opracowała dr A. Żylicz-Stachula I. ELEKTROFOREZA ...

migracji białek w żelu rozdzielającym w postaci ostrych prążków. Dodatkowym
zabiegiem pozwalającym na poprawienie jakości rozdziałów – uzyskanie ostrych
prążków jest naniesienie na górną krawędź żelu rozdzielającego wody nasączonej nbutanolem.
Na górną krawędź żelu rozdzielającego, przed wylaniem żelu
zagęszczającego, należy ostrożnie pipetą (tak aby nie spowodować zmieszania
niespolimeryzowanego akrylamidu) nakropić niewielką 0,1-0,5 ml ilość wody
nasączonej n-butanolem. Odetnie to dostęp powietrza do górnej krawędzi żelu
rozdzielającego, umożliwi jego pełna polimeryzację i zapewni ostry gradient pH. Ten
prosty zabieg wpływa w znacznym stopniu na poprawienie rozdzielczości rozdziałów
elektroforetycznych białek.
III. ELEKTROFOREZA POLIAKRYLAMIDOWA BIAŁEK W WARUNKACH
DENATURUJĄCYCH (SDS-PAGE).
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest użyteczną i powszechnie stosowaną
metodą rozdziału i charakterystyki białek. Jest to stosunkowo prosta i szybka
technika. Na jednym żelu można przeprowadzić jednocześnie analizę wielu próbek, a
rozdzielane białka można skutecznie wykrywać w żelu np. metodami barwienia,
immunoprecypitacji czy autoradiografii. Można więc stosować tę technikę na przykład
przy analizie białek we frakcjach zbieranych w trakcie rozdziału na kolumnie
chromatograficznej.
Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku polimeryzacji monomerów akrylamidowych
w długie łańcuchy, które następnie łączone są kowalencyjnie przez N,N’-metylenobis-akrylamid
(Rys. 2,3). Gęstość żelu zależy od całkowitego stężenia obu
składników, natomiast stopień usieciowania zależy od stężenia bis-akrylamidu.
Reakcja polimeryzacji jest inicjowana przez wolne rodniki dostarczone przez
N,N,N’,N’-czterometylo-etylenodwuaminę (TEMED) i stabilizowane przez
nadsiarczan amonu (Rys. 1). Polimeryzacja zachodzi bez dostępu tlenu, który jest
inhibitorem tej reakcji. Możliwa jest także fotopolimeryzacja, czynnikiem inicjującym
reakcję polimeryzacji jest wówczas UV.
Rys. 1 Chemiczne struktury związków stosowanych do przygotowania żeli poliakrylamidowych.
6