gynogenesis - Ziraat Fakültesi - Ankara Üniversitesi

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜBAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALIGYNOGENESİSYOLUYLA HAPLOİDBİTKİ ÜRETİMİTEZSİZ YÜKSEK LİSANS DÖNEM PROJESİSemiha Elif ERİŞDANIŞMANProf. Dr.. Ş. Şebnem ELLİALTIOĞLU

HAPLOİD BİTKİ NEDİR?Somatik hücrelerindeki kromozom sayısı, ait oldukları bitki türünün gamethücrelerinde bulunan kromozom sayısı kadar olan bitkilere haploid bitkiler adıverilmektedir.Haploid bitkiler kök, dal, çiçek, yaprak ve bazı durumlarda meyveler de verereknormal gelişim gösterirler.Ancak, haploid bitkilerin doku ve organlarını oluşturan hücreler diploidlere görebiraz daha küçük olduğundan, haploid bireyler morfolojik olarak diploidlerin birazküçültülmüş halidir.

Haploid bitkilerin;‣ boyları daha kısa‣yaprakları dar ve küçük,‣çiçekleri ise ufaktır.Haploid ClemenulesBitkisiDiploid ClemenulesBitkisiHAPLOİDDİPLOİD

Tam bir homozigotiyi çok kısa sürede elde etme olanağını sağlar. Mutasyonlar ve hücre modifikasyonlarının incelendiği somatik hücregenetiği çalışmalarında çok elverişli bir yöntemdir.Kendilemenin imkansız olduğu bazı dioik türlerde saf erkek bitkiler eldeetmek mümkündür.Diploid materyale uygulanan mutagenlerin resesif yönde yarattığımutasyonlar, bu materyallerden seçilen haploidler yardımıyla daha ilkgenerasyonda belirlenebilmektedir.

Klasik yöntemlerle homozigotiye ulaşmanın oldukça zor olduğu ve kendilemedepresyonunun görüldüğü çilek ve lahana gibi türlerde dihaploidizasyon ile busorun bir generasyonda çözülebilir.Tetraploid bitkilerden diploid bitkiler elde edilebilmektedir.Çok yıllık meyve ağaçları gibi uzun sürede meyveye yatan türlerde homozigotiyeulaşmak kısalmaktadır.Resesif mutasyonların ortaya çıkarılmasında en etkili yöntemdir.Haploidlerin, değişik ortamlarda ve farklı patojenlere ya da patojenlerin farklıırklarına karşı in vitro seviyede seçime olanak vermesi hastalıklara dayanıklılıkçalışmalarında yer, zaman ve maddi kazanç sağlar.

DOĞADA HAPLOİDLERİN OLUŞUM YOLLARIGYNOGENESİS• Yumurta hücresi döllenme olmaksızın zigot gibibölünmeye başlayarak haploid yapıda bir embriyooluşturur.ANDROGENESİSSEMİGAMİ• Dişi gametin çekirdeğinin döllenmeyekatılmaması ile sadece babadan gelenkromozomları taşıyan embriyonun gelişmesi• Erkek ve dişi eşey hücrelerinin birleşerek embriyooluşturur, fakat çekirdeksel erime gerçekleşmez, anave babaya ait sektörlerin bulunduğu kimeralı haploidbitkiler oluşmaktadır

POLİEMBRİYONİ• Normal döllenme sonucu yeni oluşan tohumiçinde biri diploid, diğeri haploid olan ikiembriyo bulunur.KROMOZOMELİMİNASYONU(BULBOSUM TEKNİĞİ)• Yumurta ile polen birleşir ve döllenme olur. Ancakembriyo gelişmesinin ilk devresinde ebeveynlerdenbirine ait kromozomlar elimine olur ve gelişenembriyo n sayıda kromozom içerir.

YAPAY HAPLOİD BİTKİ ÜRETİMİHaploid bitkilerin çeşitli yollardan doğada kendiliğinden ortaya çıkma sıklığı%0.1 – 0.001 gibi çok düşük seviyelerde kalmakta; birçok türde ise doğalhaploid oluşumuna hiç rastlanmamaktadır.Yetersiz ve düzensiz çıkışları nedeniyle doğal haploid oluşumunu esas alarakıslah programlarını planlamak ve gerçekleştirmek mümküngörünmemektedir.Günümüzde haploid bitkilerin elde edilebilmesi için en etkin ve verimliyöntemler; erkek veya dişi gametlerin başlangıç materyali olarak kullanıldığı invitro tekniklerle sınırlı kalmaktadır.

HAPLOİD BİTKİ ÜRETİM YÖNTEMLERİERKEK GAMETTEN HAPLOİDİ UYARTIMI(ANDROGENESİS)DİŞİ GAMETTEN HAPLOİDİ UYARTIMI(GYNOGENESİS VE PARTENOGENESİSANTER KÜLTÜRÜOVÜL VE OVARYUMKÜLTÜRLERİMİKROSPOR KÜLTÜRÜEKSİK VEYA YETERSİZPOLENLERLETOZLAMA

ERKEK GAMETTEN HAPLOİD UYARTIMI(ANDROGENESİS)Anter Kültürüİçerisinde olgunlaşmamış polenleri (mikrosporları) bulunduran anterlerin,tomurcuklardan ayrılarak in vitro koşullarda yapay besin ortamlarınayerleştirilmesi ve burada olgunlaşmamış polenlerden haploid embriyolar eldeedilmesidir.

Anterlerden EmbriyoÇıkışıEmbriyoların hormonsuz ortamlardabitkiye dönüştürülmesiTaze Ortama Transfer Edilmişİki Haftalık Tam Bir BitkicikToprağa aktarma aşamasınaulaşmış in vitro fidelerAnter kültürü yoluyla elde edilmişbitkilerSağlıklı yeni yapraklar geliştiren anterkökenli bir patlıcan bitkisiSerada Sisleme Sisteminin Altında DışKoşullara Alıştırılan Fideler

Mikrospor KültürüOlgunlaşmamış mikrosporların, anter içerisinden izole edilerek in vitrokoşullarda özel hazırlanmış besin ortamlarında geliştirilmesi ve bunlardanhaploid embriyoların elde edilmesi işlemidir.Mikrospor kültürü ve anter kültürünün yapılışı

DİŞİ GAMETTEN HAPLOİDİ UYARTIMI(GYNOGENESİS VE PARTENOGENESİS)Ovül ve Ovaryum KültürleriDöllenmemiş yumurtalığın ya da yumurta hücrelerinin kültüre alınmasıyla haploidembriyo ve bitki oluşumuna ‘ovaryum’ veya ‘ovül kültürleri’ adı verilmektedir.Fotoğraflar: Yaralı, F., Yanmaz, R. 2013. AlliumTürlerinin Islahında Haploidi TekniğindenYararlanma. Türk Bilimsel Derlemeler Dergisi 6 (2): 45-52.Yumurtalık Kültürü Yoluyla Elde Edilen Gynogenik Bitkilerinin Gelişimia: Yumurtalıklardan Embriyo Gelişimi b: Embriyonun Bitkiye Dönüşümü

GYNOGENEZİS’TEBAŞARIYI ETKİLEYEN FAKTÖRLERTür Ve GenotipAna Bitkinin Yetişme KoşullarıTomurcuk BüyüklüğüTomurcuklara Yapılan Ön UygulamalarKültür Ortamı (Bileşimi)İnkübasyon Koşulları

YUMURTA (OVUL) VE YUMURTALIK (OVARYUM)KÜLTÜRLERİNİN YAPILIŞIÇiçek Tomurcuğunun Çiçeklerin Açılmasından (Antezis) Önce Bitkiden AlınmasıFotoğraflar: Yaralı, F., Yanmaz, R. 2013. AlliumTürlerinin Islahında Haploidi TekniğindenYararlanma. Türk Bilimsel Derlemeler Dergisi 6(2): 45-52.Sterilisasyon İşlemi Yapılır , Ardından Tomurcuklar Veya İçlerinde Bulunan Yumurtalık Veya YumurtaHücreleri, Steril Şartlarda Besin Ortamı İle Doldurulmuş Petri Kaplarında Kültüre Alınır

İnkübasyon Ortamında Gelişen Eksplantlar, Alt Kültür Ortamına Aktarılır Ve İklim Odasına AlınırGelişme Gösteren Bitkiler Büyüme Ortamına Alınır

Gelişen Bitkiciklerde Ploidi Seviyesini Belirlemek Amacıyla Kromozom Sayımı YapılırHaploid Olduğu Belirlenen Bitkiciklerin Kök Uçlarından Alınan Örneklerde Kromozom Katlama İşlemiGerçekleştirildikten Sonra Kök Uçları Rejenerasyon Ortamına Aktarılarak Bu Ortamda Bitkiye DönüştürülürGelişen Bitkiler Dış Koşullara Alıştırılır

Eksik veya Yetersiz Polenlerle TozlamaPartenogenetik embriyo oluşumunu uyarmak üzere kullanılacak eksik veya yetersizpolenleri elde etmek için;o değişik kimyasal maddeler ile radyoaktif ışınlar,o uzak akrabalar arası melezlemeler,o tozlamaların geciktirilmesi,o sıcaklık şokları yöntemlerinden yararlanılır.Polenlere yapılan bu uygulamalar sayesinde polen generatif çekirdeği inaktif halegeçirilmekte, bununla birlikte çimlenme yeteneğini koruyan polenler dişicik tepesiüzerinde çimlendiklerinde oluşturdukları uyartım sonucunda, partenogenetik olarakhaploid embriyolar meydana gelmektedir.

ÖNCEKİ YAPILAN ÇALIŞMALAROVÜL VE OVARYUM KÜLTÜRLERİI. SoğanlarYaralı ve Yanmaz (2012), Allium türleriyle yapılan araştırmada gynogenezisyoluyla haploid bitki elde edilmesinde başarıyı etkileyen faktörler tartışılmıştır.Yapılan araştırma sonuçları incelendiğinde soğanlarda gynogenik embriyooluşma oranının 0.00% ile 13.33% arasında değişim gösterdiği görülmektedir.Gynogenik haploid embriyoların elde edilmesinde ortamın oksin-sitokinindengesi önemlidir. Ana bitkinin yetişme koşulları gynogenezis üzerinde etkiliolan önemli faktörlerden biridir. Yüksek sıcaklıklarda hücre bölünmesi dahahızlı olduğu için haploidi oranı düşmektedir. Buna karşılık soğanlarda düşüksıcaklık ve yüksek ışıklanma süresi de gynogenezis üzerinde olumlu etkiyesahiptir

II. Şeker PancarıDoctrinal ve ark. (1989), şeker pancarında in vitro gynogenesisüzerine sıcaklık, mevsim, genotip ve bitki büyüme düzenleyicilerinetkilerini araştırmışlardır.Araştırıcılar ovüllerden embriyo gelişimi için 27°C'nin 24°C’ye göredaha uygun olduğunu bildirmiş, yaz ayları içinde de haziranın enuygun dönem olduğunu bildirmişlerdir.Genotipin etkisinin belli ortamlar için önemli olduğu bulunanaraştırmada, kültüre alınan ovüllerden genotipe bağlı olarak % 6-10oranında bitki elde edilmiş ve bu bitkilerin % 8’inin haploid olduğusaptanmıştır.

III. GerberadaHonkanen ve ark. (1991) Gerberada yapılan çalışmada 15 hat, 3farklı işleme göre in vitro koşullarda kültüre alınmıştır.Araştırıcılar, kullanılan bütün hatlardan bitki elde edilmesinerağmen genotiplerin farklı kültürel işlemlere verdikleri tepkilerininfarklı olduğunu belirtmiştir. Çiçeklenme safhasının önemli olmadığıve çiçek gelişimi için ışıklanma şartlarının en uygun olduğuHaziran-Eylül döneminde en olumlu sonucun elde edildiğisaptanmıştır.Elde edilen bitkilerin % 90'ının haploid, % 10'unun diploidolduğunu; ayrıca bir ana bitkiden farklı renk ve şekillere sahip veana bitkiden daha küçük çiçekli, yaprak yapıları değişik haploidleroluştuğunu belirtmişlerdir.

IV. HıyarAalders (1958), hıyarda (Cucıımis sativus L.) monoploidbitki elde etmek amacıyla, olgunlaşmamış dönemde hasatedilen meyvelerin tohumlarını su üzerinde yüzdürme yoluylaayırarak, su yüzeyinde kalan hafif tohumlarla embriyokültürü yapılmış ve 13 adet monoploid hıyar bitkisi eldeedilmiştir.Cucıırbitaceae familyasının ilk monoploidleri olan bubitkilerden 8 tanesinin büyütülmesine ve kolhisin yardımıyladiploid hale getirilmesine rağmen, bunlardan yeni nesillerelde edilememiştir

EKSİK VEYA YETERSİZ TOZLANMAI. Rozet ÇiçeğiRogers ve Ellis (1966), araştırıcılar Vinca rosea L. türünde çiçektozu çim borusu generatif çekirdeğinin bölünmesi üzerinekimyasalların etkilerini incelemiştir.Polenleri 1-30 dakika arasındaki sürelerde, 0-500 ppm arasındakikonsantrasyonlarda toluidin mavisi çözeltisinde bekletmişlerdir.Uzun süre (20-30 dakika) ve yüksek konsantrasyonlardaki (500ppm) uygulamalarda çiçek tozu generatif çekirdeklerindebölünme oranı oldukça düştüğü ve çim borusu uzunluğu oldukçaazaldığı belirlenmiştir.

II.HıyarNiemirowicz-Szczytt ve Dumas de Vaulx (1989), Polan F 1 hıyar çeşidini300-900 Gray dozlarında Co 60 kaynaklı gama ışını ile ışınlanmış polenlerletozlamışlar ve normal polenlerle yaptıkları tozlamaları da kontrol olarakkullanmışlardır.Işınlanmış polenlerle yapılan tozlamalarda meyve tutum oranı % 50-60,meyve başına ortalama tohum sayısı 250 adet olmuş ve tohumlarınınçoğunun içinin boş olduğu saptanmıştır.Kontrol polenleriyle yapılan tozlamalarda ise, meyve tutum oranı % 100,meyve basına tohum sayısı ortalama 400 adet ve tohumların hemenhepsinin normal embriyolar içerdiği görülmüştür.Kontrole göre daha küçük olan bu embriyoların renk, pozisyon ve boyutbakımından anormal kotiledonlara sahip oldukları ve ileri gelişmedöneminde de anormallikler gösterdikleri saptanmıştır.

Hıyar, Kavun, Karpuz, Kabak türlerinde yani Cucurbitaceae familyasına ait bitki türlerinde ışınlanmışpolenlerle yapılan tozlamalar ve sunun sonucunda elde edilen haploid embriyoların kurtarılmasıişlemleri, Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümünde Prof. Dr. Kazım Abakdanışmanlığında yürütülen Doktora tezleri kapsamında başlatılmış, Prof.Dr.Nebahat Sarı, Prof.Dr.GülatÇağlar ve Prof.Dr.Saadet Büyükalaca ve onlar tarafından yetiştirilen bilim insanlarının da devametmesiyle genişleyerek kullanılmıştır. Bu konuda önemli çalışmalar yapılmış ve yayınlar hazırlanmıştır.Detaylı bilgilere ilgili hocaların web sitelerindeki yayın listelerinden ve Prof.Dr.Şebnem Ellialtıoğlu’nunweb sitesindeki kitap bölümünden ulaşılabilir.

III. Kabak (örnek olarak)Baktemur ve ark. (2010) Embriyoların daha kolay, hızlı, etkili şekilde ayrılması veçıkartılabilmesi için kullanılabilecek yöntemlerin karşılaştırıldığı bu çalışmada,kontrol uygulaması olarak “tohumların tek tek açılarak embriyoların kurtarılması”yöntemi kullanılmıştır. Bu yönteme alternatif olarak “tohumların hepsinindoğrudan besin ortamına ekimi”, “tohumlara ışıkta bakarak embriyolu tohumlarınayrılması” ve “tohumların hepsinin sıvı ortama ekimi” olmak üzere 3 yeni yöntemdenenmiştir.300 Gy gama ışınıyla ışınlanmış çiçek tozu kullanılarak 2008 yılının ilkbaharaylarında yapılan denemeler sonucunda, meyve başına elde edilen ortalamaembriyo sayıları tek tek açma yönteminde sonuçlar istatistiksel olarak önemliçıkmamıştır.Tohumların hepsinin sıvı ortama ekimi uygulamasında ise embriyo gelişimisağlanamamış ve yüksek oranda enfeksiyon sorunu meydana gelmiştir. Gereklisüre ile birlikte değerlendirildiğinde en iyi uygulamanın tohumların hepsinin besinortamına ekimi yöntemi olduğu görülmüştür.

IV.KiviPandey ve ark. (1990), yüksek düzeyde poliploidi gösteren kivide (Actinidiadeliciosa (A. chev) ışınlanmış polenlerle tozlama yaparak haploid bitkiler eldeetmeye çalışmışlardır.Tozlamalar Co 60 kaynaklı gama ışınının 0.5, 0.7 ve 0.9 kGray dozlarınınuygulandığı polenlerle gerçekleştirilmiştir.Işın uygulanan polenlerin normal olarak çimlendiği ve ovüle ulaştığı görülmüş,buna rağmen 0.5 ve 0.7 kGray dozda ışın uygulanmış polenlerle tozlananlardameyve tutumu % 88 olurken, 0.9 kGray'de bu oran % 76 olmuştur. 0.7 kGray'in enuygun doz olduğu saptanmıştır.Araştırıcılara göre; genotipler, haploid eldesi üzerinde hem polen kaynağı, hem deana ebeveyn olarak etkili olmuşlardır. Araştırma sonucu elde edilen toplam 416bitkinin % 79.8'i (332 adet) somatik kromozom sayısında (heksaploid) ve % 20.2'si(84 adet) gametik kromozom sayısında (triploid=polihaploid) bulunmuştur. 84 adethaploid bitkiden 31 adeti tam bitki olarak yaşamını sürdürmüştür.

SONUÇDihaploidizasyon tekniği, ıslah çalışmalarını hızlandıran çok önemlizaman kazancı ve hızlı saflaşma sağlayan bir tekniktir.Bunun yanında resesif özelliklerin ortaya çıkma şansını vermesibakımından da klasik ıslah yöntemlerine göre üstünlüklersağlamaktadır.Bu tekniğin tüm bitkilerde uygulanabilir hale getirilmesi içinçalışmalara devam edilmesi gerekmektedir.