru selecţia liniilor dihaploide purtătoare a unor gene de rezistenţă:
În cazul liniilor dihaploide s-a stabilit cu ajutorul markerilor moleculari SSR, că majoritatea
acestora poartă, cel puţin, o genă de rezistenţă, mai frecvent întâlnite fiind genele Stb7 şi Stb8
şi posibil Stb4. Mai puţin frecvent s-a întâlnit gena Stb2. Pentru genele Stb1, Stb3, Stb5 şi
Stb6 rezultatele nu sunt concludente. Plantele individuale din cadrul fiecări linii nu au
segregat (imaginea electrtoforetică a fost monomorfă) confirmând natura lor homozigotă.
Concluzii privind relizarea celui de al doilea obiectiv propus în prezenta teză de doctorat
- atribuirea markerilor RAPD pe baza cosegregării:
Markerii RAPD testaţi au dat o bună amplificare la toate genotipurile studiate: dintre cei 20
de markeri testati, 11 au evidenţiat polimorfism la populatiile bulk provenite de la liniile
recombinante rezistente la septorioză, faţă de formele parentale caracterizate a fi sensibile:
Benzile polimorfe obţinute sunt considerate a fi candidate de markeri moleculari pentru
genele de rezistenţă la Septoria tritici.
Concluzii privind relizarea celui de al treilea obiectiv propus în prezenta teză de doctorat
- atribuirea markerilor RAPD pe baza metodei BSA:
S-a obtinut un număr de 8 combinatii hibride F2 care au fost supuse infecţiilor artificiale cu
spori de S. tritici.
S-au efectuat analize moleculare asupra bulk-urilor de la plantele rezistente şi sensibile cu
markeri RAPD şi au fost atribuiţi markeri random genelor de rezistenţă la septorioză.
20

S-au stabilit relaţii de linkage dintre markeri RAPD atribuiţi genelor de rezistenţă şi genele
de rezistenţă la septorioza:
Concluzii privind relizarea celui de al patrulea obiectiv propus în prezenta teză de
doctorat - clonarea benzilor polimorfe atribuite genelor de rezistenţă în vederea convertirii
markerilor RAPD în markeri SCAR:
Folosind kitul CloneJET TM Cloning Kit s-a reuşit clonarea ADN-ului de la provenienta 6
de ADN parental cu rezistenţă la septorioza, folosind markerul RAPD- OPC13 (banda
polimorfică de 350 pb). După clonarea şi secvenţierea ADN-ului sunt construiţi markeri SCAR.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
ADHIKARI, T.B., J.M. ANDERSON, S.B. GOODWIN, 2003, Identification and
molecular mapping of a gene in wheat conferring resistance to Mycosphaerella graminicola, In:
Phytopathology, 93(9): 1158-1164
ADHIKARI, T.B., H. WALLWORK, S.B. GOODWIN, 2004b, Microsatellite Markers
Linked to the Stb2 and Stb3 Genes for Resistance to Septoria tritici Blotch in Wheat. Crop Sci.,
44:1403-1411
AGRIOS, G. N., 1997, Plant Pathology 4th edition, Academic Press, p. 286-289; 310
ALEXANDRI, Al., M. OLANGIU, M. PETRESCU, I. POP, E. RĂDULESCU, C.
RAFAILĂ, V. SEVERIN, 1969, Tratat de fitopatologie agricolă vol.II, Editura Academiei
Republicii Socialiste România p. 78-84
AO, H.C. & GRIFFITHS, 1976, Change in virulence of Septoria nodorum and S. tritici
after passage through alternative hosts, Transactions of British Mycological Society 66: 337-340
ARRAIANO, L.S., L. CHARTRAIN, E. BOSSOLINI, H.N. SLATTER, B. KELLER,
J.K.M. BROWN, 2007, A gene in European wheat cultivars for resistance to an African isolate
of Mycosphaerella graminicola, Plant Pathology 56, 73–78. doi: 10.1111/j.1365-
3059.2006.01499.x
ARRAIANO, L.S, A. J. WORLAND, C. ELLERBROOK, J.K.M. BROWN, 2001,
Chromosomal location of a gene for resistance to Septoria tritici blotch (Mycosphaerella
graminicola) in the hexaploid wheat ‘Synthetic 6x’, Theoretical and Applied Genetics 103, 758–
764. doi: 10.1007/s001220100668
BOTEZ C., DANA CURTICIU, LAURA COTA, 2008, Dihaploid wheat lines selection
with SSR marker for Septoria tritici resistance, Buletinul USAMV-CN, 65/2008, ISSN 1454-
2382
BOTEZ C., DANA CURTICIU, LAURA COTA, N.N. SAULESCU, 2009, Marker
assisted selection for Septoria tritici resistance in wheat dihaploid lines, Not. Bot. Hort. Agrobot.
Cluj, 37:253-255
BOTEZ, C., N.N. SĂULESCU, MONICA IUORAŞ, P. RAICA, 2006, Preliminary
results to the marker assisted selection for disease resistance of common wheat (Triticum
aestivum), Buletin USAMV-CN, 63/2006
BRADING, P. A, E.C.P. VERSTAPPEN, G.H.J. KEMA, J.K.M. BROWN, 2002, A
gene-for-gene relationship between wheat and Mycosphaerella graminicola, the Septoria tritici
blotch pathogen. Phytopathology 92, 439–445. doi: 10.1094/PHYTO.2002.92.4.439
BROKENSHIRE T., 1975, Wheat seed infection by Septoria tritici, Transactions of the
British Mycological Society 64: 331-334
BROKENSHIRE T., 1976, The reaction of wheat genotypes to Septoria tritici, Annals of
Applied Biology 82: 415-423
CEAPOIU, N., F. NEGULESCU, 1983, Genetica şi ameliorarea rezistenţei la boli a
21

plantelor, Editura Academiei Rep. Socialiste Romania
COLLARD, B.C.Y., M.Z.Z. JAHUFER, J.B. BROUWER, E.C.K. PANG, 2005, An
introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for
crop improvement: The basic concepts, Euphytica 142, 169-196, doi: 10.1007/s10681-005-1681
CURTICIU DANA MARIA, BALAZS ERIKA, BRICIU DANIELA, BRICIU C. A.,
TAOUTAOU A., POP TIBERIA, GANEA STEFANA, COTA LAURA, BOTEZ C., 2009,
RAPD and SSR marker selection for some dihaploid wheat lines for Septoria tritici resistance,
Journal of Horticulture, Forestry and Biotehnology 13: 114-117
CURTICIU DANA MARIA, C. BOTEZ, COTA LAURA, LUCACI MEDA, 2007,
Marker asisted selection for Septoria tritici resistance of common wheat, Buletinul USAMV-CN,
64/2007, ISSN 1454-2382
CURTICIU DANA MARIA, DANIELA TRIFAN, AL. C. BRICIU, ERIKA BALAZS,
LAURA COTA, C. BOTEZ, 2008, General aspects regarding Septoria tritici blotch on wheat,
Buletinul USAMV-CN, 65/2008, ISSN 1454-2382
DANCER, J., A. DANIELS, N. COOLEY, S. FOSTER, 1999, Septoria tritici and
Stagnospora nodorum as model pathogens for fungicide discovery, In: Lucas, J.A., P. Bowyer,
& H.M. Anderson (Eds.), Septoria on cereals: A study of pathosystems, pp. 316-331, CABI
Publishing, Cambridge
DORDEA, MANUELA, N. COMAN., CORNELIA CRACIUNAŞ, C. ANDRAŞ, 2003,
Genetică Generală şi Moleculară- abordare practică, Presa Universitară Clujană
DUDLEY, J. W., 1993, Molecular markers in plant improvement: Manipulation of genes
affecting quantitative traits, Crop Science 33: 660-668
EYAL, Z., 1999, The Septoria tritici and Stagnospora nodorum blotch diseases of wheat,
Eur. Journal of Plant Patholology 105:629-641
EYAL, Z., A.L. SCHAREN, J.M. PRESCOTI, M. van GINKEL, 1987, The Septoria
diseases of wheat: Concepts and methods of disease management, Mexico, D.F: CIMMYT
GOODWIN, S.B, 2007, Back to basics and beyond: increasing the level of resistance to
Septoria tritici blotch in wheat, Australian Plant Pathology, 36, 532-538
JACKSON, L.F., J. DUBCOVSKY, L.W. GALLAGHER, R.L. WENNIG, J. HEATON,
2000, Regional barley and common and durum wheat performance tests in California,
Agronomy Progress Report 272: 1-56
JONES, D., & B.M. COOKE, 1969, The epidemiology of Septoria tritici and Septoria
nodorum. 1. A tentative key for assessing Septoria tritici infection on wheat heads, Trans. Br.
Mycol. Soc. 53, 39-46
KEMA, G.H.J., J.G. ANNONE, T. SAYOUD, C. van SILFHOUT, M. van GINKEL, J.
de BREE, 1996, Genetic variation for virulence and resistance in the wheat - Mycosphaerella
graminicola pathosystem, I. Interaction between pathogen isolates and host cultivars,
Phytophatology 86, 213-220. Doi: 10.1094/Phyto-86-213
KING, J.E., R.J. COOK, S.C. MELVILLE, 1983, A review of Septoria diseases of wheat
and barley, Ann. Appl. Biol. 103:345-373
McCARTNEY, C.A., A.L. BRULE-BABEL, L. LAMARI, D.J. SOMERS, 2003,
Chomosomal location of a race-specific resistance gene to Mycosphaerella graminicola in the
spring wheat ST6, In: Theoretical and Applied Genetics, 107,1181-1186
MICHELMORE, R.W., I. PARAN, R.V. KESSELI, 1991, Identification of markers
linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect
markers in specific genomic regions by using segregating populations, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, Genetics, p. 9828-9832
MINCU, M., 1999, Response of winter wheat genotypes to artificial inoculation with
several Septoria tritici populations, In: Septoria and Stagnosphora diseases of cereals: A
compilation of global research, CYMMIT, Mexico, p.167-170
22

O'BRIEN, S. J., 1990, Genetic Maps, Cold Spring Harbor Lab., NY, vol. 6
PALMER, CLAIRE-LOUISE & WENDY SKINNER, 2002, Mycosphaerella
graminicola: latent infection, crop devastation and genomics, Molecular and Plant Pathology
PATTERSON F.L., G.E. SHANER, D.M. HUBER, H.W. OHM, R.E. FINNEY, R.L.
GALLUN, J.J. ROBERTS, 1979, Registration of Sullivan wheat, Crop Science 19: 297
PATTERSON F.L., J.J. ROBERTS, R.E. FINNEY, G.E. SHANER, R.L. GALLUN,
H.W. OHM, 1975, Registration of Oasis wheat, Crop Science 15: 736-737
RIBAUT, J.M. &D. HOISINGTON, 1998, Marker-assisted selection: New tools and
strategies, Trends Plant Science 3: 236–239.
RILLO A.O. & R.M CALDWELL, 1996, Inheritance of resistance to Septoria tritici in
Triticum aestivum subsp. vulgare, Bulgaria 88, Phytopathology 56:597
SIVANESAN, A., 1990, Mycosphaerella graminicola, Mycopathologia 109:51-53
SOMASCO, O.A., C.O. QUALSET C.O., D.G. GILCHRIST, 1996, Single-gene
resistance to Septoria trici blotch in the spring wheat cultivar ‘Tadinia’, Plant Breeding 115:261-
267. doi: 10.1111/j.1439-0523.1996.tb00914.x
WILLIAMS, J.G.K., A.R. KUBELIK, K.J. LIVAK., 1990, DNA Polymorphism
Amplified by Arbitrary Primers are useful as genetic markers, Nucleic Acids Res. 18:6231-6235
WINTER, P., G. KAHL, 1995, Molecular marker technologies for plant improvement,
World Journal of Microbiology and Biotechnology 11: 438-448
http://www.omafra.gov.on.ca/french/crops/facts/90-008f4.jpg
http://www.freefoto.com/images/07/45/07_45_66---Wheat_web.jpg
http://www.ksre.ksu.edu/library/plant2/EP133.pdf
http://www.hgca.com/hgca/wde/IMAGES/Septoria%202.JPG
http://www.hgca.com/minisite_manager.output/3619/3619/Cereal%20Disease%20Encyclopedia/
Diseases/Septoria%20Leaf%20Blotch.mspx?minisiteId=26
23

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY
MEDICINE CLUJ NAPOCA
DOCTORAL SCHOOL
FACULTATY OF AGRICULTURE
Biologist DANA M. BOTA (CURTICIU)
MARKER ASSISTED SELECTION FOR DISEASE
RESISTANCE OF COMMON WHEAT (TRITICUM
AESTIVUM) TO SEPTORIA TRITICI BLOTCH
(SEPTORIA TRITICI)
(SUMMMARY OF THE Ph.D. THESIS)
SCIENTIFIC COORDINATOR
Prof. Univ. Dr. CONSTANTIN BOTEZ
CLUJ-NAPOCA
2010

CUPRINS
SUMMARY .................................................................................................................................. 26
CHAPTER I .................................................................................................................................. 26
1.1. Pathogen agent and simptomatology .............................................................................. 26
1.2. Methods of disease control ............................................................................................. 27
1.3. Genetic determinism of wheat resistance to septoria tritici blotch ................................. 27
CHAPTER II ................................................................................................................................. 28
2.1. Characteristics and classification of molecular markers .................................................... 28
2.2. Application of molecular markers in plant breeding .......................................................... 28
CHAPTER III ................................................................................................................................ 29
3.1. Marker assisted selection ................................................................................................... 29
3.2. Award markers to genes of interest .................................................................................... 29
CHAPTER IV ............................................................................................................................... 29
4.1. Aim and objectives ............................................................................................................. 29
4.2. Biological material ............................................................................................................. 29
4.3. Working methods ............................................................................................................... 30
4.3.1. DNA isolation and quantification ............................................................................... 30
4.3.2. DNA amplification using RAPD markers ................................................................... 30
4.3.3. DNA amplification using SSR markers ...................................................................... 30
4.3.4. Electrophoresis ............................................................................................................ 30
4.3.5. Image capture and analysis ......................................................................................... 30
4.3.6. Maintenance, multiplication and conservation of Septoria tritici isolates .................. 31
4.3.7. Bulk Segregant Analysis ............................................................................................. 31
4.3.8. DNA cloning from polymorphic bands ....................................................................... 31
4.3.9. Obtaining F2 generation from parental crossing ......................................................... 31
CHAPTER V ................................................................................................................................. 31
5.1. Results regarding DNA isolation ....................................................................................... 31
5.2. Results regarding septoria tritici blotch disease resistance on wheat using SSR technique
................................................................................................................................................... 31
5.2.1. Results regarding DNA amplification on parental lines ............................................. 31
5.2.2. Results regarding DNA amplification on double haploid lines .................................. 32
5.3. Results regarding assigning of RAPD markers to resistance genes based on cosegregation
................................................................................................................................................... 32
5.3.1. Results regarding DNA amplification on parental lines ............................................. 32
5.3.2. Obtaining hybrid material ........................................................................................... 33
5.4. Establishing linkage relationships between assigned RAPD markers and STB resistance
genes .......................................................................................................................................... 33
5.5. Results regarding cloning of amplification products ......................................................... 34
CONCLUSIONS ........................................................................................................................... 34
25

SUMMARY
Object of the PhD thesis is the wheat disease Septoria tritici blotch, which has been
studied in order to identify molecular markers linked to resistance genes to the disease, using
molecular biology technique, especially using molecular markers. Testing was done mainly
using RAPD and SSR marker assisted selection to achieve the resistance of common wheat
(Triticum aestivum) to Septoria tritici pathogen.
Bread wheat is the most widely grown and consumed food crop in the world. This cereal
is attacked by many pathogens of which one of the most common is Mycosphaerella
graminicola (anamorph Septoria tritici) causing septoria tritici blotch disease. S. tritici is
considered to be more confined to Mediterranean-type climates (wet winters with temperate
temperatures). In our country this disease can occur during the rainy autumns and springs,
damage can reach 10-15% of the wheat yield. Wheat breeding is focused on developing widely
adapted, disease-resistant genotypes with high yields and grain quality that are stable across a
wide range of environments. Incorporating durable resistance is a priority since breeding for
stable yields without adequate resistance against the major diseases would be impossible.
This pathogen is now an important cause of wheat disease in Europe. Despite its
economic importance, molecular basis of virulence and pathogenicity of the pathogen are not
fully known (Palmer & Skinner, 2002). Several disease control methods, such as chemical
control and breeding for resistant cultivars, are taken in use to control this disease. The use of
fungicides is linked to a number of disadvantages that cannot be overlooked: - are expensive,
their production requires large quantities of raw materials and energy-intensive; - chemical
treatments should be repeated every year, and some are harmful to the environment, etc.
CHAPTER I
1.1. Pathogen agent and simptomatology
Mycosphaerella graminicola is a plant pathogenic bipolar heterothallic ascomycete
(Kema et al., 1996) that causes septoria tritici leaf blotch of wheat. The researchers deal with
genetic, cultural and chemical control measures which is one of the major means for protecting
wheat production. In Romania most currently grown wheat cultivars are more or less susceptible
to Septoria tritici, therefore, resistance to this pathogen is a highly-priority breeding goal
(Mincu, 1999). The fungus reproduces both sexually and asexually, primary infections being
initiated by airborne ascospores, which are produced in pseudothecia. Primary inoculum for the
wheat diseases caused by these pathogens is most often airborne ascospores, but may also be
wind- and rain-borne conidia. Symptoms typically appear within 14-21 days after initial
infection and there can be many cycles of asexual reproduction during the course of an epidemic.
New sources of resistance are required as only a few varieties currently available have
adequate levels of resistance. Location of resistance in synthetic wheat is interesting because
they are relatively easy to cross with common wheat and their resistance can be introgressed into
agronomically acceptable genotypes and combined with other resistances. Chromosomal
location of the resistance is the step preceding the development of recombinant chromosome
lines and mapping genes.
Higher levels of resistance are supposed to be genetically or epidemiologically linked to
late heading and tallness. The presence of genetic linkages can complicate the breeding for early
heading, short cultivars resistant to septoria tritici blotch. It is also necessary to know to what
extent resistance is present against a wide spectrum of isolates and whether that resistance is
expressed at all stages of plant development. Furthermore, some cultural practices, such as Nfertilisation
may modify the expression of the disease. Also the relation between disease
response and yield loss is not fully clarified.
26

Incidence of S. tritici depends on cultivar susceptibility, inoculum availability, crop
management practices, and favorable environmental conditions (low temperature, high humidity,
and frequent rain). Climatic factors, especially precipitation, affect fungal growth and the amount
and timing of spore production, as well as the release, dispersal, and deposition of spores. This
fungus is pathogenic on number of Triticum spp. and causes severe yield losses on bread wheat
(Triticum aestivum) in most places where this crop is grown (Eyal et al., 1987).
1.2. Methods of disease control
The economic impact of this pathogen on wheat production (yield and quality) has
become more pronounced in part due to the increased genetic resistance of wheat to other foliar
pathogens, such as rusts and powdery mildew and low resistance of cultivars. The distribution of
this pathogen is dependent on wheat debris management and the involvement of both airborne
and splash-dispersal mechanism should dictate measures to reduce the amount of infected debris
in the wheat cropping systems. Disease severity can be modified by various cultural practices:
crop rotation is a key factor affecting the health and productivity of future wheat crops (Cook &
Veseth, 1991).
Researchers recommended proper crop rotation in combination with other practices to
reduce the severity of Septoria diseases, tillage operation such as plowing have been
recommended as a means to reduce residue (King et al., 1983). Cultural practices that reduce
wheat residue through plowing, burning, removal for feeding, crop rotation, etc., help remove the
major source of primary inoculum (Eyal et al., 1987). Management of the disease is by planting
of resistant cultivars when available or, when feasible economically, by spraying fungicides. A
variety of fungicides are recommended and used to control septoria tritici blotch: Bravo 500 SC,
Artea 330 EC, Prosaro 250 EC, Falcon 460 EC, etc. It is undeniable that in combating chemicals
were obtained some good results, but the use of fungicides is linked to a number of
disadvantages that cannot be overlooked:
fungicides are expensive, their production requires large quantities of raw materials and
energy-intensive; chemical treatments must be repeated every year or several times a year;
some are phytotoxic to certain varieties of the same culture and can be toxic to animals,
especially mammals and humans;
can change the ecological balance by polluting the atmosphere, soil and water;
favor the emergence of new forms of pest resistance to fungicides as a result of directional
selection pressure or mutagenic action of chemicals on the parasites.
Integrated control is to combine all the above control methods, with a series of measures
aimed to minimize the rate of infections and strengthen the capacity of plant development and
therefore their natural resistance. Implementation of all cultural hygiene measures, such as:
burying plant debris, plowing, sowing, and weed control are recommended and used in
controlling the pathogen (Ceapoiu et al., 1983).
1.3. Genetic determinism of wheat resistance to septoria tritici blotch
More than 12 resistance genes have been mapped, with one or more associated molecular
markers each. Stb1 named by Wilson in 1985 was identified on the wheat cultivar Bulgaria 88 by
Rillo and Caldwell (1966); genes Stb2 and Stb3 were identified in Australia by Wilson (1985),
and were derived originally from cvv. Veranopolis and Israel 493. Stb4 gene was discovered in
cv. Tadorna by Somasco et al. in 1996, and Stb8 gene was discovered in Synthetic W7984
wheat, mapped on 5Bl, 3BS, 6DS, 7DS and 7BL chromosomes.
The Stb1 gene was incorporated into the Indiana soft red winter cvv. Oasis (Patterson et
al., 1975, 1979), this gene provided long-lasting resistance to wheat in Indiana and other parts of
the Midwest US. The Stb4 gene was bred into Tadinia cv. And was effective for 15 years
(Somasco, 1996), but this resistance broke down by 2000 (Jackson et al., 2000) and cultivars that
contain it now are considered susceptible.
These genes are distributed on 10 wheat chromosomes, occurring equally on the A, B and
27

D genomes (Goodwin S.B., 2007).
CHAPTER II
2.1. Characteristics and classification of molecular markers
Genetic markers represent genetic differences between individual organism or species;
generally, they do not represent the target genes themselves but act as “signs” or “flags”. Genetic
markers are located in close proximity to genes (“tightly linked”) may be referred to as gene
“tags”. These markers do not affect the phenotype of the trait of interest because they are located
only near or “linked” to genes controlling the trait. All genetic markers occupy specific genomic
positions within chromosomes (like genes) called “locus/loci”. There are three major types of
genetic markers:
► Morphological (classical or visible) - themselves are phenotypic traits or characters, for
example: flower colour, seed shape or pigmentation;
► Biochemical - include allelic variants of enzymes called isozymes (differences in enzymes),
can be detected by electrophoresis and specific staining;
► DNA or molecular - reveal sites of variation in DNA.
Molecular markers are the most widely used type of marker predominantly due to their
abundance, they arise from different classes of DNA mutations such as: substitution mutations
(point mutation), rearrangements (insertion or deletions) or errors in replication of tandem
repeated DNA. These markers are selectively natural because they are usually located in noncoding
regions of DNA; also they are practically unlimited in number and are not affected by
environmental factors and/or the developmental stage of the plant (Winter & Kahl, 1995).
2.2. Application of molecular markers in plant breeding
Using classical breeding methods the results obtained are dependent, in addition to other
factors, to the ability to differentiate genetic variations because most of the characters are
strongly influenced by the environmental conditions. Between different methods used the
possibility to identify phenotypic characters with simple genetic determinism and that are less
influenced by environment and associated with important traits, are great interest to the breeders.
These characters, named genetic marker or marker genes, are and has been used to improve
efficiency of breeding programs.
Identification of a new class of genetic markers, molecular markers, represents a truly
revolutionary event in plant improvement methodology. Strategies using molecular markers
reveal polymorphism; this molecular polymorphism is due to largely change of the amount of
repetitive DNA in plants genome.
Molecular markers are widely accepted as potentially valuable tools for crop
improvement in rice wheat, maize, barley, oilseeds and pasture species. Some studies suggest
that molecular markers will play a vital role in enhancing global food production by improving
the efficiency of conventional plant breeding programs (Kasha, 1999; Ortiz, 1998). The most
important applications of molecular markers in plant breeding are the marker assisted selection,
detecting diversity and genetic differences between populations.
28

3.1. Marker assisted selection
CHAPTER III
Molecular markers that are tightly linked to genes of interest to breeders could be used
for marker assisted selection (Ribaut & Hoisington, 1998). The major breeding goals of mapping
and tagging genes are to perform indirect selection for desired traits using the linkage between
the target gene and a molecular marker, called marker assisted selection (MAS). MAS consist of
identification of a tight linkage between genes controlling agronomic traits and molecular
markers, and the use of these markers to improve lines or cultivars (Dudley 1993). The
availability of marker systems suitable for large-scale application of MAS and the ability to
analyze vast numbers of plants in a time-adequate and cost-effective manner is one of the major
constraints in MAS implementation.
3.2. Award markers to genes of interest
Assigning markers to the gene can be done in three ways:
1. Cosegregation - analyzing the relationship of linkage between marker and gene of interest: if
the distance between marker and gene is small, marker gene is assigned;
2. Near Izogenic Lines - obtained by backcross method;
3. Bulk Segregated Analysis - method involving F2 generation obtained by crosses between two
extreme forms: a resistant plant and sensitive plant that proved to be polymorphic at the
molecular level (Michelmore et al., 1991). F2 generation individuals are grouped on susceptible
and resistant individuals; two bulked DNA samples are generated, each bulk contains individuals
that are identical for a particular trait or genomic region, but arbitrary at all unlinked regions.
The two bulks are screened for differences using molecular markers: if molecular polymorphism
is revealed (an extra band) that means that molecular markers can be assigned to the gene that
selection has been made. This system works only if gene selection is made is in coupling phase
with molecular markers.
4.1. Aim and objectives
CHAPTER IV
The aim of this thesis was to find new molecular markers linked with common wheat
(Triticum aestivum) resistance genes to septoria tritici blotch (Septoria tritici) using marker
assisted selection (MAS).
The first goal of this project is to test microsatellite -SSR markers for wheat resistance
genes to septoria tritici blotch selection.
The second objective is to assign RAPD markers to resistance genes based on co
segregation.
The third objective is to assign RAPD markers based on Bulk Segregant Analysis.
The fourth objective relate to the DNA cloning from polymorphic bands, assigned to
resistance genes, in order to convert RAPD polymorphic markers into specific SCAR (Sequence
Characterized Amplified Region) markers.
4.2. Biological material
The biological material used was delivered from INCDA Fundulea, represented by:
29

22 cultivars: 14 lines of bread wheat with field resistance to septoria tritici blotch and 8
susceptible lines to this disease;
9 double haploid lines with resistance to septoria tritici blotch;
23 double haploid lines: 21 resistant lines and 2 susceptible lines.
4.3. Working methods
4.3.1. DNA isolation and quantification
DNA isolation from biological material was made by Roger et al. protocol (1988). The
process comprises three major steps:
- Cell lyses and DNA release;
- Purification of a particular type of DNA;
- Achieving a DNA solution of known purity and concentration.
DNA quantification was made using NanoDrop UV/Vis 1µl Spectrophotometer (Labtech
International) connected to PC.
4.3.2. DNA amplification using RAPD markers
RAPDs are DNA fragments amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR) usig
short synthetic primers of random sequence (Williams et al., 1990); amplified fragments are
separated by electrophoresis and polymorphisms are detected as the presence or absence of
particular size. To amplify our DNA we used 20 random primers.
4.3.3. DNA amplification using SSR markers
Microsatellites are molecular marker loci consisting of tandem repeat units of very short
(1-5 basepairs) nucleotide motif, for ex. (AC)n.
In this study we tested 16 pairs of SSR primers, which are known that they are linked to
resistance genes to septoria tritici blotch.
4.3.4. Electrophoresis
DNA electrophoresis is an analytical technique used to separate DNA fragments by size.
DNA molecules which are to be analyzed are set upon a viscous medium, the gel, where an
electric field forces the DNA to migrate toward the positive potential, the anode, due to the net
negative charge of the phosphate backbone of the DNA chain. The separation of these fragments
is accomplished by exploiting the mobility with which different sized molecules are able to
traverse the gel: longer molecules migrate more slowly because they experience more drag
within the gel. The types of gel most commonly used for DNA electrophoresis are agarose (for
relatively long DNA molecules) and polyacrylamide (for high resolution of short DNA
molecules, for example in DNA sequencing).
4.3.5. Image capture and analysis
The DNA fragments of different lengths are visualized using a fluorescent dye specific
for DNA, such as ethidium bromide. The gel shows bands corresponding to different DNA
molecules populations with different molecular weight. Fragment size is usually reported in
"nucleotides", "base pairs" or "kb" (for thousands of base pairs) depending upon whether single-
or double-stranded DNA has been separated. Fragment size determination is typically done by
comparison to commercially available DNA ladders containing linear DNA fragments of known
length. The visualization of PCR products was made with BioSpectrum AC Imaging System
(Ultra Violet Products, UVP) and they were analyzed using Vision Works LS program.
30

4.3.6. Maintenance, multiplication and conservation of Septoria tritici isolates
Septoria tritici isolates (IPO 232, IPO 94269) were provided by Wageningen University
(Netherland) useful for artificial infection of our wheat hybrids. In order to multiply and
conserve these isolates were necessary two culture media: PDA (Potato Dextrose Agar) and
YGM (Yeas Glucose Medium); pure culture was criopreserved for future experiments.
4.3.7. Bulk Segregant Analysis
Bulk Segregant Analysis method is a rapid procedure for identifying markers in specific
regions of the genome (Michelmore et al., 1991); the method involves comparing two pooled
DNA samples of individuals from a segregating population originating from a single crosses.
Within each bulk the individuals are identical for the trait or gene of interest but are arbitrary for
all other genes; the two pools contrasting for a trait, e.g., resistant and susceptible to a particular
disease, in this case, septoria tritici blotch, are analyzed to identify markers that distinguish them.
Markers that are polymorphic between the pools will be genetically linked to the loci
determining the trait used to construct the pools. This method has immediate applications in
developing genetic maps (O’Brien, 1990).
4.3.8. DNA cloning from polymorphic bands
The last objective of this thesis was related to the DNA cloning from polymorphic bands,
in order to convert RAPD polymorphic markers into specific SCAR (Sequence Characterized
Amplified Region) markers. DNA cloning is a technique to reproduce DNA fragments. It can be
achieved by two different approaches: cell base and using Polymerase Chain Reaction. Parental
wheat DNA was amplified with RAPD markers, followed by electrophoresis and polymorphic
bands were excised from agarose gel. PCR products were cloned using pGEM Easy Vector
Sistem (Promega), pJET 1.2/blunt (CloneJET TM PCR Cloning Kit, Fermentas), and PTZ57/T
vector (InsTAclone TM Cloning Kit, Fermentas).
4.3.9. Obtaining F2 generation from parental crossing
Biological material was sown in experimental field in autumn 2006, the wear following
crosses were performed using all parental lines with filed resistance to septoria tritici blotch and
three susceptible parents (15- Farmec; 16- Delabrad; 17- F96869G1-108). F1 hybrids were sown
in autumn 2007; following year we harvested F2 generation in order to test the resistance to
Septoria tritici pathogen.
5.1. Results regarding DNA isolation
CHAPTER V
DNA isolation from wheat leaves was carried out as described by Roger et al. (1988),
CTAB-based method. Good results were obtained.
5.2. Results regarding septoria tritici blotch disease resistance on wheat using SSR technique
5.2.1. Results regarding DNA amplification on parental lines
To achieve the first objective of this thesis we tested microsatellite markers in order to
achieve marker-assisted selection for resistance in wheat to Septoria. Our trials were to find what
genes are present in our biological material. The parental lines considered resistant to septoria
tritici blotch (1 to 14) and susceptible forms were tested using several SSR markers described in
the literature as associated with Septoria resistance genes, also field phenotypic evaluation has
been made.
31

In our experiment two markers (Xgwm44 and Xgwm111) could not discriminate the
Septoria resistant from the susceptible form. The Xgwm44 marker, revealed a not very obvious
the 182 bp product amplification, associated with Stb5resistance gene (the 182 bp band appeared
only at one line).The Xgwm 577 marker provided good results; a 180 bp product of
amplification, associated with Stb8 resistance, gene was present at some resistant lines (8, 11, 13
and 14), so we can consider that these lines carry Stb8. The pSCH20 marker, specific to rye
genome, appeared in the individual plants from 2, 6, 7, 8, 10, 11, 13 and 14 resistant lines to
Septoria. This suggests that resistance genes come from rye genome.
5.2.2. Results regarding DNA amplification on double haploid lines
The Xgwm493 marker linked to Stb2 locus gave straightforward results (figure 1).
Figure 1. Amplification products obtained with Xgwm493 marker, L- ladder 50 bp
Most of the field resistant double haploid lines had amplification products similar to those
of the susceptible lines (22 and 23), being considered deprived of STB2 allele for resistance to
septoria tritici leaf blotch. Only two lines (9 and 11) had amplification products considered as
harboring Stb2 allele for resistance. Good results were obtained for Stb4 with Xgwm111 marker
and Stb6 with Xgwm369 marker.
5.3. Results regarding assigning of RAPD markers to resistance genes based on cosegregation
5.3.1. Results regarding DNA amplification on parental lines
RAPD markers linked with Septoria resistance genes could be revealed by analysis of
molecular polymorphism obtained with different primers among different resistant wheat lines
and susceptible wheat parental forms. For each primer, we can consider as candidate that marks a
resistance gene, the amplification products present in resistant lines and absent in the susceptible
parent.
Figure 2. Amplification products obtained with OPH20 marker,
L- ladder 100 bp
The OPH20 primer that usually gives one 1400 bp product of amplification for rye
introgression in the wheat genome has given such a product in almost all resistant lines (figure
2).
The OPC4 primer gives two candidates, one of approximately 510 bp and another of
approximately 1500 bp revealed in almost all resistant lines. The OPC 13 primer gives one
candidate of 350 bp and the Mic 14 primer gives one candidate of 550 bp.
32

5.3.2. Obtaining hybrid material
To achieve the third objective of this thesis we made crosses between resistant plants with
susceptible S. tritici pathogen; F1 hybrids were obtained which were self pollinated resulting F2
segregating generation (Table 1).
F2 generation obtained in field
No. Hybrids Genealogy
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
P1 X
P16
P4 X
P16
P5 X
P16
P6 X
P16
P8 X
P16
P5 X
P17
P6 X
P17
P9 X
P17
Resistant parent x Susceptible parent
ALTAR 84/Aegilopsis squarosa (219)/2
SERI/3/F96869G1-1
x DELABRAD
FARMEC/Aegilopsis squarosa x DELABRAD
CIT 3/ T. Tauschi (T2450)/Boema/3/F95160G1-3
x DELABRAD
CIT3/T.Tauschi(T2460)/229S31202/3/Bucur/4/ Jiana
x DELABRAD
TAM1074/T.Timopheevi(TA870),(KSWGRC36)/Glosa
x DELABRAD
CIT 3/ T. Tauschi (T2450)/Boema/3/F95160G1-3 x
F96869G1-108 x DELABRAD
CIT3/T.Tauschi(T2460)/229S31202/3/Bucur/4/ Jiana
x F96869G1-108
T. Timopheevi/T. Monococum/2 F132/3/2 Crina x
F96869G1-108
Table 1.
5.4. Establishing linkage relationships between assigned RAPD markers and STB resistance
genes
Genetic mapping of STB resistance genes progressed rapidly after 1995 and now more
than 12 genes have been mapped, with one or more associated molecular markers each, these
genes are distributed on 10 wheat chromosomes, occurring equally on the A, B and D genomes
(Goodwin, 2007).
Good flanking markers are essential to ensure that the resistance gene is not lost during
the process of marker assisted selection. It is desirable to have markers that are linked more
closely than those identified thus far, both for marker assisted selection and for possible mapbased
cloning of the genes in the future Cloning and sequencing of the correct locus can allow
the primers to be extended and possibly made more specific.
Another use for molecular markers will be to combine resistance to multiple diseases and
pests, this is being attempted already for the Stb2 gene on chromosome 3BS. This chromosome
arm also contains gene Sr2 for resistance against stem rust, and major quantitative trait loci
(QTL) for resistance to Stagonospora nodorum blotch and Fusarium head scab. All of these
resistances originated in different cultivars of wheat. Attempts are under way to combine these in
coupling into a single linkage block with good resistance to all four diseases. Similar map
locations between other STB resistance genes and genes for resistance to various pests and
33

pathogens also exist and could be exploited to develop linkage blocks with multiple resistances.
In this study we aimed to establish linkage relationships between molecular markers like
RAPD’s and STB resistance genes using F2 generation analysis. F2 generation is the result of
various crosses between the resistance forms to Septoria tritici with susceptible forms to this
disease. Good results were obtained by testing OPA11, OPC13 and OPC04 markers: OPA11
marker is linked to Stb resistance gene at the distance of 6 cM, OPC 13 is linked at the distance
of 3 cM and OPC04 is linked at the distance of 2 cM.
5.5. Results regarding cloning of amplification products
The last objective of our research is the cloning of DNA bands obtained by amplification
of polymorphic DNA with RAPD markers. This objective was achieved by cloning DNA of a
resistant line with RAPD markers that were assigned previous to the resistance gene. For DNA
amplification we used three RAPD markers (OPH20, OPC04 and OPC13). Best results were
obtained with CloneJET TM Cloning Kit.
The white colonies were multiplied on LB media supplemented with appropriate
antibiotic, then plasmid DNA was isolated and sequenced in order to design specific primers and
converting RAPD marker into SCAR marker.
CONCLUSIONS
Conclusions concerning the issuing of the first objective proposed in this thesis – testing
microsatellite -SSR markers for wheat resistance genes to septoria tritici blotch selection:
Isolation of DNA was performed according to protocol using CTAB, quantity and purity
of DNA obtained was good; SSR markers have been used successfully for the selection of
segregating generation of individuals carriers of alleles for resistance to Septoria and carrier
selection double haploid lines of resistance genes:
The double haploid lines tested carried at least one resistance gene, most frequently Stb4,
Stb7 and Stb8. For resistance genes Stb1, Stb3, Stb5 and Stb6 results were not conclusive.
Individual plants within each double haploid line were not segregated confirming their
homozygous nature.
Conclusions concerning the issuing of the second objective -assigning RAPD markers to
resistance genes based on co segregation:
RAPD markers tested gave good amplification in all genotypes studied: of the 20 markers
tested, 11 showed polymorphism in bulk populations from recombinant lines resistant to
Septoria tritici, compared to parental forms characterized to be susceptible to this pathogen:
Polymorphic bands obtained are considered as candidate molecular markers for Septoria
tritici resistance genes.
Conclusions concerning the issuing of the third objective - assigning RAPD markers
based on Bulk Segregant Analysis method:
Were obtained eight F2 combinations which have tested using artificial infection with
spores of S. tritici. Molecular analyses were performed on bulks of resistant and susceptible
plants with RAPD markers. Linkage relations were established between RAPD markers and
resistance genes to septoria tritici blotch.
Conclusions concerning the issuing of the fourth objective -DNA cloning from
polymorphic bands, assigned to resistance genes, in order to convert RAPD polymorphic
markers into specific SCAR markers:
Parental DNA was cloned using CloneJET TM cloning kit and OPC13 (RAPD marker)
(350 bp polymorphic band). After cloning and sequencing DNA, SCAR markers are designed.
34