119-122 immunhistokimya ve immunpatoloji

Türk Toraks Derne¤i Okulu
‹mmünhistokimya ve ‹mmmünpatoloji Uygulamalar›
Prof. Dr. Kemal BAKIR
Gaziantep Üniversitesi T›p Fakültesi, Patoloji Anabilim Dal›, GAZ‹ANTEP
e-mail: kbakir@hotmail.com
Coons ve arkadafllar›n›n 1940’l› y›llardaki infekte dokuda
floresseine ba€l› antikorlarla bakteriyel antijenleri
tan›mlamalar› ile tan›sal immünkimya gündeme gelmifltir
(fiekil 1,2) (1,2).
‹mmünpatoloji genifl bir terim olup, immünhistokimya,
immünfloresan ve in situ hibridizasyonu içine almaktad›r
(3). ‹mmünpatoloji doku kesitleri, aspirasyon materyalleri
ve bronkoalveoler lavaj gibi s›v›lara uygulanabilmektedir.
Hedef proteinler veya nükleik asitler için spesifik
olan antikorlar veya problar, doku kesitlerine uyguland›klar›nda
antijene ba€lanmaktad›rlar. ‹mmünhistokimya(‹HK)’da
antikorlar bir enzim (peroksidaz gibi) tafl›r
ve bu enzim kimyasal reaksiyonu tetikleyerek boya
ile reaksiyonun lokal bir alana toplanmas›na ve görünür
hale gelmesine neden olur (3).
‹n situ hibridizasyonda iflaretlenmifl riboprob, hedef hücre
veya organizmalarda belli bir (araflt›r›lmak veya gösterilmek
istenen protein dizinini) nükleik asid dizininin
tamamlanmas› ifllemine dayal› bir sistemdir. ‹n situ hibridizasyonda
kullan›lan problar digoksigenin ile iflaretlenmifl
olabilir. Bu prob, enzim tafl›yan anti digoksigenin
antikoru ile saptanabilir (3). Bu yöntem ile antikorun
lokalizasyon yan› s›ra kantitatif de€erlendirme de
olanakl›d›r.
fiekil 2. ‹mmünhistokimyasal tekniklerin flematik olarak gösterimi:
A. ‹flaretlenmifl primer antikorla yap›lan direkt teknik. B.
‹kinci basamakta iflaretlenmifl anti-IgG ile indirekt teknik. C. ‹flaretlenmemifl
antikorla yap›lan üç basamakl› immünglobulin-enzim
ba¤lanmas›.Üçüncü basamak antikorun ba¤lanma taraf› (genellikle
anti HRP), enzime ba¤lanmak için serbest olarak durur.
D. PAP yöntemi; üçüncü basamakta peroksidaz-antiperoksidaz
kompleksi kullan›l›r. E. Çift küprü; ikinci ve üçüncü basamak antikorlarla
yinelenen inkubasyonlar uygulan›r ve bunu takiben bir
kez HRP inkubasyonu tatbik edilir. F. Çift PAP tekni¤i; ikinci ve
üçüncü basamak komponentler, iki defadan daha fazla yinelenerek
uygulan›rlar.
Son 30-40 y›ld›r kullan›lmaya bafllanan immünhistokimyan›n
geliflmesi 1980’li y›llar›n sonlar› ve 1990’l› y›llar›n
bafl›na rastlamaktad›r. ‹lk kullan›lmaya baflland›€›nda dar
bir panel ile bafllanm›fl olmakla birlikte, bugün için rutin
uygulamalarda binlerce antikor bulunmaktad›r (4,6).
Tüm bu geliflmelere ra€men hematoksilen eozin (HE) ile
boyanma ve ›fl›k mikroskobu ile incelemeye dayal› histopatoloji
alt›n standartt›r. ‹HK tan›da morfolojik ve moleküler
bilgiyi tamamlamaktad›r. Ayr›ca, tedavi yan›t›n›n
de€erlendirilmesinde de ve son dönemlerde tedavinin flekillendirilmesinde
kullan›lmaktad›r (6-9).
‹HK hangi amaçla kullan›lmaktad›r:
fiekil 1. Yüzey antijeninin ‹HK olarak gösterilmesi. A, yüzey antijeninde
reaksiyon yok; B, spesifik antikor antijene ba¤lanm›fl; C
ve D, floressein izotiyosiyanat veya enzim ile direkt antikor ba¤lanma
yöntemi; E, peroksidaz-antiperoksidaz yöntemi ile indirekt
yöntem; F, avidin-biotin yöntemi ile indirekt yöntem.
a. HE ile konulan tan›n›n desteklenmesi,
b. Etiopatogeneze katk› sunmak için ,
c. ‹nflamatuvar hastal›klarda hücre çeflitlili€inin ve birikme
yerlerinin saptanmas›,
TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar›
119

Türk Toraks Derne¤i Okulu
d. Tedavinin flekillendirilmesi ve yeni tedavi yöntemlerinin
araflt›r›lmas›,
e. Prognostik parametrelerin araflt›r›lmas›,
f. Transplantasyonda rejeksiyon ve zedelenme mekanizmalar›
ile ilgili bilgilerin sa€lanmas›.
‹HK’n›n inceleme aflamas›na gelinceye kadar, yani
“mutfak” aflamas›nda birçok basamaktan geçmektedir
(6,10):
1. Dokunun fiksasyonu (fiksasyonun tipi ve zaman›),
2. Dokunun takip ifllemleri (doku takip cihaz›, parafine
gömme, kesme ve arflivleme),
3. Deparafinizasyon ifllemleri,
4. Antijen retrival (do€ru yöntemin seçilmesi),
5. Boyanma yöntemi ve protokolü,
6. Boyanmada kullan›lan solüsyonlar›n geçerlilik süreleri,
7. Kontroller (önerilen pozitif ve negatif kontrol materyallerinin
do€ru kullan›m›),
8. Teknisyen ve patologun bir arada çal›flmas› ve uyumu,
9. Antikor panel seçimi,
10. Seçilen antikor panelinin duyarl›l›€›,
11. Seçilen antikor klonu,
12. Sonuçlar›n do€ru okunmas›, skorlanmas› ve pozitiflik
oran›n›n de€erlendirilmesi.
‹HK, genel olarak avidin-biotin tabanl› saptama sistemleri
ile birlikte kullan›lmakla birlikte, böbrek ve karaci-
€er baflta olmak üzere hücrelerdeki biotin ile ba€lanmas›
nedeniyle hatal› sonuçlara neden oldu€u için polimer
tabanl› saptama “detection” sistemleri kullan›lmaya bafllanm›flt›r.
Gelecekte de tiramin-bazl› amplifikasyon sistemlerinin
ön planda olaca€› düflünülmektedir (6).
‹mmünhistokimyasal reaktivite hücrelerde veya stromada
karfl›m›za ç›kar. Hücrelerdeki reaktivite ise, membranöz,sitoplazmik
ve/veya nükleer olabilir (Resim 1). Boyanman›n
geniflli€ine, yo€unlu€una ve/veya genifllik ve
yo€unlu€un kombinasyonuna göre reaktivite var ve yok
aras›nda genifl bir aral›kta de€erlendirilir (zay›f, orta,
güçlü; +, ++, +++ gibi…).
‹mmünpatoloji uygulamalar›ndan immünhistokimya pulmoner
patoloji özeline indirgendi€inde ise akci€erdeki difüz
parenkimal akci€er hastal›klar›nda, astma ve KOAH gibi
hastal›klarda, inflamatuvar hücre çeflitleri ve say›lar›n›n
saptanmas›nda infektif hastal›klarda, akci€erin benign ve
malign neoplazmlar›nda, mezotelyal lezyonlarda ve patogenez
ve tedaviye yönelik deneysel çal›flmalarda kullan›lmakta
ve yararl› sonuçlar elde edilmektedir (11-14).
Astmatiklerde yap›lan çal›flmalarda, bronfl duvar›ndaki
kronik T-hücre arac›l› immünolojik reaksiyonun özellikleri
‹HK ile gösterilmeye çal›fl›lmaktad›r. Bu çal›flmalarda
T-hücreleri (CD2, CD5, CD7 ve CD8 monoklonal antikorlar›),
B-hücreleri (CD19, CD20 monoklonal antikorlar›),
monosit ve makrofajlar (CD 68), eozinofiller (EG1)
ve aktive eozinofiller (EG2) gösterilmeye ve kantitatif
olarak de€erlendirilmeye çal›fl›lm›flt›r. Ayr›ca, T-hücre
alt tiplerinin de€erlendirilmesi için de CD4: CD8 oran›
çift boyama immünfloresan yöntemi ile saptanmaya çal›fl›lm›flt›r.
Proksimal hava yollar›ndan al›nan biyopsi ile
distal hava yollar›ndan yap›lan bronkioloalveoler lavajda
(BAL) T-hücre, eozinofil ve makrofaj say› ve oranlar›
saptanabilmektedir. Astmadan ani ölümlerde distal inlamasyonu
göstermek üzere BAL T-hücre lenfositozisinde
bir art›fl saptanm›flt›r. Astma hastalar›nda ise bu art›fl›n
olmad›€› ve rölatif olarak normal kald›€› gözlenmifltir.
CD 8 + T-hücrelerindeki art›fl ile birlikte CD4:
CD8 oran›nda bir tersine dönüfl gözlenmifltir (11).
Ayr›ca, birbirine benzer iki ayr› hastal›k tablosu eozinofilik
bronflit ile astma aras›nda ki ay›r›c› tan›da balgam,
lavaj ve BAL’da eozinifili ve ‹HK olarak nitrik oksid bak›larak
ay›r›c› tan› yap›lmaya çal›fl›lmaktad›r (15).
Kronik obstrüktif akci€er hastal›€›nda (KOAH) sigara
içenlerle içmeyenler aras›nda CD8 + T-hücreleri araflt›-
r›larak, sigara içicilerinde CD8 art›fl› saptanm›flt›r. Böy-
Resim 1. Hücrenin immünhistokimyasal olarak membranöz, nükleer ve sitoplazmik veya birlikte boyanmalar›.
120
TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar›

Türk Toraks Derne¤i Okulu
lece CD8 hücrelerinin KOAH patogenezindeki rolü gösterilmifltir
(16).
Difüz parenkimal akci€er hastal›klar›nda tan› ve sürecin
iflleyiflinin de€erlendirilmesi amac›yla da ‹HK ve genel
olarak immünpatoloji yer bulmaktad›r (17).
Deneysel olarak yap›lan çal›flmalarda da ‹HK kullan›larak
insanlardaki pulmoner patolojilerin etiopatogenezi
araflt›r›lmakta ve tedavileri için çözümler üretilmeye çal›fl›lmaktad›r.
Bunlardan birisi de akci€er hipersensitivitesinde
biriken hücrelerin tipinin saptanmas› ve toplanma
lokalizasyonudur. Dendritik hücreler bronfliyoller
çevresinde birikmeyi tercih ederken, makrofajlar›n arterler
etraf›nda topland›klar› dikkati çekmektedir. Dendritik
hücrelerle birlikte CD4 pozitif Th hücrelerinde ayn›
yerde yopland›klar› gözlenmifltir (18).
Akci€er kanseri tüm dünyada kanserden ölümler s›rlamas›nda
birinci s›rada yer almaktad›r. Ayr›ca, akci€er
karsinomlar›ndan küçük hücre d›fl› akci€er kanseri
(KHDAK), tüm akci€er kanserlerinin %80’nini oluflturmaktad›r.
Bu nedenle bu tümörlerin ay›r›c› tan›s›n›n yap›lmas›
ve prognozunun belirlenmesi de önemlidir. Bu
amaçla Beta-katenin adenokarsinomlar›n ay›r›c› tan›s›nda
kullan›lmakta, c-kit ise hem adenokarsinomlardaki
pozitif boyanmalar› ay›r›c› tan›da ifle yaramakta hem de
prognoz ile iliflkisi gösterilmifl olmaktad›r (13,19,20). C-
kit yan› s›ra KHDAK’de çok say›daki prognostik faktörleri
saptamak amac›yla ‹HK kullan›lmaktad›r. Bu moleküler
prognostik faktörler Tablo 1’de gösterildi€i gibi
dört bafll›k alt›nda toplanmaktad›r (21):
a. Büyüme faktörleri ve reseptörleri, onkogenler,
b. Programl› hücre ölümü,
c. Hücre sikulusunun regülasyonu,
d. Angiogenez ve tümör progresyonu.
‹HK’n›n di€er bir kullan›m alan› olarak da mezotelyomalar›n
adenokarsinomdan ay›r›c› tan›s›d›r. Bu amaçla kal-
Tablo 1. Cerrahi olarak rezeke edilen KHDAK’daki moleküler faktörlerin prognostik de¤eri ve s›kl›¤›.
S › k l › ¤ › ( % )
Prognostik de¤eri
Onkogenler/büyüme faktörleri
ErbB-1 (EGFR) 50-80 Var
ErbB-2 (HER2-neu) 4-84 Tart›flmal›
K-ras 7-32 Tart›flmal›
TGF-beta 46-51 Yok
Pro-apoptotik faktörler
Fas 36-54 Var
Kaspaz 3 30-73 Var
P53 afl›r› ekspresyon 30-77 Yok
P53 mutasyon 21-53 Var
Antiapoptotik faktörler
Survivin 52-86 Var
Bcl-2 16-67 Tart›flmal›
Hücre siklusu
Ki-67 33-66 Tart›flmal›
Rb 15-30 Tart›flmal›
Siklin D1 25-51 Yok
p16 inaktivasyonu 27-51 Var
p21 43-73 Var
Siklin E 16-53 Var
Siklin B1 22 Var
hTERT/Telomeraz 33-85 Var
Anjiogenez/invazyon
VEGF 47-71 Var
HGF 72 Var
Angiostatin 24 Var
MMP2 ve 9 60-80 Var
CD44 20-63 Yok
Epigenetik modifikasyonlar
DAPK 44 Var
RASSF1A 32 Var
TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar›
121

Türk Toraks Derne¤i Okulu
retinin, sitokeratin 5/6, podoplanin, WT1 ile birlikte
MOC-31, Ber-EP4, B72.3, CEA, BG-8 ve TTF-1 kullan›labilir.
Peritoneal mezotelyoma ile seröz karsinom aras›ndaki
ay›r›c› tan›da MOC-31, Ber-EP4, östrojen reseptörü
ve kalretinin yararl› belirteçler olarak tan›mlanmaktad›r.
Epiteloid mezotelyoma ile skuamöz karsinom aras›ndaki
ay›r›c› tan›da ise MOC-31, Ber-EP4, CEA, BG-8
ve p63 kullan›labilir ve bunlar›n tamam› skuamöz hücreli
karsinomda eksprese olur. Yak›n zamanda kullan›lmaya
bafllan›lan ve mezotel belirteçleri olan D2-40 ve
podoplanin, epitelyal mezotelyomlar›n %90’›n›nda pozitif
boyanma göstermektedirler (22,23).
‹mmünsitokimya (‹SK), efüzyon sitoloji örneklerine uygulanan
bir yöntem olarak karfl›m›za ç›kmakta ve özellikle
smearlere, sitospin ve Thinprep örneklerine uygulanabilmektedir.
Sitolojik örneklerde ‹SK uygulamalar›nda
teknik olarak ve yorumlamalarda zorluklarla karfl›lafl›ld›-
€› için bu materyallerden elde edilen hücre bloklar›na
‹SK uygulanmaktad›r. ‹SK için en uygun örnek hücre
bloklar›ndan elde edilmektedir (24). Pulmoner patoloji
uygulamalar›m›zda da özellikle balgam ve bronfl lavajlar›n›n
tamam›ndan ve plevra s›v›lar›n›n bir k›sm›nda
hücre bloklar› haz›rlanarak hem hücrelerin bir arada oldu€u
kesitler elde edilmekte hem de ‹SK uygulamalar›
için uygun örnekler elde edilmektedir.
Sonuç olarak, doku örnekleri için HE, sitopatoloji için
Papanikolau, giemsa ve HE boyalar›n›n ›fl›k mikroskopisi
ile incelenmesi hala güncelli€ini ve alt›n standart oluflunu
korumakla birlikte, ‹HK ve ‹SK gibi geliflmifl yöntemlerin
tan›y› desteklemek, etiopatogeneze katk›da bulunmak
ve tedavi yöntemlerinin belirlenmesi ve sonuçlar›-
n›n izlenmesi amac›yla kullan›lmas›n›n yarar› aç›kt›r. Ancak
bu yöntemlerin kullan›m› s›ras›nda teknisyenle iflbirli€i
yan› s›ra, do€ru fiksatiflerin kullan›m›, do€ru ‹HK
saptama yöntemleri ve do€ru antikor panellerinin kullan›lmas›
zorunludur. HE tan›s› yaklafl›m› için kullan›lan temel
prensiplerin tamam› ‹HK prati€ine de uygulanmal›-
d›r. Bu da tan›da daha az yan›lg›ya neden olacakt›r.
KAYNAKÇA
1. Cancilla PA, Cochran AJ, Naeim F, et al. Diagnostic immüno -
pathology [Specialty Conference]. WestJ Med 1986; 145: 65-73.
2. Faul JL, Demers EA, Burke CM, Poulter LW. Alterations in
Airway Inflammation and Lung Function During Corticosteroid
Therapy for Atopic Asthma, Chest 2002; 121: 1414-20.
3. Racusen LC. Immünopathology of organ transplantation Semin
immünopathol 2003; 25: 141–65.
4. Cregger M, Berger AJ, Rimm DL. Immünohistochemistry and
Quantitative Analysis of Protein Expression Arch Pathol Lab
Med. 2006; 130: 1026–30.
5. Walker RA. Quantification of immünohistochemistry-issues
concerning methods, utility and semiquantitative assessment
Histopathology 2006; 49: 406–10.
6. Yaziji H, Barry T. Diagnostic Immünohistochemistry: What can
Go Wrong Adv Anat Pathol 2006; 13: 238–46.
7. Ward JM, Erexson CR, Faucette LJ, Foley JF. D›jkstra C, And
Cattorett› G. Immünohistochemical Markers for the Rodent
Immüne System. Toxicologic Pathology 2006; 34: 616–30.
8. N›sh›gak› Y, Fuj›uch› S, Fujita Y, et al. Increased serum le -
vel of vascular endothelial growth factor in Mycobacterium
avium complex infection. Respirology 2006; 11: 407–13.
9. Jeffrey L. Platt. Insights from the immünopathology of trans -
plantation Semin Immünopathol 2003; 25: 91–4.
10. Taylor C R, Levenson R M. Quantification of immünohistoche -
mistry—issues concerning methods, utility and semiquantitati -
ve assessment II, Histopathology 2006; 49: 411–24.
11. Faul JL, Tormey VJ, Leonard C, et al. Lung immünopathology
in cases of sudden asthma death Eur Respir J 1997; 10: 301–7.
12. Linnoila Ilona and Petruszt Peter. Immünohistochemical Tech -
niques and. Their Applications in the Histopathology of the
Respiratory System. Environmental Health Perspectives 1984;
56: 131-48.
13. Zhu CQ, Shih W, Ling CH, Tsao MS. Immünohistochemical mar -
kers of prognosis in non small cell lung cancer: A review and
proposal for a multiphase approach to marker evaluation J
Clin Pathol 2006; 59: 790–800.
14. Kepley CL, Mcfeeley PJ, Ol›ver JM, And L›pscomb MF. Immü -
nohistochemical Detection of Human Basophils in Postmortem
Cases of Fatal Asthma. Am J Respir Crit Care Med 2001; 164:
1053–8.
15. Brightling CE, Symon F A, Birring SS, Bradding P, Wardlaw A J ,
Pavord ID. Comparison of airway immünopathology of eosinop -
hilic bronchitis and asthma Thorax 2003; 58: 5 2 8 - 3 2.
16. Lams BEA, Sousa AR, Rees PJ, Lee TH. Subepithelial immü -
nopathology of the large airways in smokers with and witho -
ut chronic obstructive pulmonary disease Eur Respir J 2000;
15: 512-6.
17. Martinez FJ, Keane MP. Update in Diffuse Parenchymal Lung
Diseases 2005 Am J Respir Crit Care Med 2006; 173: 1066–71.
18. N›sh›da T, Inoue K, Kawata Y, et al. Peribronchiolar Accumu -
lation of Dendritic Cells and Their Close Association With
CD41 T Cells in the Murine Lung Hypersensitivity Microsc. Res.
Tech 2001; 53: 246–55.
19. Montgomery E, Folpe AL. The Diagnostic Value of b-Catenin
immünohistochemistry. Adv Anat Pathol 2005; 12: 350–6.
20. Micke P, Hengstler JG, Albrecht H, et al. C-kit Expression in
Adenocarcinomas of the Lung. Tumor Biology 2004; 25: 2 3 5 - 4 2.
21. Vielh P, Spano JP, Grenier J, Le Chevalier T, Soria J C. Mole -
cular prognostic factors in resectable non small cell lung can -
cer. Critical Reviews in Oncology/Hematology 2005 ; 53: 1 9 3 – 7.
22. Nelson G. Ordonez. Immünohistochemical Diagnosis of Epithe -
lioid Mesotheliom An Update. Arch Pathol Lab Med 2005; 129:
1407–14.
23. Nelson G. Ordonez. What are the current best immünohistoc -
hemical markers for the diagnosis of epithelioid mesothelio -
ma A review and update. Human Pathology 2007; 38: 1–16.
24. Pereira TC, Saad RS, Yulin Liu, Silverman JF. The Diagnosis
of Malignancy in Effusion Cytology: A Pattern Recognition Ap -
proach. Adv Anat Pathol 2006; 13: 174–84.
122
TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar›