REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT - USAMV Cluj-Napoca

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ
VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
Ing. Biolog BÂLTEANU I. VALENTIN ADRIAN
REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT
STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR
MAJORE DIN LAPTE LA PRINCIPALELE RASE DE TAURINE,
BUBALINE, OVINE ŞI CAPRINE DIN ROMÂNIA ÎN SCOPUL
UTILIZĂRII LOR CA MARKERI GENETICI ÎN AMELIORARE ŞI
TRASABILITATE
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
Prof.Univ. Dr. Ing. VLAIC AUGUSTIN

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CUPRINS
INTRODUCERE.....................................................................................................4
PARTEA I: STUDIU BIBLIOGRAFIC
CAPITOLUL I
COMPOZIŢIA LAPTELUI DE VACĂ, BIVOLIŢĂ, OAIE,
CAPRĂ ŞI MECANISMUL SINTEZEI LUI LA NIVELUL
GLANDEI MAMARE ÎN LACTAŢIE................................................................5
CAPITOLUL II
TEHNICI MOLECULARE UTILIZATE PENTRU
STUDIUL POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE..................7
CAPITOLUL III
STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PRIVIND
STUDIUL POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN
LAPTE LA TAURINE, BUBALINE, OVINE ŞI CAPRINE..............................7
CAPITOLUL IV
IMPORTANŢA STUDIERII POLIMORFISMELOR
PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE PRIN PRISMA
POSIBILITĂŢII UTILIZĂRII LOR CA MARKERI
GENETICI ÎN AMELIORAREA ANIMALELOR
ŞI TRASABILITATEA PRODUSELOR LACTATE.......................................10
PARTEA II: CERCETĂRI PROPRII
CAPITOLUL V
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII.....................................................13
CAPITOLUL VI
CARTAREA PE CROMOZOMI A GENELOR CARE
CODIFICĂ PROTEINELE MAJORE DIN LAPTE PRIN
TEHNICA HIBRIDĂRII ÎN SITU CU FLORESCENŢA (FISH)...................14
2

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CAPITOLUL VII
STUDIUL POLIMORFISMELOR CELOR DOUĂ GENE
CE CODIFICĂ K-CAZEINA ŞI -LACTOGLOBULINA
LA TAURINE DIN RASA BĂLŢATĂ ROMÂNEASCĂ
DE TIP SIMMENTAL PRIN TEHNICA PCR-RFLP......................................15
CAPITOLUL VIII
STUDIUL COMPARATIV PRIN TEHNICILE IEF ŞI
PCR-RFLP A POLIMORFISMELOR GENETICE ALE
PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE LA TAURINE
DIN RASA BĂLŢATĂ ROMÂNEASCĂ
DE TIP SIEMMENTAL.......................................................................................16
CAPITOLUL IX
CARACTERIZAREA POLIMORFISMELOR PROTEINELOR
MAJORE DIN LAPTE LA UNELE RASE DE TAURINE,
BUBALINE, OVINE ŞI CAPRINE DIN ROMÂNIA FOLOSIND
TEHNICA IEF.......................................................................................................17
CAPITOLUL X
CARACTERIZAREA MOLECULARĂ A ALELELOR NOI
IDENTIFICATE LA LOCII αS1-CAZEINEI ŞI β-CAZEINEI
LA RASA SURA DE STEPĂ, VARIETATEA MOLDOVENEASCĂ
ŞI BIVOL ROMÂNESC......................................................................................21
CAPITOLUL XI
IDENTIFICAREA AUTENTICITĀŢII/ORIGINII DECLARATE
A LAPTELUI ŞI PRODUSELOR LACTATE AUTOHTONE
FOLOSIND CA MARKERI GENETICI POLIMORFISMELE
PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE...........................................................23
CAPITOLUL XII
CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI.............................................24
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ...........................................................................25
3

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
INTRODUCERE
Lactogeneza poate fi împartita în doua faze: faza 1 - începe în ultima treime a
gestaţiei în care au loc procese de diferenţiere structurale şi funcţionale ale epiteliului
secretor; faza 2 - începe imediat după naştere şi implică finalizarea diferenţierii celulare,
care coencide cu sinteza şi secreţia laptelui în cantităţi semnificative. Aceste două faze
sunt esenţiale având ca efect final declanşarea lactaţiei.
În laptele rumegătoarelor întâlnim 6 tipuri de proteine majore codificate de 6 gene
nealele, ce se exprimă specific în celulele epiteliale ale glandei mamare în lactaţie: S1-
cazeina (S1-CN), -cazeina (-CN), S2-cazeina (S2-CN), K-cazeina (K-CN), -
lactoglobulina (-CN şi -lactoalbumina (-LA).
Variaţiile care au apărut în structura acestor gene de-a lungul timpului, au dus la
apariţia mai multor alele la aceşti loci. Aceste variaţii, denumite generic polimorfisme,
sunt cauzate de restructurări ale genelor (substituţia unor nucleotide, deleţii, inserţii etc),
ce pot avea ca efect modificarea nivelului lor de expresie, inactivarea expresiei lor,
modificarea compoziţiei în aminoacizi a proteinei etc.
Astfel unele variante genetice de la cei 6 loci au efect pozitiv asupra conţinutului
de cazeină al laptelui, timpului de coagulare, fermităţii coagulului şi randamentului de
obţinere al brânzeturilor, iar altele au efect negativ asupra acestor parametri; unele
variante genetice ale β-CN de la taurine au fost asociate cu declanşarea unor boli la
oameni, cum ar fi: diabetul de tip 1, cardiopatia ischemică, sindromul morţii subite la nou
născuţi, schizofrenia şi autismul (variantele A 1 , B, C), altele nu (variantele A 2 , A 3 ); unele
variante genetice ale αS1-CN au fost asociate cu alergii la copii, în urma consumului de
lapte.
Aplicarea în România a informaţiilor furnizate de variantele genetice ale celor 6
proteine majore din lapte, nu poate fi facută fără o caracterizare a raselor/speciilor de
fermă autohtone. Această caracterizare realizată în cadrul tezei mele de doctorat, oferă
informaţii extrem de valoroase despre frecvenţa alelelor de la cei şase loci ai proteinelor
4

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
din lapte de la speciile/rasele autohtone. Ea deschide noi posibilităţi de utilizare a acestor
polimorfisme ca markeri genetici în ameliorarea animalelor, în manipularea prin selecţie
genetică a componenţilor laptelui, în scopul producerii unui lapte alternativ care să
contracareze o serie de maldii, precum şi ca markeri genetici de indentificare a
autenticităţii, originii şi trasabilităţii produselor lactate.
PARTEA I: STUDIU BIBLIOGRAFIC
CAPITOLUL I
COMPOZIŢIA LAPTELUI DE VACĂ, BIVOLIŢĂ, OAIE, CAPRĂ ŞI
MECANISMUL SINTEZEI LUI LA NIVELUL GLANDEI MAMARE ÎN
LACTAŢIE
Cercetările ştiinţifice au stabilit că laptele are o compoziţie chimică complexă, mai
ales în ceea ce priveşte fracţiunile cazeinice, proteinele din zer, enzimele şi substanţele
antimicrobiene. Laptele reprezintă o sursă de hrană cu valoare biologică ridicată,
conţinând mai mult de 100 de substanţe dizolvate într-o formă uşor asimilabilă, aflate în
suspensie sau sub formă de emulsie, necesare funcţionării normale a organismului uman
şi animal (Banu şi colab., 1998).
Proteinele din laptele sunt împărţite în două mari grupe în funcţie de
comportamentul lor la pH acid = 4,6:
1. Fracţiunea solubilă la acest pH, denumită ,, proteine din zer ’’, este alcătuită din β-
lactoglobulină (β-LG) şi α-lactoalbumină (α-LA) şi alte proteine minore. În procesul de
producere al brânzeturilor prin adaus de cheag, această fracţiune rămâne în zer şi nu intră
în constituţia lor.
2. Fracţiunea insolubilă la acest pH, numită ,,cazeina totală’’, este constituită din patru
tipuri de cazeine: αS1-cazeina (αS1-CN), αS2-cazeina (αS2-CN), β-cazeina (β-CN) şi K-
cazeina (K-CN). Cazeinele se găsesc în laptele proaspăt dispersate sub forma unui număr
5

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
foarte mare de particule solide în suspensie, fiind sudate între ele prin molecule de
Ca 9 (PO 4 ) 6 . Aceste particule sunt denumite micelii.
Conţinutul în proteină al laptelui de vaca este în medie de 3,3%, în laptele de
bivoliţă de 4,1% , în laptele de oaie de 5,3 % , iar în cel de capră de 3,7% (Iurcă şi
colab., 1998) . Din totalul proteinelor, fractiunea cazeinică reprezintă 80%, iar proteinele
serice 20% .
De proporţia fracţiunii cazeinice şi mărimea miceliilor depind în mare masură
proprietăţile de prelucrare ale laptelui, cantitatea şi calitatea brânzei obţinute, textura şi
gustul diferitelor sortimente de brânzeturi şi produse lactate (Buchberger si colab., 2000).
Cele 6 tipuri de proteine majore din lapte sunt codificate de 6 gene nealele, care se
exprimă specific în celulele epiteliale ale glandei mamare în lactaţie.
Analiza privind segregarea Mendeliană a celor 4 gene nealele ce codifică cele 4
tipuri de cazeine de la rumegătoare, a scos în evidenţa faptul că ele sunt situate pe
cromozomii din perechea 6 în următoarea ordine: αs1-CN, β-CN, αs2-CN, K-CN
(Threadgill şi colab., 1990; Hayes şi colab., 1993a). Gena care codifică β-LG a fost
localizata pe cromozomii din perechea 11 (Hayes şi colab., 1993b), iar cea care codifică
α-LA a fost localizată pe cromozomii din perechea 5 (Soulier şi colab., 1989; Vilotte şi
colab., 1987).
Sistemul endocrin, în principal prin glanda hipofiză, joacă un rol central în toate
aspectele ce implică creşterea şi dezvoltarea ţesutului mamar (mamogeneza), declanşarea
lactaţiei şi sinteza laptelui (lactogeneza), menţinerea secreţiei lactate (galactopoieza) şi
apoi intrarea în repaus mamar, prin intermediul a 2 hormoni majori: hormonul de creştere
sau somatotrop (GH sau STH), respectiv prolactina (PRL). Semnalele hormonale
determină activarea transcripţională a genelor ce codifică proteinele din lapte şi sinteza
proteinelor specifice.
6

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CAPITOLUL II
TEHNICI MOLECULARE UTILIZATE PENTRU STUDIUL
POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE
Studiile realizate încă din anii ’50 folosind electroforeza pe hârtie (PE), au pus în
evidenţă polimorfismul proteinelor majore din lapte, β-LG fiind prima proteină al cărei
polimorfism a fost identificat de către Aschaffenburg şi Drewry (1955).
Odată cu apariţia unor tehnici de analiză a proteinelor mult mai performante: SGE
(electroforeza în gel de amidon), AE (electroforeza în gel de agaroză), PAGE
(electroforeza în gel de poliacrilamidă), IEF (electroforeza prin focalizare izoelectrică),
HPLC (cromatografia în faza lichidă de înaltă performanţă), Maldi TOF-MS
(spectrometria de masă), s-au îmbunătăţit substanţial cunoştinţele legate de
polimorfismul proteinelor majore din lapte la diverse specii de fermă.
Apariţia tehniciilor bazate pe analiza ADN: PCR (reacţia în lanţ a polimerazei),
PCR-RFLP (polimorfismul de lungime al fragmentelor de ADN amplificate şi
restrictate), SSCP (polimorfismul de conformaţie al fragmentelor de ADN
monocatenare), RT-PCR (reacţia în lanţ a polimerazei în timp real) şi a tehnicilor de
secvenţiere a ADN-ului, au permis descifrarea polimorfismelor care apar în structura
genelor, care au repercursiuni asupra expresiei genice şi compoziţiei în aminoacizi a
variantelor genetice ale proteinelor majore din lapte.
CAPITOLUL III
STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PRIVIND STUDIUL
POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE LA TAURINE,
BUBALINE, OVINE ŞI CAPRINE
Mutaţiile care au apărut de-a lungul timpului în structura genelor care codifică cele
6 proteine majore din lapte, au dus la apariţia mai multor variante genetice la aceşti loci.
7

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
Aceste variaţii, denumite generic polimorfisme, indică faptul că fiecare specie proteică
din lapte poate să se prezinte sub două sau mai multe forme codificate de gene
autozomale (alele) între care există interacţiune de co-dominanţă, ceea ce înseamnă că
ambele alele se exprimă la indivizii heterozigoţi.
Alfa S1-CN este o proteină din lapte constituită din 199 de aminoacizi, având o
greutate moleculară de 23, 614 kDa. La taurine la locusul αS1-CN au fost identificate
până în prezent 10 variante genetice: A, B, C, D, Eyak, Ebali, F, G, H, (Farrell şi colab.,
2004) şi I RV (Bâlteanu şi colab., 2007a; Bâlteanu şi colab., 2008a,b). Alela I RV a fost
redenumită I SM , deoarece nu a fost evidenţiată la alte rase de taurine din România, fiind
caracteristică doar rasei Sură de Stepă, varietatea Moldovenească (SM = Sură
Moldovenească). La bubaline au fost identificate 3 variante genetice: A, B (Chianese şi
colab., 2009) şi B RV (Bâlteanu şi colab., 2007c; Bâlteanu şi colab., 2008c). În urma
caracterizării la locusul αS1-CN a populatiilor de Bivol Românesc, am constatat că
această variantă genetică este specifică rasei Bivol Românesc, ea fiind redenumită după
regiunea în care a fost identificată: S1-CN B BT (indicele BT reprezentând Bivol din
Transilvania). La ovine au fost identificate 9 variante genetice: A, B, C, D, E, F, G, H, I
(Pirisi şi colab., 1999; Giambra şi colab., 2010). La caprine au fost identificate 17
variante genetice: A, B1, B2, B3, B4, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, 01,02 (Ramunno şi
colab., 2004).
Beta-CN este o proteină din lapte constituită din 209 aminoacizi, având o greutate
moleculară de 23,983 kDa. La taurine la locusul β-CN au fost identificate până în
prezent 14 variante genetice: A1, A2, A3, B, C, D, E, A3m, B2, A4, H, F, A5, G (Farrell
şi colab., 2004). La bubaline au fost identificate 3 variante genetice: A, B (Ferranti şi
colab., 1998) şi C RV (Bâlteanu şi colab., 2007c; Bâlteanu şi colab., 2008c). În urma
caracterizării la locusul β-CN a populatiilor de Bivol Romanesc, am constatat că această
variantă genetică este specifică rasei Bivol Românesc, ea fiind redenumită dupa regiunea
în care a fost identificată: -CN C BT (indicele BT reprezentând Bivol din Transilvania).
La ovine nu există dovezi clare privind polimorfismul la nivel proteic (Chianese şi
8

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
colab., 1995). La caprine au fost identificate 8 variante genetice: A, A 1, B, C, D, E, 0 şi
0’ (Cosenza şi colab., 2005a; Caroli şi colab., 2006)
Alfa S2-CN este o proteină din lapte constituită din 207 de aminoacizi, având o
greutate moleculară de 25,150 kDa. La taurine la locusul αS2-CN au fost identificate
până în prezent 4 variante genetice: A, B, C, D (Farrell şi colab., 2004). La bubaline au
fost identificate 3 variante genetice: A, B, C (Ferranti şi colab., 1998). La ovine au fost
identificate 2 variante genetice: A, B (Rossi şi colab., 1984; Mauriello şi colab., 1990).
La caprine au fost identificate 9 variante genetice: A, B, C, E, F, G, D, 0 şi 0’ (Erhardt şi
colab., 2002).
Kappa-CN este o proteină din lapte constituită din 169 de aminoacizi, având o
greutate moleculară de 19,007 kDa. La taurine la locusul K-CN au fost identificate
până în prezent 11 variante genetice: A, B, C, B2 , E, F, G, Az, H, I, J (Farrell şi colab.,
2004). La bubaline au fost identificate 2 variante genetice: A, B (Mitra şi colab., 1998).
La ovine au fost identificate o singură variantă genetică (Chianese şi colab., 1996;
Ceriotti şi colab., 2004b). La caprine se cunosc 16 situsuri polimorfice ce corespund
unui număr de 13 variante proteice şi 3 mutaţii tăcute, implicând un număr de 15 situsuri
polimorfe doar în exonul 4: A, B, B', B", C, C', F, G, H, I, J, L, D, E, K, M (Jann şi
colab., 2004b).
Alfa-LA este o proteină din lapte constituită din 123 de aminoacizi, având o
greutate moleculară de 14,175 kDa. La taurine la locusul α-LA au fost identificate până
în prezent 3 variante genetice: A, B, C (Farrell şi colab., 2004). La bubaline au fost
identificate 2 variante genetice: A, B (Chianese şi colab., 2004). La ovine au fost
identificate 2 variante genetice: A, B (Dall’Olio şi colab., 1989). La caprine au fost
identificate 2 variante genetice: A1, respectiv A2 (Cosenza şi colab., 2005b).
Beta-LG este o proteină din lapte constituită din 162 aminoacizi, având o greutate
moleculară de 18,277 kDa. La taurine la locusul β-LG au fost identificate până în
prezent 13 variante genetice: A, B, C, D, Dr, Dyak, E, F, G, W, H, I , J (Farrell şi colab.,
2004). La bubaline au fost identificate 2 variante genetice: A, B (Chianese şi colab.,
2004). La ovine au fost identificate 3 variante genetice A, B (Kolde şi colab., 1983;
9

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
Schlee şi colab., 1993) şi C (Erhardt şi colab., 1989). La caprine au fost identificate 2
variante genetice: A, respectiv B (Yahyaoui şi colab., 2000).
CAPITOLUL IV
IMPORTANŢA STUDIERII POLIMORFISMELOR PROTEINELOR
MAJORE DIN LAPTE PRIN PRISMA POSIBILITĂŢII UTILIZĂRII LOR
CA MARKERI GENETICI ÎN AMELIORAREA ANIMALELOR ŞI
TRASABILITATEA PRODUSELOR LACTATE
Influenţa variantelor genetice ale proteinelor majore din lapte asupra cantităţii
laptelui
La taurine influenţa variantelor genetice ale proteinelor din lapte asupra cantităţii
lui a fost evaluată în numeroase studii. Astfel genotipurile BB de la locusul S1-CN,
A 2 A 2 de la locusul -CN, AA de la locusul -LG şi AA (+15) de la locusul α-LA, au
fost asociate cu o cantitate mai mare de lapte (Bovenhuis şi colab., 1992; Bleck şi colab.,
1993b; Ikonen şi colab., 1999, Ng-Kwai-Hang şi colab., 2006).
La ovine studiile privind influenţa genotipurilor de la locusul β-LG asupra cantităţii
laptelui sunt contradictorii. Bolla şi colaboratorii (1989), respectiv Caroli şi colaboratorii
(1995) au constatat la rasa Sarda că genotipul BB este asociat cu o cantitate mai mare de
lapte. Di Stasio şi colaboratorii (1992) au constatat la rasa de ovine Siciliană o
superioritate a indivizilor AB la acest locus în ceea ce priveşte producţia de lapte. La rasa
de ovine Valle del Belice, genotipul AA a fost asociat cu o cantitate mai mare de lapte
(Giaccone şi colab., 2000).
La caprine Kumar şi colaboratorii (2006) au constatat că genotipurile AA au avut o
producţie mai mare în comparaţie cu celelalte genotipuri.
10

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
Influenţa variantelor genetice ale proteinelor majore din lapte asupra calităţii
laptelui, proprietăţilor sale de prelucrare şi randamentului de obţinere al
brânzeturilor
La taurine genotipul CC de la locusul αS1-CN, genotipul BB de la locusul K-CN
şi genotipul BB de la locusul β-LG au fost corelate cu un conţinut mai mare de cazeină şi
proteină totală a laptelui (Jakob şi colab., 1994; Fitzgerald şi colab., 1997; Lunden şi
colab., 1997 ). Genotipul BB de la locusul β-LG a fost corelat cu un conţinut mai mare de
grasime al laptelui (Wedholm şi colab., 2006; Heck şi colab., 2009). Laptele provenit de
la genotipul CC de la locusul αS1-CN, genotipul BB la locusul β-CN şi genotipul BB la
locusul K-CN, coagulează într-un timp mult mai scurt în comparaţie cu celelalte
genotipuri (Delacroix - Buchet şi colab., 1994; Fitzgerald şi colab., 1997; Kubarsepp şi
colab., 2005). Genotipul BB de la locusul K-CN influenţează pozitiv randamentul de
transformare al laptelui în brânzeturi în comparaţie cu genotipurile AA, diferenţele
constatate fiind între 2,7-15%, în functie de tipul de brânză fabricată (Van den Berg şi
colab., 1992; Fitzgerald şi colab.,1997; Walsh şi colab., 1998).
La caprine efectele polimorfismului S1-CN asupra calităţii laptelui de capra au
fost studiate la rasele Franceze (Mahe şi colab., 1994; Delacroix şi colab., 1996;
Manfredi şi colab., 2000). Rezultatele obţinute indica faptul că alela A, în comparaţie cu
alelele E şi F, are un efect semnificativ (pozitiv) asupra conţinutului de proteină, grăsime
şi proprietăţilor de prelucrare ale laptelui. În experimente de fabricare a brânzeturilor, s-
au obţinut diferenţe de 7,4% între genotipurile AA şi EE, de 6,9% între genotipurile EE şi
FF de14,8% între AA şi FF. Brânzeturile provenite de la genotipurile AA au avut un gust
mai slab pronunţat de capră (datorită lipolizei mai slabe), în comparaţie cu genotipurile
FF, care au avut un gust mai pronunţat (datorită lipolizei mai accentuate). Rezultate
similare au fost obţinute şi la rasele Spaniole (Sanchez şi colab., 1998), rasele Italiene
(Meggiolaro şi colab., 2000), rasele Norvegiene (Vegarud şi colab., 1999) şi la unele rase
din SUA (Clark şi colab., 2000).
11

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
La ovine genotipul CC de la locusul αS1-CN are o influenţa pozitivă asupra
compoziţiei laptelui şi randamentului de obţinere al brânzeturilor. În experimente de
fabricare a brânzeturilor s-au obţinut diferenţe de +3,5%, respectiv +8,6%, între genotipul
CC, în comparaţie cu genotipurile CD, respectiv DD (Pirisi şi colab., 1999). Genotipul
BB de la locusul β-LG a fost asociat cu un conţinut mai mare de grăsime al laptelui şi
mai sarac în lactoza, având un efect favorabil asupra randamentului de obţinere al
brânzeturilor (Celuk şi colab., 2006).
Utilizarea polimorfismelor proteinelor majore din lapte ca markeri genetici în
identificarea autenticităţii laptelui şi produselor lactate
Pe plan mondial un număr mare de metode au fost propuse pentru identificarea
posibilelor falsuri cauzate de amestecuri de lapte interspecifice nedeclarate. Majoritatea
metodologiilor de identificare a autenticităţii produselor lactate se bazează pe analiza
polimorfismelor proteinelor majore din lapte: a) Electroforeza în gel de poliacrilamidă
în condiţii native (Kaminarides şi colab., 2002); b) Electroforeza în gel de
poliacrilamida în condiţii denaturante (Veloso şi colab., 2002); c) Electroforeza prin
focalizare izoelectrică (Addeo şi colab,. 1990; Anonymous, 2001; Bâlteanu , 2005;
Bâlteanu şi colab., 2007b,c,d; Vlaic şi colab., 2008; Bâlteanu şi colab., 2008c); d)
Electroforeza de capilaritate (Lee şi colab., 2001); e) Metode imunochimice - ELISA
(Hurley şi colab., 2004); f) Cromatografia de înaltă performanţă în fază lichidă
inversată (Veloso şi colab., 2002); g) Spectrometria de masa (Siciliano şi colab.,
2000); h) Tehnici bazate pe analiza ADN (Bottero şi colab., 2002).
12

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
PARTEA II: CERCETĂRI PROPRII
CAPITOLUL V
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII
Studiul polimorfismelor proteinelor majore din lapte la speciile / rasele de fermă
autohtone a avut ca scop evaluarea posibilităţii folosirii ulterioare a acestor informaţii în
mai multe direcţii, ca de exemplu:
- Creşterea calităţii laptelui (în principal al conţinutului de cazeină), proprietăţilor sale de
prelucrare şi randamentului de obţinere al brânzeturilor;
- Obţinerea unui lapte hipoalergenic prin selecţia unor indivizi ce nu produc αS1-CN,
care este principalul alergen din lapte;
- Obţinerea unui lapte mai sănătos ce conţine variante ale β–CN care nu afecteză
sanătatea umana;
- Identificarea autenticităţii/originii laptelui şi produselor lactate.
Aplicarea informaţiilor furnizate de aceşti markeri genetici nu poate fi făcută fără o
cunoaştere aprofundată a polimorfismelor genetice ce apar la cei 6 loci la speciile / rasele
autohtone de taurine, bubaline, ovine şi caprine. Această caracterizare poate oferi
informaţii extrem de valoroase în ceea ce priveşte frecvenţa alelelor de la cei 4 loci ai
cazeinelor şi cei 2 loci ai proteinelor din lactoserum în populaţiile autohtone.
În contextul stadiului actual al cunoaşterii în domeniu, teza are ca obiective
principale direcţii de cercetare cu importanţă deosebită pe plan mondial, însă mai puţin
sau deloc cunoscute pe plan naţional:
- Testarea unor protocoale de hibridare FISH (hibridare in situ cu fluorescenţă), folosind
sonde BAC (cromozom artificial bacterian), care să permită cartarea genelor ce codifică
proteinele majore din lapte pe cromozomii metafazici şi în nuclei interfazici;
13

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
- Caracterizarea polimorfismelor genetice de la cei 6 loci ce codifică cele 6 proteine
majore din lapte, la unele rase de taurine: Bălţată Românească de tip Simmental, Bălţată
cu Negru Românească, Holstein Roşu, Brună, Pinzgau de Transilvania şi Sura de Stepă;
- Caracterizarea polimorfismelor genetice de la cei 6 loci ce codifică cele 6 proteine
majore din lapte, la bubalinele autohtone din rasa Bivol Românesc;
- Caracterizarea polimorfismelor genetice de la cei 6 loci ce codifică cele 6 proteine
majore din lapte, la caprinele autohtone din rasa Carpatina;
- Caracterizarea polimorfismelor genetice de la cei 6 loci ce codifică cele 6 proteine
majore din lapte, la ovinele autohtone din rasele: Ţurcană, Carabaşa, Ţigaie, Ţigaie
Ruginie, Merinos de Cluj şi Karakul de Botoşani;
- Caracterizarea moleculară a alelei noi descoperite la Sura de Stepă, varietatea
Moldovenească, redenumită S1-CN I SM , în vederea studierii posibilităţii folosirii ei ca
marker genetic de biodiversitate al rasei;
- Caracterizarea moleculară a alelelor noi descoperite la rasa Bivol Românesc,
redenumite S1-CN B BT şi β-CN C BT ;
- Studierea posibilităţii folosirii polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din
laptele speciilor/raselor de fermă, ca markeri genetici de identificare a
autenticităţii/originii laptelui, brânzeturilor şi altor produse lactate autohtone, luând în
considerare şi noile alele identificate la cei doi loci ai cazeinelor la rasa Bivol Românesc.
CAPITOLUL VI
CARTAREA PE CROMOZOMI A GENELOR CARE CODIFICĂ
PROTEINELE MAJORE DIN LAPTE PRIN TEHNICA HIBRIDĂRII ÎN
SITU CU FLORESCENŢĂ (FISH)
În cadrul experimentelor realizate am folosit două sisteme de detecţie a sondei
hibridate şi anume: un sistem de detecţie cu un singur anticorp marcat cu un fluorocrom
roşu (TRITC), anticorp care recunoaşte specific digoxigenina cu care a fost marcată una
14

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
din sonde BAC (sonda ce conţine gena WAP) şi un sistem dublu, în care un anticorp
primar recunoaşte specific biotina cu care a fost marcată cealaltă sondă (sonda ce conţine
clusterul de cazeine), care la rândul său este recunoscut de un anticorp secundar marcat
cu un fluorocrom verde (FITC).
Au fost realizate hibridări (cu sondele menţionate) pe cromozomi metafazici,
proveniţi din culturi celulare de fibroblaşti de iepure şi celule mamare tumorale HC11 din
glanda mamară de şoarece, precum şi pe nuclei interfazici bidimensionali sau
tridimesionali cu structură prezervată preparaţi din celule HC11.
În toate cazurile au fost obţinute semnale de hibridare specifice, care au permis o
cartare corectă pe cromozomi, respectiv în teritoriile cromozomiale specifice, a genelor
studiate.
CAPITOLUL VII
STUDIUL POLIMORFISMELOR CELOR DOUĂ GENE CE CODIFICĂ
K-CAZEINA ŞI -LACTOGLOBULINA LA TAURINE DIN RASA
BĂLŢATĂ ROMÂNEASCĂ DE TIP SIMMENTAL PRIN TEHNICA PCR-
RFLP
Studiul polimorfismelor K-CN şi β-LG a vizat testarea unor protocoale de lucru
PCR-RFLP, care să permită diferenţierea celor mai comune alele de la aceşti doi loci (A,
respectiv B). Astfel în cazul amplificării unui fragment de 350 pb din gena K-CN şi
digestiei cu enzima Hinf I, s-au observat 3 profile de restricţie corespunzătoare
genotipurilor AA, AB şi BB, de la acest locus. În cazul amplificării unui fragment de 262
pb din gena β-LG şi digestiei cu enzima Hae III s-au observat de asemenea 3 profile de
restricţie, corespunzătoare genotipurilor AA, AB si BB, de la acest locus.
Calcularea frecvenţei genotipurilor la locusul K-CN a scos în evidenţă o frecvenţă
mai mare a genotipului AB în comparaţie cu celelalte două. Calcularea frecvenţei
15

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
alelelorde la acest locus, a scos în evidenţă o frecvenţă mai mare a alelei A, în comparaţie
cu alela B.
Calcularea frecvenţei genotipurilor de la locusul β-LG a scos în evidenţă o
frecvenţă mai mare a genotipului AB în comparaţie cu celelalte 2. Calcularea frecvenţei
alelelorde la acest locus, a scos în evidenţă o frecvenţă mai mare a alelei B în comparaţie
cu alela A.
Rezultatele obţinute evidenţiază că cele 2 teste ADN pot fi folosite pentru
identificarea alelelor comune A şi B de la acesti loci, ceea ce permite o genotipizare
precoce a reproducătorilor taurini pentru cei 2 markeri genetici.
CAPITOLUL VIII
STUDIUL COMPARATIV PRIN TEHNICILE IEF ŞI PCR-RFLP A
POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR MAJORE DIN
LAPTE LA TAURINE DIN RASA BĂLŢATĂ ROMÂNEASCĂ DE TIP
SIEMMENTAL
Studiul a fost realizat pe 14 indivizi din rasa Bălţată Românească de tip
Simmental, care au fost genotipizaţi comparativ la locusul K-CN şi β-LG atât prin PCR-
RFLP, cât şi prin IEF. El a avut ca scop evaluarea eficienţei genotipizării la nivel de
ADN (realizat prin tehnica PCR-RFLP) şi la nivelul expresiei genice (realizat prin
tehnica IEF), la locii ce codifică proteinele majore din lapte.
În urma analizei comparative a rezultatelor obţinute am identificat la locii K-CN,
respectiv β-LG aceleaşi genotipuri, atât prin PCR-RFLP, cât şi prin IEF. În plus prin
tehnica IEF au fost vizualizate în acelaşi gel şi genotipurile de la ceilalţi 4 loci ce codifică
αS1-CN, αS2-CN, β-CN şi α-LA, permiţând o identificare corectă a tuturor alelelor, chiar
şi a celor mai rare, ce apar cu frecvenţă mai redusă.
16

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
Rezultatele obţinute scot în evidenţă faptul că tehnica IEF permite stabilirea mai
corectă a genotipurilor la cei 6 loci ce codifică proteinele majore din lapte, deoarece pot
fi identificate şi alele mai rare, lucru dificil şi costisitor cu ajutorul tehnicii PCR.
CAPITOLUL IX
CARACTERIZAREA POLIMORFISMELOR PROTEINELOR MAJORE
DIN LAPTE LA UNELE RASE DE TAURINE, BUBALINE, OVINE ŞI
CAPRINE DIN ROMÂNIA FOLOSIND TEHNICA IEF
În cazul taurinelor au fost genotipizaţi prin IEF la cei 6 loci ce codifică
proteinele majore din lapte un număr de 693 de indivizi din 7 rase autohtone, după cum
urmează: Bălţată Românească de tip Simmental (236 de indivizi), Bălţată cu Negru
Românească (230 de indivizi), Holstein Roşu (13 indivizi), Brună (134 de indivizi),
Pinzgau de Transilvania, varietăţile neagră (26 de indivizi) şi roşie (30 de indivizi) şi
Sura de Stepă, varietatea Moldovenească (24 de indivizi).
La locusul αS1-CN au fost identificate cele 2 variante genetice comune B şi C.
Frecvenţa variantei B este de peste 0,9 la rasele mai ameliorate în direcţia unei producţii
mai mari de lapte studiate, atingând frecvenţa 1 la rasa Holstein Roşu. Frecvenţa cea mai
mică a fost observată la rasa Pintzgau, varietatea negră. Frecvenţa variantei C, asociată la
multe rase de taurine cu o calitate superioară de procesare în brânzeturi a laptelui, a fost
cea mai mare la rasa Pinzgau Negru (0,308), această alelă fiind absentă la rasa Holstein
Roşu. La locusul αS1-CN a fost identificată la rasa Sura de Stepă, varietatea
Moldovenească, o nouă variantă genetică denumită I SM , cu un punct izoelectric între cel
al variantelor B şi C. Frecvenţa acestei alele determinată prin IEF este de 0,041 în
populaţiile studiate.
La locusul β-CN au fost identificate 5 variante genetice A 1 , A 2 , A 3 , B, C.
Frecvenţa variantei ancestrale A 2 este cea mai mare în comparaţie cu a celorlalte (peste
0,5), cu excepţia rasei Pintzgau, varietatea rosie, la care frecvenţa variantei A 1 este mai
17

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
mare (0,483). Varianta A 3 a fost detectată doar un individ din rasa Bălţată Românească de
tip Simmental. Varianta B, asociată la multe rase de taurine cu o calitate superioară de
procesare în brânzeturi a laptelui, are o frecvenţă extrem de redusă la toate rasele (între
0,039-0,117).Varianta C a fost detectată cu o frecvenţă foarte redusă la rasele Bălţată
Românească de tip Simmental, Brună şi Pinzgau Negru. La rasa Sura de Stepă prezenţa
variantei C a fost evidenţiată doar la indivizii genotipizaţi din zona Tazlău şi Tupilaţi, ea
fiind o dovadă a infuziei cu rasa Brună. Ea nu a fost detectată la indivizii consideraţi a fi
rasa curată de la SCDCB Dancu.
La locusul αS2-CN au fost identificate o singură variantă genetică şi anume
varianta A, cu o frecvenţa egala 1.
La locusul K-CN au fost identificate 3 variante genetice A, B şi C. Cea mai mare
frecvenţă a variantei A a fost înregistrată la rasa Bălţată cu Negru Românească (0,835),
iar a variantei B la rasa Brună (0,619). La rasa Bălţată Românească de tip Simmental
frecvenţa alelei A este foarte mare (0,679). Varianta C a fost detectată cu o frecvenţă
redusă la rasele Bălţată Românească de tip Simmental şi Brună.
La locusul α-LA au fost identificate o singură variantă genetică şi anume varianta
B, cu o frecvenţă egală 1.
La locusul β-LG au fost identificate 3 variante genetice A, B şi C. Frecvenţa
variantei A este cea mai mare la rasa Bălţată Românească de tip Simmental şi Sura de
Stepă (peste 0,5). Frecvenţa variantei B este mare la toate rasele, la rasa Holstein Roşu
fiind de 0,769.
În cazul bubalinelor au fost genotipizaţi la cei 6 loci ce codifică proteinele
majore din lapte un număr de 139 de indivizi din rasa Bivol Românesc. La locii αS1-CN
şi β-CN au fost identificate cu o frecvenţă de 0,86 cele 2 variante genetice comune: A de
la locusul αS1-CN şi B de la locusul β-CN. Au fost identificate cu o frecvenţă de 0,14
două variante genetice noi, αS1-CN B RV şi β-CN C RV (redenumite αS1-CN B BT şi β-CN
C BT ). Ele au fost observate în linkage pe cromozomul 6. La ceilalţi 4 loci a fost
identificată doar câte o alelă cu o frecvenţă egală cu 1.
18

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
În cazul ovinelor au fost genotipizaţi la cei 6 loci ce codifică proteinele majore
din lapte un număr de 282 de indivizi din 6 rase autohtone, după cum urmează: Ţurcană
(44 de indivizi), Carabaşa (40 de indivizi), Ţigaie (45 de indivizi), Ţigaie Ruginie (28 de
indivizi), Merinos de Cluj (35 de indivizi), Karakul de Botoşani, varietăţile neagră (15
indivizi), brumărie (15 indivizi), maro (15 indivizi), sură (15 indivizi), roz (15 indivizi),
albă (15 indivizi).
La toate cele 6 rase de ovine genotipizate polimorfismul proteinelor din lapte este
foarte redus, singurul locus polimorf fiind locusul β-LG, unde au fost identificate două
variante genetice A şi B. Varianta A are o frecvenţă mai mare (de peste 0,5) la rasele
Ţurcană, Carabaşă, Merinos de Cluj, respectiv Karakul, cea mai mare fiind la Karakul,
varietatea albă. Alela B are o frecvenţă mai mare, în comparaţie cu A, la rasele Ţigaie şi
Ţigaie Ruginie.
La locii αS1-CN, β-CN, αS2-CN, K-CN şi α-LA a fost identificată câte o singură
variantă genetică cu o frecvenţă egală cu 1. Prezenţa alelei C la locusul αS1-CN are o
semnificaţie pozitivă, deoarece ea a fost asociată în multe studii cu calităţi superioare de
procesare ale laptelui şi randamente mai mari de obţinere a brânzeturilor.
În cazul caprinelor au fost genotipizaţi la cei 6 loci ce codifică proteinele majore
din lapte un număr de 283 de indivizi din rasa Carpatină.
La locusul αS1-CN au fost identificate 4 categorii de alele, asociate cu 4 nivele
diferite de expresie. Rezultatele indică o frecvenţă de 0,569 a alelelor cu expresie
puternică a αS1-CN (A, B, C) şi o frecvenţă de 0,431 în cazul alelelor cu expresie medie,
slabă şi nule. Dacă luăm în considerare efectivul de 700.000 de capre existent în
România şi frecvenţa calculată a alelelor de tip E, F sau 0 de 43,1%, putem deduce că un
număr de 301.700 de capre produc un lapte cu un conţinut mai sărac în proteină, care
afectează substanţial calitatea lui şi randamentul de obţinere al brânzeturilor. Aceste
rezultate pot explica heterogenitatea rasei Carpatină în ceea ce priveşte unii parametrii
calitativi şi de procesare ai laptelui. La locusul αS1-CN au fost identificate 2 posibile noi
variante genetice denumite αS1-CN 0 şi αS1-CN X. Prima, identificată cu o frecvenţă de
0,021, se caracterizează prin absenţa αS1-CN în lapte, fiind observată întotdeauna în
19

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
linkage cu un profil necunoscut de la locusul β-CN, dovedind transmiterea înlănţuită a
celor 2 variante genetice situate pe acelaşi cromozom. A două posibilă variantă genetică,
αS1-CN X, a fost observată doar la un individ, în stadiu heterozigot cu alela B. Pe baza
comportamentului electroforetic se pare că prezintă în secvenţa aminoacizilor o
restructurare majoră, cauzată probabil de acelaşi fenomen de exon skipping ce
caracterizează şi alela F. Cu toate acestea, pe baza intensităţii de colorarea a benzilor
electroforetice, am concluzionat că face parte probabil din categoria alelelor cu expresie
puternică.
La locusul β-CN au fost identificate 3 variante genetice. Varianta genetică comună
A, respectiv varianta C au fost identificate cu o frecvenţă de 0,979. Ele nu au putut fi
diferenţiate prin IEF deoarece au acelaşi punct izoelectric. La câţiva indivizi a fost
identificată cu o frecvenţă de 0,021, o variantă genetică necunoscută denumită β-CN X
linkată întotdeauna cu αS1-CN 0.
La locusul αS2-CN au fost identificate 3 variante genetice. Varianta genetică C a
αS2-CN are o frecvenţă mai mare (0,553), în comparaţie cu varianta A (0,431), varianta
E având o frecvenţa redusă (0,016).
La locusul K-CN au fost identificate 2 variante genetice. Varianta genetică A este
predominantă (0,912), varianta B având o frecvenţa redusă (0,088). Prezenţa variantei B
şi la rasa Carpatina are o semnificaţie pozitivă deoarece ea a fost asociată în diverse studii
cu o calitate superioară de procesare a laptelui în brânzeturi.
La locii β-LG şi α-LA a fost identificată câte o singură variantă genetică la fiecare
locus, cu frecvenţe egale cu 1.
20

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CAPITOLUL X
CARACTERIZAREA MOLECULARĂ A ALELELOR NOI
IDENTIFICATE LA LOCII αS1-CAZEINEI ŞI β-CAZEINEI LA RASA
SURA DE STEPĂ, VARIETATEA MOLDOVENEASCĂ ŞI BIVOL
ROMÂNESC
La Sura de Stepă
O nouă alelă a αS1-CN de la taurine a fost descoperită la rasa Sura de Stepă,
varietatea Moldovenească, denumită I SM , fiind complet caracterizată folosind o
metodologie combinată de secvenţiere a proteinei, cADN-ului şi ADN-ului.
Prin analiza Maldi Tof-MS am reuşit identificarea unei substituţii în poziţia 192 a
proteinei mature. În această regiune varianta I SM conţine glicina ca şi variant C, şi nu acid
glutamic prezent la varianta B. Celelalte substituţii prin care varianta genetică I SM se
diferenţiază de B şi C, nu au putut fi clar identificate prin analiza Maldi Tof-MS.
Secvenţierea comparativă a cADN-rilor din două probe purtătoare ale αS1-CN I SM
(BI SM , CI SM ), respectiv a 2 probe de referinţă (BB, CC), au evidenţiat mutaţiile care
caracterizează această nouă alelă: substituţia unei adenine din alela C şi B (exonul 11,
nucleotidă 297, codonul 99 gaA ce codifică glutamina), cu o timină în alela I SM (gaT ce
codifică acidul aspartic); substituţia unei adenine din alela B (exonul 17, nucleotida 620,
codonul 207 gAa ce codifică glutamina) cu o guanină în alelele C şi I SM (gGa ce codifică
glicina). Această ultimă substituţie a fost confirmată şi la nivel proteic prin analiza Maldi
Tof-MS. Au fost identificate două alte substituţii comune alelelor B, C şi I SM (secvenţiate
de la rasa Sura de Stepă, Varietatea Moldovenească), care sunt diferite de ale unor
secvenţe de referinţă publicate în GenBank, fără efect asupra secvenţei aminoacizilor în
proteină.
Pe baza substituţiei unei adenine din poziţia 21 a exonului 11 din alela C (adenina
regăsită şi în alela B), cu o timină în alela I SM , a fost pus la punct un test PCR-RFLP ,
prin amplificarea şi restricţia cu enzima BseGI a unui fragment de 422 pb din gena αS1-
21

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CN incluzând exonul 11. Deoarece prezenţa acestei noi alele a fost observată doar la
indivizi consideraţi rasă curată, apartenenţa ei la rasa Sura de Stepă nu poate fi contestată.
Această teorie este susţinută şi de frecvenţa cu care a fost identificată în populaţia de Sura
de Stepă genotipizată: 0,128; frecvenţa este destul de mare pentru o nouă variantă
genetică. Aceasta sugerează că alela I SM a avut o frecvenţa şi mai mare când această rasă
(şi progenitorii ei) era predominantă în România.
Pe baza similarităţilor şi diferenţelor observate la nivel molecular între alelele αS1-
CN B, C şi I SM am concluzionat că această nouă alelă a derivat filogenetic din alela
ancestrală C, furnizând prima dovadă moleculară despre relaţiile filogenetice dintre Sura
de Stepă şi reprezentanţii genului Bos din Africa şi Asia
La Bivolul Românesc
Secvenţierea cADN-urilor αS1-CN A (alela comună) şi alelei B BT de la Bivolul
Românesc, a scos în evidenţă în cazul alelei B BT 2 mutaţii punctiforme care o diferenţiază
de celelalte alele cunoscute la bivolul Mediteranean şi Indian. Deleţia întregului exon 6,
este un tip de restructurare extrem de interesant, care scurtează proteina matură cu 8
aminoacizi, faţă de proteina normală care are 199 aminoacizi. Au mai fost identificate
încă 3 mutaţii, care fie sunt asemănătoare fie sunt diferite faţă de alte alelele comune.
Secvenţierea cADN-urilor β-CN B (alela comună) şi alelei C BT de la Bivolul
Românesc, a dus la identificarea a 4 mutaţii care diferenţiază cele 2 variante genetice şi
care afectează secvenţa previzionată a proteinei mature. De asemenea au fost identificate
2 mutaţii tăcute în sensul că, codonul rezultat codifică acelaşi aminoacid în ambele
cazuri.
De vreme ce alelele noi identificate apar cu frecvenţă mare la Bivolului Românesc,
ele ar putea fi folosite ca markeri genetici de origine/autenticitate a brânzeturile
autohtone de bivoliţă, cu aplicabilitate imediată.
22

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CAPITOLUL XI
IDENTIFICAREA AUTENTICITĀŢII/ORIGINII DECLARATE
A LAPTELUI ŞI PRODUSELOR LACTATE AUTOHTONE
FOLOSIND CA MARKERI GENETICI POLIMORFISMELE
PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE
Dacă în alte ţări UE cazurile de falsificare sunt destul de rare, în România laptele
de vacă (produs la un preţ mai mic şi în cantitate mai mare), este de multe ori adăugat
nedeclarat în laptele de bivoliţă, capră sau oaie, destinat preparării unor produse lactate
,,autentice’’, asta mai ales în cazul laptelui prelucrat industrial.
Metodologia Europeană acreditată de identificare a falsurilor din brânzeturi, se
bazează pe analiza prin IEF a fracţiunilor gama cazeinice, care rezultă din hidroliza cu
plasmină a β-CN, având dezavantajul că nu poate diferenţia laptele de capră de cel de
oaie. La ora actuală în România nu există o metodologie de identificare a adausurilor de
lapte interspecifice nedeclarate în produsele lactate.
Cercetările descrise în acest capitol au avut ca scop studierea posibilităţii folosirii
polimorfismelor genetice ale proteinelor din lapte, descrise la toti cei 6 loci la speciile de
fermă studiate, ca markeri genetici de indentificare a autenticităţii produselor lactate
autohtone. De asemenea, studierea posibilităţii utilizării noilor alele identificate la rasa
Bivol Românesc la locii -CN: alela C BT şi S1-CN: alela B BT , ca markeri genetici de
origine/autenticitate a brânzeturilor tradiţionale româneşti de bivoliţă, a fost un alt
obiectiv al prezentelor cercetări.
Analiza de autenticitate privind depistarea posibilelor amestecuri interspecifice
nedeclarate de lapte, a fost realizată pe număr de 12 sortimente de brânzeturi de pe piaţa
din România, după cum urmează: 2 sortimente de vacă, 3 de bivoliţă, 3 de oaie şi 4 de
capră. În cazul brânzeturilor de vacă s-a constatat că sunt fabricată numai din lapte de
vacă. Acest lucru nu este surprinzător deoarece folosirea altor tipuri de lapte la fabricarea
brânzeturilor de vacă este puţin probabilă. În cazul brânzeturilor de bivoliţă, s-a constatat
23

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
că majoritatea sunt falsificate cu lapte de vacă în proporţie de 100%. În cazul
brânzeturilor de oaie s-a constatat că două au fost fabricate exclusiv din lapte de oaie, una
fiind falsificată în proporţie de aproximativ 50% cu lapte de vacă. În cazul brânzeturilor
de capră s-a constatat că trei au fost fabricate exclusiv din lapte de capră, cea de-a patra
fiind falsificată în proporţie de 100% din lapte de vacă.
Compararea a două tipuri de brânză de bivoliţă, una de tip Mozzarella produsă din
lapte de la rasa Bivol Italian din regiunea Campania, Italia şi una de tip telemea produsă
din lapte de la rasa Bivol Românesc din Transilvania, a scos în evidenţă în mod clar că
acestea se diferenţiază net prin prezenţa în brânza telemea a variantelor genetice αS1-CN
B BT şi β-CN C BT , variante genetice care sunt absente la Bivolul Italian. Ca urmare
posibilitatea utilizării celor două variante genetice (ce nu au mai fost semnalate până
acum la nici o altă rasă de bivoli din Europa sau din Asia), ca markeri genetici de origine,
autenticitate şi trasabilitate a brânzeturilor Româneşti de bivoliţă este imediată.
CAPITOLUL XII
CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI
1. Experimentele de citogenetică au permis cartarea corectă pe cromozomii metafazici,
respectiv în teritoriile cromozomiale specifice, a celor patru cazeine şi a genei WAP. Ca
urmare recomand aceste protocoale de lucru pentru cartarea genelor de interes pe diverşi
cromozomi, studiul linkageului sau crossing-overului, studiul cariotipului în vederea
identificării unor deleţii, duplicaţii, inversii, translocaţii, care nu sunt vizibile prin metode
clasice de bandare a cromozomilor;
2. În urma analizei comparative a rezultatelor obţinute am identificat la locii K-CN,
respectiv β-LG aceleaşi genotipuri, atât prin PCR-RFLP, cât şi prin IEF. In plus prin
tehnica IEF au fost vizualizate în acelaşi gel şi genotipurile de la ceilalţi 4 loci ce codifică
αS1-CN, αS2-CN, β-CN şi α-LA, permiţând o identificare corectă a tuturor alelelor, chiar
şi a celor mai rare, ce apar cu frecvenţă mai redusă;
24

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
3. Au fost genotipizati prin IEF la cei 6 loci ce codifică proteinele majore din lapte un
număr de 693 de indivizi din 7 rase de taurine autohtone, 139 de indivizi dintr-o rasă
autohtonă de bubaline, 282 de indivizi din 6 rase autohtone de ovine, 283 de indivizi
dintr-o rasă autohtonă de caprine. În urma genotipizării au fost stabilite frecvenţele
alelelor şi genotipurilor la cei şase loci ce codifică proteinele majore din lapte;
4. Ca urmare recomand cele tehnica PCR-RFLP pentru genotipizarea precoce a
reproducătorilor pentru cei doi markeri, iar tehnica IEF pentru genotipizarea la toţi cei 6
loci, în vederea identificării mai corecte a genotipurilor şi evaluarea nivelului de expresie
al acestor alele;
5. Au fost identificate şi caracterizate molecular 3 variante genetice noi, una la locusul
αS1-CN la Sura de Stepă şi două la locii αS1-CN şi β-CN la Bivolul Românesc. La
caprinele din rasa Carpatină au fost identificate 3 posibile noi variante genetice, doua la
locusul αS1-CN şi una la locusul β-CN, care sunt în curs de caracterizare.
6. Folosind o analiză combinată de detecţie a polimorfismului fracţiunii cazeinice şi a
proteinelor din lactoserum de la speciile de fermă autohtone, am reuşit o identificare
rapidă a speciilor în probele de lapte de amestec şi în brânzeturile analizate. Se poate
concluziona că variantele genetice ale celor 6 proteine majore din lapte întâlnite la
speciile de fermă autohtone (majoritatea fiind comune la toate speciile şi rasele din
lume), pot fi folosite cu succes ca markeri genetici de identificare a autenticităţii/originii
produselor lactate autohtone.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia
A., Bocca A., 1990. Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine
milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of 2 γ-caseins.
Milchwissenschaft, 45:708-711;
2. Aschaffenburg R., Drewry J., 1955. Occurrence of different beta-lactoglobulins in
cow's milk. Nature, 176:218-219;
25

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
3. Bâlteanu V.A., Pop F.D., Vlaic A., Carsai T.C., Creangă Şt., Rusu A.R., 2010a.
Characterization of the αS1-casein I RV allele provides evidence for phylogeny of the
ancient Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian strain. Lucrări Ştiinţifice Seria
Zootehnie Iaşi, 53: 315-320;
4. Bâlteanu V.A., Vlaic A., Pop F.D., Carşai T.C., Pascal C., Creangă Şt., Zaharia N.,
Pădeanu I., Voia O.S., Sauer M., Sauer I.W., 2010b. The study of αS1-casein genetic
marker polymorphism in Carpathian goat breed: synthesis of 2009 research (Project PN II
52104/2008). Lucrări Ştiinţifice Seria Zootehnie Iaşi, 53: 321-325;
5. Bâlteanu V.A., Pop F.D., Vlaic A., Rusu A.R., Creangă S., 2008b. Molecular
characterization of αS1-CN I RV allele discovered in Romanian Grey Steppe cattle and it's
frequency in this breed. Bulletin of USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 65: 477;
6. Bâlteanu V.A., Pop F.D, Vlaic A.Rusu A.R. , 2008c. Multiple mutations events are
characterizing alpha s1 casein B RV and beta casein C RV alleles discovered in Romanian
Buffalo breed. Bulletin of USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 65: 477;
7. Bâlteanu V.A., Vlaic A., Pop F.D., Rusu A. R., Odagiu A., Cighi V., Creanga S.,
2007d. αS1-casein alleles frequency in Carpathian goat. Bulletin of USAMV-CN, Anim.
Sci. and Biotech., 63-64/2007: 527;
8. Chianese L., Garro G., Mauriello R., Laezza P., Ferranti P., Addeo F., 1996.
Occurrence of five αs1 casein variants in ovine milk. J. Dairy Res., 63: 49-59;
9. Farrell H. M., Jimenez-Flores R., Bleck G. T, Brown. E. M.,. Butler J. E, Creamer L.
K., Hicks C. L., Hollar C. M., Ng-Kwai-Hang K. F., Swaisgood H. E., 2004.
Nomenclature of the Proteins of Cows’ Milk-Sixth Revision. J. Dairy Sci., 87:1641–1674;
10. Giaccone P., Di Stasio L., Macciotta N.P.P., Portolano B., Todaro M., Cappio-Borlino
A., 2000. Effect of betalactoglobulin polymorphism on related traits of dairy ewes’ milk
analysed by repeated measures design. J. Dairy Res., 67: 443-448;
11. Heck J. M. L, Schennink A., Valenberg H. J. F., Bovenhuis H., Visker M. H.,
Arendonk J. A. M, Hooijdonk A. C. M, 2009. Effects of milk protein variants on the
protein composition of bovine milk, J. Dairy Sci., 92:1192-1202;
26

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
12. Mahé M.F., Miranda G., Queval R., Bado A., Zafindrajaona P.S., Grosclaude F.,
1999. Genetic polymorphism of milk proteins in African Bos taurus and Bos indicus
populations. Characterization of variants αs1-Cn H and k-Cn J. Genet. Sel. Evol., 31:
239-253;
13. Ng-Kwai-Hang, K. F., 2006. Genetic variants of milk proteins and their effects on the
yield 484 and quality of cheese. Nutrition and Natural Resources, 56: 1-11;
14. Siciliano R.A., Rega B., Amoresano A., Pucci P., 2000. Modern mass spectrometric
methodologies in monitoring milk quality. Analytical Chemistry, 72: 408-415;
15. Threadgill D.W., Womack J.E., 1990. Genomic analysis of the major bovine milk
protein genes. Nucleic Acids Research, 18: 6935-6942;
16. Veloso A.C.A., Teixeira N., Ferreira I.M., 2002. Separation and quantification of the
major casein fractions by reverse-phase high-performance liquid chromatography and
urea-polyacrylamide gel electrophoresis. Detection of milk adulterations. Journal of
Chromatography, 967: 209-218;
17. Vlaic A., Bâlteanu V.A., F.D. Pop, 2008. Molecular methods used in detection of
cattle milk in buffalo, ewe and goat in dairy products. Lucrări Ştiinţifice Seria Zootehnie,
Iasi, 51: 1016-1021;
18. Vlaic, A., D.C. Pamfil, Ioana Gaboreanu, B. Vlaic, R. Renaville, 2003. Increasing
milk production in cattle using DNA marker assisted selection (Pit-1). Bulletin of
USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 59:188-191;
19. Vlaic A., Ciobanu D.C., Oroian T., Handoca E., 2002.Variantele genetice ale k-
cazeinei determinate prin tehnica PCR – RFLP şi asocierea acestora cu însuşirile
producţiei de lapte la rasa Brună. „Cercetări de genetică vegetală şi animală”, ASAS
Bucureşti şi ICCPT Fundulea, vol. VII;
20. Wedholm A., Larsen L B., Lindmark-Månsson H., Karlsson A. H., Andrén A., 2006.
Effect of Protein Composition on the Cheese-Making Properties of Milk from Individual
Dairy Cows. J. Dairy Sci., 89: 3296-3305;
27

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND
VETERINARY MEDICINE CLUJ-NAPOCA
DOCTORAL SCHOOL
FACULTY OF ANIMAL HUSBANDRY AND BIOTECHNOLOGY
Eng. Biologist BÂLTEANU I. VALENTIN ADRIAN
SUMMARY OF Ph.D. THESIS
THE STUDY OF MAJOR MILK PROTEINS GENETIC
POLYMORPHISMS IN THE MAIN CATTLE, BUFFALO, SHEEP AND
GOAT BREEDS FROM ROMANIA WITH THE AIM OF USING THEM
AS GENETIC MARKERS IN BREEDING AND TRACEABILITY
Scientific advisor
Prof.Univ. Eng. VLAIC AUGUSTIN Ph.D.
28

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CONTENTS
INTRODUCTION.................................................................................................31
PART I: BIBLIOGRAPHIC STUDY
CHAPTER I
COMPOSITION OF CATTLE, BUFFALO, SHEEP, GOAT
MILK AND MILK SYNTHESIS MECHANISM IN
LACTATING MAMMARY GLAND..................................................................32
CHAPTER II
MOLECULAR TECHNIQUES USED FOR MILK
PROTEINS POLYMORPHISMS STUDY.........................................................33
CHAPTER III
CURRENT STAGE OF THE RESEARCH CONCERNING
THE STUDY OF MILK PROTEINS POLYMORPHISMS
IN CATTLE, BUFFALO, SHEEP AND GOAT.................................................34
CHAPTER IV
THE IMPORTANCE OF MAJOR MILK PROTEINS
POLYMORPHISMS STUDY BY THEIR POSSIBLE
USE IN ANIMAL BREEDING AND DAIRY
PRODUCTS TRACEABILITY...........................................................................37
PART II: PERSONAL RESEARCH
CHAPTER V
THE RESEARCH AIM AND OBJECTIVES……………………………........39
CHAPTER VI
CHROMOSOME MAPPING OF THE GENES CODING
FOR MAJOR MILK PROTEINS BY FLUORESCENCE
IN SITU HYBRIDISATION (FISH)…………………..…………………….....40
29

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CHAPTER VII
THE STUDY BY PCR-RFLP OF THE TWO GENES
POLYMORHISM CODING FOR K-CASEIN AND
β-LACTOGLOBULIN IN CATTLE BELONGING
TO ROMANIAN SIMMENTAL BREED ……………………….……….…....41
CHAPTER VIII
COMPARATIVE STUDY BY IEF AND PCR-RFLP OF
MAJOR MILK PROTEINS GENETIC POLYMORPHISMS
IN CATTLE BELONGING TO ROMANIAN SIMMENTAL
BREED……..........................................................................................................42
CHAPTER IX
THE CHARACTERIZATION OF MAJOR MILK
PROTEINS POLYMORPHISMS IN SOME ROMANIAN
CATTLE, BUFFALO, SHEEP AND GOAT BREEDS
BY IEF TECHNIQUE……………………………………………………...…...42
CHAPTER X
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE NEW
ALLELES IDENTIFIED IN αS1-CASEIN AND
β-CASEIN LOCI IN ROMANIAN GREY STEPPE
CATTLE, MODAVIAN VARIETY AND ROMANIAN
BUFFALO..............................................................................................................47
CHAPTER XI
IDENTIFICATION OF DECLARED AUTHENTICITY/
ORIGIN OF MILK AND DAIRY PRODUCTS USING
THE MAJOR MILK PROTEINS POLYMORPHISMS AS
GENETIC MARKERS……………………………………………………...…..48
CHAPTER XII
GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS.........................49
SELECTIVE BIBLIOGRAPHY..........................................................................50
30

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
INTRODUCTION
Lactogenesis can be divided in two phases: Phase I - begins in the last stage of
gestation and is characterized by cellular, structural and functional differentiation
processes of the secretor epithelium; Phase I - begins immediately after birth and
involves the ending of cellular differentiation, which coincides with milk secretion and
it’s synthesis in significant quantities. These two phases are essential having as final
effect the beginning of milk production (the start of lactation).
In ruminants’ milk there are 6 major milk proteins types, which are coded by 6 nonallelic
genes specifically expressed in mammary epithelial cells during lactation: S1-
casein (S1-CN), -casein (-CN), S2-casein (S2-CN), K-casein (K-CN), -
lactoglobulin (-LG) and -lactoalbumin (-LA).
The mutations occurring in these genes structure during the years, lead to the
appearance of many alleles in these loci. These variations, named generically
polymorphisms, are caused by genes restructuration (substitution of a nucleotide with
another, deletions, insertions etc), which can have as effects: modification of genes
expression levels, inactivation of genes expression and modification in aminoacid
sequence of the proteins codified by these genes.
Some of these genetic variants from the 6 loci have a positive effect on milk casein
content, coagulation time, curd firmness and cheese making efficiency, others having a
negative effect on these parameters; some β-CN genetic variants (A 1 , B, C) were
associated with some illnesses in humans as Diabetes Mellitus type 1, Ischemic Heart
disease, Sudden Infant Death Syndrome, Schizophrenia and Autism; some of αS1-CN
genetic variants are incriminated for causing allergies in children, following milk
consumption.
Using of the information provided by the 6 major milk proteins genetic variants,
cannot be done without a characterization of Romanian farm species/breeds.
31

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
The characterization accomplished in my Ph.D. Thesis, provides extremely valuable
information about the alleles frequencies in the six milk proteins loci in local Romanian
species/breeds. This can open new possibilities of using these polymorphisms as genetic
markers in animal breeding, in manipulation of milk components by genetic selection in
order to create alternative milk formulas in order to overcome some illnesses, or as
genetic markers in authenticity/origin identification of dairy products.
PART I: BIBLIOGRAPHIC STUDY
CHAPTER I
COMPOSITION OF CATTLE, BUFFALO, SHEEP, GOAT MILK AND
MILK SYNTHESIS MECHANISM IN LACTATING MAMMARY GLAND
The scientific research established that milk has a complex composition, mainly
concerning the casein fraction, whey proteins, enzymes and antimicrobial components.
The milk represents a highly valuable food source containing more than 100 components
in suspension or emulsion needed for a normal development of humans and animals
(Banu et al., 1998).
The milk proteins are divided in two main groups according to their behaviour in
acid pH = 4,6:
1. The soluble fraction in acid pH (whey proteins), is composed of β-lactoglobulin (β-
LG), α-lactoalbumin (α-LA) and other minor proteins. In the cheese making process
by adding chimosin, this fraction remains in whey.
2. The insoluble fraction in acid pH (whole casein) is composed of αS1-casein (αS1-
CN), αS2-casein (αS2-CN), β-casein (β-CN) and K-casein (K-CN). The caseins are found
in fresh milk in a high number of solid particles in suspension, bounded by Ca 9 (PO 4 ) 6
molecules. These particles are named micelles.
32

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
The protein content of cattle milk is in average 3,3%, in buffalo milk 4,1%, in sheep
milk 5,3 % and in goat milk 3,7% (Iurcă et al., 1998). From the total milk proteins the
casein fraction represents 80% and whey proteins 20%.
The proportion of the casein fraction has a significant influence on milk
manufacturing properties, quantity and quality of obtained cheese, texture and flavour of
different cheeses and other dairy products (Buchberger et al., 2000).
The 6 major milk proteins are coded my 6 non allelic genes, which are specifically
expressed in mammary gland during lactation.
The Mendelian segregation analysis of the 4 non-allelic genes coding for the 4
casein types in ruminants, revealed that they are located on the chromosome pair 6 in the
following order: αS1-CN, β-CN, αS2-CN, K-CN (Threadgill et al., 1990; Hayes et al.,
1993a). The gene coding for β-LG was located on the chromosome pair 11 (Hayes et al.,
1993b) and that coding for α-LA was located on the chromosome pair 5 (Soulier et al.,
1989; Vilotte et al., 1987).
The endocrine system, mainly the pituitary gland, plays a central role in all aspects
involving growth and development of mammary gland (mamogenesis), starting of
lactation and milk synthesis (lactogenesis), maintaining of milk synthesis (galactopoesis)
and then it’s activity ending, by two major hormones: growth hormone or somatotroph
(GH or STH) and prolactin (PRL). The hormonal signals induce the transcriptional
activation of the genes coding for major milk proteins and specific protein synthesis.
CHAPTER II
MOLECULAR TECHNIQUES USED FOR MILK PROTEINS
POLYMORPHISMS STUDY
The studies accomplished from the early ’50 using paper electrophoresis (PE)
evidenced the milk proteins polymorphism, β-LG being the first protein in which a
polymorphism was identified by Aschaffenburg and Drewry (1955).
33

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
Due to the development of more advanced techniques for protein analysis as: SGE
(starch gel electrophoresis), AE (agarose gel electrophoresis), PAGE (polyacrylamide gel
electrophoresis), IEF (isoelectric focusing), HPLC (high performance liquid
chromatography), Maldi TOF-MS (mass spectrometry), the knowledge concerning the
polymorphisms of major milk proteins in farm species was enriched substantially.
The appearance of the DNA based techniques: PCR (polymerase chain reaction),
PCR-RFLP (restriction fragments length polymorphism), SSCP (single strand
conformation polymorphism), RT-PCR (real time polymerase chain reaction) and DNA
sequencing techniques, allowed the identification of many polymorphisms in the genes
structure, having repercussions on gene expression and aminoacid composition of milk
proteins.
CHAPTER III
CURRENT STAGE OF THE RESEARCH CONCERNING THE STUDY OF
MILK PROTEINS POLYMORPHISMS IN CATTLE, BUFFALO, SHEEP
AND GOAT
The mutations which appeared over the years in the structure of these genes coding
for the six major milk proteins, lead to the appearance of many genetic variants in these
loci.
These variations, named polymorphisms, indicate the fact that each milk protein is
found in several forms codified by autosomal codominant genes named alleles, meaning
that both alleles are expressed in heterozygous individuals.
Alpha S1-CN is a composed of 199 aminoacids, having a molecular weight of 23,
614 kDa. In cattle in αS1-CN locus 10 genetic variants were identified so far: A, B, C,
D, Eyak, Ebali, F, G, H, (Farrell et al., 2004) and I RV (Bâlteanu et al., 2007a; Bâlteanu et
al., 2008a, b). The I RV allele was renamed I SM because it was not evidenced in other
Romanian breeds, being specific to Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian variety (SM
34

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
= Moldavian variety). In buffalo, 3 genetic variants were identified so far: A, B
(Chianese et al., 2009) and B RV (Bâlteanu et al., 2007c; Bâlteanu et al., 2008c).
Following the characterization in αS1-CN locus of Romanian Buffalo populations it was
established that this genetic variant is specific to this breed, being renamed according to
the region in which it was identified αS1-CN B BT (BT = Transylvanian Buffalo). In
sheep, 9 genetic variants were identified so far: A, B, C, D, E, F, G, H, I (Pirisi et al.,
1999; Giambra et al., 2010). In goat, 17 genetic variants were identified so far: A, B 1 , B 2 ,
B 3 , B 4 , C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, 01 and 02 (Ramunno et al., 2004).
Beta-CN is a protein composed of 209 aminoacids, having a molecular weight of
23,983 kDa. In cattle in β-CN locus 14 genetic variants were identified so far: A 1 , A 2 ,
A3, B, C, D, E, A 3 m, B 2 , A 4 , H, F, A 5 , G (Farrell et al., 2004). In buffalo, 3 genetic
variants were identified so far: A, B (Ferranti et al., 1998) and C RV (Bâlteanu et al.,
2007c; Bâlteanu et al., 2008c). Following the characterization of β-CN locus of
Romanian Buffalo populations it was established that this genetic variant is specific to
this breed, being renamed according to the region in which it was identified -CN C BT
(BT = Transylvanian Buffalo). In sheep there is no clear evidence of polymorphism at
the protein level (Chianese et al., 1995). In goat 8 genetic variants were identified so far:
A, A 1, B, C, D, E, 0 and 0’ (Cosenza et al., 2005a; Caroli et al., 2006).
Alpha S2-CN is a protein composed of 207 aminoacids, having a molecular weight
of 25,150 kDa. In cattle in αS2-CN locus 4 genetic variants were identified so far: A, B,
C, D (Farrell et al., 2004). In buffalo, 3 genetic variants were identified so far: A, B, C
(Ferranti et al., 1998). In sheep, 2 genetic variants were identified so far: A, B (Rossi et
al., 1984; Mauriello et al., 1990). In goat, 9 genetic variants were identified so far:: A, B,
C, E, F, G, D, 0 and 0’ (Erhardt et al., 2002).
Kappa-CN is a protein composed of 169 aminoacids, having a molecular weight of
19,007 kDa. In cattle in K-CN locus 11 genetic variants were identified so far: A, B, C,
B2, E, F, G, Az, H, I, J (Farrell et al., 2004). In buffalo, 2 genetic variants were identified
so far: A, B (Mitra et al., 1998). In sheep, 1 genetic variant was identified so far
(Chianese et al., 1996; Ceriotti et al., 2004b). In goat, 16 polymorphic sites were
35

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
identified, corresponding to 13 protein variants and 3 silent mutations, involving 15
polymorphic sites just in exon 4: A, B, B', B", C, C', F, G, H, I, J, L, D, E, K, M (Jann et
al., 2004b).
Alpha-LA is a protein composed of 123 aminoacids, having a molecular weight of
14,175 kDa. In cattle in α-LA locus, 3 genetic variants were identified so far: A, B, C
(Farrell et al., 2004). In buffalo, 2 genetic variants were identified so far: A, B (Chianese
et al., 2004). In sheep, 2 genetic variants were identified so far: A, B (Dall’Olio et al.,
1989). In goat, 2 genetic variants were identified so far: A 1 and A 2 (Cosenza et al.,
2005b).
Beta-LG is a protein composed of 162 aminoacids, having a molecular weight of
18,277 kDa. In cattle in β-LG locus 13 genetic variants were identified so far: A, B, C,
D, Dr, Dyak, E, F, G, W, H, I, J (Farrell et al., 2004). In buffalo, 2 genetic variants were
identified so far: A, B (Chianese et al., 2004). In sheep, 3 genetic variants were identified
so far: A, B (Kolde et al., 1983; Schlee et al., 1993) and C (Erhardt et al., 1989). In goat
2 genetic variants were identified so far: A and B (Yahyaoui et al., 2000).
CHAPTER IV
THE IMPORTANCE OF MAJOR MILK PROTEINS POLYMORPHISMS
STUDY BY THEIR POSSIBLE USE IN ANIMAL BREEDING AND DAIRY
PRODUCTS TRACEABILITY
The influence of major milk proteins genetic variants on milk quantity
In cattle the influence of major milk proteins genetic variants on milk quantity was
evaluated in several studies. The BB genotypes form S1-CN locus, A 2 A 2 from -CN
locus, AA from -LG locus and AA (+15) genotype from α-LA locus, were associated
with a higher milk quantity (Bovenhuis et al., 1992; Bleck et al., 1993b; Ikonen et al.,
1999, Ng-Kwai-Hang et al., 2006).
36

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
In sheep the studies concerning the influence of β-LG genotypes on milk quantity
are contradictory. Bolla et al. (1989) and Caroli et al. (1995) observed in Sarda sheep that
BB genotype is associated with a higher milk quantity. In another study made on a
Sicilian sheep breed, Di Stasio et al. (1992) observed that AB genotypes had the highest
milk production. In Valle del Belice breed, Giaccone et al. (2000) observed that AA
genotype is associated with a higher milk quantity.
In goat Kumar et al. (2006) observed that individuals with AA genotypes at the β-
LG locus had a higher milk production when compared to other genotypes.
The influence of major milk protein genetic variants on milk quality, milk
manufacturing properties and cheese making efficiency
In cattle the CC genotype from αS1-CN locus, the BB genotype from K-CN locus
and the BB genotype from β-LG locus were associated with a higher casein and whole
protein content in milk (Jakob et al., 1994; Fitzgerald et al., 1997; Lunden et al. 1997).
The BB genotype from β-LG locus was correlated with a higher fat content in milk
(Wedholm et al., 2006; Heck et al., 2009). The milk from CC genotypes in αS1-CN, the
BB genotypes from β-CN locus and BB genotypes from K-CN has a shorter coagulation
time (Delacroix - Buchet et al., 1994; Fitzgerald et al., 1997; Kubarsepp et al., 2005). The
BB genotype from K-CN locus has a positive influence on cheese yield, in comparison
with AA genotypes, the observed differences being situated between 2,7-15% ,
depending on the cheese type produced (Van den Berg et al., 1992; Fitzgerald et al.,
1997; Walsh et al., 1998).
The effects of S1-CN polymorphism on goat milk quality were studied in French
breeds (Mahe et al., 1993; Delacroix et al. 1996, Manfredi et al., 2000). The results
obtained indicated that A allele in comparison with E and F has a significant effect
(positive) on protein and fat content and milk manufacturing properties. In cheese making
experiments the following differences were obtained concerning the cheese quantity:
+7,4% between AA and EE genotypes, +6,9% between EE and FF and +14,8% between
37

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
AA and FF genotypes. The cheese obtained from AA genotypes had a weak specific goat
flavour (because of a weaker lipolysis), in comparison with FF genotypes which had a
more pronounced goat flavour (because of a higher lipolysis). Similar results were
obtained in Spanish breeds (Sanchez et al., 1998), Italian breeds (Meggiolaro et al.,
2000), Norwegian breeds (Vegarud et al., 1999) and SUA (Clark et al., 2000).
In sheep the CC genotype from αS1-CN locus has a positive influence on milk
composition and cheese yield. In cheese making experiments the following differences
were obtained concerning the cheese yield, +3,5% and +8,6% respectivelly, between the
CC genotype, in comparison with CD and DD genotypes (Pirisi et al., 1999). The BB
genotype from β-LG locus was associated with a higher fat content in milk and lower in
lactose, having a favorable effect on cheese yield (Celuk et al., 2006).
The use of major milk protein polymorphism as genetic markers in
authenticity identification of milk and dairy products
At international level a high number of methods were proposed for the identification
of possible adulteration caused by undeclared inter-specific milk mixtures. In most cases
dairy products authenticity identification is based on major milk protein polymorphism
analysis: a) Polyacrylamide gel electrophoresis in native conditions (Kaminarides et
al., 2002); b) Polyacrylamide gel electrophoresis in denaturant conditions (Veloso şi
colab., 2002); c) Isoelectric focusing electrophoresis (Addeo et al., 1990; Anonymous,
2001; Bâlteanu, 2005; Bâlteanu et al., 2007b,c,d; Vlaic et al., 2008; Bâlteanu et al.,
2008c); d) Capilarity electrophoresis (Lee et al., 2001); e) Immunochemical methods
- ELISA (Hurley et al., 2004); f) Reverse phase high performance liquid
chromatography (Veloso et al., 2002); g) Mass spectrometry (Siciliano et al., 2000); h)
DNA based techniques (Bottero et al., 2002).
38

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
PART II: PERSONAL RESEARCH
CHAPTER V
THE RESEARCH AIM AND OBJECTIVES
The study of major milk protein polymorphisms in local species / breeds had as a
goal the evaluation of the possibility of using this information in several directions as:
- improving milk quality (especially of casein content), its manufacturing properties and
cheese making efficiency;
- obtaining of a hypoallergenic milk by selection of individuals with no αS1-CN in milk,
which is the main milk allergen;
- obtaining of a healthier milk which is containing β-CN genetic variants which don’t
have a negative effect on human health;
- authenticity / origin identification of milk and dairy products.
The using of information provided by these genetic markers cannot be done without
the knowledge of genetic polymorphisms occurring in the six loci in cattle, buffalo, sheep
and goat local breeds. This characterization can provide extremely valuable information
about the allele frequencies in the four casein loci and the two whey protein loci in local
breeds.
In the context of actual research knowledge in this research field, the proposed
project has as major objectives research directions with importance on international level,
but little or not known at the national level:
- Setting up of a FISH protocol (fluorescence in situ hybridisation) using BAC probes
(bacterial artificial chromosome), in order to map on metaphase chromosomes and
interphase nuclei the genes coding for major milk proteins;
- The characterization of genetic polymorphisms in the 6 loci coding for the 6 major milk
proteins in some cattle breeds: Romanian Simmental, Romanian Black and White,
Brown, Red Holstein, Transylvanian Pinzagau, Romanian Grey Steppe cattle;
39

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
- The characterization of genetic polymorphisms in the 6 loci coding for the 6 major milk
proteins in Romanian Buffalo;
- The characterization of genetic polymorphisms in the 6 loci coding for the 6 major milk
proteins in Carpathian goat;
- The characterization of genetic polymorphisms in the 6 loci coding for the 6 major
milk proteins in some local ovine breeds: Turcana, Carabasa, Tigaie, Rusty Tigaie, Cluj
Merinos and Botosani Karakul;
- The molecular characterization of new discovered allele (renamed S1-casein I SM ) in
Romanian Grey Steppe Cattle, Moldavian variety, in order to study the possibility of
using it as biodiversity genetic marker;
- The molecular characterization of new discovered alleles in Romanian Buffalo breed
renamed S1-casein B BT and β-casein C BT ;
- The study of the possibility to use milk proteins polymorphisms from native farm
species/ breeds milk, to identify authenticity and origin of milk, cheeses and other dairy
products, considering also the 2 new casein allele identified in Romanian Buffalo.
CHAPTER VI
CHROMOSOME MAPPING OF THE GENES CODING FOR MAJOR
MILK PROTEINS BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDISATION
(FISH)
In these experiments I used two detection systems of the hybridised probe: a
system with a single antibody labelled with a red fluorophore (TRITC), antibody
recognising specifically the digoxigenin, which was used to label one of the BAC probes
(the probe containing WAP gene), and a double system, in which a primary antibody is
specifically recognising the biotine (used to label the second probe containing the casein
cluster), which is further recognised by a secondary antibody labelled with a green
fluorophore (FITC).
40

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
The hybridising with mentioned probes was done on metaphase chromosomes,
obtained from rabbit fibroblasts cell cultures and mouse mammary tumour cells HC11.
The hybridisation was also done on bi-dimensional and three-dimensional interphase
nuclei with a preserved structure, prepared from HC11 cells. In all cases were obtained
specific hybridisation signals, which allowed a correct mapping on the chromosomes and
specific chromosomes territories of studied genes.
CHAPTER VII
THE STUDY BY PCR-RFLP OF THE TWO GENES POLYMORHISM
CODING FOR K-CASEIN AND β-LACTOGLOBULIN IN CATTLE
BELONGING TO ROMANIAN SIMMENTAL BREED
The study of K-CN şi β-LG genes polymorphism had a goal testing some PCR-
RFLP protocols, which two allow the identification of the two common A and B allele
from these loci. In the case of K-CN a 350 bp fragment was amplified and digested with
Hinf I, three restriction profiles being observed corresponding to AA, AB and BB, from
this locus. In the case of β-LG, a 262bp fragment was amplified and digested with Hae
III, three restriction profiles being observed corresponding to AA, AB and BB, from this
locus. The calculation of genotypes frequencies in K-CN locus, revealed a higher
frequency of AB genotype, in comparison with the other two. The calculation of genes
frequencies this locus revealed a higher frequency of A allele, in comparison with B
allele. The calculation of genotypes frequencies in β-LG locus revealed a higher
frequency of AB genotype, in comparison with the other two. The calculation of genes
frequencies this locus revealed a higher frequency of B allele, in comparison with A
allele.
The obtained results are indicating that the two DNA tests can be used in
identification of the common A and B allele from the two loci, allowing a precocious
genotyping of cattle for the two genetic markers.
41

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CHAPTER VIII
COMPARATIVE STUDY BY IEF AND PCR-RFLP OF MAJOR MILK
PROTEINS GENETIC POLYMORPHISMS IN CATTLE BELONGING TO
ROMANIAN SIMMENTAL BREED
The study was done on 14 individuals belonging to Romanian Simmental breed,
which were comparatively genotyped in K-CN and β-LG loci by PCR-RFLP and IEF.
This experiment had as a goal the evaluation of genotyping efficiency at the DNA level
(by PCR-RFLP) and at the expression level directly from milk (by IEF), in the loci
coding form major milk proteins.
Following the comparative analysis were identified in K-CN and β-LG loci the
same genotypes by PCR-RFLP and IEF. Moreover by IEF were identified in the same gel
the genotypes in the other 4 loci coding for αS1-CN, αS2-CN, β-CN and α-LA, allowing
a correct identification of all allele, even of those which are very rare.
The obtained results are evidencing the fact that IEF technique allows to establish
more precisely the genotypes in the 6 loci, even of the rare allele, difficult and costly
identifiable by PCR.
CHAPTER IX
THE CHARACTERIZATION OF MAJOR MILK PROTEINS
POLYMORPHISMS IN SOME ROMANIAN CATTLE, BUFFALO, SHEEP
AND GOAT BREEDS BY IEF TECHNIQUE
În cattle were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a
number of 693 individuals belonging to 7 breeds, as follows: Romanian Simmental (236
individuals), Romanian Black and White (230 individuals), Red Holstein (13
individuals), Brown (134 individuals), Transylvanian Pinzgau, black variety (26
42

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
individuals) and red variety (30 individuals) and Romanian Grey Steppe cattle,
Moldavian variety (24 individuals).
In αS1-CN locus two common genetic variants were identified, namely B and C.
The frequency of B allele was 0,9 in improved breeds in direction of higher milk
production, the highest frequency being observed in Red Holstein breed. The lowest
frequency was observed in Black Pintzgau. The frequency of C variant, associated in
many cattle breeds with a higher milk processing quality, was the biggest in Black
Pintzgau (0,308), this allele being absent in Red Holstein breed. In αS1-CN casein locus
a new allele, renamed I SM , was identified in Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian
variety, with an isoelectric point between those of B and C genetic variants. The
frequency of this new allele, identified by IEF, was 0,041 in analysed populations.
In β-CN locus five genetic variants were identified: A 1 , A 2 , A 3 , B, C. The
frequency of ancestral allele A 2 was the highest in almost all breeds (over 0,5) in
comparison with the others allele. The exception was observed in Red Pintzgau, in which
the frequency of A 1 variant was higher (0,483), in comparison with the other alleles. The
A 3 variant was detected only in one individual belonging to Romanian Simmental breed.
The B variant, associated in many cattle breeds with a higher milk processing quality, has
an extremely reduced frequency in all breeds (between 0,039-0,117). The C variant was
detected with a very low frequency in Romanian Simmental, Brown and Pinzgau, black
variety, breeds. In Grey Cattle the presence of C variant was detected only in individuals
from Tazlau şi Tupilati, this being a proof of infusion with Brown breeds. It was not
detected in individuals, considered pure breed, from SCDCB Dancu.
In αS2-CN locus only one genetic variant was identified, namely A variant, with
the frequency 1.
In K-CN locus three genetic variants, named A, B and C, were identified. The
highest frequency of A variant was observed in Black and White breed (0,835) and of B
variant was observed in Brown (0,619). In Romanian Simmental breed the frequency of
A allele is very high (0,679). The C variant was detected with a low frequency in
Romanian Simmental and Brown breeds.
43

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
In α-LA locus only one genetic variant was identified, namely B, with the
frequency 1.
In β-LG locus three genetic variants were identified: A, B and C. The frequency of
A variant was the highest in Romanian Simmental and Grey Steppe cattle (over 0,5). The
frequency of B allele is high in all breeds, in Red Holstein breed being 0,769.
In buffalo were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a
number of 139 individuals belonging to Romanian Buffalo. In αS1-CN and β-CN loci
were identified with a 0,86 frequency two common allele: A in αS1-CN and B in β-CN
locus. Two new genetic variants, named αS1-CN B SM and β-CN C SM , were identified
with a frequency of 0,14. They were observed in linkage on chromosome 6. In the other
four loci just one allele was identified with the frequency 1.
In sheep were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a
number of 282 individuals belonging to six breeds, as follows: Turcana (44 individuals),
Carabasa (40 individuals), Tigaie (45 individuals), Rusty Tigaie (28 individuals), Cluj
Merinos (35 individuals), Botosani Karakul, black variety (15 individuals), dark grey
variety (15 individuals), brown variety (15 individuals), light grey variety (15
individuals), pink variety (15 individuals), white variety (15 individuals).
In all six ovine breeds genotyped, the milk proteins polymorphisms was very
reduced, the only polymorphic locus being β-LG, in which two genetic variants were
identified A and B. The A variant had the highest frequency (over 0,5) in Turcana,
Carabasa, Cluj Merinos, and Karakul respectively, having the highest frequency in
Karakul, white variety. The B allele had a higher frequency in comparison with A allele
in Tigaie and Rusty Tigaie breeds.
In αS1-CN, β-CN, αS2-CN, K-CN and α-LA just one allele was identified in each
locus with the frequency 1. The presence of C allele in αS1-CN locus has a positive
meaning, because this allele was associated in many studies with higher milk processing
parameters and higher cheese yield.
In goat were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a
number of 283 individuals belonging to Carpathian goat.
44

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
In αS1-CN four allele categories, associated with four expression levels were
identified. The results indicate a 0,569 frequency of high expression allele in αS1-CN (A,
B, C) and a frequency of 0,431 in the case of medium, low expression and null alleles. If
we consider that in Romania there are 700.000 goats and the calculated frequency of E, F
and 0 allele is 43,1%, we can deduce that a number of 301.700 of Carpathian goat are
producing a milk with a low protein content, which are significantly affecting milk
quality and cheese making efficiency. These results can explain the heterogeneity of
Carpathian goat concerning some milk quality parameters. In αS1-CN locus, two new
possible alleles were identified, named αS1-CN 0 and αS1-CN X. The first was identified
with a 0,021 frequency and is characterised by the absence of αS1-CN in milk. It was
observed always in linkage with an unknown profile in β-CN locus, proving the linkage
of the two alleles on the same chromosome. The second genetic variant, αS1-CN X, was
observed just in one individual in a heterozygous condition with B allele. Based on the
electrophoresis profile, it seems to present in the sequence a major restructuration,
probably caused by an exon skipping phenomenon as that found in F allele. Based on the
electrophoresis bands colour intensity, was concluded that this variant belongs to high
expression alleles category.
In β-CN locus three genetic variants were identified. The common A and C
variants were identified with a 0,979 frequency. They were not differentiated by IEF due
to the same isoelectric point. In some individuals was identified, with a frequency of
0,021, an unknown genetic variant named β-CN X, always in linkage with αS1-CN 0.
In αS2-CN locus three genetic variants were identified. The variant C of αS2-CN
had the highest frequency (0,553), in comparison A variant (0,431), the E allele having a
low frequency (0,016).
In K-CN locus two genetic variants were identified. The A variant was
predominant (0,912), the B variant having a low frequency (0,088). The presence of B
variant in Carpathian goat has a positive significance, as long as this allele was associated
in different studies with a high milk processing quality.
In β-LG şi α-LA, just one allele was identified in each locus with the frequency 1.
45

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CHAPTER X
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE NEW ALLELES
IDENTIFIED IN αS1-CASEIN AND β-CASEIN LOCI IN ROMANIAN
GREY STEPPE CATTLE, MODAVIAN VARIETY AND ROMANIAN
BUFFALO
In Romanian Grey Steppe cattle
A new genetic variant in cattle αS1-CN locus, renamed I SM , was identified in
Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian variety, being complete characterized using a
combined methodology of protein, cADN and DNA sequencing.
By Maldi Tof-MS analysis, a substitution in the position 192 of mature protein
was identified. In this region I SM variant is containing Gly as C variant and not glutamic
acid, present in B variant. The other substitutions which are making the difference
between I SM variant and B or C were not clearly identified by Maldi Tof-MS analysis.
Comparative analysis of chromatograms obtained following sequencing (with the
forward and reverse primer, respectively) of the 2 samples carriers of α S1 -CN I SM (BI SM ,
CI SM ) and 2 reference samples (BB, CC), revealed the mutations characterizing this new
genetic variant: substitution of an adenine from C and B allele (exon 11, nucleotide 297,
codon 99 gaA coding for Glu) with a thymine in the I SM allele (gaT coding for Asp);
substitution of an adenine from the B allele (exon 17, nucleotide 620, codon 207 gAa
coding for Glu) with guanine in C and I SM alleles (gGa coding for Gly). This last
substitution was confirmed at the protein level by Maldi Tof-MS analysis.
There are 2 additional substitutions observed in the B, C and I SM alleles (sequenced
from Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian variety), that differ from some sequences
published in GenBank, with no effect on aminoacid sequence of protein.
Based of the substitution of an adenine from position 21 of exon 11 from C allele
(adenine found in B allele too), with a timine in I SM allele, a PCR-RFLP test was
developed based on the amplification and restriction with BseGI enzyme of a 422 base
46

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
pairs (bp) fragment from αS1-CN gene, including entire exon 11. Because the presence
of this new αS1-CN allele was noticed only in pure breed individuals, its origin in this
breed is unquestionable. This theory is also sustained by the high frequency of this allele
in the genotyped Grey Steppe cattle population: 0,128, frequency relatively high for a
new genetic variant. This suggests that I SM variant had an even higher frequency at the
time when this breed and its progenitors were the only ones existing in Romania.
Based on similarities and differences observed at the molecular level, between αS1-
CN B, C and I SM allele, was concluded that this new allele was issued directly from the
ancestral C allele, bringing the first molecular clue about phylogenetic relationships
among the Romanian Grey Steppe cattle and Bos genus representative breeds from Africa
and Asia.
In Romanian Buffalo
The cADN sequencing of αS1-CN A (common allele) and B SM alleles from
Romanian Buffalo, revealed two point mutations characterizing B SM allele, different from
the other known allele in Mediterranean and Indian Buffalo. The deletion of entire exon 6
is a very interesting type of restructuration, shortening the sequence of mature protein
with 8 aminoacids, in comparison with the normal protein which has 199 aminoacids.
Three further mutations were identified, which are similar or different from those found
in common allele.
The cADN sequencing of β-CN B (common allele) and C BT alleles, leaded to
identification of four further mutations differentiating the two variants and affecting the
predictable protein sequence. Furthermore two additional silent substitutions were
identified with no effect on protein sequence, as long the resulting codons are coding for
the same aminoacids.
As long as these new identified allele are specific to Romanian Buffalo they could
be easily used as genetic markers for Romanian Buffalo cheeses authenticity/origin
identification.
47

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
CHAPTER XI
IDENTIFICATION OF DECLARED AUTHENTICITY/ORIGIN OF MILK
AND DAIRY PRODUCTS USING THE MAJOR MILK PROTEINS
POLYMORPHISMS AS GENETIC MARKERS
If in other EU countries, products adulteration cases are quite rare, in Romania
undeclared cow milk (produced at a lower price and in higher quantities), is often added
into buffalo, goat or ewe milk, normally fated to produce ,,authentic’’ dairy products,
especially in the case of industrial processed milk.
The official European methodology for cheeses authenticity identification is based
on the IEF analysis of gamma casein fractions, resulting from the hydrolysis of β-CN by
plasmin, having the disadvantage that it cannot be differentiated goat and sheep milk.
Up-to-date in Romania there is no identification methodology of undeclared interspecific
milk addition in dairy products.
The researches described in this Chapter had as a main goal the study of
possibility to use milk proteins polymorphisms, found in whole six loci from native farm
species studied, as genetic markers to identify authenticity and origin of dairy products.
Also, the study of possibility of using the two alleles identified in Romanian Buffalo -
CN C SM and S1-CN B SM , as genetic markers for origin/authenticity identification of
Romanian Buffalo cheeses, was another goal of this research.
The authenticity analysis concerning the possible identification of undeclared
inter-specific milk mixtures was done on 12 cheese types form Romanian market, as
follows: 2 types of cattle cheeses, 3 types of buffalo cheeses, 3 types of sheep cheeses
and 4 types of goat cheeses.
In the case of cattle cheeses it was found that these were produced only form cattle
milk. This is not surprising because the using of other milk types in cattle cheese
production in less probable. In the case of buffalo cheeses, it was observed that the
majority of them were produced exclusively from cattle milk. In the case of sheep
48

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
cheeses it was observed that two of them were produced exclusively from sheep milk,
and one had a 50% cattle milk. In the case of goat cheeses it was observed that three of
them were exclusively produced from goat milk, the forth one being falsified 100% with
cow milk.
The comparison between two buffalo cheeses types, a Mozzarella type produced
form Italian buffalo milk from Campania region, Italy and a salty cheese produced from
Romanian Buffalo from Transylvania, clearly revealed that they can be differentiated by
the presence in salty cheese of the αS1-CN B SM and β-CN C SM genetic variants, which are
absent in Italian Buffalo. Therefore the possibility of using these genetic variants (which
were not observed so far in other European or Asian buffalo breeds), as genetic markers
for authenticity origin and traceability identification of Romanian buffalo cheeses is
possible immediately.
CHAPTER XII
GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS
1. The cytogenetic experiments allowed a correct mapping on metaphase chromosomes
and specific chromosome territories of the four caseins and WAP gene. As a consequence
I recommend these protocols for mapping of genes on specific chromosomes territories,
the study of linkage, crossing over and of the karyotype, in order to identify deletions,
duplications, inversions, translocations, which are not visible by classical cytogenetic
methods.
2. Following the comparative analysis were identified in K-CN and β-LG loci the same
genotypes by PCR-RFLP and IEF. Moreover by IEF were identified in the same gel the
genotypes in other 4 loci coding for αS1-CN, αS2-CN, β-CN and α-LA, allowing a
correct identification of all alleles, even of those which are very rare.
3. Were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a number of 693
individuals belonging to 7 cattle breeds, 139 individuals belonging to a local buffalo
breed, 282 individuals belonging to six local sheep breeds and 283 individuals belonging
49

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
to a local goat breed. Following genotyping alleles and genotypes frequencies, in the 6
loci coding for major milk proteins, were calculated.
4. As a consequence I recommend the PCR-RFLP technique for precocious genotyping
of cattle for the two markers and the IEF technique for genotyping in the 6 milk protein
loci, to a more precisely genotyping and for the evaluation of alleles expression levels.
5. There were identified and molecular characterized 3 new genetic variants, one in
Romanian Grey Steppe cattle in αS1-CN locus and two in αS1-CN and β-CN loci in
Romanian Buffalo. In Carpathian goat breed were identified 3 new possible genetic
variants, two in αS1-CN locus and one in β-CN, which are in progress of
characterization.
6. Using a combined analysis for detection of casein fraction and whey proteins
polymorphisms found in Romanian farm species, were rapidly identified the species in
the bulk milk samples and analysed cheeses. It can be concluded that the genetic variants
of major milk proteins found in Romanian farm species (the majority of them being
found in all world breeds), can be successfully used as genetic markers in identification
of authenticity/ origin dairy products.
SELECTIVE BIBLIOGRAPHY
1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia
A., Bocca A., 1990. Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine
milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of 2 γ-caseins.
Milchwissenschaft, 45:708–711;
2. Aschaffenburg R., Drewry J., 1955. Occurrence of different beta-lactoglobulins in
cow's milk. Nature, 176:218-219;
3. Bâlteanu V.A., Pop F.D., Vlaic A., Carsai T.C., Creangă Şt., Rusu A.R., 2010a.
Characterization of the αS1-casein I RV allele provides evidence for phylogeny of the
ancient Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian strain. Lucrări Ştiinţifice Seria
Zootehnie Iaşi, 53: 315-320;
50

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
4. Bâlteanu V.A., Vlaic A., Pop F.D., Carşai T.C., Pascal C., Creangă Şt., Zaharia N.,
Pădeanu I., Voia O.S., Sauer M., Sauer I.W., 2010b. The study of αS1 casein genetic
marker polymorphism in Carpathian goat breed: synthesis of 2009 research (Project PN II
52104/2008). Lucrări Ştiinţifice Seria Zootehnie Iaşi, 53: 321-325;
5. Bâlteanu V.A., Pop F.D., Vlaic A., Rusu A.R., Creangă S., 2008b. Molecular
characterization of αS1-CN I RV allele discovered in Romanian Grey Steppe cattle and it's
frequency in this breed. Bulletin of USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 2008b , 65:
477;
6. Bâlteanu V.A., Pop F.D, Vlaic A.Rusu A.R. , 2008c. Multiple mutations events are
characterizing alpha s1 casein B RV and beta casein C RV alleles discovered in Romanian
Buffalo breed. Bulletin of USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 65: 477;
7. Bâlteanu V.A., Vlaic A., Pop F.D., Rusu A. R., Odagiu A., Cighi V., Creanga S.,
2007d. αS1-casein alleles frequency in Carpathian goat. Bulletin of USAMV-CN, Anim.
Sci. and Biotech., 63-64/2007: 527;
8. Chianese L., Garro G., Mauriello R., Laezza P., Ferranti P., Addeo F., 1996.
Occurrence of five αs1 casein variants in ovine milk. J. Dairy Res., 63: 49-59;
9. Farrell H. M., Jimenez-Flores R., Bleck G. T, Brown. E. M.,. Butler J. E, Creamer L.
K., Hicks C. L., Hollar C. M., Ng-Kwai-Hang K. F., Swaisgood H. E., 2004.
Nomenclature of the Proteins of Cows’ Milk-Sixth Revision. J. Dairy Sci., 87:1641–1674;
10. Giaccone P., Di Stasio L., Macciotta N.P.P., Portolano B., Todaro M., Cappio-
Borlino A., 2000. Effect of betalactoglobulin polymorphism on related traits of dairy
ewes’ milk analysed by repeated measures design. J. Dairy Res., 67: 443-448;
11. Heck J. M. L, Schennink A., Valenberg H. J. F., Bovenhuis H., Visker M. H.,
Arendonk J. A. M, Hooijdonk A. C. M, 2009. Effects of milk protein variants on the
protein composition of bovine milk, J. Dairy Sci., 92:1192-1202;
12. Mahé M.F., Miranda G., Queval R., Bado A., Zafindrajaona P.S., Grosclaude F.,
1999. Genetic polymorphism of milk proteins in African Bos taurus and Bos indicus
populations. Characterization of variants αs1-Cn H and k-Cn J. Genet. Sel. Evol., 31:
239-253;
51

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de
taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri
genetici în ameliorare şi trasabilitate
13. Ng-Kwai-Hang, K. F., 2006. Genetic variants of milk proteins and their effects on the
yield 484 and quality of cheese. Nutrition and Natural Resources, 56: 1-11;
14. Siciliano R.A., Rega B., Amoresano A., Pucci P., 2000. Modern mass spectrometric
methodologies in monitoring milk quality. Analytical Chemistry, 72: 408-415;
15. Threadgill D.W., Womack J.E., 1990. Genomic analysis of the major bovine milk
protein genes. Nucleic Acids Research, 18: 6935-6942;
16. Veloso A.C.A., Teixeira N., Ferreira I.M., 2002. Separation and quantification of the
major casein fractions by reverse-phase high-performance liquid chromatography and
urea-polyacrylamide gel electrophoresis. Detection of milk adulterations. Journal of
Chromatography, 967: 209-218;
17. Vlaic A., Bâlteanu V.A., F.D. Pop, 2008. Molecular methods used in detection of
cattle milk in buffalo, ewe and goat in dairy products. Lucrări Ştiinţifice Seria Zootehnie,
Iasi, 51: 1016-1021;
18. Vlaic, A., D.C. Pamfil, Ioana Gaboreanu, B. Vlaic, R. Renaville, 2003. Increasing
milk production in cattle using DNA marker assisted selection (Pit-1). Bulletin of
USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 59:188-191;
19. Vlaic A., Ciobanu D.C., Oroian T., Handoca E., 2002.Variantele genetice ale k-
cazeinei determinate prin tehnica PCR – RFLP şi asocierea acestora cu însuşirile
producţiei de lapte la rasa Brună. „Cercetări de genetică vegetală şi animală”, ASAS
Bucureşti şi ICCPT Fundulea, vol. VII;
20. Wedholm A., Larsen L B., Lindmark-Månsson H., Karlsson A. H., Andrén A.,
2006. Effect of Protein Composition on the Cheese-Making Properties of Milk from
Individual Dairy Cows. J. Dairy Sci., 89: 3296-3305.
52