opracowała dr A. Żylicz-Stachula I. ELEKTROFOREZA ...

cząsteczek bardzo dużych (rzędu 100 kDa), stosuje się żele o bardzo niskim
stężeniu akrylamidu, nawet 2.5%. Do rozdziału bardzo małych białek (m.cz. rzędu
2000 Da) używa się żeli zawierających 20% a nawet 30% akrylamidu. Ze wzrostem
czynnika sieciującego wielkość porów również maleje; stężenie to decyduje także o
własnościach mechanicznych żelu, jego elastyczności i przejrzystości.
Żel poliakrylamidowy może być formowany w rurkach lub jako żel płytowy o grubości
najczęściej 0.75-1.5 mm. Ze względu na możliwość naniesienia jednocześnie na
jeden żel wielu próbek, obecnie preferowana jest forma płytowa. Najczęściej stosuje
się elektroforezę w tzw. żelu nieciągłym, w którym próbkę nanosi się na żel
zagęszczający (o dużych porach) spolimeryzowany na wierzchu żelu rozdzielającego
(o małych porach). W tej technice bufor używany jako bufor elektrodowy oraz bufory
wchodzące w skład obu żeli różnią się składem i pH. Zaletą tego systemu jest
koncentracja białek podczas wędrówki przez żel zagęszczający, co powoduje, że
niezależnie od objętości próbki białka wchodzą w żel rozdzielający w postaci
wąskiego, zatężonego pasma.
Użycie anionowego detergentu soli sodowej kwasu dodecylosiarkowego (SDS – ang.
Sodium Dodecyl Sulfate) pozwala na rozdział elektroforetytczny białek zgodnie z ich
masą cząsteczkową. Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i
denaturacji w obecności SDS, który łączy się z białkami specyficznie w stosunku
masowym 4,1:1. Zapewnia to przejęcie przez białko ujemnego ładunku elektrycznego
netto o stałej gęstości bez względu na jego długość. Dla całkowitego rozwinięcia
polipeptydu, zapewnienia mu pierwszorzędowej struktury, niezbędne jest dodatkowo
zniszczenie mostków dwusiarczkowych (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol).
Opłaszczenie białka przez SDS oraz redukcja mostków dwusiarczkowych pozwala
na separację białek w żelu poliakrylamidowym ze względu na ich wielkość, a zatem
pośrednio masę cząsteczkową. Szybkość migracji w SDS-PAGE nie jest
determinowana przez ładunek elektryczny białka zależny od pH i jego konformację
ale przez masę białka.
Dzięki możliwości rozdziału białek na podstawie ich wielkości możemy oznaczyć
masę cząsteczkową nieznanego białka, porównując jego położenie w żelu w
stosunku do innych białek (tzw. białek wzorcowych) po zakończonej migracji i
wybarwieniu.
Próbki nanosi się na żel po 5 minutowym ogrzaniu w 100 o C (we wrzącej łaźni wodnej
lub w bloku grzejnym) w buforze denaturującym. Wchodząca w skład buforu
denaturującego sacharoza obciąża próbki, ułatwiając ich umieszczenie w studzience.
W obecności SDS i czynnika redukującego wiązania dwusiarczkowe (βmerkaptoetanolu)
białka ulegają denaturacji (rozdzielają się na podjednostki) a ich
wiązania niekowalencyjne ulegają rozkładowi. Początkowo rozdział prowadzi się przy
małym napięciu (60 V), aby białka jak najlepiej weszły w pory żelu. Następnie
zwiększa się napięcie (do 120 V), przyspieszając przepływ białek. Rozdział prowadzi
się w buforze glicynowym. Odpowiednie napięcie wraz z użyciem żelu o mniejszym
stężeniu akrylamidów w stosunku do żelu dolnego pozwala na zagęszczenie próbek.
Efekt taki uzyskujemy dzięki glicynie i jonom chlorkowym zawartym w buforze
elektrodowym. Glicyna w pH 6.8 górnego żelu (wyższym od jej punktu
izoelektrycznego pI 6.3) przyjmuje ładunek lekko ujemny. W porównaniu z silnym
ładunkiem ujemnym jonów chlorkowych i białka (dzięki obecności SDS) jest to
ładunek znikomy. Glicyna jako cząsteczka o najmniejszym ładunku wypadkowym
8