Immunoglobulin

ImmunoglobulinFunktion och StrukturProjektarbete skrivet av:Linnéa Ahlin, Louise Andersson, Elsa Björn och Karin ThellenbergHandledare: Hans EklundBke1 (KE0026) 2004-06-02

SammanfattningImmunsystemet är en viktig fuktion i kroppen som ser till att vi håller oss fria från skadligainkräktare i form av virus och bakterier. Försvaret består av det specifika och ospecifikaimmunförsvaret. I det specifika immunförsvaret hittar vi immunoglobulinerna/antikropparsom har till uppgift att binda till sig antigener. Immunoglobulin molekylen är Y-formad ochuppbyggd av två lätta kedjor och två tunga kedjor som i sin tur är uppbyggda av variabla ochkonstanta domäner. I de variabla domänerna, som finns vid N-terminalen på immunoglobulin,finns de hypervariabla regionerna som är de som binder till sig antigenet. Bindningen i sigutgörs av icke-kovalenta bindningar mellan en del på antigenet och antikroppen. Inombiokemin kan antikroppar användas till att identifiera proteiner och andra substanser.Immunförsvaret - inledningImmunsystemet är en viktig funktion i våran kropp när det gäller försvar mot sjukdomar ochär uppbyggt av det specifika och det ospecifika immunförsvaret. Det ospecifikaimmunförsvaret fungerar redan från födseln och består av huden och slemhinnorna somskyddar oss mot främmande smittoämnen. Till det ospecifika immunförsvaret räknas delskomplementsystemet som utgörs av olika proteiner som hjälper till att oskadliggöra bakterier,samt olika typer av vita blodkroppar. Det finns många olika slags vita blodkroppar och allahar varsin uppgift, exempelvis granulocyter som har förmågan att äta upp och oskadliggörabakterier och andra smittoämnen. De kan känna igen en främmande eller sjuk cell genom attvarje cell har antigener på sig som fungerar som ett slags fingeravtryck.Det specifika immunförsvaret utgörs av T-lymfocyter och B-lymfocyter som är ett slags vitablodkroppar. Bådas uppgift är att på olika sätt identifiera antigener så som virus ellerbakterier. I en individ finns över en miljon olika B-lymfocyter och varje B-lymfocytproducerar en specifik antikropp (immunoglobulin) som i sin tur är specialiserad på en typ avantigen. I det här projektarbetet har vi valt att inrikta oss på just immunoglobuliner.B-lymfocyter som någon gång blivit aktiverat av ett antigen "kommer ihåg" detta och finnskvar som så kallade minnesceller och kan snabbt mobiliseras om vi återigen utsätts för sammasmittoämne, så kallad immunitet. Vi kan även bli immuna på medicinsk väg med hjälp avvaccin där man injicerar det smittoämnet som man vill bli immun mot. Det framställs dåantikroppar och minnesceller mot just den sjukdomens antigen. Då ett smittoämne redan fåttfäste i kroppen och man på ett snabbt sätt vill få antikroppar kan man injicera ett serum.Serumet består av redan färdiga antikroppar som utvunnits ur blod från exempelvis människaeller djur. Det varar dock inte så länge eftersom att antikropparna tar slut efter ett tag och detegna försvaret blir passivt.

ImmunoglobulinAlla immunoglobuliner är uppbyggda av två lätta kedjor (L) och två tunga kedjor (H) sombinds samman av disulfidbindningar. Det finns två olika klasser (isotyper) av lätta kedjor, loch k och det finns fem olika isotyper av tunga kedjor som delar in immunoglobuliner i olikaklasser: IgG, IgA, IgE, Ig M och Ig D. Dessa skiljer sig inte bara åt i strukturen utan också ihur de binder antigen (se figur 1). IgM är en pentamer, där H-kedjan består av en variabeldomän och fyra konstanta domäner. Det svarta strecket i molekylen är en polypeptidkedjasom har adderats och kallas för J-kedjan (se figur 1). Den kan binda ihop två enheter ochforma en dimer av IgA. IgG, IgD och IgE är monomeriska immunoglobulinmolekyler [2].Figur 1. (a) Immunoglobulin molekylen med de tunga och lätta kedjorna och vart antigen binder tillImmunoglobulin. (b) Schematisk polypeptidkedjestruktur av olika immunoglobulin molekyler. [2]Immunoglobulin G är den antikropp som finns i högst koncentration i människans serum ochsom har den enklaste strukturen. Immunoglobulin M är den första klassen av antikroppar somdyker upp i serum efter ett ha blivit utsatt av en antigen. Immunoglobulin A finns mest i yttreavsöndringar så som saliv, tårar och luftrörsslem och fungerar som försvar mot bakterier ochvirusantigener. Immunoglobulin D vet man inte så mycket om ännu. Immunoglobulin Etilldelar försvar emot parasiter. IgE kan också orsaka allergiska reaktioner.Immunoglobulin GImmunoglobulin G består av två olika polypeptidkedjor, en 25-kd lätt kedja och en 50-kd tungkedja. Den lätta kedjan har två domäner, immunoglobulindomäner, medan den tunga kedjanhar fyra. Subenhetskompositionen hos immunoglobulin G är L 2 H 2 . Varje L-kedja är bundentill en H-kedja genom en disulfidbindning, och H-kedjorna är bundna till varandra genomminst en disulfidbindning.

IgG-molekylen har en Y-liknade struktur, bestående av stammen F c och de två armarna F ab(F= fragment, ab= antigenbindande) (se figur 2). De tre delarna formas när proteaset papainklyver IgG-molekylen. Stammen består av två C-terminal immunoglobulindomäner av varjeH-kedja. Armarna består av två N-terminal immunoglobulindomäner av varje H-kedja och tvåN-terminal domäner av varje L-kedja. Papain klyver H-kedjan på C-terminalsidan avdisulfidbindningen som binder ihop varje L- och H-kedja. Varje F ab består en hel L-kedja sombinds med en disulfidbrygga till tre N-terminalhalvor av en H-kedja. Varje F c består av C-terminalhalvor av båda H-kedjorna. Varje F ab innehåller en antigenbindande yta. Eftersom enintakt IgG molekyl består av två F ab komponenter har den två bindningsytor vilket gör attmolekylen kan tvärbinda flera antigener. [1]Figur 2. Klyvning av immunoglobulin G med papain som bildar två Fab delar och en Fc del. [2]Bindningen mellan F ab - och F c -regionerna i IgG-molekylen är flexibel och gör så att de tvåantigenbindande ytorna kan orientera sig rätt för att kunna binda till ett antigen. Detta kallasför segmental flexibility.Jämförelse av aminosyrasekvenser från olika IgG-antikroppar, från människor eller möss,visar att N-terminaldomäner av varje polypeptidkedja har mycket variabla sekvenser medande återstående domänerna har konstanta sekvenser. En L-kedja är uppbyggd från en N-terminaldomän som är variabel (V L ) och en C-terminaldomän som är konstant (C L ). H-kedjanär uppbyggd från en variabel N-terminaldomän (V H ) och tre konstanta N-terminaldomäner(C H1 , C H2 och C H3 ). De fyra kedjorna hålls ihop av disulfidbryggor. Ytan som binder antigenfinns vid slutet på de variabla domänerna.I figur 3 syns tre små regioner som visar mycket hög variabilitet än resten av domänerna.Dessa områden kallas hypervariabla regioner eller complementarity determining regions,CDR1, CDR2 och CDR3 och är lokaliserade vid N-terminalen på varje variabla domän. Dessavarierar både i storlek och aminosyrasekvens hos olika immunoglobuliner. Dessa regionerbestämmer specificiteten hos antigen-antikropp interaktionerna. De olika konstantadomänerna - C L , C H1 , C H2 och C H3 - visar stor sekvenslikhet mellan varandra och andrakonstanta domäner från olika klasser av immunoglobulin.

Figur 3. (a) De hypervariabla regionerna hos immunoglobulin. (b) Diagram över variabilitet som funktion avaminosyra nummer längs polypeptidkedjan. De tre topparna i diagrammet visar de tre hypervariabla regionerna,CDR1, CDR2 och CDR3. [2]Både konstanta och variabla domäner från både H- och L-kedjor har liknande strukturer,vilket har blivit känt som immunoglobulin fold. Detta tas upp i nästa del, immunoglobulinersstruktur.Immunoglobulins strukturEn immunoglobulin molekyl består av 12 domäner där varje domän har en liknande struktur:2 b-flak bestående av antiparallella b-strängar är tätt ihop packade mot varandra i enkomprimerad b-tunna med en hydrofob kärna [3]. Tunnan hålls samman och stabiliseras avvätebindningar mellan b-strängarna i varje flak, hydrofoba interaktioner mellan sidokedjorna ide två b-flaken samt genom en disulfidbrygga mellan flaken. Denna konserverade strukturkallas The Immunoglobulin Fold och återfinns i många andra proteiner som har nyckelroller iimmunsystemet [1].Som tidigare beskrivet består immunoglobulin molekylen av konstanta och variabla domäner.Alla konstanta domäner är uppbyggda av sju b-strängar, varav fyra strängar bygger upp ettflak och tre strängar det andra flaket (se figur 4). Looparna i de konstanta domänerna varierari längd och sekvens mellan de olika klasserna av immunoglobulin, men är konstanta inomvarje klass. Den övergripande strukturen hos de variabla domänerna är väldigt lik strukturenhos konstanta domäner, förutom att variabla domäner är uppbyggda av nio b-strängar iställetför sju [3]. De två extra strängarna är inlagda i loopregionen där b-sträng C är ihop bundenmed b-sträng D (se figur 4). Det är i de variabla domänerna som de hypervariabla regionerna(CDRs) är lokaliserade.

Figur 4. (a) Jämförelse i struktur mellan konstanta och variabla domäner hos immunoglobuliner. Hos de variabladomänerna finns de hypervariabla looparna som tillsammans bildar en potentiell bindningsyta för ett antigen. (b)illustration över att ett _-flak återfinns i både den variabla och konstanta domänen. [2]Det finns två aspekter gällande immunoglobulins struktur som är speciellt viktiga för dessfunktion [1]:1. De hypervariabla looparna hos de variabla domänerna då de bestämmer specificiteten hosen immunoglobulin molekyl och bildar en bindningsyta för ett antigen.2. N-terminalerna och C-terminalerna är på motsatt sida om varandra i strukturen, vilketmedför att domänerna i immunoglobulin kan kopplas samman och bilda kedjor (se figur1). Sådana kedjor är närvarande i många andra nyckelmolekyler i immunsystemet.Immunoglobulins specifika bindningsförmågaHos samtliga typer av antikroppar bildar de utgående looparna vid N-terminalerna hos L- ochH-kedjorna en bindningsyta till vilken olika antigener kan bindas (se figur 5). Varje domänhar tre loopar med hypervariabla sekvenser. De totalt sex looparna bildar tillsammans en endayta vid slutet av antikroppens arm. Då alla typer av variabla L- och H-kedjor kan binda tillvarandra kan därigenom ett mycket stort antal olika bindningsytor uppstå.

Figur 5. Två överblickar av de variabla domänerna hos L-kedjan (gul) och H-kedjan (blå), de hypervariablalooparna är i rött. De sex looparna bildar tillsammans en bindningsyta och specificiteten för olika antigenbestäms av sekvensen och strukturen hos de hypervariabla looparna. [1]Bindningen mellan ett antigen och en antikropp styrs av samma princip som när ett substratbinds till ett enzym, bland annat med hjälp av approximitetseffekten, närhetseffekten.Fenomenet ”induced fit” förekommer även vid antigen – antikropp komplex och ökarantikroppens specificitet [1]. Monoklona antikroppar har en Lock-and-Key passning tillvarandra vilket innebär att bindningsytornas form anpassas till varandra [4]. En formbarbindningsyta bidrar till betydligt fler bindningsmöjligheter än en stel sådan. Ett stort antalvätebindningar, elektrostatiska bindningar och van der Waals bindningar förstärkta med hjälpav hydrofobiska krafter bidrar till de starka och specifika bindningarna. Bindningsytan påantikroppen använder sig av en eller flera av looparna vid bindningen till molekyler. Småmolekyler har kontakt med färre loopar medan en större molekyl kan vara i kontakt med allasex loopar. Vid bindning av små molekyler deltar omkring 15 sidokedjor hos antikroppen ibindningen. Vanligtvis binds små molekyler i klyftor i bindningsytan med hjälp avexempelvis elektrostatiska bindningar. En makromolekyl, som exempelvis globuläraproteiner, binder till större mer plana bindningsytor. Då en makromolekyl binds deltar 20 ellerfler sidokedjor till bindningen [1]. Bindningen mellan en antigen och en antikropp ärreversibel och komplex av stora molekyler kan brytas bland annat genom en förändring i pHsom i sin tur förstör passningen mellan molekylerna. Detta gör att man kan användaaffinitetskromatografi för att rena fram antikroppar och antigener [4].Användning av immunoglobuliner/antikroppar inom BiokeminInom biokemin kan man använda antikroppar för att på immunologisk väg identifieraproteiner och andra substanser genom olika tester som t.ex. ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) eller Western Blot. Vid dessa test använder man sig antingen av polyclonalantibodies eller monoclonal antibodies.Monoklona antikroppar är antikroppar som är identiska med varandra. De är producerade frånen typ av B-cell och är kloner av varandra. Monoklona antikroppar kan massproduceras i ettlaboratorium genom att exempelvis smälta samman en antikropp-producerande B-cell med

elativt kort livslängd, med en snabbt växande cancer cell. Resultatet blir en hybridcell somförökar sig snabbt och skapar en klon som producerar den antikropp man vill åt, i storakvantiteter. Monoklona antikroppar används ofta i laboratorium och i medicinska tester då deminskar bieffekterna som kan uppstå om man använder sig av polyklona antikroppar som ärantikroppar producerade av olika B-celler och är därmed olika i sin struktur. [1]Varje B-cell producerar antikroppar som är specifika, inte till en antigen utan till ett epitopsom är en liten del på detta antigen där antikroppen binder. Polyklona antikroppar binder tillmånga epitoper på ett antigen, medan monoklona enbart binder till en enda epitop. Nackdelenmed att använda monoklona antikroppar är att när man preparerar antikroppar kan vissabindningsförmågor blir fördärvade, om de monoklona antikropparna som man jobbar med ärkänsliga för detta kan de lätt bli oanvändbara då de bara binder till en epitop. Om man arbetarmed polyklona antikroppar kommer de fortfarande att vara användbara även om vissaepitopbindningstyper försvinner. [1]ELISAAnvänds för att undersöka om en viss substans är närvarande i ett prov. ELISAgår till på så sätt att man har ett enzym, som reagerar med ett färglöst substratför att bilda en färgad produkt, som är kovalent bunden till en specifikantikropp som känner igen antigenet man vill ha tag på. Om antigenet ärnärvarande i lösningen binder antikropp-enzym komplexet antigenen ochkatalyserar reaktionen som ger den färgade produkten. Närvaron av denfärgade produkten indikerar på närvaron av antigenen. Detta är ett snabbt ochlättanvändligt sätt att detektera olika substanser. Ett ELISA test kan upptäckaen substans även om mängden av det är mindre än ett nanogram (10 -9 g). IELISA kan man använda sig av både monoklona och polyklona antikroppar,men monoklona ger ett mer tillförlitligt resultat. ELISA test används vidundersökning om man har en HIV infektion i blodet.[5]Western Blot Används då man vill hitta ett protein som finns i liten mängd i en lösninginnehållande en massa andra proteiner, t.ex. i blodet. Western Blot går till på såsätt att man först applicerar provet på en SDS-polyacrylamid gel, sedan”blottar” man genom att överföra de denaturerade proteinerna till enpolymerplatta som gör proteinerna mer tillgängliga för antikroppen somspecifikt binder det protein man vill ha tag på. Antikropp-antigen komplexetidentifieras genom att tvätta plattan med en annan antikropp som känner igenden första antikroppen (t.ex. en antikropp från ett annan djur). Ett radioaktivtmärke på den andra antikroppen frambringar ett mörkt streck vid röntgenstrålning. Alternativt är den andra antikroppen bundet till ett enzym som ger enfärgad produkt (som ELISA test). Western Blotting gör det möjligt att hitta ettprotein i en komplex blandning och används t.ex. vid test för hepatit C. [5]

Referenser[1] Biochemistry, Fifth Edition. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and Lubert Stryer, s.921-947.[2] Introduction to Protein Structure, Second Edition, Carl Branden and John Tooze, s. 300-306.[3] Hemsida: An Introduction to immunoglobulin structure.www.clunet.edu/BioDev/omm/ig/molmast.htm 2004-05-27[4] Essential immunology, Seventh Edition. Ivan Roitt, s. 68.[5] Hemsida: Wikipedia, the free encyclopedia. http://en.wikipedia.org/wiki/Immunoglobulin.2004-05-30