4. Oznaczanie zawartości związków fenolowych w materiale ...

4. Laboratorium przyrodnicze – Oznaczanie zawartości związków fenolowych w materiale roślinnym 

UNIWERSYTET GDAŃSKI 

Pracownia studencka 

Katedry Analizy Środowiska 

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych 

Ćwiczenie nr 4 

Oznaczanie zawartości związków 

fenolowych w materiale roślinnym metodą 

spektrofotometryczną 

LABORATORIUM PRZYRODNICZE 

Gdańsk, 2011 

1


I. Wprowadzenie 

1. Stres oksydacyjny w komórce i jego skutki 

Gdy odkryto w zdrowych organizmach wolne rodniki tlenowe, które powodują uszkodzenia 

komórek, zwłaszcza jądra i mitochondriów, okazało się, że tlen, pierwiastek niezbędny do życia, 

może być toksyczny. Wolne rodniki są to atomy lub cząsteczki mające na ostatniej powłoce 

(orbitalu walencyjnym) niesparowany elektron, co sprawia, że są niestabilne i bardzo reaktywne, 

zdolne do reakcji z różnorodnymi składnikami komórki. 

Reaktywne formy tlenu (RFT lub ang. ROS – reactive oxygen species) powstają jako 

uboczne i niepożądane produkty reakcji oksydacyjno-redukcyjnych zachodzących w procesie 

zwanym łańcuchem transportu elektronów czyli w łańcuchu oddechowym, dostarczającym 

organizmowi niezbędnej energii. Powstają podczas procesu autooksydacji wielu związków, 

zwłaszcza lipidów, podczas licznych reakcji enzymatycznych a także w czasie procesów 

fagocytozy. Najważniejszymi reaktywnymi formami tlenu są: tlen cząsteczkowy (słabo reaktywny, 

zwiększający swą reaktywność pod wpływem jonów żelaza i miedzi); tlen singletowy (1O2); 

anionorodnik ponadtlenkowy (O2 .- ), powstający w wyniku przeniesienia elektronu na tlen 

cząsteczkowy; nadtlenek wodoru (H2O2), powstający w wyniku redukcji tlenu cząsteczkowego; 

rodnik hydroksylowy (HO·); tlenek azotu (NO·); anion kwasu nadtlenoazotawego (ONOO-); rodniki 

alkoksylowe (RO·, ROO·). W warunkach homeostazy zachowana jest równowaga między 

szybkością wytwarzania i rozpadu RFT. Równowagę tę zapewniają systemy antyoksydacyjne 

wewnątrz i zewnątrzkomórkowe, chroniące komórkę przed szkodliwymi formami tlenu. W skład 

systemów antyoksydacyjnych wchodzą substancje zwane antyoksydantami (przeciwutleniaczami). 

Są to substancje, które w niskich stężeniach w porównaniu do utlenianego substratu, opóźniają 

lub hamują jego utlenianie. Działanie antyoksydantów może być: 

o prewencyjne, polegające na powstrzymywaniu tworzenia RFT, a w szczególności 

powstawania najbardziej reaktywnego rodnika wodorotlenowego. Prewencyjnie działają 

dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza glutationowa, albuminy, transferryna, 

laktoferryna, ceruloplazmina, haptoglobina i hemopeksyna; 

o interwencyjne, polegające na przerywaniu reakcji wolnorodnikowych lub ukierunkowanie 

terminacji poprzez wchodzenie w reakcje z RFT. Do przeciwutleniaczy interwencyjnych 

należą glutation, askorbinian, kwas moczowy, kreatynina, bilirubina, tokoferole, 

karotenoidy, ubihydrochinon-koenzym Q, pochodne estronu i estradiolu; 

o reparacyjne, polegające na usuwaniu skutków reakcji RFT z DNA i białkami. Reperacyjne 

działanie wykazują ligazy, glikolazy, tioredoksyna i proteazy. 

2


Zaburzenia prawidłowego przebiegu procesów redukcyjno-oksydacyjnych komórki prowadzą 

do zwiększonego wytwarzania RFT. Sytuacja taka może być powodowana różnymi zjawiskami 

patologicznymi, jak niedotlenienie, wirusowe czy bakteryjne stany zapalne, hiperglikemia i inne. 

Reaktywne formy tlenu powstają również pod wpływem zewnętrznych czynników, takich jak 

promieniowanie jonizujące, ultradźwięki, promieniowanie ultrafioletowe, oddziaływanie 

ksenobiotyków, podwyższona temperatura, zanieczyszczenia śladami metali (szczególnie żelazem i 

miedzią), barwniki naturalne (chlorofil, mioglobina, hemoglobina), produkty utleniania innych 

związków (zwłaszcza nadtlenki i inne rodniki). Nasilenie szybkości wytwarzania RFT lub/i 

upośledzenie mechanizmów antyoksydacyjnych prowadzą do tzw. stresu oksydacyjnego. 

Stres oksydacyjny definiuje się jako zaburzenie równowagi prooksydacyjno- 

antyoksydacyjnej w kierunku reakcji utleniania. Najistotniejsze zaburzenia w komórce to 

peroksydacja lipidów wchodzących w skład fosfolipidów błon komórkowych i mitochondrialnych, 

prowadząca do powstawania uszkodzonych cząstek lipidów oraz końcowych produktów utleniania 

– aldehydów. Aldehydy powodują zaburzenie struktury błony komórkowej, jej depolaryzację, utratę 

integralności oraz rozprzężenie fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach, co prowadzi do 

śmierci komórki. Poza tym aldehydy hamują działanie wielu enzymów, co prowadzi do hamowania 

replikacji DNA, transkrypcji, pękania nici DNA i również śmierci komórki. Stres oksydacyjny jest 

istotnym czynnikiem etiopatologicznym procesu starzenia oraz wielu chorób ogólnoustrojowych. 

Do najważniejszych należą: miażdżyca naczyń i jej powikłania, cukrzyca, choroba Alzheimera, 

choroba Parkinsona, stwardnienie rozsiane, schizofrenia, nowotwory, reumatoidalne zapalenie 

stawów, astma, choroba popromienna, porfirie, zapalenie kłębuszków nerkowych, zapalenie naczyń 

krwionośnych, AIDS, choroba wrzodowa, choroba alkoholowa i inne. Organizm ludzki jest 

narażony na wiele czynników indukujących stres oksydacyjny. Nieodpowiednia dieta, niewłaściwe 

przyrządzanie i przechowywanie żywności, zanieczyszczenie środowiska to powody dostarczania 

organizmowi wielu ksenobiotyków i wolnych rodników. Wszechobecna mechanizacja i technika 

sprawia, że źródeł wolnych rodników przybywa. Mogą one powstać podczas wielu chemicznych 

procesów, np. przy wytwarzaniu powszechnie stosowanych mas plastycznych, wskutek reakcji 

tlenu z paliwem napędowym podczas pracy silników, w czasie tworzenia smogu. Coraz częściej też 

jesteśmy narażeni na działanie takich szkodliwych czynników jak promieniowanie jonizujące, 

ultradźwięki, promieniowanie ultrafioletowe. 

3


2. Naturalne antyoksydanty polifenolowe 

2.1. Właściwości antyoksydacyjne związków fenolowych 

Antyoksydacyjne właściwości posiadają związki zawierające grupę -OH, która redukuje 

wolne rodniki. Związki fenolowe (grupa hydroksylowa związana z pierścieniem aromatycznym o 

właściwościach kwasowych) wykazują szczególne właściwości antyoksydacyjne: łatwo 

wychwytują rodnik a powstały wolny rodnik fenolowy jest na tyle stabilny (delokalizacja rodnika 

na skutek rezonansu), że nie jest w stanie oderwać atomu wodoru z cząsteczki kwasu tłuszczowego. 

C6H5-OH + R·→ C6H5O· + RH 

Polifenole są związkami organicznymi zawierającymi przynajmniej dwie grupy hydroksylowe 

przyłączone do pierścienia aromatycznego. Są grupą związków o bardzo zróżnicowanej budowie i 

właściwościach. 

Działanie przeciwutleniające związków fenolowych zachodzi wg różnorodnych mechanizmów: 

o mogą oddawać elektron lub atom wodoru (wł. redukujące), 

o mogą stabilizować i delokalizować niesparowany elektron, 

o mogą chelatować jony metali enzymów katalizujących reakcje utleniania, 

o mogą być inhibitorem oksydaz, 

o mogą być terminatorem przerywającym łańcuchowe reakcje rodnikowe, 

o mogą być stabilizatorem wolnych rodników, powstających w reakcjach oksydacyjnych. 

Wynikające z mechanizmów działania właściwości antyoksydacyjne związków fenolowych 

polegają na: 

o eliminowaniu reaktywnych form tlenu przez bezpośrednią reakcję z wolnymi rodnikami, 

przez blokowanie (zmiatanie) wolnych rodników (najczęściej nadtlenkowych, 

hydroksylowych i hydroksynadtlenkowych), przez nasilenie dysmutacji wolnych rodników 

do związków o znacznie mniejszej reaktywności, 

o hamowaniu lub wzmacnianiu działania wielu enzymów, np. inhibicji enzymów z grupy 

oksydaz, podnoszenie ekspresji antyoksydacyjnych białek, takich jak katalazy (CAT) i 

dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), 

o chelatowaniu jonów metali prooksydacyjnych (np. żelaza, miedzi), 

o wzmacnianiu działania innych antyoksydantów np. przywracają z rodnikowej pierwotną 

postać tokoferoli, przedłużają działanie kwasu askorbinowego. 

4


2.2. Właściwości biologiczne naturalnych związków fenolowych. 

Działanie związków fenolowych sprawia, że pełnią one funkcje biologiczne i mają 

pozytywny wpływ na ludzkie zdrowie. Wśród właściwości leczniczych poszczególnych polifenoli 

wymienia się kilka głównych, które zostały udowodnione w różnych badaniach na zwierzętach i w 

badaniach statystycznych: 

1. Ochrona organizmu przed kancerogenami, mutagenami i chorobami nowotworowymi, 

udział w leczeniu raka. 

2. Zapobieganie schorzeniom układu sercowo-naczyniowego, w tym hamowanie procesu 

prowadzącego do miażdżycy. 

3. Zapobieganie i leczenie infekcji, alergii i chorób przewodu pokarmowego. 

4. Pobudzanie wydzielania estrogenów w organizmie kobiety. 

2.3. Występowanie naturalnych polifenoli 

Naturalne antyoksydanty polifenolowe to związki o różnej strukturze i właściwościach 

(Rys. 1). Produkowane są przez niektóre rośliny w odpowiedzi na stres, uszkodzenie, infekcję 

grzybową lub promieniowanie ultrafioletowe(UV). Na te związki, w technologii żywności, zwraca 

się w ostatnich latach szczególną uwagę. Występują powszechnie w roślinach, zwłaszcza w 

liściach, tkankach kwiatowych i zdrewniałych częściach, jak łodygi i kora, w mniejszym stężeniu w 

owocach, nasionach. Do roślinnych związków fenolowych należą: flawonoidy, taniny 

(skondensowane i łatwo hydrolizujące), kwasy fenolowe, stilbenoidy (np. resweratrol), lignany, 

ligniny i inne. Jednym ze źródeł kwasów fenolowych są ziarniaki zbóż. Na przykład, w ziarnie 

jęczmienia jest ok.0,5 g/kg kwasu ferulowego, ok. 100 mg/kg kwasu wanilinowego, ok. 30 mg/kg 

kwasu p-kumarowego i ok.20 mg/kg kwasu kawowego W winogronach występują trzy grupy 

flawonoidów (czerwone antocyjaniny, flawonole, flawan-3-ole), oligomeryczne proantocyjanidyny 

i polimeryczne skondensowane taniny, kwasy fenolowe (galusowy, hydroksycynamonowy, 

hydroksybenzoesowy) i stilbenoidy. Stilbenoidów w winorośli jest mniej niż innych związków 

fenolowych jak np. flawonoidów. Podobnie jak ciemne owoce, ciemne warzywa, takie jak 

czerwona kapusta, czerwona cebula, czarna fasola, bakłażan są również dobrym źródłem 

antocyjanów, stilbenoidów i innych związków fenolowych. Związki fenolowe we wszystkich 

warzywach występują w naziemnych częściach roślin, jedynym wyjątkiem jest cebula, która w 

części podziemnej zawiera duże ilości polifenoli, głównie kwercetyny. 

5


resweratrol 

Rys. 1. Struktury chemiczne wybranych związków fenolowych 

2.4. Oznaczanie całkowitej zawartości związków fenolowych metodą Folina-Ciocalteau (F-C) 

Oznaczanie całkowitej zawartości związków fenolowych przeprowadza się metodami 

kolorymetrycznymi, z których najczęściej stosowaną jest metoda Folina-Ciocalteau (F-C). 

Podstawą oznaczania jest odwracalna reakcja redukcji przez fenole w środowisku alkalicznym 

molibdenu(VI) do molibdenu(V) zawartego w odczynniku Folina-Ciocalteau (F-C). W wyniku 

reakcji powstaje niebieski związek, który wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali 745 - 

750 nm. Intensywność absorpcji przy tej długości fali jest proporcjonalna do stężenia fenoli. 

Odczynnik F-C przygotowuje się z mieszaniny wolframianu sodu (Na2WO4), molibdenianu sodu 

(Na2MoO4), siarczanu litu (Li2SO4), wody bromowej i stężonych kwasów solnego i fosforowego. 

Struktura powstającego związku nie jest znana, przypuszcza się, że powstaje 

heteropolifosfowolframian molibdenu. 

Na2WO4/Na2MoO4 + fenol →(fenol-MoW11O40) -4 

Mo(VI) (żółty) + ē→ Mo(V) (niebieski) 

Mechanizm reakcji polega na przenoszeniu elektronu. Do reakcji potrzebne jest alkaliczne 

środowisko (pH 10), w którym powstaje anion fenolanowy redukujący molibden. Niebieski 

barwnik powstaje w reakcji odczynnika F-C z fenolami niezależnie od ich struktury.W 1965 r 

Singleton i Rossi zmodyfikowali tę metodę, stosując mieszaninę tlenków tungstenu i molibdenu: 

3H2O - P2O5 - 13WO3 - 5MoO3 - 10H2O 

i 3H2O - P2O5 - 14WO3 - 4MoO3 - 10H2O 

kwercetyna 

6


Mieszanina tlenków utlenia fenole bardziej specyficznie, dając produkt reakcji wykazujący 

maksimum absorpcji przy λmax 765 nm. Interferencje w tej metodzie mogą powodować różne, 

niefenolowe związki, jak cukry redukujące, aromatyczne aminy, ditlenek siarki, kwas askorbinowy, 

sorbowy, Fe(II) i inne i powinny być brane pod uwagę, ewentualnie usuwane wcześniej z badanej 

próbki. 

Dla uzyskania wiarygodności wyników pomiarów należy zachować następujące warunki, które są 

krytyczne w tej metodzie: 

1. Należy zachować odpowiedni stosunek ilościowy zasady do odczynnika F - C. 

2. Zoptymalizować czas i temperaturę reakcji dla uzyskania właściwej barwy i trwałości produktu. 

3. Mierzyć absorbancję przy długości fali 765 nm. 

4. Używać kwasu galusowego jako fenolowego standardowego odniesienia. 

Dla uzyskania środowiska alkalicznego stosuje się nasycony roztwór bezwodnego węglanu 

sodu. Próbkę o odpowiednim rozcieńczeniu miesza się z odczynnikiem F - C i po 30s, ale przed 

upływem 8 min, dodaje się nasyconego roztworu Na2CO3. Próbkę inkubuje się w temperaturze 

40ºC przez 30 min, po czym wykonuje pomiar absorbancji. Przy temperaturze pokojowej, czas 

inkubacji wydłuża się do 2 godzin. Zalecana proporcja objętości nasyconego roztworu Na2CO3 i 

odczynnika F-C wynosi 3:1. Kwas galusowy jest rekomendowany jako standard z wielu powodów. 

Stosowanie go jako pojedynczego standardu ułatwia porównywanie danych. Otrzymanie kwasu 

galusowego w postaci czystej nie jest drogie a przechowywany jako substancja sucha jest trwały. W 

roztworze alkoholowo-wodnym przechowywany w lodówce jest trwały przez 2 tygodnie. Metoda 

Folina- Ciocalteau jest stosowana w analizie ekstraktów roślinnych, żywności, również leków 

zawierających grupy fenolowe, jak salbutamol czy morfina. 

3. Spektrofotometria UV/Vis 

3.1. Wprowadzenie 

W metodach spektroskopowych sygnał analityczny powstaje w wyniku oddziaływania 

promieniowania elektromagnetycznego lub korpuskularnego na badana próbkę. Promieniowanie 

elektromagnetyczne zachodzi wskutek okresowych zmian pola elektromagnetycznego 

rozchodzących się w przestrzeni ze skończoną prędkością i związanych z przenoszeniem energii. 

Promieniowanie elektromagnetyczne składa się z fotonów, czyli kwantów promieniowania 

(kwantów energii). Charakterystyczną ich własnością jest energia: 

gdzie: E - energia fotonu wyrażona w jednostkach energii (zgodnie z układem SI w dżulach, poprzednio w ergach lub w 

kaloriach: 1J = 107 erg = 0,2389 cal); 

7


h - stała uniwersalna Plancka - 6,626.10-34 J.s (6,626.10-27erg.s, 1,583.10-34 cal.s); 

γ - częstotliwość drgań promieniowania emitowanego lub absorbowanego, wyrażona w hercach (Hz). 

Promieniowanie elektromagnetyczne określa się także przy pomocy długości fali 

gdzie: c - prędkość światła w próżni (3.108 m/s). 

Wzory przedstawione powyżej można przekształcić: 

Spektroskopia molekularna (cząsteczkowa) obejmuje badanie widm cząsteczkowych. 

W ogólnym pojęciu widma cząsteczkowego są zawarte trzy rodzaje widm promieniowania 

elektromagnetycznego: widmo rotacyjne, widmo oscylacyjno-rotacyjne oraz 

elektronowooscylacyjno-rotacyjne danej cząsteczki. Całkowitą energię cząsteczki E można zatem 

przedstawić jako sumę trzech składników odpowiadających trzem rodzajom ruchu w cząsteczce: 

E = Ee + Eos + Erot 

gdzie: Ee - energia elektronowa (związana z ruchem elektronów), 

Eos - energia oscylacyjna (związana z ruchem oscylacyjnym), 

Erot - energia rotacyjna (związana z ruchem rotacyjnym). 

Energia elektronowa w cząsteczce (wartość podobna jak w atomie) jest wielokrotnie 

większa od energii oscylacyjnej, a ta z kolei jest większa od energii rotacyjnej. Różnice pomiędzy 

poziomami elektronowymi wynoszą kilka elektronowoltów, pomiędzy poziomami oscylacyjnymi 

dziesiąte i setne części eV, a pomiędzy poziomami rotacyjnymi tysięczne części eV. Stosunek 

wartości poszczególnych rodzajów energii jest w przybliżeniu następujący: 

Ee : Eos : Erot = 1000 : 10 : 1 

Znaczne różnice wartości poszczególnych rodzajów energii powodują, że odpowiednie 

widma pojawiają się w różnych zakresach spektralnych. Pochłonięcie kwantów promieniowania z 

zakresu dalekiej podczerwieni jako najmniej energetycznego może powodować tylko zmiany 

energii rotacji; powstaje wtedy widmo rotacyjne. Zaabsorbowana energia nie wystarcza do zmiany 

energii oscylacji i energii elektronowej. Promieniowanie z zakresu bliskiej podczerwieni, o 

większej energii, powoduje przejścia pomiędzy poziomami oscylacyjnymi. Ponieważ zmianom 

8


energii oscylacyjnej towarzyszą zmiany energii rotacyjnej, powstają widma oscylacyjno-rotacyjne. 

Zmiany energii elektronowej może wywołać tylko zaabsorbowanie promieniowania z zakresu 

widzialnego i nadfioletu. Ponieważ zmianom tej energii towarzyszą zazwyczaj zmiany energii 

oscylacyjnej i rotacyjnej, powstaje widmo elektronowo-oscylacyjno-rotacyjne (Rys. 2). 

Rys. 2. Schemat przejść elektronowych, oscylacyjnych i rotacyjnych w cząsteczce dwuatomowej. E - poziomy 

elektronowe, v- poziomy oscylacyjne, I - poziomy rotacyjne, a - przejścia elektronowe, b - przejścia oscylacyjne, c 

- przejścia rotacyjne 

3.2. Prawa absorpcji 

Promieniowanie elektromagnetyczne, przechodząc przez roztwór, może ulegać: absorpcji, 

odbiciu i rozproszeniu. Natężenie wiązki padającej wyraża się wzorem: 

Io = Ia + It + Ir 

gdzie: Ia - natężenie promieniowania zaabsorbowanego przez roztwór, 

It - natężenie promieniowania przechodzącego przez roztwór, 

Ir -natężenie promieniowania odbitego i rozproszonego. 

Ponieważ pomiary absorpcji promieniowania wykonuje się najczęściej w stosunku do 

roztworu porównawczego (odnośnika), którego skład powinien być zbliżony do składu próbki i 

który znajduje się w identycznych kuwetach, promieniowanie odbite i rozproszone (Ir) w obu 

przypadkach jest jednakowe i może być pominięte. Roztwór odnośnika w warunkach pomiaru nie 

absorbuje promieniowania, gdyż nie zawiera substancji oznaczanej i można przyjąć, że natężenie 

wiązki promieniowania przechodzącej przez roztwór odnośnika jest równe natężeniu wiązki 

padającej na roztwór badanej próbki. Stosunek natężenia promieniowania przechodzącego przez 

próbkę (It) do natężenia promieniowania padającego na próbkę (Ia) (równego natężeniu 

promieniowania przechodzącego przez odnośnik), nazywamy transmitancją lub przepuszczalnością 

i oznaczamy 

9


Transmitancję najczęściej wyrażamy w procentach 

Może ona przybierać wartości od 0% do 100%. 

Natężenie promieniowania zaabsorbowanego zależy od stężenia roztworu i od grubości warstwy 

absorbującej. Matematycznie zależność tę opisuje prawo Lamberta-Beera, które w postaci 

logarytmicznej przyjmuje postać 

Logarytm dziesiętny stosunku natężenia wiązki promieniowania padającego na badaną próbkę (Io) 

do natężenia wiązki promieniowania przechodzącego przez badaną próbkę (It) nazywany jest 

absorbancją. Przyjmuje ona wartości z przedziału od 0 do nieskończoności. 

Gdy stężenie roztworu jest wyrażone w mol/l, a grubość warstwy jest wyrażona w cm, 

współczynnik proporcjonalności k nosi nazwę molowego współczynnika absorpcji (e). Wzór 

przyjmuje wówczas postać: 

Jest to podstawowe prawo spektrofotometrii absorpcyjnej. 

Zależność między absorbancją a transmitancją wyraża zależność: 

lub gdy transmitancja jest wyrażona w procentach 

Zależność odwrotną tj. transmitancji od absorbancji wyraża wzór 

Jeżeli w badanym roztworze znajduje się kilka składników, oznaczanie spektrofotometryczne 

można wykonać poprawnie tylko wtedy, gdy spełnione jest prawo addytywności absorbancji, wg 

którego absorbancja mieszaniny jest równa sumie absorbancji poszczególnych składników, a 

absorbancja pojedynczego składnika jest taka, jakby tylko on jeden znajdował się w badanej 

próbce. Matematycznie prawo to określają następujące wzory: 

10


gdzie: A - absorbancja mieszaniny, 

A1, A 2, An - absorbancje poszczególnych składników, 

c1, c2 , cn - stężenia molowe poszczególnych składników, 

ε1, ε2, εn - molowe współczynniki absorpcji poszczególnych składników. 

3.3. Aparatura 

Do pomiarów absorpcji służą spektrofotometry. Na Rys. 3 przedstawiono blokowy schemat 

spektrofotometru. 

Rys. 3. Blokowy schemat spektrofotometru optycznego: Z - źródło promieniowania ciągłego, M -monochromator, 

K - kuweta z badanym roztworem, Ko - kuweta z rozpuszczalnikiem (odnośnik), D – układ detektora, R - 

rejestrator, P- synchroniczny przesuw taśmy rejestratora i bębna monochromatora 

Źródło Z wysyła ciągłe promieniowanie elektromagnetyczne. Wyodrębniona przez 

monochromator M monochromatyczna wiązka promieniowania przechodzi na przemian przez 

kuwetę K z badaną substancją i przez identyczną kuwetę porównawcza Ko (z odnośnikiem). Kuweta 

Ko w przypadku pomiarów absorpcji roztworów jest wypełniona ta samą cieczą, w której 

rozpuszczono substancję badaną. W niektórych przyrządach (tzw. spektrofotometry dwuwiązkowe) 

promieniowanie wychodzące z monochromatora jest dzielone na dwie wiązki o jednakowym 

natężeniu, z których jedna przechodzi przez K a druga, jednocześnie, przez Ko. W obu przypadkach, 

w układzie detektora D, następuje pomiar natężenia wiązki, która przeszła przez kuwetę K (Ip) i 

przechodzącej prze kuwetę Ko (Io). Rejestrator R kreśli widmo absorpcyjne badanej substancji w 

postaci krzywej A = f(λ). 

Czułość metody definiuje się jako najmniejsze oznaczalne stężenie substancji lub 

najmniejsza różnica w stężeniach substancji, którą można oznaczyć za pomocą danej metody. Dla 

metod spektrofotometrycznych obiektywnym, liczbowym wyrażeniem czułości jest molowy 

współczynnik absorpcji (ε). Molowy współczynnik absorpcji nie może przekroczyć wartości 1,5.10 5 

(ta wartość wynika z teorii). Najmniejsze stężenie substancji (mol/l) oznaczalne 

spektrofotometrycznie można obliczyć ze wzoru Lamberta-Beera. Przy założeniu, że A = 0,02 

11


(minimalna absorbancja, którą można zmierzyć), l = 2 cm (grubość kuwety), ε = 104 (molowy 

współczynnik absorpcji średnio czułej metody spektrofotometrycznej). 

Jeśli przyjąć masę molową substancji jako przykładowo równą 200 g/mol to minimalne oznaczalne 

stężenie tej substancji (dla średnio czułej metody, ε = 104, i klasycznego spektrofotometru) 

wyniesie: 

3.4. Metoda krzywej kalibracyjnej 

W przeważającej części metod detekcji mierzony parametr jest funkcją liniową stężenia analitu: 

Y = ac + b 

gdzie: Y - wielkość mierzona, c – stężenie analitu, a – współczynnik proporcjonalności, a = BC/AB 

= tg α, b – wartość stała, jest często wartością eksperymentalną ślepej próby, którą można 

przedstawić graficznie (Rys. 4a) 

Rys. 4a. Krzywa kalibracyjna Y = ac + b 

Współczynnik proporcjonalności a określa czułość metody; im większe zmiany wartości mierzonej 

Y na jednostkę stężenia c, tym większa jego wartość i tym wyższa czułość metody. Metody o 

małym kącie nachylenia krzywych kalibracyjnych nie są przydatne do celów analitycznych. 

Parametr b może przyjmować wartości dodatnie, ujemne lub zero. W metodzie krzywej 

kalibracyjnej przygotowuje się szereg roztworów o znanych stężeniach substancji analizowanych 

oraz tzw. ślepą próbę – roztwór, w którym są wszystkie składniki roztworów wzorcowych z 

wyjątkiem analitu i dla każdego roztworu mierzy się wartość Y. Zależność Y od c wzorców 

wykreśla się (Rys. 4b) lub wylicza równanie prostej. Wartość Y mierzy się również dla próbki 

badanej, nanosi na krzywą kalibracyjną i odczytuje stężenie lub oblicza z równania prostej. 

12


Rys. 4b. Krzywa kalibracyjna Y = a c 

II. Wykonanie ćwiczenia 

1. Cel ćwiczenia 

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodami izolacji związków wrażliwych na działanie 

temperatury, tlenu i promieniowania UV, jakimi są polifenole; oznaczania całkowitej zawartości 

związków fenolowych w surowcach i produktach roślinnych metodami spektroskopowymi. 

Wykonanie ćwiczenia polega na ekstrakcji rozpuszczalnikowej (wspomaganej ultradźwiękami) 

związków fenolowych z czterech surowców roślinnych: kasza gryczana, wytłoki z winogron 

czerwonych, czerwona kapusta (świeża), czerwona cebula (świeża). W otrzymanych ekstraktach 

należy oznaczyć sumaryczną zawartość związków fenolowych metodą spektrofotometryczną z 

odczynnikiem Folina-Ciocalteu'a (F-C). Wynik oznaczeń ilościowych należy przedstawić w 

przeliczeniu na zawartość kwasu galusowego na masę surowca (mg/g). W tym celu należy 

przeprowadzić reakcję kwasu galusowego (roztwory kalibracyjne o różnych stężeniach) 

z odczynnikiem F-C i wykonać krzywą kalibracyjną. 

1.1. Odczynniki 

1. Nasycony roztwór węglanu sodu Na2CO3 (studenci otrzymują gotowy) 

200 g Na2CO3 rozpuścić w 800 ml wody i podgrzać do wrzenia. Po wystudzeniu dodać kilka 

kryształków węglanu sodu i po 24 godz. przesączyć do kolby miarowej i uzupełnić wodą do 1 l. 

2. Odczynnik Folina-Ciocalteu'a. 

3. Kwas galusowy. 

4. Alkohol etylowy 96%. 

5. Alkohol metylowy destylowany. 

6. Kwas octowy. 

7. Woda destylowana. 

13


1.2. Ekstrakcja 

W czasie ekstrakcji i innych etapów izolacji polifenoli należy chronić próbkę przed 

działaniem światła i tlenu. Naczynia należy osłaniać folią aluminiową, jeśli to możliwe, czynności 

wykonywać bez dostępu światła. Ekstrakcję i hydrolizę wykonywać w atmosferze gazu obojętnego, 

np. azotu. Przechowywać ekstrakty w ciemności, najlepiej w temperaturze -20ºC. 

Ekstrakcja kaszy gryczanej 

Około 100 mg rozdrobnionej (na mąkę) kaszy gryczanej odważyć z dokładnością do 0,5 mg 

do naczynka zakręcanego o pojemności 4 ml, dodać 1 ml 1% roztworu kwasu octowego w 

metanolu, przestrzeń nad cieczą przedmuchać azotem i zamknąć naczynko. Zawinąć naczynko folią 

aluminiową i wstawić do łaźni lodowo-wodnej. Całość umieścić w łaźni ultradźwiękowej 

i ekstrahować przez 3 min. Po 3 min sprawdzić, czy w łaźni znajduje się lód, jeśli brak, uzupełnić i 

ekstrahować następne 3 min. Próbkę z ekstraktem pozostawić do dekantacji w ciemności. 

Ekstrakcja skórek i nasion winogron czerwonych 

Skórki i nasiona owoców czerwonych winogron oddzielono w sokowirówce a następnie zliofilizowano, 

zabezpieczając przed światłem. Do czasu analizy przechowywano w temperaturze -20ºC . 

Około 20 mg rozdrobnionego liofilizatu odważyć z dokładnością do 0,5 mg w naczynku 

zakręcanym o pojemności 4 ml, dodać 1 ml 1% roztworu kwasu octowego w metanolu, przestrzeń 

nad cieczą przedmuchać azotem i zamknąć naczynko. Zawinąć naczynko folią aluminiową i 

wstawić do łaźni lodowo-wodnej. Całość umieścić w łaźni ultradźwiękowej i ekstrahować przez 

3 min. Po 3 min sprawdzić, czy w łaźni znajduje się lód, jeśli brak, uzupełnić i ekstrahować 

następne 3 min. Próbkę z ekstraktem pozostawić do dekantacji w ciemności. 

Ekstrakcja czerwonej kapusty i czerwonej cebuli 

Około 100 mg rozdrobnionej (posiekanej lub rozgniecionej) czerwonej cebuli (kapusty) odważyć z 

dokładnością do 0,5 mg w naczynku zakręcanym, dodać 1 ml metanolu zawierającego 1% kwasu 

octowego, usunąć powietrze z naczynka azotem i zamknąć. Zawinąć naczynko folią aluminiową i 

wstawić do łaźni lodowo-wodnej. Całość umieścić w łaźni ultradźwiękowej i ekstrahować przez 

3 min. Po 3 min sprawdzić, czy w łaźni znajduje się lód, jeśli brak, uzupełnić i ekstrahować 

następne 3 min. Próbkę z ekstraktem pozostawić do dekantacji w ciemności. 

Szkło i sprzęt laboratoryjny do p.1.2: 4 naczynka zakręcane o pojemności 4 ml, moździerz 

porcelanowy, łopatka dentystyczna, pipety miarowe o pojemności 0,1 ml; 1 ml, folia aluminiowa, 

14


naczynie na łaźnię lodowo-wodną. 

1.3. Oznaczanie całkowitej zawartości fenoli metodą Folina-Ciocalteu'a (F-C) 

Ekstrakty z badanych surowców po zdekantowaniu nadają się do oznaczania fenoli. 

Wykonanie krzywej kalibracyjnej dla roztworu wzorca - kwasu galusowego 

a) Przygotowanie wzorcowego roztworu kwasu galusowego: 5 mg kwasu galusowego odważyć w 

naczynku zakręcanym, rozpuścić w 100 µl etanolu, następnie dodać 900 µl wody, wymieszać i 

zamknąć. 

Szkło i sprzęt laboratoryjny do p. 1.3.a: 1 naczynko zakręcane o poj. 4 ml, łopatka dentystyczna, 

pipeta miarowa o poj. 0,1 ml, pipeta miarowa o poj.1 ml. 

b) Przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń roztworu kwasu galusowego, dla uzyskania 

roztworów kalibracyjnych o stężeniach: 

0; 0,05; 0,15; 0,25; 0,35 i 0,50 mg/ml. 

W tym celu do naczynek o poj. 4 ml umieścić odpowiednie objętości roztworu wzorcowego 

kwasu galusowego a następnie dodać tyle destylowanej wody, by całkowita objętość każdego 

roztworu kalibracyjnego roztworu wynosiła 1 ml. 

c) Do osobnych naczynek (o poj. 4 ml) pobrać po 20 µl z każdego roztworu kalibracyjnego, 

dodać po 1,58 ml wody, następnie po 100 µl odczynnika Folina- Ciocalteu'a, dobrze wymieszać i 

pozostawić na czas min 0,5 min do maks. 8,0 min, następnie dodać po 300 µl nasyconego roztworu 

węglanu sodu, wymieszać i wstawić do termostatu ustawionego na 40ºC na 30 min (do uzyskania 

trwałego, charakterystycznego, niebieskiego koloru). Mierzyć absorbancję przy 765 i 735 nm 

wobec ślepej próby (0 µl roztworu kwasu galusowego). 

Szkło i sprzęt laboratoryjny do p. 1.3.b i 1.3.c: 12 naczynek zakręcanych o poj. 4 ml, pipeta 

miarowa o poj. 0,1 ml, pipeta miarowa o poj.1 ml, pipeta miarowa o poj.2 ml. 

d) Pomiar absorbancji badanych ekstraktów 

Do osobnych naczynek (o poj. 4 ml) pobrać po 20 µl z roztworu każdego badanego ekstraktu, 

dodać po 1,58 ml destylowanej wody, następnie po 100 µl odczynnika Folina - Ciocalteu'a, dobrze 

wymieszać i pozostawić na 0,5 do 8,0 min, następnie dodać po 300 µl roztworu węglanu sodu i 

15


wstawić do termostatu, ustawionego na 40ºC na 30 min (do uzyskania trwałego, 

charakterystycznego niebieskiego koloru). Mierzyć absorbancję przy 765 i 735 nm. 

Szkło i sprzęt laboratoryjny do 1.3.d: 4 naczynka zakręcane o poj.4 ml, pipeta miarowa o poj. 

0,1 ml, pipeta miarowa o poj.1 ml, pipeta miarowa o poj.2 ml. 

2. Wykreślić krzywą kalibracyjną A = f(c kwasu galusowego[mg/ml]) 

3. Odczytać z krzywej kalibracyjnej stężenie kwasu galusowego odpowiadające absorbancji 

badanej próbki i obliczyć całkowitą zawartość polifenoli w mg/g próbki w przeliczeniu 

na kwas galusowy. 

4. Porównać ilości polifenoli w badanych surowcach z danymi opublikowanymi, 

np. w internecie, i przeprowadzić dyskusję na temat możliwości przeciwutleniających 

badanych próbek. 

5. Sprawozdanie z wykonanego ćwiczenia powinno obejmować: 

- 0,5 stronicowy wstęp teoretyczny obejmujący zagadnienia wyszczególnione w wymaganiach, 

- schemat wykonania ćwiczenia, 

- uzyskane wyniki wg punktów 2, 3 i 4. 

16

4. Oznaczanie zawartości związków fenolowych w materiale ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?