AF-10-Labrapport T4 elfores - Umeå universitet
AF-10-Labrapport T4 elfores - Umeå universitet
AF-10-Labrapport T4 elfores - Umeå universitet
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>Umeå</strong> Universitet<br />
Biomedicinska analytikerprogrammet<br />
Årskull:<br />
Separation av plasmaproteiner med elektrofores,<br />
HYDRAGEL PROTEIN(E) K20<br />
Laborationsrapport i Klinisk laboratoriemetodik 1, termin 4<br />
Laborationsdatum: Inlämnad: Godkänd:<br />
Handledare:<br />
Granskare:
Abstrakt<br />
I levern bildas plasmaproteiner med undantag för immunglobuliner som produceras av B- lymfocyter i<br />
benmärgen. Vid en infektion aktiveras leverceller att producera akutfasproteiner som interagerar vid<br />
akutfasreaktioner, men vid en hematologisk cancer ökar produktionen av en viss monoklonal<br />
immunglobulin (M-komponent). Dessa två proteinproduktioner kan analyseras med elektrofores<br />
genom att aminosyrorna görs negativt laddade. Syftet med denna laboration var att analysera tre<br />
patienters serumprover mot normala plasma- och serumprover med hjälp av elektrofores HYDRAGEL<br />
PROTEIN(E) K20. De tre patienternas prover samt de nytagna plasma- och serumproverna<br />
applicerades till agarosgelen och proteinerna in- och avfärgades enligt anvisningarna för<br />
elektroforesen. Resultaten för patient 1 och 2 visade varsitt starkt sista band med uppklarnade zoner<br />
runtom, detta påvisade att patienterna drabbats av en hematologisk cancer. Den tredje patientens<br />
band konstaterade att det pågick en akutfasreaktion till följd av en infektion.<br />
Nyckelord<br />
Infektion, akutfasproteiner, hematologisk cancer, immunglobulin och elektrofores.<br />
2
Innehållsförteckning<br />
Abstrakt .......................................................................................................................................................... 2<br />
Nyckelord ................................................................................................................................................... 2<br />
Innehållsförteckning ...................................................................................................................................... 3<br />
Introduktion ................................................................................................................................................... 4<br />
Material och metod ........................................................................................................................................ 5<br />
Resultat ........................................................................................................................................................... 6<br />
Diskussion ...................................................................................................................................................... 7<br />
Referenser....................................................................................................................................................... 8<br />
Figurer ............................................................................................................................................................ 9<br />
Riskbedömning av Blod ............................................................................................................................... <strong>10</strong><br />
Riskbedömning av Natriumazid .................................................................................................................. 11<br />
Riskbedömning av Natriumbarbital ........................................................................................................... 12<br />
3
Introduktion<br />
Blod består av komponenterna blodkroppar och plasma. Plasmans innehåll är till stor del vatten och<br />
proteiner. Plasmaproteinernas huvudsakliga uppgift är att upprätthålla det kolloidosmotiska trycket,<br />
transportera lågmolekylära föreningar och utgöra en integrerad del av försvarsmekanismer. I levern<br />
bildas de flesta plasmaproteinerna med undantag för immunglobulinerna som produceras av B-<br />
lymfocyterna i benmärgen. Vid en infektion eller ett inflammatoriskt tillstånd aktiveras levercellerna<br />
att producera plasmaproteiner som interagerar vid akutfasreaktioner, så kallade akutfasproteiner. C-<br />
reaktivt protein (CRP) och α1-antikymotrypsin har högst synteshastighet jämfört med α1-antitrypsin,<br />
orosomukid, haptoglobin, fibrinogen och komplementfaktorerna C3 samt C4 (1). Vid analys med<br />
proteinelektrofores, vilket är en metod för att diagnostisera proteinabnormaliteter i exempelvis serum,<br />
kan man se en pågående akutfasreaktion. Detta genom att α1- antitrypsin, haptoglobin och fibrinogen<br />
framträder starkare på agarosgelen jämfört med normalserum eller normalplasma (2). Skulle däremot<br />
B-lymfocyter öka sin produktion av en viss monoklonal immunglobulin till följd av en hematologisk<br />
cancer skulle detta sjukdomstillstånd synas som ett betydligt kraftigare band med uppklarnade zoner<br />
runtom (M- komponent) (2,3). För att kunna utnyttja denna metod måste proteinets byggstenar<br />
(aminosyror) vara negativt laddade. Genom att ändra aminosyrornas miljö kan de fungera som<br />
antingen syror eller baser. Alla proteiner har en isoelektriskpunkt vilket innebär att antalet positiva<br />
och negativa laddningar är lika vid ett visst pH-värde. Plasmaproteinernas isoelektriskapunkt infinner<br />
sig mellan pH 4,6-7,2 och genom att höja omgivningens pH till 8,5 blir aminosyrorna negativt laddade.<br />
De negativt laddade plasmaproteinerna kommer att vandra mot anoden och separeras med avseende<br />
på storlek, laddning och form (2).<br />
Syftet med denna laboration var att analysera tre patienters serumprover mot normala plasma- och<br />
serumprover med hjälp av elektrofores HYDRAGEL PROTEIN(E) K20.<br />
4
Material och metod<br />
Venprovtagning:<br />
Provtagning enligt föreskrifter gjordes och det användes natriumcitratrör samt serumrör med gel.<br />
Elektrofores med HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 kit:<br />
Ramens nedre del på applikatorhållaren fuktades med 120 µl destillerat vatten. Ett tunt filterpapper<br />
sattes på en agarosgelplatta (agaros 0,8g/dl; Tris- barbitalbuffert pH 8,5 ± 0,1) för att absorbera<br />
överflödig fukt från gelen. Agarosgelplattan placerades mot applikatorhållarens nedre del med<br />
gelsidan uppåt. Till en applikator applicerades 2 plasma- och 2 serumprover som normala referenser<br />
samt serumprover från 3 patienter. Applikatorn sattes till hållarens femte skåra och fick komma i<br />
kontakt med gelen i 40 sekunder. Agarosgelplattan placerades med gelsidan nedåt i en<br />
elektroforeskammare fylld med buffert (stocklösning + destillerat vatten 1:<strong>10</strong>, Tris- barbital pH8,5 ±<br />
0,3; natriumazid), enligt gelens polaritet. Elektroforeskammaren kopplades till en strömkälla (sebia)<br />
programmerad på 90V och proteinerna fick vandra i 22 minuter.<br />
Fixeringssteg:<br />
Agarosgelplattan torkades i en inkubator (sebia) vid 80°C i <strong>10</strong> minuter för att fixera proteinerna.<br />
In- och avfärgning:<br />
Gelen placerades i infärgningslösning (acidviolett+ destillerat vatten, 1:4) under 4 minuter för att<br />
sedan avfärgas i avfärgningslösning (stocklösning + destillerat vatten 1:<strong>10</strong>00, 0,05g citronsyra/dl) fyra<br />
gånger, fyra minuter vardera. Därefter torkades gelen likt ovan.<br />
5
Resultat<br />
Vandringsträckorna för proteinerna i de normala referens-proverna gav starka tydliga band. För<br />
proteinerna i plasmaproverna framträdde ett ytterligare band jämfört med de normala serumproverna<br />
och patientproverna. För patient 1 framträdde ett grovt sista band med uppklarnade zoner runtom.<br />
Serumprovet för patient 2 gav också ett tydligt sista band med uppklarnade zoner, dock inte lika<br />
markant som för patient 1. För patient 3 uppträdde två av banden skarpare utan uppklarningszoner<br />
jämfört med patient 1 och 2. De fyra normala referens- proverna visade överlag mörkare band än de<br />
tre patient- provernas band (figur 1).<br />
6
Diskussion<br />
Det som har stärkt att patienternas prover är serum, är att det inte existerar något fibrinogenband.<br />
Hos patient 1 och 2 ses två starka sista band vilket tyder på att de båda patienterna har en M-<br />
komponent och de uppklarnade zonerna tydliggör ökad produktion av en viss monoklonal<br />
immunglobulin. Sista bandet för patient 1 som är starkare jämfört med patient 2 kan bero på att<br />
serumprovet har varit färskare eller att sjukdomsförloppet varit längre framskridet. De två banden<br />
som framträder starkare hos patient 3 är belägen där akutfasproteinerna α1 antitrypsin och<br />
haptoglobin har sin kända plats. Detta tyder på att patient 3 har en pågående akutfasreaktion i<br />
kroppen. Alla normala referens- prover visar mörkare band än patienternas, detta kan bero på att<br />
patientproverna har varit frysta och upptinade ett flertal gånger. Proteinerna i patienternas prover har<br />
då tagit skada och mängden blivit mindre.<br />
7
Referenser<br />
1 Plasmaproteiner och elektrofores. Biomedicinska analytikerprogrammet, Klinisk laboratoriemetodik<br />
1, <strong>Umeå</strong> <strong>universitet</strong>.<br />
2 Elektrofores med HYDRAGEL PROTEIN(E) K20. Laborationsanvisningar, Biomedicinska<br />
analytikerprogrammet, Klinisk laboratoriemetodik 1, <strong>Umeå</strong> Universitet.<br />
3 Wikipedia. Myelom. [Elektronisk]. Tillgänglig [20<strong>10</strong>-02-25]<br />
4 Kemi. Databaser. Ämnesregister. Fenol/kloroform. [Elektronisk]<br />
Tillgänglig < http://apps.kemi.se/Amnesregistret/default.cfm> [20<strong>10</strong>-01-19]<br />
8
Figurer<br />
Figur 1: Agarosgel med negativa referenser i brunn 1-4 (1-2 plasmaprover och 3-4 serumprover), i<br />
brunn 5: patient 1, i brunn 6: patient 2 och i brunn 7: patient 3.<br />
9
Riskbedömning av Blod<br />
På vilket sätt är kemikalien farlig?<br />
Tänk på att blod alltid ska betraktas som smittat. Det kan innehålla livshotande smittor som kan ge<br />
kroniska sjukdomar så som HIV/Aids och Hepatit.<br />
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning<br />
Använd alltid handskar och skyddsrock vid exponering. Låt inte skärande och stickande föremål ligga<br />
framme oskyddat. Undvik stress vid provtagningar som kan leda till olyckor. Kvarvarande prover,<br />
använda kanyler och dylikt skall hanteras som riskavfall. Tänk på att rengöra, sterilisera arbetsytor.<br />
Skyddsåtgärder<br />
Vid olycka kontakta omedelbart arbetsgivare och uppsök läkare för vidare utredning.<br />
Avfallshantering<br />
Hanteras och slängs som riskavfall.<br />
<strong>10</strong>
Riskbedömning av Natriumazid<br />
CAS- nr 26628-22-8<br />
På vilket sätt är kemikalien farlig?<br />
Miljöfarlig<br />
Mycket giftig<br />
Den är mycket giftig vid förtäring, utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. Mycket giftig för<br />
vattenlevande organismer och kan orsaka skadliga långtidseffekter i vattenmiljön.<br />
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning<br />
Använd skyddsutrustning så som skyddsrock, handskar, munskydd, dragskåp och glasögon (aldrig<br />
använda linser). Förvaras inlåst, oåtkomligt för barn.<br />
Skyddsåtgärder<br />
Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan skölj rikligt med vatten, kontakta sedan läkare och visa<br />
etiketten. Undvik exponering och vid användning begär special instruktioner.<br />
Avfallshantering<br />
Hanteras och slängs som riskavfall.<br />
11
Riskbedömning av Natriumbarbital<br />
På vilket sätt är kemikalien farlig?<br />
Natriumbarbital har en lugnande och sömngivande effekt, är narkotikaklassat. Förtäring kan det leda<br />
till döden.<br />
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning<br />
Använd skyddsutrustning så som skyddsrock, handskar, munskydd, dragskåp och glasögon (aldrig<br />
använda linser). Skall förvaras inlåst och oåtkomligt för barn.<br />
Skyddsåtgärder<br />
Vid illamående eller annan påverkan kontakta läkare och visa etiketten.<br />
Avfallshantering<br />
Hanteras och slängs som riskavfall.<br />
12
Change language