kloniranje in izražanje smoc-1 in njegovih tiroglobulinskih domen

UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
Univerzitetni študijski program BIOKEMIJA
KLONIRANJE IN IZRAŽANJE SMOC-1 IN NJEGOVIH
TIROGLOBULINSKIH DOMEN
Mentor: prof. dr. Brigita Lenarčič
Diplomsko delo
Marko Novinec
Ljubljana, junij 2004

Izjavljam, da sem avtor predloženega dela.
Marko Novinec

Zahvala
Diplomsko delo sem opravljal na Odseku za biokemijo in molekularno biologijo Instituta Jožef
Stefan in na Katedri za biokemijo Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo.
Najlepše se zahvaljujem mentorici prof. dr. Brigiti Lenarčič za pomoč, vzpodbudo in podporo
pri delu ter za temeljit pregled diplomskega dela. Za pomoč pri delu se posebej zahvaljujem Mihi
Pavšiču, univ. dipl. biokem. in Primožu Mehu, univ. dipl. kem.
Prof. dr. Metki Renko in prof. dr. Vitu Turku se zahvaljujem za temeljit pregled dela. Vodji
programske skupine prof. dr. Vitu Turku se dodatno zahvaljujem za dobre delovne pogoje na
Institutu Jožef Stefan.
Vsem kolegom na odseku se zahvaljujem za prijetno delovno vzdušje.
Nenazadnje se zahvaljujem svoji družini za vso ljubezen in podporo.

Povzetek
Povzetek
SMOC-1 je široko razširjen heparan sulfatni proteoglikan, ki se nahaja skoraj izključno v
bazalnih laminah. Njegovo proteinsko jedro je zgrajeno iz petih domen, od katerih sta dve
tiroglobulinski domeni tipa 1. Obe kažeta znatno homologijo s tiropini, skupino inhibitorjev
papainu podobnih cisteinskih proteaz.
V diplomskem delu smo klonirali SMOC-1 in posamezni tiroglobulinski domeni tipa 1.
Rekombinanten SMOC-1 smo izrazili v Sf9 celicah z uporabo bakulovirusnega
ekspresijskega sistema Bac-to-Bac. Rekombinanten protein se je le delno izločil iz celic,
prisotnost L21 zaporedja pa je močno povečala količino izraženega SMOC-1. Ugotovili smo, da
je optimalen čas okužbe 48 ur, optimalna multipliciteta okužbe pa 5.
Drugo tiroglobulinsko domeno SMOC-1 smo izrazili v E. coli v obliki fuzijskega proteina s
tioredoksinom, ki smo ga dobili z uporabo vektorja pET-32b(+). Topen fuzijski protein smo z Niafinitetno
kromatografijo popolnoma očistili v enem koraku. Izkoristek izražanja in izolacije smo
ocenili na 6 mg fuzijskega proteina na liter kulture.
SMOC-1 smo izrazili tudi v obliki inkluzijskih telesc v E. coli. Izoliran protein je bil nad 90%
čist, izkoristek pa smo ocenili na 50 mg rekombinantnega proteina na liter kulture. Z
denaturiranim SMOC-1 smo imunizirali kunca in tako dobili krvni serum s proti-SMOC-1
protitelesi. Poskus renaturacije denaturiranega SMOC-1 ni bil uspešen, najverjetneje zaradi
modularne strukture proteina s skupno desetimi disulfidnimi vezmi.
Računalniški modeli tiroglobulinskih domen tipa 1 kažejo na fleksibilnost prve in tretje zanke
na spodnji strani domen. V primerjavi s strukturo p41 fragmenta imata obe domeni podaljšani
α-vijačnici, od p41 fragmenta pa se razlikujeta tudi v manjših podrobnostih.
Ključne besede: SMOC-1, tiroglobulinske domene tipa 1, katepsini, tiropini, ekstracelularni
matriks
Abstract
SMOC-1 is a widely expressed heparan sulphate proteoglycan, restricted almost exclusively
to basal laminae. Its protein core is made up of five domains, two of which are thyroglobulin
type-1 domains. Both of them show high sequence homology to thyropins, a group of
inhibitors of papain-like cysteine proteases.
In this work we have cloned the SMOC-1 protein as well as its individual thyroglobulin type-
1 domains.
Expression in Sf9 cells using the Bac-to-Bac baculovirus expression system resulted in party
secreted recombinant SMOC-1. The L21 leader sequence proved to be a potent enhancer of
recombinant protein expression. Optimal harvest time has been determined to be 48 hours
post infection at an optimal MOI of 5.
Using the pET-32b(+) vector to generate a thioredoxin fusion protein, we have expressed
the second thyroglobulin type-1 domain of SMOC-1 in soluble form in E. coli. The fusion
protein was purified to homogeneity in one step on a metal-chelating column. The yield of
recombinant protein was 6 mg per litre of culture.
The expression of SMOC-1 in the form of inclusion bodies in E. coli yielded 50 mg of
recombinant protein per litre of culture. The isolated protein was over 90% pure and was used
to immunize a rabbit. The obtained antiserum was confirmed to contain anti-SMOC-1
antibodies. The attempt to refold denatured SMOC-1 failed, probably due to the modular
design of the protein with a complex pattern of ten disulphide bonds.
Computer models of the individual thyroglobulin type-1 domains show flexibility of loops
one and three on the lower side of the domains. In comparison to the structure of the p41
fragment both domains possess expanded α-helices and a few other minor differences.
Keywords: SMOC-1, thyroglobulin type-1 domains, cathepsins, thyropins, extracellular matrix
Stran i

Kazalo
Kazalo
Povzetek .......................................................................................................................i
Abstract ........................................................................................................................i
Kazalo ..........................................................................................................................ii
Okrajšave....................................................................................................................iv
1. Uvod.........................................................................................................................1
1.1. Papainu podobne cisteinske proteaze.............................................................1
1.1.1. Katepsini............................................................................................................... 2
1.1.2. Inhibitorji papainu podobnih cisteinskih proteaz................................................ 3
1.1.3. Delovanje katepsinov v ekstracelularnem prostoru ........................................... 4
1.2. Ekstracelularni matriks vretenčarjev in bazalne lamine..................................6
1.3. SMOC-1.............................................................................................................7
1.3.1. Tiroglobulinski domeni SMOC-1 in tiropini ........................................................ 8
2. Namen dela ...........................................................................................................11
3. Materiali in metode ..............................................................................................12
3.1. Materiali...........................................................................................................12
3.1.1. cDNA zapis za SMOC-1...................................................................................... 12
3.1.2. Vektorji ............................................................................................................... 13
3.1.2.1. pPCR-Script Amp SK(+) ........................................................................................... 13
3.1.2.2. pET-28b(+) ................................................................................................................ 14
3.1.2.3. pET-32b(+) ................................................................................................................ 14
3.1.2.4. Bakulovirusni ekspresijski sistem Bac-to-Bac .......................................................... 15
3.1.3. Začetni oligonukleotidi ...................................................................................... 16
3.1.4. Bakterijski sevi.................................................................................................... 18
3.1.5. Bakterijska gojišča in antibiotiki......................................................................... 18
3.1.6. Insektne celice in bakulovirusi........................................................................... 19
3.1.7. Gojišče za insektne celice .................................................................................. 19
3.1.8. Ostali materiali ................................................................................................... 20
3.1.8.1. Encimi ........................................................................................................................ 20
3.1.8.2. Elektroforetski standardi ........................................................................................... 20
3.1.8.3. Kompleti reagentov................................................................................................... 21
3.1.8.4. Ostale kemikalije........................................................................................................ 21
3.1.8.5. Pomembnejše aparature........................................................................................... 21
3.2. Metode ............................................................................................................22
3.2.1. Molekulsko kloniranje ........................................................................................ 22
3.2.1.1. Pomnoževanje cDNA zapisov s PCR ........................................................................ 22
3.2.1.2. Čiščenje produktov po PCR reakciji.......................................................................... 22
3.2.1.3. PCR bakterijske kolonije............................................................................................ 23
3.2.1.4. PCR bakmidne DNA .................................................................................................. 23
3.2.1.5. PCR bakulovirusne DNA ........................................................................................... 24
3.2.1.6. Agarozna gelska elektroforeza in detekcija DNA z etidijevim bromidom............... 24
3.2.1.7. Rezanje DNA z restrikcijskimi endonukleazami........................................................ 25
3.2.1.8. Izolacija DNA iz agaroznega gela.............................................................................. 26
3.2.1.9. Ligacija zapisa v vektor ............................................................................................. 26
3.2.1.10. Kloniranje zapisa v vektor pPCR-Script Amp SK(+).............................................. 26
3.2.1.11. Izolacija plazmidne DNA ......................................................................................... 27
3.2.1.12. Izolacija bakmidne DNA .......................................................................................... 27
3.2.1.13. Izolacija bakulovirusne DNA iz transficiranih insektnih celic................................. 27
3.2.1.14. Obarjanje DNA iz etanola........................................................................................ 28
3.2.1.15. Določanje nukleotidnega zaporedja na avtomatskem sekvenatorju .................... 28
Stran ii

Kazalo
3.2.2. Delo z bakterijami............................................................................................... 29
3.2.2.1. Prekonočne kulture E. coli ........................................................................................ 29
3.2.2.2. Priprava kompetentnih celic E. coli .......................................................................... 29
3.2.2.3. Transformacija kompetentnih celic E. coli ............................................................... 29
3.2.2.4. Izražanje rekombinantnega proteina v E. coli .......................................................... 30
3.2.3. Delo z insektnimi celicami ................................................................................. 30
3.2.3.1. Opazovanje okuženih celic pod invertnim mikroskopom ....................................... 30
3.2.3.2. Transfekcija insektnih celic z bakmidno DNA .......................................................... 31
3.2.3.3. Amplifikacija zaloge bakulovirusov .......................................................................... 31
3.2.3.4. Določanje titra bakulovirusov ................................................................................... 31
3.2.3.5. Prečiščenje plakov..................................................................................................... 32
3.2.3.6. Poskusno izražanje SMOC-1 v insektnih celicah...................................................... 32
3.2.4. Izolacija in analiza proteinov.............................................................................. 32
3.2.4.1. Analiza proteinov na poliakrilamidni gelski elektroforezi v prisotnosti NaDS........ 32
3.2.4.2. Detekcija proteinov v gelu s Coomassie Brilliant Blue ............................................ 33
3.2.4.3. Prenos western.......................................................................................................... 33
3.2.4.4. Imunodetekcija proteinov na membrani .................................................................. 34
3.2.4.5. Analiza proteinov v celičnem lizatu E. coli ............................................................... 34
3.2.4.6. Izolacija inkluzijskih telesc iz E. coli .......................................................................... 34
3.2.4.7. Priprava vzorca za imunizacijo.................................................................................. 35
3.2.4.8. Renaturacija ............................................................................................................... 35
3.2.4.9. Ni-afinitetna kromatografija ...................................................................................... 35
3.2.4.10. Obarjanje proteinov s TCA...................................................................................... 36
3.2.4.11. Analiza proteinov v lizatu in gojišču insektnih celic............................................... 36
3.3. Molekulsko modeliranje tiroglobulinskih domen SMOC-1 ..........................37
4. Rezultati.................................................................................................................38
4.1. Kloniranje in izražanje SMOC-1 v inkluzijskih telescih v E.coli .....................38
4.2. Kloniranje in izražanje tiroglobulinskih domen SMOC-1 v E. coli ................42
4.3. Kloniranje in izražanje SMOC-1 v insektnih celicah ......................................46
4.4. Molekulsko modeliranje tiroglobulinskih domen SMOC-1 ..........................51
5. Diskusija ................................................................................................................53
6. Zaključek................................................................................................................55
7. Literatura...............................................................................................................56
Stran iii

Okrajšave
A 280 – absorbanca pri 280 nm
AcMNPV – multipli jedrni polihedrozni virus organizma Autographa californica
AGE – agarozna gelska elektroforeza
APS – amonijev persulfat
BSA – albumin iz govejega seruma
bp – bazni par
C-terminal – karboksi terminal
cDNA – komplementarna DNA
Da – dalton (1/12 mase atoma 12 C)
DAB – 3,3'-diaminobenzidin
dH 2O – destilirana voda
DMF – N,N-dimetilformamid
DMSO – dimetilsulfoksid
DNA – deoksiribonukleinska kislina
dNTP – deoksiribonukleotid trifosfati
DOPE – dioleoil fosfatidiletanolamin
DTT - ditiotreitol
E. coli – Escherichia coli
ECM – ekstracelularni matriks
EDTA – etilendiamin tetraacetat
GAG – glikozaminoglikani
HEPES – 1-piperazinetansulfonska kislina
His 6 oznaka – heksahistidinska oznaka, zaporedje šestih His ostankov
Ii – invariantna veriga MHC razreda II
IPTG – izopropil- β-D-tiogalaktopiranozid
K-acetat – kalijev acetat
kb – kilobazni par (tisoč baznih parov)
MCS – klonirno mesto
MHC – poglavitni histokompatibilnostni kompleks
MOI – multipliciteta okužbe
N-terminal – amino terminal
Na-acetat – natrijev acetat
NaDS – natrijev dodecilsulfat
OD 600 – absorbanca oz. optična gostota pri valovni dolžini 600 nm
PAGE – poliakrilamidna gelska elektroforeza
PBS – fosfatni pufer s soljo
PCR – verižna reakcija s polimerazo
PDB – Protein Data Bank
rpm – obrati na minuto
SMOC-1 – sekrecijski modularen kalcij vezaven protein 1
ssDNA – enoverižna DNA
TCA – trikloroocetna kislina
TEMED – N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin
Tg1 – prva tiroglobulinska domena SMOC-1
Tg2 – druga tiroglobulinska domena SMOC-1
T m – temperatura tališča DNA
TM-TPS – N,N I ,N II ,N III -tetrametil- N,N I ,N II ,N III -tetrapalmitilspermin
Tris - hidroksimetilaminometan
U – encimska enota
V – volumen
X-gal – 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozid
Okrajšave
Stran iv

Oznake aminokislin
alanin Ala A
arginin Arg R
asparagin Asn N
aspartat oz. asparaginska kislina Asp D
cistein Cys C
fenilalanin Phe F
glicin Gly G
glutamat oz. glutaminska kislina Glu E
glutamin Gln Q
histidin His H
izolevcin Ile I
levcin Leu L
lizin Lys K
metionin Met M
prolin Pro P
serin Ser S
tirozin Tyr Y
treonin Thr T
triptofan Trp W
valin Val V
Oznake aminokislin
Stran v

1. Uvod
Uvod
Nobenega dvoma ni, da so celice osnovna enota živih bitij, od enoceličarjev, kjer ena sama
predstavlja celoten organizem, do človeka, ki je zgrajen iz miljard celic. Ko prehajamo od nižjih
k višje organiziranim bitjem, opažamo, da se celice začenjajo specializirati za opravljanje točno
določenih funkcij, ki jih organizem potrebuje za svoje normalno delovanje. Celice, ki opravljajo
enake funkcije, se začenjajo organizirati v tkiva, ta pa v organe.
Te organizirane tvorbe pa niso sestavljene le iz celic, ampak tudi iz prostora med njimi. Ta
prostor imenujemo ekstracelularni matriks. Nanj se je dolgo časa gledalo kot na »mrtev«
prostor, ki služi zgolj zapolnjevanju praznine. Vedno bolj pa postaja jasno, da je njegova vloga v
tkivih in celotnem organizmu zelo aktivna in kompleksna, o čemer nenazadnje priča tudi
raznolikost molekul, ki ga sestavljajo.
Med njimi so tudi proteaze, encimi, ki razgrajujejo druge proteine. Nekatere med njimi so
omejene le na ekstracelularen prostor, druge pa se pojavljajo tako v celicah kot izven njih.
Fiziološka, včasih patološka, vloga slednjih v ekstracelularnem matriksu je često drugačna kot v
celicah. Tako v celicah kot zunaj njih pa obstajajo tudi inhibitorji proteaz, ki preprečujejo za
organizem neželeno delovanje teh encimov.
Med drugimi tudi nekatere tiroglobulinske domene tipa I kažejo inhibitorne lastnosti proti
delovanju določenih članov družine papainu podobnih cisteinskih proteaz. Proteine, katerih
sestavni del so te domene, najdemo predvsem izven celic. Eden izmed ekstracelularnih
proteinov, ki vsebuje tiroglobulinske domene tipa 1 je SMOC-1.
1.1. Papainu podobne cisteinske proteaze
Proteaze so encimi, ki katalizirajo hidrolizo peptidnih, včasih tudi estrskih vezi [1]. Glede na
mehanizem katalize jih delimo na [2]:
• serinske proteaze,
• cisteinske proteaze,
• aspartatne proteaze,
• metaloproteaze,
• glutamatne proteaze,
• treoninske proteaze in
• proteaze mešanega katalitskega tipa.
Vse cisteinske proteaze imajo enak katalitski mehanizem, v katerem deprotonirana tiolna
skupina stranske verige Cys ostanka deluje kot nukleofil, ki napade karbonilni ogljikov atom
peptidne vezi, bližnji His ostanek pa služi kot baza za prenos protona [3].
Na podlagi homolognosti primarnih zaporedij cisteinske proteaze razdelimo na klane, te pa
dalje na družine. Papain in njemu podobne cisteinske proteaze uvrščamo v družino C1 klana
CA, ki jo imenujemo družina papainu podobnih cisteinskih proteaz [3].
Vse papainu podobne cisteinske proteaze imajo enak tip zvitja iz dveh domen, ki ju po
dogovoru glede na standarden pogled imenujemo domeni R (angl. right, desno) oz. L (angl.
left, levo), med katerima se nahaja aktivno mesto v obliki črke V. V osredju domene L je
približno 30 ostankov dolga α-vijačnica, domena R pa je zvita v strukturo β-sodčka [4].
Mehanizem delovanja papainu podobnih cisteinskih proteaz, je dobro poznan. V aktivnem
mestu, ki se razteza po celotni dolžini encima, se nahaja katalitska diada Cys 25 , ki je del Ldomene
in His 159 (oštevilčenje po papainu), ki je del R-domene (slika 1.1). Stranski skupini obeh
ostankov pri pH vrednostih med 3,5 in 8 tvorita tiolat-imidazolijev ionski par, ki katalizira že
omenjeno reakcijo hidrolize peptidne vezi [5].
Stran 1

Uvod
Slika 1.1: (levo) Struktura papaina (iz PDB, 1PPN). (sredina) V standardnem pogledu ima aktivno mesto
obliko črke V. (desno) Aktivno mesto se razteza po celotni dolžini encima. V osredju sta katalitska ostanka
Cys 25 (rumen) in His 159 (rjav). Slike so bile narejene s programoma Grasp2 (levo) oz. Accelrys ViewerLite 5.0.
Aktivno mesto encima je dovolj veliko, da lahko interagira z najmanj petimi ostanki
substrata, interakcijsko površino pa predstavljajo zanke tako L- kot R-domene encima (slika 1.2).
Mesta S2, S1 in S1' so dobro definirana in interagirajo tako z glavno verigo kot s stranskimi
verigami P2, P1 oz. P1' ostankov substrata. V okviru mesta S1 se nahaja oksianionska luknja, ki
stabilizira negativen naboj intermediata pri reakciji. Edini pravi žepek, v katerega se veže
stranska skupina substrata, se nahaja znotraj mesta S2, zato je specifičnost teh encimov do
substratov v glavnem določena s P2 ostankom le-teh. Kot kažejo kristalografski podatki, se
substrat v aktivno mesto veže v iztegnjeni konformaciji [6].
1.1.1. Katepsini
Slika 1.2: Aktivno mesto encima interagira z vsaj
petimi ostanki substrata. (prirejeno po [7])
Katepsini je poimenovanje za raznoliko skupino proteaz, ki pripadajo različnim
mehanističnim razredom, so različnega izvora in izvajajo raznolike funkcije. Na tem mestu bo
pozornost posvečena enajstim človeškim, primarno lizosomalnim katepsinom iz družine
papainu podobnih cisteinskih proteaz, tj. katepsinom B, C, F, H, K, L, O, S, V, W in X [zbrano v
4,8,9].
Vseh enajst se sintetizira kot preproencimi, v katerih pretežno α-vijačne pro-regije sterično
blokirajo dostop do aktivnega mesta. Optimalno aktivni so v kislem (pH 4,5 do 6,5)
reducirajočem okolju, kakršno je v lizosomih. Z izjemo katepsina C, ki je tetramer, so v aktivni
obliki monomerni glikoproteini, veliki približno 22 do 28 kDa, sestavljeni iz ene ali dveh z
disulfidno vezjo povezanih polipeptidnih verig [zbrano v 4,8,9].
Večinoma so katepsini endopeptidaze, nekateri med njimi pa lahko delujejo tudi ali izključno
kot eksopeptidaze [9]. Temelj eksopeptidazne aktivnosti teh katepsinov so njihove edinstvene
strukturne lastnosti (slika 1.4).
Stran 2

Uvod
Slika 1.4: Edinstvene strukturne lastnosti
katepsinov z eksopeptidazno aktivnostjo:
superpozicija okluzijske zanke katepsina B (iz
PDB, 1CSB), ekskluzijske domene katepsina C (iz
PDB, 1K3B), mini verige katepsina H (iz PDB,
1NB5) in mini zanke katepsina X (iz PDB, 1EF7)
na katepsin L (iz PDB, 1ICF). Slika je bila narejena
s programom Accelrys ViewerLite 5.0.
Med seboj se katepsini razlikujejo tako po razširjenosti v različnih tkivih kot po aktivnosti.
Poleg skupne funkcije razgradnje polipeptidnih verig v lizosomih posamezni opravljajo še
druge, bolj specializirane funkcije [zbrano v 4,8,9].
Eden izmed pomembnih fizioloških procesov, v katerem sodelujejo katepsini, je procesiranje
invariantne verige MHC razreda II. Ta se veže na de novo sintetizirane dimerne molekule MHC
razreda II in jih usmerja v endosome, kjer se nanje vežejo tuji antigeni [10]. V večini antigen
prezentirajočih celic je ključen katepsin S [11], v makrofagih ga zamenjuje katepsin F [12], v
priželjcu pa katepsin L [13] in katepsin V. Čezmerno izražanje slednjega je povezano z razvojem
miastenije gravis [14].
Katepsin L poleg tega sodeluje tudi v vzdrževanju homeostaze epidermalnih celic in
regulaciji življenjskega cikla lasnih mešičkov [15].
Z delovanjem imunskega sistema sta povezana tudi katepsina W in C. Katepsin W se izraža
izključno v citotoksičnih limfocitih T [16] in naravnih celicah ubijalkah, kjer je koz kaže vpleten v
mehanizem citotoksičnosti teh celic [17], katepsin C pa sodeluje pri aktivaciji zimogenov
serinskih proteaz v granulocitih [18]. Mutacije, ki okvarijo njegovo funkcijo, so povezane z
nekaterimi boleznimi, kot so Papillon-Lefevrov sindrom [19], periodontalna bolezen [20] in
astma [21].
1.1.2. Inhibitorji papainu podobnih cisteinskih proteaz
Endogeni inhibitorji papainu podobnih cisteinskih proteaz so v glavnem reverzibilni
kompetitivni inhibitorji, ki z vezavo v aktivno mesto tvorijo kompleks s tarčnim encimom in tako
preprečijo dostop substratu [22].
Znanih je več skupin inhibitorjev. Najbolje raziskana je naddružina cistatinov, ki je
sestavljena iz štirih družin. Prve tri družine, cistatini, stefini in kininogeni imajo inhibitorne
lastnosti, medtem ko četrto družino predstavljajo homologi cistatinov brez inhibitornih lastnosti
Stefini in cistatini so se razvili iz skupnega prednika [22], medtem ko kininogeni, prekurzorji
vazoaktivnih peptidov kininov, vsebujejo tri cistatinom podobne domene, od katerih imata dve
inhibitorne lastnosti [23].
Med inhibitorje papainu podobnih cisteinskih proteaz spadata tudi antigen 1 karcinoma
skvamoznih celic [24] in splošni inhibitor proteaz α 2-makroglobulin [25], v zadnjem času pa je
bilo tudi za nekaj sicer že znanih proteinov dokazano, da lahko delujejo kot inhibitorji papainu
podobnih cisteinskih proteaz. Mednje sodijo protein VEG iz človeških solz ter laktoferin in βkazein
iz mleka, za vse pa je značilna delna homologija s cistatini [26,27].
Stran 3

Uvod
Tudi na pro-regije katepsinov lahko gledamo kot na neke vrste inhibitorje. Ponavadi je
ravnotežje med aktivno in neaktivno obliko prokatepsinov pomaknjeno v smeri slednje,
določeni stimuli okolja pa lahko ravnotežje prevesijo v obratno smer [28]. V to skupino bi lahko
uvrstili tudi antigen 2β citotoksičnih limfocitov T, ki je homologen pro-regiji katepsina L in
inhibira zlasti endopeptidaze med katepsini [29].
Posebna skupina inhibitorjev papainu podobnih cisteinskih proteaz so tiropini, inhibitorji, ki
vsebujejo tiroglobulinske domene tipa 1 [30]. V primerjavi s cistatini, ki so splošni inhibitorji
papainu podobnih cisteinskih proteaz [22], so tiropini mnogo bolj specifični [30]. Najbolje
preučen tiropin je p41 fragment invariantne verige MHC razreda II (p41 fragment), o celotni
skupini pa bo več govora kasneje.
Kristalografski podatki kažejo, da tiropini in cistatini ter stefini interagirajo s svojimi tarčami
na zelo podoben način. Pri obojih glavnino interakcij s tarčo predstavljajo tri zanke, ki se vežejo
v aktivno mesto [31,32] (slika 1.6), gre torej za lep primer konvergentne evolucije [9].
Slika 1.6: Superpozicija kompleksa stefina B in
papaina (iz PDB, 1STF) na kompleks p41
fragmenta in katepsina L (iz PDB, 1ICF). Katepsin L
je prikazan belo, p41 fragment rdeče, stefin B
modro, papain pa ni prikazan. Superpozicija
struktur je bila narejena s programom Swiss-
PdbViewer v3.7, slika pa s programom Accelrys
ViewerLite 4.2.
1.1.3. Delovanje katepsinov v ekstracelularnem prostoru
Kot rečeno, so katepsini primarno lizosomalni encimi. Vsaj za nekatere pa je znano, da se
lahko nahajajo in delujejo tudi izven celic. Ekstracelularna lokalizacija katepsinov je lahko
povezana tako z normalnim delovanjem tkiva kot s patološkimi spremembami.
Katepsin K je eden ključnih encimov, ki jih uporabljajo osteoklasti v procesih resorpcije in
remodeliranja kostnega tkiva. Kolagen tipa I, poglavitno proteinsko komponento kosti,
razgrajuje mnogo učinkoviteje kot ostale endogene proteaze [33-35]. Molekule kolagena cepi
tako izven regij trojne vijačnice kot znotraj njih [33,36]. Primerno okolje za delovanje mu
osteoklasti omogočajo s pomočjo H + -ATPaze vakuolarnega tipa, translocirane v plazemsko
membrano, ki črpa protone v ekstracelularni prostor [35]. Pomembnost katepsina K se pokaže
pri avtosomalni recesivni dedni bolezni piknodisostozi, pri kateri prihaja zaradi
nefunkcionalnega katepsina K do hudih nenormalnosti v zgradbi kosti [37].
Stran 4

Uvod
Katepsin K skupaj s katepsinoma L in S izločajo tudi makrofagi, njihova skupna funkcija pa je
razgradnja elastinskih vlaken, ki je potrebna za migracijo makrofagov v tkiva pri vnetnih
procesih. Vsi trije se izločajo tako v aktivni kot v pro-obliki, skupaj z njimi pa se izloča tudi
cistatin C, ki verjetno inaktivira in stabilizira aktivne oblike encimov. Podobno kot osteoklasti
tudi makrofagi uporabljajo H + -ATPazo vakuolarnega tipa za nakisanje periceličnega prostora in
s tem omogočajo aktivnost katepsinom [38]. V primerjavi s katepsinoma L in S ima katepsin K
največjo elastinolitično aktivnost, a kaže da ni ključen za pravilno delovanje makrofagov, saj so
tudi tisti, ki imajo okvarjen gen za katepsin K, torej izločajo le aktivna katepsina L in S,
popolnoma funkcionalni [38,39]. Pokazalo se je, da tako makrofagi kot dendritske celice
pravzaprav ves čas vzdržujejo določeno koncentracijo katepsina L v svoji neposredni okolici.
Stabilnost pri nevtralnem pH mu zagotavlja asociacija s p41 fragmentom, kompleks obeh je
namreč obstojen v nevtralnem okolju, ali pa se izloča v stabilni pro-obliki (slika 1.7). Zanimivo
je, da je katepsin L v kompleksu s p41 Ii sposobnen razgrajevati elastin pri nevtralnem pH [40].
Slika 1.7: Katepsin L se iz celic izloča v pro-obliki
in v kompleksu s p41 fragmentom. (prirejeno po
[40])
Katepsini so vpleteni tudi v razgradnjo tiroglobulina, prekurzorja ščitničnih hormonov v
lumnu ščitničnih foliklov [41]. V lumen jih izločajo epitelijske celice ščitnice, ki so v ta namen
razvile poseben transportni sistem [41,42]. In vitro lahko vsaj katepsini B, L in K razgrajujejo
tiroglobulin pri nevtralnem pH [41,43].
Nekatera patološka stanja so povezana s povišanimi ekstracelularnimi nivoji ekspresije
določenih katepsinov. Pri različnih karcinomih so bile dokazane povišane koncentracije
katepsinov B, H in L, pa tudi stefinov A in B ter cistatina C [44]. Vsaj za katepsin B vemo, da se
pri teh tvorbah nahaja tudi ekstracelularno. Izloča se tako v aktivni [45] kot tudi v pro-obliki, v
kateri propeptid stabilizira encim pri nevtralnem pH [46]. Poleg prostega najdemo pri teh
tvorbah katepsin B vezan tudi na membrane [47]. Vloga katepsinov v tumorjih je remodeliranje
ekstracelularnega matriksa, ki je ena ključnih stopenj pri invazivnosti tumorjev [48]. Razgradnja
komponent poteka tako ekstracelularno kakor tudi intracelularno v endocitiranih veziklih [49].
Znano je tudi, da katepsin B stimulira angiogenezo, ki je eden ključnih korakov pri razvoju raka,
pa tudi osteoartitisa [50].
Stran 5

1.2. Ekstracelularni matriks vretenčarjev in bazalne lamine
Uvod
Ekstracelularni matriks (ECM) je prostor med posameznimi celicami v tkivu. Sestavljen je iz
proteinov in polisaharidov, ki jih te celice izločajo. Tkiva se med seboj močno razlikujejo po
količini ECM, od epitelijev, kjer ga skorajda ni, do vezivnega tkiva, v katerem zapolnjuje večino
prostora. Tako kot delež se v različnih tkivih razlikujejo tudi komponente in oblika ECM [51].
Poglavitni skupini makromolekul ECM sta proteoglikani in fibrilarni proteini [51]. Praktično
vsi pripadniki obeh skupin so multifunkcionalni proteini, sestavljeni iz omejenega nabora
domen oz. modulov [52].
Proteoglikani so sestavljeni iz proteinskega jedra in nanj kovalentno vezanih
glikozaminoglikanov (GAG), nerazvejanih, ponavadih 70-200 monosaharidnih enot dolgih
iztegnjenih polisaharidnih verig, sestavljenih iz ponavljajočih se disahardnih enot. GAG lahko
razdelimo na štiri glavne skupine, in sicer hialuronsko kislino, hondroitin sulfat in dermatan
sulfat, heparan sulfat ter keratan sulfat. GAG tvorijo hidratirane gele z visokim turgorskim
tlakom, ki dajejo ECM in s tem tudi tkivu mehansko oporo in čvrstost, aktivno pa lahko
sodelujejo pri določanju prepustnosti tkiv za določene molekule, pri signalizaciji med celicami
ter kontroli aktivnosti drugih sekrecijskih proteinov, med njimi tudi proteaz in inhibitorjev
proteaz [51].
Druga velika skupina molekul ECM so fibrilarni proteini iz družine kolagenov. Glavna
značilnost vseh kolagenov je paličasta struktura trojne vijačnice, v grobem pa jih lahko
razdelimo na tiste, ki tvorijo fibrile, s fibrilami povezane kolagene, kolagene, ki tvorijo omrežja in
kolagenom podobne proteine [51].
Med poglavitnimi proteini ECM velja omeniti še elastin, ki mnogim tkivom zagotavlja
elastičnost [51].
Bazalne lamine so specializirane, membranam podobne tvorbe ECM, debele od 40 do 120
nm. Ponavadi ločujejo celice od vezivnega tkiva, tako jih npr. najdemo pod vsemi epiteliji in
okrog vseh endotelijev, obdajajo pa tudi posamezne mišične, maščobne in Schwannove celice.
V ledvičnem glomerulu jih najdemo tudi med žilnim endotelijem in epitelijem ledvičnih tubulov.
Sprva se je bazalnim laminam pripisovala zgolj strukturna funkcija prepreke med celicami in
pod njimi ležečim ekstracelularnim matriksom, vse bolj pa se kopičijo dokazi o še mnogih
drugih, bolj aktivnih funkcijah teh tvorb. Do sedaj je znano, da lahko določajo polarnost celic,
vplivajo na celični metabolizem, organizacijo proteinov v plazemskih membranah, preživetje,
diferenciacijo in razmnoževanje celic ter sodelujejo pri celičnih migracijah [51].
Strukturno je bazalna lamina preplet omrežij kolagena tipa IV in laminina, v katerega so
vpletene ostale komponente, od katerih je zlasti treba omeniti nidogen, perlekan in agrin in
fibuline, ki so vključeni v zapleten vzorec interakcij, esencialnih tako za samo integriteto bazalne
lamine kakor za vezavo celotnega prepleta na receptorje na površini celic [53].
V bazalnih laminah se nahaja tudi protein BM-40 (imenovan tudi SPARC oz. osteonektin)
[54]. Po BM-40 se imenuje družina raznolikih ekstracelularnih proteinov, ki jim je skupno, da
vsebujejo folistatinsko (FS) domeno, ki ji sledi EC domena (slika 1.12).
Slika 1.12: člani družine BM-40. FS – folistatinska
domena, TG – tiroglobulinska domena, EC –
ekstracelularna kalcij vezavna domena. (prirejeno po
[55])
Stran 6

1.3. SMOC-1
Uvod
Med iskanjem homologov BM-40 je bil iz cDNA knjižnice možganov človeškega fetusa
izoliran 3669 bp dolg cDNA zapis, ki je kazal 37% homologijo z BM-40. Izkazalo se je, da kodira
za 434 ostankov velik protein z izračunano molekulsko maso 48,2 kDa, ki je bil okarakteriziran in
poimenovan sekrecijski modularen kalcij vezaven protein 1 (Secretory MOdular Calciumbinding
protein 1) ali krajše SMOC-1 [55].
Na N-terminalnem koncu proteina se nahaja 26 ostankov dolgo signalno zaporedje, ki se
konča s cepitvenim signalom za signalno peptidazo in kaže na to, da se protein izloča iz celice.
Procesiran SMOC-1 je 408 ostankov velik protein, zgrajen iz petih domen oz. modulov. Na Nterminalnem
koncu je folistatinu podobna domena, sledi ji prva tiroglobulinska domena, tej
sledi za proteina SMOC specifična domena, njej druga tiroglobulinska domena, na C-terminalu
pa je ekstracelularna kalcij vezavna (EC) domena [55] (slika 1.13).
Gen za SMOC-1 se nahaja na 14 kromosomu na lokaciji 14q24.1. Velik je približno 150 kb
parov, sestavljen pa je iz 12 eksonov. Vsako domeno kodira eden ali več eksonov, meje med
domenami pa sovpadajo z mesti izrezovanja eksonov [55] (slika 1.13).
Slika 1.13: Modularna zgradba SMOC-1 se kaže tako na nivoju proteina kot na nivoju gena. Oštevilčeni
so posamezni eksoni, zunanje meje eksonov 1 in 12 niso znane. SP – signalni peptid, FS – folistatinu
podobna domena, TG – tiroglobulinska domena tipa 1, SMOC – za SMOC specifična domena, EC –
ekstracelularna kalcij vezavna domena. (prirejeno po [55])
Folistatinske domene so tipično sestavljene iz dveh delov, pri čemer je drugi del podoben
Kazalovi domeni, pogosto prisotnem modulu v inhibitorjih serinskih proteaz. Vsebujejo značilen
vzorec desetih Cys ostankov, štirje so v prvem delu, preostalih šest pa se nahaja v domeni,
podobni Kazalovi. Prvih šest Cys ostankov SMOC-1 se prilega Kazalovi domeni in Cys
ostankom 5 do 10 proteina BM-40, ki vsebuje pravo folistatinsko domeno [56]. Ostankov, ki v
SMOC-1 ležijo N-terminalno od Kazalove domene, ni mogoče klasificirati, zato celotno domeno
najbolje opišemo kot folistatinu podobno domeno SMOC-1 [55].
Za SMOC specifična domena vsebuje visok delež aromatskih aminokislin, kar kaže na to, da
se verjetno zvije v strukturo s hidrofobno notranjostjo [55].
EC domena tako kot tista v BM-40 vsebuje dva motiva EF dlani, ki vežeta vsak po en kalcijev
ion [55].
Iz zaporedja SMOC-1 lahko napovemo tri potencialna mesta N-glikozilacije, in sicer Asn 153 ,
Asn 214 in Asn 374 . Prvo potencialno mesto glikozilacije se nahaja v prvi tiroglobulinski domeni,
drugo v za SMOC specifični domeni, tretje pa je del EC domene. Kaže, da je v SMOC-1 na
proteinsko ogrodje vezan keratan sulfat, poleg njega pa še nekaj krajših sladkornih verig,
vezanih preko kisika, torej lahko SMOC-1 klasificiramo kot keratan sulfatni proteoglikan [55].
Imunohistokemični testi kažejo, da je SMOC-1 večinoma kolokaliziran z lamininom, ki je
specifični marker za bazalne lamine. Izjema pa se pokaže v ovarijih, kjer SMOC-1 ni mogoče
zaznati v bazalni lamini, ki obdaja ovarijski folikel, temveč je lokaliziran v zoni pellucidi,
ekstracelularnem matriksu, ki obdaja oocit [55].
Fiziološka vloga SMOC-1 še ni znana.
Stran 7

1.3.1. Tiroglobulinski domeni SMOC-1 in tiropini
Uvod
Primerjava primarnih zaporedij posameznih tiroglobulinskih domen tipa 1 SMOC-1 med
človekom in mišjo kaže, da se prva domena med vrstama razlikuje le v enem samem
aminokislinskem ostanku, medtem ko se druga med vrstama razlikuje v dveh ostankih [57].
Tako visoka stopnja ohranjenosti kaže na močan evolucijski pritisk na ohranitev teh domen in s
tem na pomembno fiziološko vlogo, ki se od ločitve vrst ni spreminjala.
Tiroglobulinske domene tipa 1 so tipično 60 do 70 ostankov dolga zaporedja, ki jih v enajstih
kopijah najdemo v N-terminalnem delu tiroglobulina, velikega proteina, ki zapolnjuje matriks
ščitnice in je prekurzor tiroidnih hormonov [58,59]. Kot moduli se pojavljajo tudi v številnih
drugih, funkcijsko zelo različnih proteinih [30] (slika 1.14). Značilnost vseh tiroglobulinskih
domen tipa 1 je ohranjen CWCV motiv, ohranjeni pa so tudi določeni Cys, Gly in Pro ostanki
[59,60]. Glede na število Cys ostankov jih lahko razdelimo na podtipa A in B. Tipa 1A so tiste
domene, ki vsebujejo šest Cys ostankov in zato vsebujejo tri disulfidne vezi, tip 1B pa vsebuje le
štiri Cys ostanke v dveh disulfidnih vezeh [59].
Slika 1.14: Tiroglobulinske domene
tipa 1 se pojavljajo v mnogih različnih
proteinih. (prirejeno po [30])
Tiropini so skupina inhibitorjev cisteinskih proteaz, ki vsebujejo tiroglobulinske domene tipa
1. Praktično vse tiroglobulinske domene tiropinov so tipa 1A [30]. Trenutno skupina šteje pet
članov, ki so zelo specifični inhibitorji papainu podobnih cisteinskih proteaz.
Obe tiroglobulinski domeni SMOC-1 kažeta znatno homologijo s tiropini. Pri obeh je
ohranjenih večina značilnih ostankov, vidna izjemi sta pri prvi domeni le zamenjava prvega
konerviranega Gly ostanka z nekoliko večjim Ala ostankom in konzerviranega Ser ostanka s Tyr
ostankom, pri drugi domeni pa opazimo insercijo Thr ostanka glede na tiropine (slika 1.15).
SMOC-1(1 ) QSKCRLERAQALEQAKK-PQEAVFVPECGEDGSFTQVQCHTYTGYCWCVTPD-GKPISGSSVQNK--TPVCSGS
SMOC-1(2) VYSCDQERQSALEEAQQNPREGIVIPECAPGGLYKPVQCHQSTGYCWCVLVDTGRPLPGTSTRYV--MPSCESD
p41 LTKCQEEVSH-----IPAVHPGSFRPKCDENGNYLPLQCYGSIGYCWCVFPN-GTEVPNTRSR-G--HHNCSES
saksifilin LQKCLKERQQ-----ALAKKMGHYIPQCDEKGNYQPQQCHGSTGHCWCVNAM-GEKISGTNTPPGQTRATCERH
ekvistatin(1) LSKCQQLQAS-----ANSGLIGAYVPQCKETGEFEEKQCWGSTGYCWCVDED-GKEILGTKIR-G--SPDCSRR
ekvistatin(2) LTLCQMMQAI---IVNVPGWCGP--PSCKADGSFDEVQCCASNGECYCVDKK-GKELEGTRQK-G--RPSCERH
ekvistatin(3) LSPCEEARLQA---HSNSLRVGMFVPQCLEDGSYNPVQCWPSTGYCWCVDEG-GVKVPGSDVRFK--RPTC---
ECI KTPCELARDA-----ATHGPIGGFIPTCDYNGQYTPEQCWGSTGYCWCVNSS-GQKLPGTDTPPG-SASNC--testikan-1
GLPCQNEMNRIQKLSKGKSLLGAFIPRCNEEGYYKATQCHGSTGQCWCVDKY-GNELAGSRKQ-G--AVSCEEE
Slika 1.15: Poravnava zaporedij tiroglobulinskih domen tipa 1 tiropinov in SMOC-1. Rumeno so
označeni ohranjeni ostanki, rdeče sta označena Ala in Tyr ostanek, ki pri prvi domeni zamenjujeta sicer
ohranjena Gly in Ser ostanka, zeleno pa Thr ostanek, ki v drugi domeni predstavlja insercijo glede na
tiropine.
Stran 8

Uvod
Edina danes znana struktura tiroglobulinskih domen tipa 1 je struktura p41 fragmenta
invariantne verige MHC razreda II (p41 fragment) [31,61]. p41 fragment je del invariantne
verige (Ii), prisoten le pri p41 obliki Ii, ne pa tudi pri pogostejši p31 obliki. Obe obliki sta
produkta istega gena, ki nastaneta z alternativnim izrezovanjem ter sodelujeta v procesu
prezentacije antigenov [62]. 65 ostankov velika tiroglobulinska domena fragmenta inhibira
katepsin L (K i = 1,8 pM), katepsin H (K i = 5,3 nM), papain (K i = 1,4 nM) [63] in krucipain (K i =
5,8 pM) [64].
Tiroglobulinska domena tipa 1 je kompaktna struktura, ki jo lahko razdelimo na dve
poddomeni, notranje stabilizirani z disulfidnimi vezmi. Prva poddomena ima α-β topologijo,
začne se s kratko α-vijačnico, ki ji sledi dokaj dolg zavoj, nato pa se nadaljuje v iztegnjeni
konformaciji. Ta poddomena ima hidrofobno notranjost. Druga poddomena je sestavljena iz
antiparalelne β-ploskve, sestavljene iz treh β-trakov stabilizirane z dvema disulfidnima vezema, v
osrčju te domene pa je ohranjen motiv CWCV [31] (slika 1.16).
Slika 1.16: Struktura p41 fragmenta (iz PDB,
1ICF). Z rumeno so označene disulfidne vezi,
struktura α-vijačnice je označena rdeče, trakovi βstrukture
pa modro. Slika je bila narejena s
programom Accelrys ViewerLite 4.2.
Edini vir informacij o interakcijah med tiropini in katepsini, ki je na voljo, je kristalna struktura
nekovalentno povezanega kompleksa p41 fragmenta in katepsina L [31]. Vse tri zanke, ki se
nahajajo v spodnjem delu p41, interagirajo s katepsinom L. Prva zanka, sestavljena iz ostankov
Val 206 do Arg 213 (štetje po zaporedju invariantne verige), se veže v S2 mesto encima v podobni
konformaciji kot substrati. V osrčju druge zanke je Ser 230 , ki tvori vodikovo vez s Cys 25
katepsina, tretja zanka p41 pa interagira z ostanki R-domene. Pravzaprav je celotna struktura
p41 rahlo nagnjena proti R-domeni in interagira z zankami na vrhu le-te. Kaže, da so prav te
interakcije ključne za specifičnost posameznih tiropinov [31] (slika 1.17).
Slika 1.17: Kristalna struktura kompleksa p41 fragmenta in katepsina L (iz PDB, 1ICF). (levo)
Standardni pogled. (desno) Pogled od zgoraj. Cys 25 ostanek katepsina L je prikazan rumeno,
stranska veriga Ser 230 ostanka p41 fragmenta pa modro. Sliki sta bili narejeni s programom
Accelrys ViewerLite 4.2.
Stran 9

Uvod
ECI je inhibitor cisteinskih proteaz, ki je bil izoliran iz iker lososa Oncorhynchus keta v treh
izooblikah z molekulskimi masami 16, 11 oz. 9 kDa. Zgrajen je iz ene tiroglobulinske domene
tipa 1 in inhibira katepsin L (K i = 0,14 nM), katepsin B (K i = 15,8 nM) in papain (K i = 0,35 nM)
[65].
Ekvistatin je 22 kDa velik protein iz morske vetrnice Actinia equina, zgrajen iz treh
zaporednih tiroglobulinskih domen tipa 1 [66]. Prva domena je inhibitor papaina (K i = 0,26 nM
[67]), katepsin L (Ki = 0,051 nM [60]) in katepsin B (Ki = 1,4 nM [60,66]). Posebej zanimiva je
druga domena, saj inhibira aspartatno proteazo katepsin D (Ki = 0,5 nM). Nastanek kompleksa
spremljajo konformacijske spremembe te domene, kar ni značilno za interakcije tiropinov s
cisteinskimi proteazami [67]. Prostorska orientacija domen je takšna, da omogoča tvorbo
trojnega kompleksa, v katerem vsaka od obeh domen interagira s po eno molekulo encima
[129]. Tretja tiroglobulinska domena je tipa 1B in nima inhibitornih lastnosti [67].
Saksifilin je 91 kDa velik protein iz severnoameriške žabe Rana catesbiana. Ime je dobil po
svoji lastnosti, da veže nevrotoksin saksitoksin. V N-terminalnem delu proteina se nahajata dve
zaporedni tiroglobulinski domeni tipa I. Obe domeni inhibirata papain (navidezna K i = 1,72 nM),
iz stehiometrije vezave pa izhaja, da lahko obe hkrati vežeta po eno molekulo papaina. Poleg
papaina saksifilin inhibira tudi katepsin B (K i = 1,67 nM) in katepsin L (K i = 0,02 nM), iz
stehiometrije teh interakcij pa sledi, da ena izmed domen inhibira katepsin B, druga pa katepsin
L [68].
Testikan-1 je ekstracelularen hondroitin sulfatni proteoglikan, ki je bil najprej odkrit v testisih
[69], od koder mu tudi ime, najvišji nivo ekspresije pa je v možganih [70,71]. Njegova fiziološka
vloga še ni popolnoma raziskana, znano pa je, da inhibira tvorbo nevritov in pritrjevanje na
podlago pri nekaterih možganskih celicah, gojenih v celičnih kulturah [71]. Ker vsebuje
folistatinsko domeno, ki ji sledi ekstracelularna kalcij vezavna domena, spada tudi v družino
BM-40 (poglavje 1.2.1). 49 kDa veliko proteinsko jedro je sicer zgrajeno iz petih domen (slika
1.18), od katerih so tri podobne inhibitorjem proteaz oz. imajo inhibitorne lastnosti. Nterminalna
za testikane specifična domena inhibira nekatere metaloproteaze, vsebuje pa tudi
kazalni modul kot del folistatinske domene (poglavje 1.2.1) [70]. Poleg tega testikan-1 inhibira
tudi katepsin L (Ki = 0,7 nM) [70], za kar je odgovorna tiroglobulinska domena tipa 1 [Meh, P. in
sod., v tisku]. Zanimivo je, da tiroglobulinska domena ni le inhibitor, ampak tudi substrat
katepsina L, je pa tudi substrat katepsina K, čeprav ni inhibitor le-tega [Meh, P. in sod., v tisku].
Slika 1.18: Modularna zgradba testikana-1. TST – za testikane
specifična domena, FS – folistatinska domena, EC – ekstracelularna kalcij
vezavna domena, TG – tiroglobulinska domena tipa 1, AC – domena,
bogata s kislimi ostanki.
Tiroglobulinske domene tipa 1 so torej lahko inhibitorji papainu podobnih cisteinskih
proteaz, njihovi substrati ali pa z njimi sploh ne interagirajo. Vzroki tega še niso razjasnjeni, na
podlagi računalniških modelov pa je moč sklepati, da so posredi najverjetneje tako sterične kot
elektrostatske interakcije [31; Meh, P. in sod., v tisku].
Stran 10

2. Namen dela
Namen dela
SMOC-1 je proteoglikan, ki vsebuje dve tiroglobulinski domeni tipa 1. Obe kažeta znatno
homologijo s tiropini, skupino inhibitorjev papainu podobnih cisteinskih proteaz.
Namen diplomske naloge je bil razviti sistem za pridobivanje rekombinantnega proteina SMOC-1
ter ločeno njegovih tiroglobulinskih domen tipa 1. Sistem bi moral omogočati pridobivanje
zadostnih količin rekombinantnega materiala za karakterizacijo in študije interakcij s potencialnimi
tarčnimi proteini. Za izražanje celega proteina SMOC-1 smo izbrali bakulovirusni ekspresijski sistem,
posamezni domeni pa smo se odločili izraziti v topni obliki v E. coli. Nameravali smo pridobiti
poliklonska proti-SMOC-1 protitelesa in v ta namen SMOC-1 izraziti v obliki inkluzijskih telesc v E.
coli, protein v taki obliki pa smo nameravali tudi renaturirati.
Stran 11

3. Materiali in metode
3.1. Materiali
3.1.1. cDNA zapis za SMOC-1
Materiali in metode
Pri RZPD GmbH (Nemčija) je bil naročen cDNA zapis celotnega kodirajočega zaporedja za
SMOC-1 z identifikacijsko številko IRAKp961G1312Q. Gre za cDNA zapis, vključen v plazmidni
vektor pCMV-SPORT6, ki kot selekcijski marker nosi zapis za rezistenco proti ampicilinu.
Gostiteljski organizem vektorja je bila bakterija E. coli seva DH10B TonA. Zaporedje cDNA zapisa
ter prevedeno aminokislinsko zaporedje sta prikazani na sliki 3.1.
atgctgcccgcgcgctgcgcccgcctgctcacgccccacttgctgctggtgttggtgcag
M L P A R C A R L L T P H L L L V L V Q
ctgtcccctgctcgcggccaccgcaccacaggccccaggtttctaataagtgaccgtgac
L S P A R G H R T T G P R F L I S D R D
ccacagtgcaacctccactgctccaggactcaacccaaacccatctgtgcctctgatggc
P Q C N L H C S R T Q P K P I C A S D G
aggtcctacgagtccatgtgtgagtaccagcgagccaagtgccgagacccgaccctgggc
R S Y E S M C E Y Q R A K C R D P T L G
gtggtgcatcgaggtagatgcaaagatgctggccagagcaagtgtcgcctggagcgggct
V V H R G R C K D A G Q S K C R L E R A
caagccctggagcaagccaagaagcctcaggaagctgtgtttgtcccagagtgtggcgag
Q A L E Q A K K P Q E A V F V P E C G E
gatggctcctttacccaggtgcagtgccatacttacactgggtactgctggtgtgtcacc
D G S F T Q V Q C H T Y T G Y C W C V T
ccggatgggaagcccatcagtggctcttctgtgcagaataaaactcctgtatgttcaggt
P D G K P I S G S S V Q N K T P V C S G
tcagtcaccgacaagcccttgagccagggtaactcaggaaggaaagatgacgggtctaag
S V T D K P L S Q G N S G R K D D G S K
ccgacacccacgatggagacccagccggtgttcgatggagatgaaatcacagccccaact
P T P T M E T Q P V F D G D E I T A P T
ctatggattaaacacttggtgatcaaggactccaaactgaacaacaccaacataagaaat
L W I K H L V I K D S K L N N T N I R N
tcagagaaagtctattcgtgtgaccaggagaggcagagtgccctggaagaggcccagcag
S E K V Y S C D Q E R Q S A L E E A Q Q
aatccccgtgagggtattgtcatccctgaatgtgcccctgggggactctataagccagtg
N P R E G I V I P E C A P G G L Y K P V
caatgccaccagtccactggctactgctggtgtgtgctggtggacacagggcgcccgctg
Q C H Q S T G Y C W C V L V D T G R P L
cctgggacctccacacgctacgtgatgcccagttgtgagagcgacgccagggccaagact
P G T S T R Y V M P S C E S D A R A K T
acagaggcggatgaccccttcaaggacagggagctaccaggctgtccagaagggaagaaa
T E A D D P F K D R E L P G C P E G K K
atggagtttatcaccagcctactggatgctctcaccactgacatggttcaggccattaac
M E F I T S L L D A L T T D M V Q A I N
tcagcagcgcccactggaggtgggaggttctcagagccagaccccagccacaccctggag
S A A P T G G G R F S E P D P S H T L E
gagcgggtagtgcactggtatttcagccagctggacagcaatagcagcaacgacattaac
E R V V H W Y F S Q L D S N S S N D I N
aagcgggagatgaagcccttcaagcgctacgtgaagaagaaagccaagcccaagaaatgt
K R E M K P F K R Y V K K K A K P K K C
gcccggcgtttcaccgactactgtgacctgaacaaagacaaggtcatttcactgcctgag
A R R F T D Y C D L N K D K V I S L P E
ctgaagggctgcctgggtgttagcaaagaaggacgcctcgtctaa
L K G C L G V S K E G R L V
Slika 3.1: Nukleotidno zaporedje cDNA zapisa za SMOC-1 in prevedeno
aminokislinsko zaporedje. Aminokislinski ostanki signalnega peptida so
prikazani poševno, tisti obeh tiroglobulinskih domen pa so obarvani modro.
Stop kodon je obarvan rdeče.
Stran 12

3.1.2. Vektorji
3.1.2.1. pPCR-Script Amp SK(+)
Materiali in metode
pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, ZDA) je klonirni plazmidni vektor, ki omogoča hitro in
učinkovito vključevanje PCR produktov s topimi konci. Deluje po principu ligacije takih insertov v
restrikcijsko mesto SrfI, ki se ob uspešni vključitvi uniči, v primeru, ko se zapre vektor brez inserta,
pa se restrikcijsko mesto ohrani in restriktaza SrfI, ki je prisotna v reakcijski mešanici, vektor
ponovno cepi (slika 3.2).
Slika 3.2: Princip kloniranja v
vektor pPCR-Script Amp SK(+).
Plazmidna karta vektorja je prikazana na sliki 3.3. Vektor vsebuje replikatorsko mesto plazmida
pUC, ki mu omogoča razmnoževanje v E. coli v visokem številu kopij na celico. Kot selekcijski
marker nosi gen za rezistenco proti ampicilinu. Ob vstavitvi inserta v klonirno mesto se prekine
bralni okvir zapisa lacZ', ki je pod kontrolo lac promoterja. To nam omogoča selekcijo
transformant, ki imajo v vektor vstavljen insert, z α-komplementacijo, seveda v kombinaciji z
ustreznim gostiteljskim sevom E. coli. Plazmid vsebuje tudi mesto začetka replikacije nitastega
faga f1, ki omogoča sintezo ssDNA s (+) verige plazmida.
Slika 3.3: Plazmidna karta vektorja pPCR-
Script Amp SK(+).
pUC ori – mesto začetka replikacije
plazmida pUC; P lac – lac promoter; MCS
– klonirno mesto; lacZ' – zapis za lacZα
peptid; f1 (+) ori – mesto začetka
replikacije faga f1; ampicillin – zapis za
rezistenco proti ampicilinu.
Stran 13

3.1.2.2. pET-28b(+)
Materiali in metode
pET-28b(+) (Novagen, Nemčija) je ekspresijski plazmidni vektor, ki omogoča izražanje
rekombinantnih proteinov v E. coli. Kompatibilen je s sevi, ki vsebujejo lizogen bakteriofag DE3, ki
omogoča prepisovanje s promoterja bakteriofaga T7. Na sliki 3.4 je prikazana plazmidna karta
vektorja pET-28b(+).
Slika 3.4: Plazmidna karta vektorja pET-28b(+).
pBR322 ori – mesto začetka replikacije plazmida
pBR322; lacI – zapis za lac represorski protein;
MCS – klonirno mesto; f1 (+) ori – mesto začetka
replikacije faga f1; Kan – zapis za rezistenco proti
kanamicinu.
Vektor vsebuje replikator plazmida pBR322, ki mu omogoča razmnoževanje v E. coli v nizkem
številu kopij. Kot selekcijski marker nosi zapis za rezistenco proti kanamicinu.
Vektor vsebuje tudi replikator faga f1, ki omogoča sintezo ssDNA s (+) verige.
Zapis za rekombinanten protein vstavimo v klonirno mesto, prepisovanje pa poteka z močnega
T7 promoterja, ki je pod kontrolo lac operatorja. Dodatno vsebuje vektor še zapis lacI, ki kodira za
lac represorski protein. Ta se veže na lac operator in preprečuje prepisovanje s promoterja pred
indukcijo ekspresije.
Vektor omogoča fuzije zapisa za rekombinanten protein z zapisi za C-terminalno His 6 oznako, Nterminalno
His 6 oznako ter N-terminalno ali C-terminalno T7 oznako. His 6 oznaka omogoča izolacijo
proteina z afinitetno kromatografijo, pa tudi imunodetekcijo z ustreznimi protitelesi.
Imunodetekcijo proteina omogoča tudi T7 oznaka. N-terminalno His 6 oznako se da iz fuzijskega
proteina odcepiti s trombinom.
3.1.2.3. pET-32b(+)
Vektor pET-32b(+) (Novagen, Nemčija) tako kot vektor pET-28b(+) omogoča izražanje
rekombinantnih proteinov s T7 promoterja pod kontrolo lac operatorja v E. coli in prav tako
vsebuje mesto začetka replikacije plazmida pBR322, replikator faga f1 ter zapis lacI.
Selekcijski marker pri tem vektorju je zapis za rezistenco proti ampicilinu.
Posebnost vektorja je možnost fuzije zapisa za rekombinanten protein z zapisom trxA, ki kodira
za tioredoksin. Ta N-terminalna fuzija bi naj izboljšala topnost nekaterih proteinov v citoplazmi E.
coli, saj bi naj pospeševala zvijanje fuzijskih partnerjev [72].
Vektor dodatno omogoča tako N-terminalno kot C-terminalno fuzijo s His 6 oznako ter Nterminalno
fuzijo z S oznako. Slednja omogoča kvantitativno analizo ekspresije, detekcijo
rekombinantnega proteina in njegovo izolacijo z afinitetno kromatografijo. Za odcep N-terminalnih
fuzij sta na voljo cepitveni mesti za trombin in enterokinazo.
Plazmidna karta vektorja pET-32b(+) je prikazana na sliki 3.5.
Stran 14

3.1.2.4. Bakulovirusni ekspresijski sistem Bac-to-Bac
Materiali in metode
Slika 3.5: Plazmidna karta vektorja pET-32b(+).
pBR322 ori – mesto začetka replikacije
plazmida pBR322; lacI – zapis za lac represorski
protein; trxA – zapis za tioredoksin; MCS –
klonirno mesto; f1 (+) ori – mesto začetka
replikacije faga f1; Amp – zapis za rezistenco
proti ampicilinu.
Sistem Bac-to-Bac (Invitrogen, ZDA) temelji na mestno-specifični transpoziciji ekspresijske
kasete iz donorskega plazmida v bakulovirusni prenosni vektor, ki se razmnožuje v E. coli.
Kot donorski plazmid smo uporabili plazmidni vektor pFastBac 1, katerega plazmidna karta je
prikazana na sliki 3.6.
Slika 3.6: Plazmidna karta vektorja pFastBac 1.
pUC ori – mesto začetka replikacije plazmida
pUC; Ampicillin - zapis za rezistenco proti
ampicilinu; f1 ori – mesto začetka replikacije faga
f1; Tn7L – leva ročica transpozona Tn7; SV40 pA
– poliadenilacijski signal opičjega virusa SV40;
P PH – polihedrinski promoter; Gentamicin – zapis
za rezistenco proti gentamicinu; Tn7R – desna
ročica transpozona Tn7.
Vektor pFastBac 1 vsebuje replikatorsko mesto plazmida pUC, ki mu omogoča razmnoževanje
v gostiteljskih celicah E. coli v visokem številu kopij in replikator faga f1, ki omogoča sintezo
ssDNA s plazmida, kot selekcijski marker pa nosi zapis za odpornost proti ampicilinu.
Zapis za rekombinanten protein vstavimo v klonirno mesto znotraj ekspresijske kasete, ki jo
omejujeta leva in desna ročica bakterijskega transpozona Tn7. Ti dve mesti omogočata mestnospecifično
transpozicijo rekombinantnega zapisa v bakulovirusni vektor (slika 3.7).
Stran 15

Materiali in metode
Slika 3.7: Transpozicija ekspresijske kasete iz
donorskega plazmida v bakmid.
Prepisovanje rekombinantnega zapisa pri izražanju v insektnih celicah je pod kontrolo
polihedrinskega promoterja multiplega nuklearnega polihedroznega virusa deteljne sovke
Autographa californica (AcMNPV), zapisu za rekombinanten protein pa sledi poliadenilacijski
signal opičjega virusa SV40.
V okviru ekspresijske kasete se nahaja tudi zapis za rezistenco proti gentamicinu, ki omogoča
selekcijo po transpoziciji v gojišču z gentamicinom.
Bakulovirusni prenosni vektor bMON14272, ki ga krajše imenujemo bakmid, je modificiran
genom AcMNPV, ki se v gostiteljskih celicah E. coli (poglavje 3.1.5) razmnožuje kot velik plazmid.
Razmnoževanje mu omogoča replikon mini-F, kot selekcijski marker pa uporablja zapis za
rezistenco proti kanamicinu.
Vsebuje tudi zapis za lacZα peptid, ki lahko komplementira mutacijo zapisa za ta peptid na
kromosomu E. coli. V zapis za lacZα je vstavljeno mesto mini-attTn7, in sicer tako, da ne prekinja
bralnega okvirja zapisa za lacZα. V to mesto se z mestno-specifično transpozicijo prenese
ekspresijska kaseta iz vektorja serije pFastBac in pri tem prekine bralni okvir za lacZα. Na ta način je
z α-komplementacijo omogočena selekcija kolonij, pri katerih je prišlo do transpozicije.
3.1.3. Začetni oligonukleotidi
Na tem mestu navajam zaporedja začetnih oligonukleotidov, ki smo jih uporabljali pri delu.
Razvrstil in poimenoval sem jih po namenu uporabe, označil restrikcijska mesta in navedel
temperature tališč. Vsi za SMOC-1 specifični začetni oligonukleotidi so od proizvajalca MWG
Biotech AG (Nemčija), univerzalni pa od proizvajalca Promega (ZDA).
Kloniranje zapisa za SMOC-1 brez signalnega peptida za izražanje v E.coli:
5' začetni oligonukleotid ECN (modro je označen start kodon):
NcoI
5'-CATGCCATGGGCCACCGCACCACAGG-3' T m = 81,3 °C
3' začetni oligonukleotid ECC (rdeče je označen stop kodon):
XhoI
5'-CCGCTCGAGTTAGACGAGGCGTCCTTCTTTGC-3' T m = 73,2 °C
Kloniranje zapisa za prvo tiroglobulinsko domeno SMOC-1 za izražanje v E. coli:
5' začetni oligonukleotid T1N (modro je označen start kodon):
NcoI
5'-CATGCCATGGGCCAGAGCAAGTGTCGCC-3' T m = 74,4 °C
3' začetni oligonukleotid T1C:
XhoI
5'-CGGCTCGAGTGAACATACAGGAGTTTTATTCTGCACAG-3' T m = 71,6 °C
Stran 16

Kloniranje zapisa za drugo tiroglobulinsko domeno SMOC-1 za izražanje v E. coli:
5' začetni oligonukleotid T2N (modro je označen start kodon):
NcoI
5'-CATGCCATGGTCTATTCGTGTGACCAGGAGAG-3' T m = 69,7 °C
3' začetni oligonukleotid T2C:
XhoI
5'-CGGCTCGAGCTCACAACTGGGCATCACGTAG-3' T m = 73,6 °C
Kloniranje zapisa za cel SMOC-1 za izražanje v insektnih celicah:
5' začetni oligonukleotid BACN (modro je označen start kodon):
BamHI
5'-CGCGGATCCATGCTGCCCGCGCGCTG-3' T m = 81,3 °C
3' začetni oligonukleotid BACC (rdeče je označen stop kodon):
XhoI
5'-CCGCTCGAGTTAGACGAGGCGTCCTTCTTTGC-3' T m = 73,2 °C
Materiali in metode
5' začetni oligonukleotid BACL z L21 zaporedjem (modro je označen start kodon):
BamHI
5'-CGCGGATCCAACTCCTAAAAAACCGCCACCATGCTGCCCGCGCGCTG-3' T m = 89,5 °C
L21 zaporedje (označeno z zeleno), je zaporedje 21 nukleotidov tik pred mestom začetka
translacije. V nekaterih primerih prisotnost tega zaporedja, ki izvira iz 5' neprevedene regije zapisa
za tropomiozin jastoga močno poveča količino proizvedenega rekombinantnega proteina [73].
Za SMOC-1 specifični začetni oligonukleotidi za določanje nukleotidnega zaporedja zapisa:
Sekvenčni začetni oligonukleotid SEQ1:
5'-AGTGTCGCCTGGAGC-3' T m = 42,7 °C
Sekvenčni začetni oligonukleotid SEQ2:
5'-ATGAAATCACAGCCCC-3' T m = 41,9 °C
Sekvenčni začetni oligonukleotid SEQ3:
5'-GCGACGCCAGGG-3' T m = 44,0 °C
Univerzalni začetni oligonukleotidi:
Univerzalni začetni oligonukleotid U-20:
5'-GTTTTCCCAGTC-3' T m = 36,0 °C
Univerzalni začetni oligonukleotid R-40:
5'-AACAGCTATGAC-3' T m = 34,0 °C
Univerzalni začetni oligonukleotid T3:
5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3' T m = 48,0 °C
Stran 17

3.1.4. Bakterijski sevi
Pri delu smo uporabljali naslednje naslednje seve bakterije Escherichia coli:
Materiali in metode
DH5α (Invitrogen, ZDA), sev z genotipom SupE44 ∆lacU169 (Φ80 lacZ ∆M15) hdsR17 recA1
gyrA96 thi-1 relA1, je zaradi zmanjšane nukleazne aktivnosti primeren za vzdrževanje plazmidne
DNA. Delecija lacZ v kombinaciji s primernim vektorjem omogoča selekcijo transformant z αkomplementacijo.
BL21 (DE3) (Novagen, Nemčija) je sev z genotipom F - ompT hsdS B (r B - mB - ) gal dcm (DE3).V
genom ima vključen rekombinanten lizogen bakteriofag DE3, derivat bakteriofaga λ z vključenim
lacI genom in zapisom za RNA-polimerazo bakteriofaga T7 pod kontrolo lacUV5 promoterja, zato
se uporablja za ekspresijo proteinov z močnega T7 promoterja. Obenem ima ta sev zmanjšano
proteazno aktivnost.
Rosetta-gami (DE3) pLysS (Novagen, Nemčija), sev z genotipom ∆ara–leu7697 ∆lacX74
∆phoAPvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F'[lac+(lacIq)pro] gor522 ::Tn10 (TcR) trxB::kan
(DE3) pLysSRARE6 (CmR), ima v genom vključen enak rekombinanten bakteriofag kot sev BL21
(DE3). Sev vsebuje plazmid pLysSRARE6 z zapisi za tiste tRNA, ki se pri E. coli redko uporabljajo.
Na tem plazmidu je tudi zapis za T7 lizocim, ki razgrajuje manjše količine T7 RNA-polimeraze,
posledico puščanja lacUV5 promoterja. Kot selekcijski marker ta plazmid nosi zapis za rezistenco
proti kloramfenikolu. Sev ima tudi okvarjena gena za glutation-reduktazo in tioredoksin-reduktazo,
kar omogoča tvorbo disulfidnih vezi v citoplazmi. Selekcijska markerja za ohranjanje teh mutacij
sta rezistenca proti tetraciklinu oz. kanamicinu.
DH10Bac (Invitrogen, ZDA) je sev z genotipom F - mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZDM15
∆lacX74 deoR recA1 endA1 araD139 ∆ara–leu7697 galU galK rpsL nupG bMON14272 pMON7124.
Ta sev se uporablja za transpozicijo rekombinantnega zapisa iz vektorja vrste pFastBac v bakmid,
ki ga te celice vsebujejo. Poleg bakmida bMON14272 (poglavje 3.1.2.4) vsebuje tudi pomožni
plazmid pMON7124, ki nosi zapis za transpozazo in selekcijski marker za odpornost proti
tetraciklinu.
3.1.5. Bakterijska gojišča in antibiotiki
Za gojenje bakterij smo uporabljali naslednja, po sestavi bogata in kompleksna, gojišča:
Tekoče gojišče LB (Luria-Bertani) je najpogosteje uporabljano tekoče gojišče za bakterije. Za
pripravo enega litra gojišča smo v čašo zatehtali 10 g kazeinskega hidrolizata, 5 g kvasnega
ekstrakta in 10 g NaCl, dopolnili z dH 2O do 900 mL in mešali na magnetnem mešalu, dokler se vse
komponente niso raztopile. Nato smo uravnali pH na 7,0, dopolnili z dH 2O do 1 L in avtoklavirali.
Trdno agarno gojišče LB, ki mu pogosteje rečemo kar agarna plošča LB, je osnovno trdno
gojišče za bakterije. Pripravili smo ga enako kot tekoče gojišče, le da smo mu dodali še 15 g
agarja. Po avtoklaviranju smo pustili raztopino, da se je ohladila na približno 50 °C, nato pa smo jo
nalili v petrijevke do debeline plasti približno 1 cm in počakali, da se je agar strdil.
Tekoče gojišče S.O.C. je posebej bogato gojišče, ki se uporablja pri transformacijah. 100 mL
gojišča smo pripravili tako, da smo 2 g triptona, 0,5 g kvasnega ekstrakta in 0,5 g NaCl raztopili v
90 mL dH 2O, uravnali pH na 7,0, dodali še 6 mL vode in avtoklavirali. Po avtoklaviranju smo dodali
1 mL sterilno filtriranega 1 M MgCl 2, 1 mL sterilno filtriranega 1 M MgSO 4 in 2 mL sterilno filtrirane
20% (w/v) L-glukoze.
Trdno agarno gojišče Luria omogoča boljšo rast bakterijam kot agarno gojišče LB, ker vsebuje
bogatejši vir aminokislin. Pripravili smo ga enako kot agarno gojišče LB, le da smo namesto 10 g
kazeinskega hidrolizata uporabili 10 g peptona.
Trdno agarno gojišče z X-gal in IPTG se uporablja za selekcijo kolonij z α-komplementacijo.
Gojišče smo pripravili tako, da smo zmešali 40 µL raztopine X-gal (20 mg/mL v DMF), 10 µL 0,1 M
raztopine IPTG in 50 µL dH 2O ter to zmes razmazali na trdno agarno ploščo ali pa smo na 1 L
gojišča pred ulivanjem dodali 1 mL raztopine X-gal (100 mg/mL v DMF) in 200 µL raztopine IPTG
(200 mg/mL).
Stran 18

Materiali in metode
Antibiotiki, ki smo jih uporabljali pri delu z bakterijskimi celicami, so zbrani v tabeli 3.1, kjer so
podane tudi njihove založne ter delovne koncentracije. Vsi antibiotiki so bili od proizvajalca Sigma
(ZDA).
založna koncentracija delovna koncentracija
ampicilin 100 mg/mL 50 µg/mL
gentamicin 50 mg/mL 7 µg/mL
kanamicin 10 mg/mL 30 µg/mL*, 15 µg/mL**
kloramfenikol 25 mg/mL 34 µg/mL
tetraciklin 12,5 mg/mL 12,5 µg/mL
* rezistenca, zapisana na vektorju
** rezistenca, zapisana na kromosomu
Tabela 3.1: Antibiotiki, ki smo jih uporabljali pri delu z bakterijami.
Tekoča gojišča z antibiotiki smo pripravili tako, da smo v ohlajeno avtoklavirano gojišče
odpipetirali ustrezen volumen antibiotika trdna pa tako, da smo v ohlajeno avtoklavirano gojišče
odpipetirali ustrezen volumen antibiotika, tik preden smo ulili plošče.
3.1.6. Insektne celice in bakulovirusi
Pri delu smo uporabljali celice linije Sf9, izolirane iz ovarijskega tkiva organizma Spodoptera
frugiperda [74]. Celice te linije so sferične oblike in vse približno enake velikosti. V gojišču Sf-900 II
SFM (poglavje 3.1.7) se delijo na približno vsakih 48 ur, primerne pa so za gojenje tako v
monosloju kot v suspenzijski kulturi.
Insektne celice Sf9 smo gojili v avtomatsko vlaženem inkubatorju, termostatiranem na 27 °C. Pri
delu smo uporabljali plošče s šestimi oz. dvanajstimi vdolbinicami in strgala za celice proizvajalca
Techno Plastic Products AG (Švica).
Bakulovirus AcMNPV je dvoverižen DNA virus z velikostjo genoma približno 130 kb. Tekom
svojega življenjskega cikla se divji tip bakulovirusa pojavlja v dveh oblikah. Virioni služijo za
horizontalen prenos virusa med celicami gostiteljskega organizma, polihedroni, s polihedrinom
obdani skupki virionov, pa služijo za vertikalen prenos virusa med gostitelji. Življenjski cikel
bakulovirusa je sestavljen iz treh faz. V zgodnji fazi virus okuži celico in sprosti svojo DNA. Ta v
jedru ustavi izražanje gostiteljevih genov, začnejo pa se izražati zgodnji virusni geni. V pozni fazi se
izražajo virusni geni, potrebni za replikacijo virusne DNA in tvorbo virusne ovojnice. V tej fazi se iz
celice intenzivno izločajo virioni, vrhunec izločanja nastopi 18 do 36 ur po infekciji. V zelo pozni fazi
se sintetizirajo polihedrin in ostali proteini, potrebni za tvorbo polihedronov. Z nastajanjem
polihedronov pride do lize celice.
V rekombinantnem AcMNPV, dobljenem s sistemom Bac-to-Bac (poglavje 3.1.2.4), je zapis za
polihedrin zamenjan z zapisom za rekombinanten protein. Izražanje rekombinantnega proteina je
torej povezano z nastajanjem polihedronov in se začne približno 20 do 36 ur po infekciji. Po celični
kulturi pa se okužba širi z virioni, kar izkoriščamo za amplifikacijo oz. povečanje titra
rekombinantnega virusa.
3.1.7. Gojišče za insektne celice
Insektne celice smo gojili v brezserumskem gojišču Sf-900 II SFM. Liter gojišča smo pripravili
tako, da smo 38,10 g Sf-900 II SFM gojišča v prahu (Invitrogen, ZDA), 600 mg NaCl in 800 µL Sf-
900 II suplementa (Invitrogen, ZDA) raztopili v 900 mL dH 2O, uravnali pH na 5,9 in dopolnili z dH 2O
do 1 L. Po dodatku 350 mg NaHCO 3 se je pH dvignil na približno 6,2. Gojišče smo sterilno
prefiltrirali z uporabo vakuumskega filtracijskega sistema proizvajalca Techno Plastic Products AG
(Švica).
Stran 19

3.1.8. Ostali materiali
3.1.8.1. Encimi
Pri delu smo uporabljali naslednje encime:
Materiali in metode
• Pfu DNA-polimeraza in pripadajoč 10x pufer (MBI Fermentas, Latvija)
• Taq DNA-polimeraza in pripadajoči 10x pufri ter MgCl 2 (MBI Fermentas, Latvija)
• restriktazi NcoI in XhoI ter pripadajoča pufra 10x Y + /Tango in 10x R + z BSA (MBI
Fermentas, Latvija)
• restriktaza BamHI in pripadajoč 10x pufer BamHI z BSA (New England Biolabs, ZDA)
• T4 DNA-ligaza in pripadajoč 10x ligacijski pufer (Roche, Švica)
• RNaza I (Promega, ZDA)
• proteinaza K (Merck, Nemčija)
• DNaza I (Roche, Švica)
• lizocim (Promega, ZDA)
• s hrenovo peroksidazo konjugirana proti-zajčji IgG protitelesa (Roche, Švica)
3.1.8.2. Elektroforetski standardi
Pri delu smo uporabljali naslednje elektroforetske standarde (slika 3.8):
• GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas, Latvija)
• GeneRuler 1kb DNA Ladder (MBI Fermentas, Latvija)
• LMW-SDS Markers (Amersham Biosciences, ZDA)
• Novex Wide Range SeeBlue Plus 2 Prestained Standard (Helixx, Kanada)
Slika 3.8: Velikosti elektroforetskih standardov, ki smo jih uporabljali pri delu. (A) GeneRuler 1kb DNA
Ladder na 1% agaroznem gelu (velikosti standardov so v bp). (B) GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus na
1,7% agaroznem gelu (velikosti standardov so v bp). (C) LMW-SDS Markers na 12% poliakrilamidnem gelu
v prisotnosti NaDS (molekulske mase standardov so v kDa). (D) Novex SeeBlue Plus 2 Prestained Standard
na 20% poliakrilamidnem gelu v prisotnosti NaDS (navidezne molekulske mase so v kDa).
Stran 20

3.1.8.3. Kompleti reagentov
Pri delu smo uporabljali naslednje komplete reagentov:
Materiali in metode
• QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Nemčija)
• QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Nemčija)
• NucleoSpin Plasmid Kit (Macherey-Nagel, Nemčija)
• JetQuick Plasmid Miniprep Spin Kit (Genomed, Nemčija)
• BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, ZDA)
• PCR-Script Amp Cloning Kit (Stratagene, ZDA)
• DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen, Nemčija)
3.1.8.4. Ostale kemikalije
Pri delu smo uporabljali naslednje kemikalije (v abecednem vrstnem redu):
Agar (Sigma, ZDA), agaroza (Serva, Nemčija), akrilamid:bisakrilamid (37,5:1) (Fluka, Nemčija),
APS (Serva, Nemčija), bromfenol modro (LKB-produkter AG, Švedska), Cellfectin (Invitrogen,
ZDA), Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences, Velika Britanija), DAB (Sigma,
ZDA), DMF (Merck, Nemčija), DTT (BioVectra, Kanada), dNTP (Promega, ZDA), dH 2O, etanol (Carlo
Erba Reagenti, Italija), EDTA (Serva, Nemčija), etidijev bromid (Sigma, ZDA), fenol:kloroform (1:1)
(Serva, Nemčija), Freundov nepopoln adjuvans (Sigma, ZDA), glicerol (Carlo Erba Reagenti, Italija),
glicin (Serva, Nemčija), glutation – oksidirana oblika (Sigma, ZDA), glutation – reducirana oblika
(Sigma, ZDA), HEPES (Serva, Nemčija), imidazol (Fluka, Nemčija), IPTG (Sigma, ZDA), izopropanol
(Merck, Nemčija), kalcijev diklorid (CaCl 2) (Merck, Nemčija), kalijev acetat (Fluka, Nemčija), kalijev
klorid (KCl) (Riedel-de Haën, Nemčija), kalijev dihidrogenfosfat dihidrat (KH 2PO 4·2H 2O) (Riedel-de
Haën, Nemčija), kazeinski hidrolizat N-Z-Case (Sigma, ZDA), kvasni ekstrakt (Sigma, ZDA), Larginin
(Fluka, Nemčija), L-glukoza monohidrat (Fluka, Nemčija), magnezijev diklorid (MgCl 2)
(Sigma, ZDA), magnezijev sulfat (MgSO 4) (Fluka, Nemčija), β-merkaptoetanol (Serva, Nemčija),
metanol (Carlo Erba Reagenti, Italija), mleko v prahu (Pomurske mlekarne, Slovenija), natrijev
acetat (Carlo Erba Reagenti, Italija), NaDS (Serva, Nemčija), natrijev hidrogenkarbonat (NaHCO 3)
(Merck, Nemčija), natrijev hidroksid (NaOH) (Carlo Erba Reagenti, Italija), natrijev klorid (NaCl)
(Carlo Erba Reagenti, Italija), natrijev dihidrogen fosfat (NaH 2PO 4) (Fluka, Nemčija), dinatrijev
hidrogenfosfat dihidrat (Na 2HPO 4·2H 2O) (Fluka, Nemčija), nikljev sulfat heksahidrat (NiSO 4·6H 2O)
(Sigma, ZDA), ocetna kislina (Merck, Nemčija), pepton (Sigma, ZDA), PlusOne Coomassie Blue
PhastGel R-350 tablete (Amersham Biosciences, Velika Britanija), saharoza (Serva, Nemčija),
TEMED (Merck, Nemčija), tripton (Sigma, ZDA), Tris (Serva, Nemčija), Triton X-100 (Serva,
Nemčija), Tween-20 (Fluka, Nemčija), vodikov peroksid (H 2O 2), X-gal (BioVectra, Kanada)
3.1.8.5. Pomembnejše aparature
Pri delu smo uporabljali naslednje aparature:
• PCR aparatura Primus 96 Plus (MWG-Biotech AG, Nemčija)
• aparatura za agarozno gelsko elektroforezo (Owl Scientific, ZDA)
• aparatura za poliakrilamidno gelsko elektroforezo (BioRad, Nemčija)
• avtomatski DNA sekvenator ABI Prism 310 (Applied Biosystems, ZDA)
• centrifuga Sorvall RC5C Plus (Sorvall, Nemčija)
• mikrocentrifuga Eppendorf 5417R (Eppendorf, Nemčija)
Stran 21

3.2. Metode
3.2.1. Molekulsko kloniranje
3.2.1.1. Pomnoževanje cDNA zapisov s PCR
Materiali in metode
Verižna reakcija s polimerazo (angl. Polymerase Chain Reaction, PCR) je metoda, s katero
pomnožimo željen fragment DNA v velikem številu kopij. Deluje na principu denaturacije
dvoverižne matrične DNA, vezave specifičnih začetnih oligonukleotidov na oba konca zaporedja, ki
ga želimo pomnožiti ter podaljševanja verige DNA, katere začetnik je začetni oligonukleotid, s
termostabilno DNA-polimerazo. Tak cikel reakcij ponavadi ponovimo 30 do 40-krat. V vsakem ciklu
se število kopij zapisa podvoji, torej dobimo po koncu reakcije ogromno število kopij željenega
zapisa.
Za pomnoževanje cDNA zapisov s PCR smo pripravili naslednjo reakcijsko zmes:
matrična DNA 10 µL
5' začetni oligonukleotid (10 µM) 7 µL
3' začetni oligonukleotid (10 µM) 7 µL
mešanica dNTP (vsak 2 mM) 8 µL
10x Pfu pufer 10 µL
dH 2O 57 µL
Pfu DNA-polimeraza (1 U/µl) 1 µL
100 µL
Kot matrično DNA smo uporabili stokrat redčen plazmid pCMV-SPORT6 s cDNA zapisom za
SMOC-1 (poglavje 3.1.1) po mini preparaciji (poglavje 3.2.1.11). Pfu DNA-polimerazo smo dodali
na koncu.
PCR reakcija je bila izvedena po naslednjem programu:
začetna denaturacija 95 °C 1 min
denaturacija 95 °C 1 min
30x prileganje začetnih oligonukleotidov 65 °C 1 min
podaljševanje verige 72 °C 2 min 45 sec
zaključno podaljševanje 72 °C 10 min
hramba 4 °C
3.2.1.2. Čiščenje produktov po PCR reakciji
Po PCR reakciji je PCR produkte potrebno očistiti, tj. odstraniti nezreagirane začetne
oligonukleotide, nezreagirane dNTP in ostale komponente reakcijske zmesi.
PCR produkte smo očistili s kompletom reagentov QIAquick PCR Purification Kit. Pri postopku
čiščenja produktov PCR reakcije smo se držali navodil proizvajalca kompleta reagentov.
Stran 22

3.2.1.3. PCR bakterijske kolonije
Materiali in metode
PCR bakterijske kolonije je izvedenka PCR, kjer kot matrično DNA uporabimo bakterijsko
kolonijo z agarne plošče. Metoda je zelo uporabna za identifikacijo pozitivnih transformant, zlasti v
sistemih, ki ne omogočajo α-komplementacije.
Pripravili smo naslednjo reakcijsko zmes:
dH2O 9 µL
5' začetni oligonukleotid (10 µM) 2 µL
3' začetni oligonukleotid (10 µM) 2 µL
MgCl2 (25 mM) 2 µL
mešanica dNTP (po 2 mM) 2 µL
10x Taq pufer brez MgCl2 2 µL
19 µL
V reakcijsko zmes smo s sterilnim zobotrebcem inokulirali kolonijo transformante z agarne
plošče, nato pa smo kolonijo nacepili na novo agarno ploščo. PCR reakcija je potekala po
naslednjem programu:
začetna denaturacija 95 °C 10 min
premor 80 °C 10 min
denaturacija 95 °C 1 min
30x prileganje začetnih oligonukleotidov 65 °C 1 min
podaljševanje verige 72 °C 1 min
zaključno podaljševanje 72 °C 10 min
hramba 4 °C
V premoru smo v reakcijsko zmes dodali 1 µL Taq DNA-polimeraze (1 U/µL).
3.2.1.4. PCR bakmidne DNA
Ta metoda se uporablja za preverjanje transpozicije ekspresijske kasete iz vektorja pFastBac v
bakmid. Če je transpozicija iz vektorja pFastBac 1 potekla, dobimo v kombinaciji z začetnima
oligonukleotidoma U-20 in R-40 (poglavje 3.1.3) PCR produkte velikosti 2300 bp plus velikost
rekombinantnega zapisa, kar je v našem primeru pomenilo fragmente DNA velikosti dobrih 3500
bp, v nasprotnem primeru pa fragmente velikosti 300 bp.
Kot matrično DNA smo uporabili izolirano bakmidno DNA (poglavje 3.2.1.12). Pripravili smo
naslednjo reakcijsko zmes:
izolirana bakmidna DNA 1 µL
univerzalni U-20 začetni oligonukleotid (10 µM) 2 µL
univerzalni R-40 začetni oligonukleotid (10 µM) 2 µL
mešanica dNTP (vsak 2 mM) 2 µL
MgCl 2 (25 mM) 2 µL
10x Taq pufer 2 µL
dH 2O 8 µL
Taq DNA-polimeraza (1 U/µL) 1 µL
20 µL
Stran 23

PCR reakcija je bila izvedena po naslednjem programu:
začetna denaturacija 94 °C 3 min
denaturacija 94 °C 45 sec
30x prileganje začetnih oligonukleotidov 55 °C 45 sec
podaljševanje verige 72 °C 5 min
zaključno podaljševanje 72 °C 7 min
hramba 4 °C
3.2.1.5. PCR bakulovirusne DNA
Materiali in metode
S to metodo smo preverili prisotnost rekombinantnega zapisa v izoliranem bakulovirusu po
prečiščenju plakov (poglavje 3.2.3.5). Kot rezultat pričakujemo enake fragmente kot pri PCR
bakmidne DNA (poglavje 3.2.1.4). Kot matrično DNA smo uporabili bakulovirusno DNA, izolirano iz
insektnih celic (poglavje 3.2.1.13).
Pripravili smo reakcijsko zmes:
izolirana bakulovirusna DNA 4 µL
univerzalni U-20 začetni oligonukleotid (10 µM) 2 µL
univerzalni R-40 začetni oligonukleotid (10 µM) 2 µL
mešanica dNTP (vsak 2 mM) 2,5 µL
MgCl 2 (25 mM) 2,5 µL
10x Taq pufer 2,5 µL
DMSO 0,75 µL
dH 2O 7,75 µL
Taq DNA-polimeraza (1 U/µL) 1 µL
25 µL
PCR reakcija je bila izvedena po istem programu kot PCR bakmidne DNA (poglavje 3.2.1.4).
3.2.1.6. Agarozna gelska elektroforeza in detekcija DNA z etidijevim bromidom
Agarozna gelska elektroforeza (AGE) je postopek ločevanja DNA fragmentov na podlagi njihove
mobilnosti v agaroznem gelu pod vplivom enosmernega električnega toka. Pri pogojih izvedbe je
elektroforetska mobilnost linearnih fragmentov DNA obratnosorazmerna njihovi velikosti, krožne
molekule DNA pa potujejo nekoliko drugače.
Po končani elektroforezi smo ločene molekule DNA v gelu detektirali z etidijevim bromidom,
mutagenom, ki se interkalira med bazne pare DNA. Pri obsevanju z ultravijolično svetlobo
interkaliran etidijev bromid fluorescira rdeče-oranžno svetlobo valovne dolžine 590 nm.
Pri delu smo uporabljali različno zamrežene gele, in sicer 0,8%, 1%, 1,2% in 1,5% agarozne
gele. V erlenmajerico smo zatehtali ustrezno količino agaroze, npr. 0,6 g agaroze za pripravo 60 mL
1% gela, dodali 60 mL TAE pufra (40 mM Tris, 20 mM Na-acetat, 1 mM EDTA, pH=8,3) in zmes
segrevali v mikrovalovni pečici do vretja. Zmes smo pustili nekaj časa rahlo vreti, da se je raztopila
vsa agaroza, nato pa smo tekoč gel pustili ohladiti na približno 50 °C, ga nalili v elektroforezno
kadičko, vstavili glavniček in počakali, da se je gel strdil. Iz trdnega gela smo odstranili glavniček in
nalili v kadičko toliko TAE pufra, da je bil ves gel potopljen v njem.
Vzorce DNA smo za nanos na elektroforezo pripravili tako, da smo k 1 V vzorca dodali 1/5 V 6x
nanašalnega pufra in premešali. Tako pripravljene vzorce smo nanesli v žepke v gelu, priključili
električni tok in pustili delovati približno eno uro pri napetosti 12 V/cm.
Po kočnani elektroforezi smo gel 20 do 30 min barvali v raztopini etidijevega bromida (5 µg/mL),
nato pa osvetlili na transiluminatorju pri 312 nm.
Stran 24

3.2.1.7. Rezanje DNA z restrikcijskimi endonukleazami
Materiali in metode
Restrikcijske endonukleaze, ali krajše restriktaze, so encimi, ki katalizirajo hidrolizo točno
določenih fosfodiestrskih vezi v specifičnih zaporedjih dvoverižne DNA. Pri tem lahko ustvarijo
tope ali lepljive konce.
Pri delu smo uporabljali naslednje restriktaze:
BamHI (iz organizma Bacillus amyloliquefaciens) cepi zaporedje
NcoI (iz organizma Nocardia Corallina) cepi zaporedje
XhoI (iz organizma Xanthomonas holcicola) cepi zaporedje
Dvojna restrikcija z NcoI in XhoI:
Pripravili smo reakcijsko zmes:
DNA (plazmid po mini preparaciji) 22 µL
10x pufer Y + /Tango z BSA 6 µL
restriktaza XhoI (10 U/µL) 1 µL
restriktaza NcoI (10 U/µL) 1 µL
30 µL
5'-G↓G A T C C-3'
3'-C C T A G↑G-3'
5'-C↓C A T G G-3'
3'-G G T A C↑C-5'
5'-C↓T C G A G-3'
3'-G A G C T↑C-3'
Reakcijsko zmes smo inkubirali 3 ure pri 37 °C in nato reakcijo prekinili z dodatkom 6 µL 6x
nanašalnega pufra ter fragmente ločili na agarozni gelski elektroforezi.
Restrikcija z BamHI in XhoI:
Pripravili smo reakcijsko zmes:
DNA (plazmid po mini preparaciji) 25 µL
10x pufer BamHI z BSA 2,88 µL
restriktaza BamHI (10 U/µL) 1 µL
28,88 µL
Reakcijsko zmes smo inkubirali 2 uri pri 37 °C, nato pa DNA očistili s kompletom reagentov
QIAquick PCR purification kit po navodilih proizvajalca, le da smo DNA eluirali s 30 µL dH 2O.
Nato smo pripravili naslednjo reakcijsko zmes:
DNA (očiščena DNA po rezanju z BamHI) 25 µL
10x pufer R + z BSA 2,88 µL
restriktaza XhoI (10 U/µL) 1 µL
28,88 µL
Reakcijsko zmes smo inkubirali 2 uri pri 37 °C in nato reakcijo prekinili z dodatkom 6 µL 6x
nanašalnega pufra ter fragmente ločili na agarozni gelski elektroforezi.
Stran 25

3.2.1.8. Izolacija DNA iz agaroznega gela
Materiali in metode
Princip ločevanja fragmentov DNA na agarozni gelski elektroforezi lahko uporabimo za izolacijo
željenega fragmenta DNA od ostalih, ki so prisotni v vzorcu.
Fragmente DNA, ki so bili prisotni v vzorcu, smo ločili na agarozni gelski elektroforezi, nato pa
gel pobarvali z etidijevim bromidom, osvetlili na transiluminatorju in izrezali liso, ki je pripadala
željenemu fragmentu. Iz te rezine agaroze smo DNA izolirali s kompletom reagentov QIAquick Gel
Extraction Kit po navodilih proizvajalca.
3.2.1.9. Ligacija zapisa v vektor
DNA-ligaze so encimi, ki katalizirajo tvorbo fosfodiestrskih vezi med dvema fragmentoma DNA
tako med fragmenti z lepljivimi konci kot med fragmenti s topimi konci. Pri delu smo uporabljali
DNA-ligazo bakteriofaga T4.
Pripravili smo naslednjo ligacijsko zmes:
izolirana DNA vektorja 2 µL
izolirana DNA zapisa 5 µL
10x T4 ligacijski pufer 1 µL
T4 DNA-ligaza (5 U/µL) 1 µL
dH 2O 1 µL
10 µL
Ligacijsko zmes smo čez noč inkubirali v vodni kopeli pri 16 °C.
3.2.1.10. Kloniranje zapisa v vektor pPCR-Script Amp SK(+)
Vektor pPCR Script Amp SK(+) je del kompleta reagentov PCR-Script Amp Cloning Kit. Princip
kloniranja zapisa v restrikcijsko mesto SrfI je prikazan v poglavju 3.1.2.1. SrfI je restriktaza, ki cepi
zaporedje
5'-G C C C↓G G G C-3'
3'-C G G G↑C C C G-5'
Ker so bili zapisi, ki smo jih klonirali v vektor, dobljeni s pomnoževanjem s Pfu DNA-polimerazo,
so že imeli tope konce in smo jih lahko direktno ligirali v vektor.
Pripravili smo naslednjo reakcijsko zmes:
pPCR-Script Amp SK(+) (10 ng/µL) 1 µL
PCR-Script 10x pufer 1 µL
rATP (10 mM) 0,5 µL
očiščen PCR produkt 4 µL
restriktaza SrfI (5 U/µL) 1 µL
T4 DNA-ligaza (4 U/µL) 1 µL
dH 2O 1,5 µL
10 µL
Reakcijsko zmes smo inkubirali eno uro pri 37 °C, nato pa reakcijo prekinili z 10 min inkubacijo v
vodni kopeli pri 65 °C.
Stran 26

3.2.1.11. Izolacija plazmidne DNA
Materiali in metode
Vse izolacije plazmidne DNA so bile glede na količino izoliranih plazmidov mini preparacije in
so potekale s kompleti reagentov NucleoSpin Plasmid Kit ali JetQuick Plasmid Kit. Pri obeh gre
praktično za enak princip kombinacije alkalne lize celic in vezave plazmidne DNA na kolono.
Plazmide smo izolirali iz prekonočnih kultur E. coli (poglavje 3.2.2.1). Pri plazmidih, ki se v
celicah E. coli razmnožujejo v visokem številu kopij, smo izhajali iz 3 do 5 mL prekonočne kulture,
pri tistih, ki se razmnožujejo v nizkem številu kopij, pa iz 6 do 7,5 mL prekonočnih kultur.
Pri delu smo sledili navodilom proizvajalca kompleta reagentov. Uspešnost izolacije smo
preverili z agarozno gelsko elektroforezo (poglavje 3.2.1.6).
3.2.1.12. Izolacija bakmidne DNA
Izolacija bakmidne DNA je postopek mini preparacije, prirejen za izolacijo velikih plazmidov.
3 mL prekonočne kulture smo centrifugirali 1 min pri 14.000×g. Supernatant smo odstranili,
celice pa resuspendirali v 300 µL raztopine I (15 mM Tris pH=8,0, 10 mM EDTA, 100 µg/mL RNaza
I). Dodali smo 300 µL raztopine II (0,2 M NaOH, 1% NaDS), premešali z obračanjem
mikrocentrifugirke in inkubirali 5 min na sobni temperaturi. Nato smo dodali 300 µL raztopine III (3
M K-acetat pH=5,5), ponovno premešali z obračanjem mikrocentrifugirke ter inkubirali 10 min na
ledu. Po centrifugiranju 10 min pri 14.000×g smo supernatant prenesli v mikrocentrifugirko z 800
µL izopropanola, premešali z obračanjem mikrocentrifugirke in inkubirali 10 min na ledu. Oborjeno
DNA smo odcentrifugirali s centrifugiranjem 15 min pri 14.000×g, odstranili supernatant in
usedlino sprali z dodatkom 500 µL 70% etanola ter obračanjem mikrocentrifugirke. Centrifugirali
smo 5 min pri 14.000×g in ponovili postopek spiranja. Nato smo odstranili supernatant in oborino
posušili na zraku. Posušeni oborini smo dodali 40 µL pufra TE (10 mM Tris pH=8,0, 1 mM EDTA) in
počakali, da se je vsa DNA raztopila. Raztopino bakmidne DNA smo shranili na 4 °C.
3.2.1.13. Izolacija bakulovirusne DNA iz transficiranih insektnih celic
Bakulovirusno DNA smo izolirali iz insektnih celic po transfekciji z izoliranim plakom (poglavje
3.2.3.4).
Gojišče, ki je vsebovalo ekstracelularne viruse in odlepljene celice, smo sterilno odstranili, k
pritrjenim celicam pa dodali 1 mL PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2HPO 4, 0,24 g KH 2PO 4 na 1 L
dH 2O, pH=7,4). Celice smo postrgali s strgalom, suspenzijo prenesli v mikrocentrifugirko in
centrifugirali 1 min pri 1.000×g. Supernatant smo odstranili, usedlino celic pa resuspendirali v 250
µL litičnega pufra (50 mM Tris pH=8,0, 10 mM EDTA, 5% β-merkaptoetanol, 0,4% NaDS), dodali
12,5 µL proteinaze K (10 mg/mL) in 10 µL RNaze I (10 mg/mL) ter inkubirali 30 min na 37 °C. Po
inkubaciji smo dodali 500 µL mešanice fenol:kloroform (1:1) in 5 min mešali z obračanjem
mikrocentrifugirke. Fazi smo ločili s centrifugiranjem 2 min pri 20.000×g, nato pa vodno fazo
prenesli v novo mikrocentrifugirko. Dodali smo 50 µL 3 M Na-acetata (pH=5,2) in 1 mL
absolutnega etanola ter inkubirali 10 min pri -20 °C. Centrifugirali smo 5 min pri 20.000×g,
odstranili supernatant, usedlino DNA pa sprali s 500 µL 70% etanola. Centrifugirali smo 5 min pri
20.000×g, ponovili postopek spiranja, nato pa usedlino posušili na zraku. Posušeni usedlini smo
dodali 50 µL pufra TE (10 mM Tris pH=8,0, 1 mM EDTA) in jo čez noč inkubirali pri 4 °C, da se je
DNA raztopila.
Stran 27

3.2.1.14. Obarjanje DNA iz etanola
Materiali in metode
Obarjanje DNA iz etanola smo uporabili za dodatno čiščenje plazmidne DNA po izolaciji s
kompletom reagentov.
K 1 V raztopine DNA smo dodali 2,5 V absolutnega etanola in 0,11 V 3 M Na-acetata (pH=5,2)
ter premešali. Nato smo zmes centrifugirali 10 min pri 20.000×g, odstranili supernatant, sprali
usedlino z 1 V 70% etanola in močno pretresli. Sprano DNA smo centrifugirali 3 min pri 20.000×g,
odstranili supernatant in usedlino posušili na zraku. DNA smo raztopili v dH 2O.
3.2.1.15. Določanje nukleotidnega zaporedja na avtomatskem sekvenatorju
Nukleotidna zaporedja DNA je možno določati po več različnih postopkih. Pri delu smo
nukleotidna zaporedja določali na avtomatskem sekvenatorju ABI PRISM 310, ki temelji na
dideoksi metodi. Po tem postopku s PCR pomnožimo fragment ssDNA v prisotnosti ustreznega
začetnega oligonukleotida. Reakcijska zmes vsebuje fluorescenčno označene
dideoksiribonukleotide. Ob vgradnji teh se pomnoževanje zaključi, saj ne vsebujejo 3'-OH skupine,
ki je potrebna za dodajanje novega nukleotida pri replikaciji DNA. Ker se vgrajujejo naključno,
dobimo različno dolge fragmente DNA, ki jih sekvenator loči s kapilarno elektroforezo, pri tem pa s
pomočjo laserja določi tip končnega nukleotida.
Za sekveniranje smo uporabljali zapise, vključene v klonirni vektor pPCR-Script Amp SK(+).
Plazmidna DNA je bila pred PCR reakcijo očiščena z obarjanjem iz etanola, koncentracija DNA pa
ocenjena na agarozni gelski elektroforezi. Uporabili smo komplet reagentov BigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit.
Pripravili smo naslednjo reakcijsko zmes za PCR reakcijo:
Terminator Ready Reaction Mix 8 µL
plazmidna DNA (500 - 800 ng) različno
začetni oligonukleotid (3,2 µM) 1 µL
dH 2O do 20 µL
20 µL
PCR reakcija je potekala po naslednjem programu:
začetna denaturacija 96 °C 4 min
denaturacija 96 °C 10 s
30x prileganje začetnih oligonukleotidov 40 °C 5 s
podaljševanje verige 60 °C 4 min
zaključno podaljševanje 60 °C 5 min
hramba 4 °C
Po PCR reakciji smo PCR produkte očistili s kompletom reagentov Dye-Ex 2.0 Spin Kit, dobljene
eluate posušili na koncentratorju in oddali za določitev nukleotidnega zaporedja.
Stran 28

3.2.2. Delo z bakterijami
3.2.2.1. Prekonočne kulture E. coli
Materiali in metode
Prekonočne kulture E. coli smo pripravili tako, da smo bakterijsko kolonijo z agarne plošče
precepili v 5 do 10 mL tekočega gojišča LB z ustreznim antibiotikom in čez noč inkubirali pri 37 °C s
stresanjem z 250 rpm.
3.2.2.2. Priprava kompetentnih celic E. coli
Kompetenca je naravna sposobnost nekaterih bakterij, da sprejmejo tujo DNA. E. coli te
sposobnosti sama po sebi nima, obstaja pa več postopkov, s katerimi se da membrani in celično
steno E. coli toliko permeabilizirati, da lahko vanjo vnesemo tujo DNA. Kompetentne celice smo
pripravili po metodi s CaCl 2.
Izolirano kolonijo E. coli smo inokulirali v 5 mL gojišča LB z ustreznim antibiotikom in stresali
čez noč pri 37 °C. Prekonočno kulturo smo inokulirali v 200 mL gojišča in stresali pri 37 °C. Rast
bakterij smo spremljali z merjenjem optične gostote pri 600 nm (OD 600). Celice smo gojili do
vrednosti OD 600 približno 0,375, nato pa smo kulturo alikvotirali na štiri alikvote in jih inkubirali 10
min na ledu. Celice smo odcentrifugirali s centrifugiranjem 7 min pri 1.600×g in 4 °C, pri čemer
smo izključili ustavljanje centrifuge z dodatnim zaviranjem. Supernatant smo odlili, celice pa na
ledu nežno resuspendirali v po 10 mL ledeno hladne raztopine CaCl 2 (60 mM CaCl 2, 15% glicerol,
10 mM HEPES, pH=7,0). Ponovno smo jih odcentrifugirali, tokrat s centrifugiranjem 5 min pri
1.100×g in 4 °C. Supernatant smo odstranili, celice pa resuspendirali v 10 mL ledeno hladne
raztopine CaCl 2 in inkubirali na ledu 30 min. Po inkubaciji smo celice ponovno centrifugirali 5 min
pri 1.100×g in 4 °C, odstranili supernatant, jih resuspendirali v po 2 mL ledeno hladne raztopine
CaCl 2 in jih alikvotirali v 200 µL alikvote, ki smo jih shranili na -70 °C.
3.2.2.3. Transformacija kompetentnih celic E. coli
Transformacija pomeni vnos tuje DNA v bakterijske celice. Temelji na inkubaciji plazmidne DNA
s kompetentnimi celicami, ki ji sledi toplotni šok, pri katerem se membrane ponovno popolnoma
zlijejo. Nato celice nekaj časa gojimo v gojišču brez selecije, da omogočimo sintezo proteinov
selekcijskih markerjev. Sledi selekcija transformant na selekcijskem gojišču.
Kompetentne celice E. coli smo transformirali z izolirano plazmidno DNA (poglavje 3.2.1.11) ali
z ligacijsko mešanico (poglavji 3.2.1.9 in 3.2.1.10). V primeru transformacije s plazmidno DNA, smo
uporabili 0,5 µl le-te, pri transformaciji z ligacijsko mešanico pa smo kompetentnim celicam dodali
5 µl slednje.
Kompetentne celice, shranjene na -70 °C, smo odtalili na ledu, k 200 µl dodali DNA, premešali z
obračanjem mikrocentrifugirke in inkubirali na ledu 30 min. Nato smo jih za 45 do 60 s prestavili v
vodno kopel, segreto na 42 °C, ter ponovno za 2 min dali na led. Dodali smo jim 800 µL gojišča LB
brez antibiotikov in stresali 1 uro pri 37 °C. Celice smo posedli s centrifugiranjem 3 min pri
3.500×g, odstranili 900 µL supernatanta, celice resuspendirali v preostanku in razmazali na agarno
ploščo z ustreznimi antibiotiki. Plošče smo inkubirali čez noč pri 37 °C.
Nekoliko drugačen postopek smo uporabili pri transformaciji kompetentnih celic seva DH10Bac
(poglavje 3.1.4) s plazmidom pFastBac 1 (poglavje 3.1.2.4). Tukaj smo celicam dodali S.O.C.
gojišče (poglavje 3.1.5) in stresali 4 ure pri 37 °C. Nato smo na agarne plošče Luria nanesli serijske
redčitve celic od 10 -1 do 10 -5 . Serijsko redčitev 10 -1 smo nanesli tako, da smo na ploščo razmazali
100 µL od skupno 1 mL celic, za redčitev 10 -2 smo zmešali 100 µL celic z 900 µL gojišča in na
Stran 29

Materiali in metode
ploščo razmazali 100 µL, za redčitev 10 -3 smo zmešali 100 µL serijske redčitve celic 10 -2 in 900 µL
gojišča ter ponovno razmazali 100 µL na ploščo, itd. Plošče smo inkubirali 48 ur pri 37 °C.
Po transformaciji celic DH10Bac s plazmidom pFastBac 1, kakor tudi po transformaciji celic
DH5α (poglavje 3.1.4) s plazmidom pPCR-Script Amp SK(+) (poglavje 3.1.2.1), smo transformante
selekcionirali na gojišču z X-gal in IPTG (poglavje 3.1.5), saj ti dve kombinaciji omogočata selekcijo
transformant, ki imajo v plazmid vstavljen rekombinanten zapis, z α-komplementacijo.
Po transformaciji celic seva Rosetta-gami (DE3) pLysS (poglavje 3.1.4) smo morali zaradi
počasne rasti transformant na gojišču s štirimi antibiotiki čas inkubacije podaljšati na 48 ur.
3.2.2.4. Izražanje rekombinantnega proteina v E. coli
Pri ekspresiji rekombinantnih proteinov smo uporabljali omenjena vektorja iz sistema pET
(poglavji 3.1.2.2 in 3.1.2.3) z vključenim ustreznim zapisom za rekombinanten protein. Vektor je bil
predhodno transformiran v ustrezen ekspresijski sev E. coli (poglavje 3.1.4).
Prekonočno kulturo smo inokulirali v stresalno erlenmajerico s svežim gojiščem, tako da je bil
faktor redčitve 50x (npr. 2 mL prekonočne kulture v 100 mL svežega gojišča) in stresali s hitrostjo
250 rpm pri 37 °C. Rast bakterij smo spremljali z merjenjem optične gostote oz. absorbance pri 600
nm. Ko je kultura dosegla določen OD 600, ponavadi med 0,6 in 1, smo inducirali izražanje z
dodatkom toliko IPTG, da je bila končna koncentracija induktorja 1 mM. Po indukciji smo celice
gojili tri do štiri ure, da se je izrazil rekombinanten protein.
Tako pred indukcijo kot po končanem izražanju smo odvzeli po 1 mL kulture, ki smo ju uporabili
za analizo proteinov v celičnem lizatu.
3.2.3. Delo z insektnimi celicami
3.2.3.1. Opazovanje okuženih celic pod invertnim mikroskopom
Znake napredovanja okužbe celic (tabela 3.1) smo opazovali pod invertnim mikroskopom pri
250-400x povečavi, tako da smo okužene celice primerjali primerjali s kontrolnimi neokuženimi
celicami.
znaki okužbe opis
zgodnji (do 24 ur)
25-50% povečanje premera celic
povečana velikost jedra glede na velikost celice
celice prenehajo rasti oz. zaostajajo v rasti glede na neokuženo kontrolo
pozni (24 do 72 ur)
zaradi nastajajočih virusnih delcev videz celic postaja granularen oz.
vezikularen
celice se začnejo odlepljati od podlage
zelo pozni (nad 72 ur) liza celic
Tabela 3.2: Znaki okužbe insektnih celic z bakulovirusi.
Stran 30

3.2.3.2. Transfekcija insektnih celic z bakmidno DNA
Materiali in metode
Za transfekcijo insektnih celic z bakmidno DNA smo izbrali metodo s Cellfectin-om. Cellfectin je
komercialno ime za mešanico lipidov TM-TPS in DOPE (1:1,5), ki v vodnih raztopinah tvorita
liposome, v katere se ujame bakmidna DNA. Ob zlitju liposomov s plazmalemo se bakmidna DNA
prenese v celico.
V vdolbinice plošče s šestimi vdolbinicami smo nasejali po 9×10 5 celic v 1 mL gojišča Sf-900 II
SFM in jih inkubirali eno uro, da so se celice pritrdile na podlago. 60 µL Cellfectina smo razredčili z
gojiščem na 1 mL. Pripravili smo mešanico 15 µL bakmidne DNA, 100 µL razredčenega Cellfectina
in 85 µL gojišča, mešanico 15 µL bakmidne DNA in 185 µL gojišča ter mešanico 100 µL
razredčenega Cellfectina in 100 µL gojišča. Vse mešanice smo inkubirali 45 min na sobni
temperaturi, nato pa smo k vsaki dodali 800 µL gojišča. S pritrjenih celic smo odstranili gojišče, jih
sprali z 2 mL svežega gojišča, nato pa vsako od mešanic dodali v eno vdolbinico. Celice z
dodanimi mešanicami smo inkubirali 5 ur, nato pa z njih odstranili gojišče, dodali po 1 mL svežega
gojišča ter inkubirali 72 ur. Po 72 urah smo pobrali gojišče s celic in ga centrifugirali 5 min pri
500×g, da smo posedli plavajoče celice. Supernatant smo prenesli v novo centrifugirko in P1
zalogo bakulovirusov shranili na 4 °C.
3.2.3.3. Amplifikacija zaloge bakulovirusov
Z amplifikacijo zaloge bakulovirusov povečamo titer virusov. Pri vsaki amplifikaciji se titer
virusov poveča za približno 10x, vendar ni priporočljivo izvajati več kot dve ali tri zaporedne
amplifikacije, saj virus s časom mutira.
Amplificirali smo tako P1 kot P2 zaloge bakulovirusov. Ker točnega titra zalog nismo poznali,
smo za P1 zalogo predpostavili titer 5×10 6 virusov/mL, za P2 zalogo pa 5×10 7 virusov/mL.
Postopali smo tako, da smo predhodno pritrjenim celicam dodali toliko zaloge bakulovirusov, da je
multipliciteta infekcije pri amplifikaciji P1 zaloge znašala 0,1, pri amplifikaciji P2 zaloge pa 1. Pri
amplifikaciji neprečiščenih P1 zalog smo izhajali iz 1,5×10 6 celic v 1 mL gojišča, pri amplifikaciji
prečiščenih zalog pa iz 5×10 6 celic v 10 mL gojišča pri amplifikaciji P1 zaloge oz. 6,5×10 6 celic v 15
mL gojišča pri amplifikaciji P2 zaloge. Po 72-urni inkubaciji okuženih celic smo z njih pobrali
gojišče, odcentrifugirali odpadni material s centrifugiranjem 5 min pri 500×g in shranili P2 oz. P3
zalogo bakulovirusov pri 4 °C.
3.2.3.4. Določanje titra bakulovirusov
Titer bakulovirusne zaloge določimo tako, da celice prehodno okužimo z virusom, nato pa
prekrijemo z agarozo. Virus okuži posamezno celico, ki čez nekaj dni razpade, potomci virusa pa
okužijo sosednje celice, tako da čez čas dobimo prazne prostore v monosloju, imenovane plaki.
V vdolbinice plošče s šestimi vdolbinicami smo nasejali po 5×10 5 celic in jih inkubirali, dokler
se niso pritrdile. Pripravili smo serijske redčitve od 10 -1 do 10 -6 P2 zaloge bakulovirusov. Serijsko
redčitev 10 -1 smo pripravili tako, da smo 150 µL zaloge razredčili s 1350 µL gojišča, za pripravo
redčitve 10 -2 smo 150 µL serijske redčitve 10 -1 razredčili s 1350 µL gojišča, itd. S pritrjenih celic smo
odstranili gojišče in v vsako vdolbinico dodali 1 mL posamezne serijske redčitve. Okužene celice
smo inkubirali eno uro. Pripravili smo 2% raztopino agaroze z nizko temperaturo tališča v gojišču
in jo do uporabe shranili v vodni kopeli, segreti na 42 °C. Tik pred uporabo smo agarozo razredčili
z gojiščem, tako da smo dobili 1% gel. Z okuženih celic smo pobrali gojišče in jih prekrili s po 1,5
mL agaroze. Počakali smo, da se je gel strdil, nato pa plošče inkubirali 7 do 10 dni, da so se razvili
dobro vidni plaki. S preštetjem plakov smo določili titer P2 zaloge bakulovirusov.
Stran 31

3.2.3.5. Prečiščenje plakov
Materiali in metode
S prečiščenjem plakov dobimo virusno populacijo, ki izvira iz enega samega virusa, torej imajo
vsi virusi v njej načeloma enak genetski material.
Po določitvi titra virusne zaloge smo izbrali izoliran plak in ga s konico pipete prenesli v
vdolbinico plošče z dvanajstimi vdolbinicami, v kateri je bilo pritrjenih 5×10 5 celic v 750 µL gojišča.
Ploščo smo inkubirali 72 ur, nato pa zbrali prečiščeno P1 zalogo bakulovirusov.
3.2.3.6. Poskusno izražanje SMOC-1 v insektnih celicah
Za poskusno izražanje SMOC-1 v insektnih celicah smo uporabili neprečiščeno P2 zalogo
bakulovirusov. Ker smo bili omejeni s količino zaloge, smo se odločili za omejen nabor variabilnih
parametrov, in sicer za multipliciteti infekcije 5 in 10 ter za trajanje okužbe 48 in 72 ur pri vsaki
multipliciteti.
Poskusno izražanje smo izvedli na plošči z dvanajstimi vdolbinicami. V vdolbinice smo nasejali
po 7,5×10 5 celic in jih inkubirali, dokler se niso pritrdile. S pritrjenih celic smo odstranili gojišče in
dodali 750 µL z gojiščem razredčene P2 zaloge, ki je bila redčena toliko, da je končna koncentracija
virusa ustrezala željeni multipliciteti infekcije. Plošče smo inkubirali željen čas, nato pa z njih
pobrali gojišče, ki je vsebovalo iz celic izločene proteine ter odcentrifugirali plavajoče nečistoče s
centrifugiranjem 5 min pri 500×g.
3.2.4. Izolacija in analiza proteinov
3.2.4.1. Analiza proteinov na poliakrilamidni gelski elektroforezi v prisotnosti NaDS
Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS (NaDS PAGE) je metoda ločevanja
denaturiranih polipeptidnih verig na osnovi njihove velikosti. Sama izvedba elektroforeze je
vertikalna in zahteva prisotnost dveh različnih gelov, spodnjega bolj zamreženega separacijskega,
v katerem poteka dejanska ločba ter zgornjega manj zamreženega koncentracijskega gela. Pri
prehodu iz koncentracijskega v separacijski gel se polipeptidne verige upočasnijo glede na tiste, ki
so še v koncentracijskem gelu, tako da se celoten vzorec tukaj skoncentrira.
Gele smo pripravili tako, da smo posamezne komponente zmešali v erlenmajerici in po dodatku
vsake komponente zmes premešali, pripravljene gele pa takoj ulili. Sestava gelov, ki smo jih
uporabljali pri delu, je navedena v tabeli 3.3, sestavine pa so navedene v vrstnem redu, v katerem
smo jih dodajali.
separacijski gel separacijski gel koncentracijski
(12,5%)
(15%)
gel (5%)
40% akrilamid:bisakrilamid (37,5:1) 3,13 mL 3,75 mL 1,25 mL
4x separacijski pufer (1,5 M Tris pH=8,8) 2,50 mL 2,50 mL /
4x koncentracijski pufer (0,5 M Tris pH=6,8) / / 2,50 mL
dH2O 4,27 mL 3,65 mL 6,15 mL
10% NaDS 100 µL 100 µL 100 µL
TEMED 15 µL 15 µL 15 µL
10% APS 30 µL 30 µL 30 µL
Tabela 3.3: Sestava poliakrilamidnih gelov, ki smo jih uporabljali pri delu.
Stran 32

Materiali in metode
Za ulivanje gelov smo sestavili aparaturo po navodilih proizvajalca. Najprej smo ulili
separacijski gel do višine približno 2 cm pod robom sprednjega stekelca, ga prekrili z
izopropanolom, da smo preprečili izsuševanje gela in počakali, da se je gel strdil. Nato smo odlili
izopropanol, ulili koncentracijski gel do vrha prednjega stekelca in vstavili glavniček z desetimi
zobki. Počakali smo, da se je tudi ta gel strdil, nato pa odstranili glavniček in gel takoj uporabili ali
pa ga zavili v vlažno papirnato brisačo in do uporabe shranili na 4 °C.
Elektroforetsko aparaturo smo sestavili po navodilih proizvajalca in vanjo nalili toliko
elektroforetskega pufra (25 mM Tris, 100 mM glicin, 0,1% (w/v) NaDS), da je bil gel popolnoma
potopljen vanj. Elektroforeza je potekala pri konstantnem toku 35 mA ob uporabi enega gela oz. 70
mA ob uporabi dveh gelov.
Vzorce smo za nanos na elektroforezo pripravili tako, da smo k 1 V vzorca dodali ¼ V 5x
vzorčnega pufra (10% (v/v) glicerol, 2% (w/v) NaDS, 75 mM Tris pH=6,8, 4% (w/v) DTT, 0,05%
(w/v) bromfenol modro).
3.2.4.2. Detekcija proteinov v gelu s Coomassie Brilliant Blue
Coomassie Brilliant Blue R-350 je barvilo, ki se nespecifično veže na proteine v
poliakrilamidnem gelu in jih obarva modro. Meja detekcije je okoli 100 ng proteina.
Koncentrirano raztopino Coomassie Brilliant Blue R-350 smo pripravili tako, da smo tableto
PlusOne Coomassie Blue PhastGel R-350 5 min raztapljali v 80 mL dH 2O, dodali 120 mL
absolutnega etanola in mešali, dokler se ni tableta popolnoma raztopila. Pred uporabo smo
koncentrirano raztopino razredčili z 20% ocetno kislino v razmerju 1:1 in tako pripravljeno barvo
zlili v petrijevko. Gel po elektroforezi smo prenesli v barvo in vsaj 30 min inkubirali pri sobni
temperaturi na rotacijskem stresalniku. Nato smo odlili barvo z gela in gel razbarvali v razbarvalni
raztopini (30% (v/v) etanol, 10% (v/v) ocetna kislina).
3.2.4.3. Prenos western
Prenos western je metoda polsuhega prenosa proteinov iz poliakrilamidnega gela na
membrano pod vplivom električnega toka. Membrane so bolj obstojne kot geli in omogočajo vrsto
različnih načinov detekcije nanje vezanih proteinov, poleg tega pa jih lahko tudi večkrat
uporabimo.
Gel po elektroforezi smo namočili v pufru za prenos (2,93 g Tris, 5,81 g glicin, 3,75 mL 10%
NaDS, 200 mL metanol, dH 2O do 1 L). Odrezali smo košček membrane in šest koščkov filter papirja
enakih dimenzij, kot je bil gel. Membrano in filter papirje smo omočili v pufru za prenos, nato pa
zložili v aparaturo za prenos western, kot kaže slika 3.9.
Slika 3.9: Sestava aparature za prenos
western.
Prenos je potekal eno uro pri toku, ki smo ga izračunali po enačbi I = S gela (v cm 2 ) × 0,8 mA.
Stran 33

3.2.4.4. Imunodetekcija proteinov na membrani
Materiali in metode
Detekcija s protitelesi, konjugiranimi z določenimi encimi, je ena izmed metod za detekcijo
proteinov na membranah. Protitelesa specifično interagirajo s proteini na membrani, mesto vezave
pa detektiramo preko reakcije, ki jo katalizira konjugiran encim.
Pri delu smo kot vir primarnih protiteles uporabili krvni serum imuniziranega kunca (poglavje
3.2.4.7), kot sekundarna protitelesa pa proti-zajčji-IgG protitelesa, konjugirana s hrenovo
peroksidazo. Na mestu reakcije s kromogenim substratom DAB v prisotnosti H 2O 2 se membrana
obarva rjavo.
Membrano po prenosu smo 30 min blokirali v pufru za blokiranje (PBS [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44
g Na 2HPO 4, 0,24 g KH 2PO 4 na 1 L dH 2O, pH=7,4], 0,1% Tween-20, 10% mleko) ob stresanju na
rotacijskem stresalniku. Blokirano membrano smo sprali s PBS in eno uro na sobni temperaturi ob
stresanju inkubirali v plastični vrečki s 5 mL raztopine primarnih protiteles v PBS. Nevezana
protitelesa smo z membrane sprali s tremi zaporednimi petminutnimi spiranji s pufrom za spiranje
(PBS, 0,1% Tween-20) ob stresanju na sobni temperaturi. Postopek vezave protiteles in spiranja
smo ponovili s sekundarnimi protitelesi. Vezana protitelesa smo detektirali s stresanjem v raztopini
DAB (25 mg DAB, 10 µL 37% H 2O 2 v 50 mL PBS), dokler se niso razvile rjave lise. Reakcijo smo
prekinili s prenosom membrane v dH 2O, nato pa smo membrano posušili na zraku.
3.2.4.5. Analiza proteinov v celičnem lizatu E. coli
Pri analizi celičnih lizatov analiziramo vse proteine, ki so prisotni v bakterijskih celicah, torej tako
topne kot netopne. Pri ekspresiji rekombinantnih proteinov je metoda zlasti uporabna za
primerjavo vzorcev bakterijskih celic pred indukcijo ekspresije in po končani ekspresiji. Pri
opisanem postopku ekspresije predstavlja izražen rekombinanten protein namreč edino razliko
med obema vzorcema.
1 mL bakterijske kulture z znanim OD 600 smo centrifugirali 3 min pri 14.000×g in 4 °C. Z vodno
črpalko smo odstranili supernatant, celice pa resuspendirali v 40 µL dH 2O in sonificirali 15 min v
sonifikacijski vodni kopeli. Po sonifikaciji smo dodali 10 µL 5x vzorčnega pufra in vzorec inkubirali 5
min v vreli vodni kopeli, nato pa nanesli na NaDS PAGE. Volumen nanosa smo izračunali po
enačbi
nanos =
OD
600
270
× konc.faktor(
= 20)
konc. faktor = faktor koncentriranja celic glede na izhodno kulturo, v opisanem primeru 20.
3.2.4.6. Izolacija inkluzijskih telesc iz E. coli
Inkluzijska telesca so amorfni agregati nepravilno zvitih, netopnih proteinov v citoplazmi E. coli.
Za njihovo izolacijo je na voljo veliko različnih protokolov, ki pa se večinoma med seboj ne
razlikujejo bistveno. Mi smo uporabili dokaj hiter in preprost, a učinkovit protokol.
Bakterijske celice iz 1 L kulture smo odcentrifugirali s centrifugiranjem 10 min pri 5.000×g in 4
°C. Supernatant smo odlili, usedlino pa resuspendirali v 40 mL pufra A (20 mM Tris pH=7,5, 20%
(w/v) saharoza, 1 mM EDTA), inkubirali na ledu 10 min in centrifugirali 5 min pri 14.000×g in 4 °C.
Usedlino smo resuspendirali v 40 mL ledeno mrzle dH 2O, inkubirali 10 min na ledu in ponovno
centrifugirali 5 min pri 14.000×g in 4 °C. Usedlino smo resuspendirali v 10 mL pufra P (PBS [8 g
NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2HPO 4, 0,24 g KH 2PO 4 na 1 L dH 2O, pH=7,4], 5 mM EDTA) in sonificirali
šestkrat po 15 s pri 65% moči in s 15 s premori. Dodali smo 100 µL 0,5 M MgCl 2 in 500 µg DNaze I
Stran 34

Materiali in metode
ter inkubirali 15 min na sobni temperaturi. Nato smo dodal pufer P do 40 mL in centrifugirali 30
min pri 14.000×g in 4 °C. Usedlino smo resuspendirali v 2 mL pufra P, dodali pufer W (PBS, 25%
(w/v) saharoza, 5 mM EDTA, 1% (w/v) Triton X-100) do 40 mL in centrifugirali 10 min pri 14.000×g
in 4 °C. Spiranje s pufrom W smo ponovili še dvakrat, nato pa smo usedlino resuspendirali v 5 mL
pufra D (50 mM Tris pH=8,0, 5 mM EDTA, 8 M urea, 5 mM DTT).
3.2.4.7. Priprava vzorca za imunizacijo
Imunizacija je postopek vnosa tujega antigena v žival, ki začne proizvajati protitelesa proti
vnešenim antigenom. Po določenem času iz živali izoliramo serumsko frakcijo krvi, ki vsebuje
poliklonska protitelesa, med drugimi tudi tista, s katerimi smo žival imunizirali.
Vzorec smo za imunizacijo pripravili tako, da smo na 1,5 mm debel poliakrilamidni gel nanesli
300
µL izoliranih inkluzijskih telesc (poglavje 3.2.4.4), po elektroforezi in detekciji s Coomassie Brilliant
Blue pa smo iz gela izrezali liso, ki je ustrezala proteinu, s katerim smo želeli imunizirati kunca.
Izrezan košček gela smo zdrobili v terilnici, drobce porazdelili v šest mikrocentrifugirk ter jih
suspendirali v po 300 µL PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2HPO 4, 0,24 g KH 2PO 4 na 1 L dH 2O,
pH=7,4). Suspenziji gela smo dodali 300 µL Freundovega popolnega adjuvansa in vzorce oddali za
imunizacijo kunca.
Čez dva meseca smo dobili kunčjo kri, ki smo jo pustili čez noč koagulirati na 4 °C. Nekoaguliran
del smo ločili od strdkov in ga centrifugirali 15 min pri 1.500×g in 4 °C. Supernatant, krvni serum s
protitelesi, smo ločili od usedline.
3.2.4.8. Renaturacija
Renaturacija je postopek zvijanja denaturiranih proteinov v nativno obliko. Pri delu smo
uporabili metodo renaturacije s hipnim razredčenjem, kot redoks par za tvorbo disulfidnih vezi
smo izbrali reduciran in oksidiran glutation, odločili pa smo se tudi za dodatek L-arginina, ki deluje
kot supresor agregacije nepravilno zvitih intermediatov.
1 mL vzorca denaturiranega SMOC-1, ki smo ga dobili z izolacijo inkluzijskih telesc (poglavje
3.2.4.6), smo po kapljicah dodali v renaturacijski pufer (100 mM Tris pH = 8,0, 2 mM EDTA, 400
mM L-arginin, 5 mM reduciran glutation, 0,5 mM oksidiran glutation), ki smo ga močno mešali na
magnetnem mešalu pri 4 °C. Po dodatku smo mešanico močno mešali še 2 min, nato pa počasi
mešali čez noč. Postopek smo ponovili še s štirikrat po 1 mL denaturiranega SMOC-1. Po končani
renaturaciji smo agregate odstranili s centrifugiranjem 30 min pri 17.000×g in 4 °C.
3.2.4.9. Ni-afinitetna kromatografija
Ni-afinitetna kromatografija je metoda izolacije proteinov na podlagi tvorbe koordinacijskih
kompleksov določenih aminokislinskih zaporedij z Ni 2+ ioni. Najpogosteje uporabljano tako
zaporedje je His 6 oznaka.
Kot nosilec smo uporabili visoko zamrežen sefarozni gel s kovalentno vezanimi
iminodiacetatnimi skupinami, na katere se vežejo Ni 2+ ioni.
V kolono ustrezne velikosti smo odpipetirali 4 mL suspenzije Chelating Sepharose Fast Flow,
sestavljene iz 75% gela v 20% etanolu, kar je ustrezalo 3 mL gela. Počakali smo nekaj minut, da se
je gel posedel, nato pa ga sprali z 10 V (30 mL) dH 2O. Gel smo nabili z 0,5 V (1,5 mL) NiSO 4, nato
pa smo ga sprali s 5 V (15 mL) dH 2O ter ekvilibrirali s 5 V (15 mL) pufra za vezavo (50 mM NaH 2PO 4
pH=8,0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol).
Stran 35

Materiali in metode
Vzorec smo za nanos pripravili tako, da smo bakterijsko kulturo po izražanju rekombinantnega
proteina odcentrifugirali in odstranili supernatant, usedlino celic pa resuspendirali v pufru za
vezavo. Suspenziji smo dodali raztopino MgCl 2 (končna koncentracija 10 mM), DNazo I (končna
koncentracija 50 µg/mL) in lizocim (končna koncentracija 0,2 mg/mL) ter inkubirali 15 min na ledu,
nato pa smo vzorec sonificirali štirikrat po 15 s pri 65% moči in s 15 s premori. Po centrifugiranju
15 min pri 14.000×g in 4 °C smo topno frakcijo nanesli na kolono.
Po vezavi vzorca smo kolono sprali z 10 V pufra za spiranje (50 mM NaH 2PO 4 pH=8,0, 500 mM
NaCl, 30 mM imidazol), nato pa vezane proteine eluirali s štirikrat po 2 V elucijskega pufra 1 (50
mM NaH 2PO 4 pH=8,0, 500 mM NaCl, 100 mM imidazol), štirikrat po 2 V elucijskega pufra 2 (50 mM
NaH 2PO 4 pH=8,0, 500 mM NaCl, 150 mM imidazol) ter štirikrat po 2 V elucijskega pufra 3 (50 mM
NaH 2PO 4 pH=8,0, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol).
Po uporabi smo kolono dobro sprali z dH 2O in shranili v 20% etanolu.
3.2.4.10. Obarjanje proteinov s TCA
Vzorcu proteinov smo dodali toliko 100% (w/v) TCA, da je bila končna koncentracija 10 do
15%. Vzorec smo pretresli in inkubirali na ledu vsaj 30 min. Oborjene proteine smo posedli s
centrifugiranjem 15 min pri 20.000×g in 4 °C. Supernatant smo odsesali z vodno črpalko, usedlino
pa dvakrat sprali z absolutnim etanolom, ohlajenim na -20 °C, tako da smo dodali etanol, premešali
in centrifugirali 5 min pri 20.000×g in 4 °C, nato pa odstranili supernatant. Po drugem spiranju smo
vzorec posušili na zraku.
3.2.4.11. Analiza proteinov v lizatu in gojišču insektnih celic
Po izražanju rekombinantnega proteina (poglavje 3.2.3.6) smo s celic pobrali gojišče in jim
dodali 1 mL PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2HPO 4, 0,24 g KH 2PO 4 na 1 L dH 2O, pH=7,4). Celice
smo postrgali s strgalom in suspenzijo prenesli v mikrocentrifugirko. Centrifugirali smo 1 min pri
1.000×g, odstranili supernatant, celice resuspendirali v vzorčnem pufru ter pripravili za nanos na
NaDS PAGE (poglavje 3.2.4.1).
Proteine v gojišču smo oborili s TCA (poglavje 3.2.3.10), jih raztopili v toliko vzorčnega pufra,
da je bil faktor koncentriranja približno 15 ter pripravili za nanos na NaDS PAGE (poglavje 3.2.4.1).
Stran 36

3.3. Molekulsko modeliranje tiroglobulinskih domen SMOC-1
Materiali in metode
Modele tiroglobulinskih domen SMOC-1 smo zgradili z uporabo programa Modeller 6v2
[75,76]. Program zgradi model na osnovi homologije polipeptidne verige z znano strukturo in
tarče. Kot predlogo smo uporabili NMR strukturo p41 fragmenta, ki je shranjena v PDB pod oznako
1L3H.
Prvi korak je bilo generiranje poravnave primarnih struktur domen SMOC-1 (Tg1 oz. Tg2) ter
p41 fragmenta. Prileganje vsake domene s p41 smo shranili v datoteko alignment.pir (slika 3.10)
>P1;p41
structureN:p41:.:.:.:.
LTKCQEEVS-----HIPAVHPGSFRPKCDENGNYLPLQCYGSIGYCWCVFPNGTEVPNTRSR-GHHNCSES*
>P1;Ty1
sequence:Tg1
QSKCRLERAQALEQAKK-PQEAVFVPECGEDGSFTQVQCHTYTGYCWCVTPDGKPISGSSVQNKTPVCSGS*
>P1;p41
structureN:p41:.:.:.:.
LTKCQEEVS-----HIPAVHPGSFRPKCDENGNYLPLQCYGSIGYCWCVFPN-GTEVPNTRSR-GHHNCSES*
>P1;Ty2
sequence:Tg2
VYSCDQERQSALEEAQQNPREGIVIPECAPGGLYKPVQCHQSTGYCWCVLVDTGRPLPGTSTRYVMPSCESD*
Slika 3.10: Poravnava primarnih struktur Tg1 in p41 fragmenta (zgoraj) ter Tg2 in p41 fragmenta
(spodaj).
Ker obe domeni v N-terminalnem delu vsebujeta po pet ostankov veliki inserciji glede na p41
fragment, smo uporabili različne programe za napovedovanje sekundarne strukture, da bi določili
vsebnost elementov sekundarne strukture v tem delu. Združen rezultat vseh uporabljenih
programov je bil, da ostanki 5 do 14 Tg1 ter ostanki 3 do 13 Tg2 tvorijo α-vijačnico, kar smo
uporabili kot dodatno omejitev pri modeliranju.
Ker so nekatere zanke p41 fragmenta fleksibilne, smo dodatno uporabili tudi rutino za
izčrpnejše modeliranje strukture zank. Kot rezultat smo tako dobili osnovni model in štiri dodatne
modele z izčrpneje izračunanimi strukturami zank. Celotna ukazna datoteka, ki smo jo uporabili, je
prikazana na sliki 3.11.
INCLUDE
SET OUTPUT_CONTROL = 1 1 1 1
SET ALNFILE = 'alignment.pir'
SET KNOWNS = 'p41'
SET SEQUENCE = 'TgX'
SET ATOM_FILES_DIRECTORY = 'e:\modeller6v2\tg'
# SET STARTING_MODEL = 1
# SET ENDING_MODEL = 1
SET DO_LOOPS = 1
SET LOOP_STARTING_MODEL = 1
SET LOOP_ENDING_MODEL = 4
SET LOOP_MD_LEVEL = 'refine_1'
SET MD_LEVEL = 'nothing'
CALL ROUTINE = 'model'
STOP
SUBROUTINE ROUTINE = 'special_restraints'
SET ADD_RESTRAINTS = on
MAKE_RESTRAINTS RESTRAINT_TYPE = 'alpha',
RESIDUE_IDS = 'X' 'Y'
END_SUBROUTINE
Slika 3.11: Ukazna datoteka za izgradnjo modelov Tg1 in Tg2.
# datoteka s prileganjem primarnih struktur
# znane strukture
# tarčno zaporedje
# pot do datotek s koordinatami atomov
# znanih struktur
# rutina za izčrpnejše modeliranje strukture
# zank
# osnovna rutina izgradnje modela
# rutina, ki omejuje ostanke X do Y
# tarčne sekvence v strukturo α-vijačnice
Stran 37

4. Rezultati
4.1. Kloniranje in izražanje SMOC-1 v inkluzijskih telescih v E.coli
Rezultati
Pregledna shema poteka kloniranja in izražanja SMOC-1 v inkluzijskih telescih v E. coli je
prikazana na sliki 4.1.
Slika 4.1: Shema kloniranja in izražanja SMOC-1 v inkluzijskih telescih.
Stran 38

Rezultati
S PCR smo z uporabo začetnih oligonukleotidov ECN in ECC pomnožili zapis za SMOC-1 brez
signalnega peptida. Na 5' konec PCR produkta smo uvedli restrikcijsko mesto NcoI, na 3' konec
PCR produkta pa restrikcijsko mesto XhoI (slika 4.2). Preko teh dveh restrikcijskih mest nam je
kasneje bila omogočena ligacija zapisa v ekspresijski vektor pET-28b(+).
Slika 4.2: S PCR smo z uporabo začetnih oligonukleotidov ECN in ECC pomnožili zapis za SMOC-1 brez
signalnega peptida ter v PCR produkt uvedli restrikcijski mesti NcoI in XhoI.
PCR produkte smo očistili in analizirali na AGE, kjer smo detektirali fragment DNA pričakovane
velikosti 1200 bp (slika 4.3).
Slika 4.3: Elektroforetska analiza pomnoževanja
zapisa za SMOC-1 brez signalnega peptida s PCR.
1 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 – produkti pomnoževanja zapisa za SMOC brez
signalnega peptida s PCR
Ker smo v vzorcu zaznali tudi druge fragmente DNA, smo fragment velikosti 1200 bp, ki je po
velikosti ustrezal pričakovanemu PCR produktu, izolirali iz gela. Da bi preverili pravilnost
nukleotidnega zaporedja pomnoženega zapisa, smo izoliran fragment ligirali v vektor pPCR-Script
Amp SK(+). Z ligacijsko mešanico smo transformirali kompetentne celice E. coli DH5α. Na plošči
so zrasle tako bele kot modre kolonije.
Transformante, ki so vsebovale vektor z vstavljenim zapisom za SMOC-1, smo selekcionirali na
podlagi α-komplementacije. Deset belih kolonij smo dodatno preverili na prisotnost zapisa s PCR.
Analiza na AGE je pokazala, da je vseh deset kolonij vsebovalo vektor pPCR-Script Amp SK(+) z
vstavljenim zapisom za SMOC-1, saj smo pri vseh desetih vzorcih zaznali PCR produkte
pričakovane velikosti okoli 1200 bp (slika 4.4).
Stran 39

Rezultati
Slika 4.4: Elektroforetska analiza PCR bakterijskih
kolonij, s katero smo preverili prisotnost zapisa za
SMOC-1 v vektorju pPCR-Script Amp SK(+).
1 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 do 11 – PCR produkti, dobljeni po PCR bakterijskih
kolonij
Določili smo nukleotidni zaporedji zapisov za SMOC-1 iz dveh bakterijskih kolonij in ugotovili,
da oba ustrezata nukleotidnem zaporedju cDNA zapisa.
Iz vektorja pPCR-Script Amp SK(+) smo z restriktazama NcoI in XhoI izrezali fragment DNA s
preverjeno pravilnim zapisom za SMOC-1 in ga ligirali v ekspresijski vektor pET-28b(+), ki smo ga
predhodno rezali z istima restriktazama. Z ligacijsko mešanico smo transformirali kompetentne
celice E. coli DH5α.
Po transformaciji smo šest naključno izbranih kolonij transformant preverili na prisotnost zapisa
za SMOC-1 s PCR in produkte PCR pomnoževanja analizirali na AGE. Ugotovili smo, da vseh šest
kolonij vsebuje vektor pET-28b(+) z vstavljenim zapisom za SMOC-1, saj smo pri vseh vzorcih
zaznali PCR produkte velikosti približno 1200 bp (slika 4.5).
Slika 4.5: Elektroforetska analiza PCR bakterijskih
kolonij, s katero smo preverili prisotnost zapisa za
SMOC-1 v vektorju pET-28b(+).
1 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 do 7 – PCR produkti, dobljeni po PCR bakterijskih
kolonij
Z izoliranim vektorjem pET-28b(+) z vstavljenim zapisom smo transformirali kompetentne
celice E. coli BL21 (DE3), izrazili rekombinanten protein SMOC-1 v obliki inkluzijskih telesc in
slednja izolirali. Rekombinanten SMOC-1 smo v vzorcih celičnih lizatov zaznali kot liso z navidezno
molekulsko maso okoli 55 kDa, ki je bila dokaj močna v vzorcu lizata celic po ekspresiji, v vzorcu
lizata celic ob indukciji ekspresije pa je ni bilo. Izolirana inkluzijska telesca so vsebovala nad 90%
čist rekombinanten SMOC-1 (slika 4.6), izkoristek izražanja in izolacije pa smo na podlagi
elektroforetske analize in merjenja A 280 vzorca ocenili na dobrih 50 mg rekombinantnega proteina
na liter bakterijske kulture.
Stran 40

Rezultati
Slika 4.6: Elektroforetska analiza celičnih lizatov in
izoliranih inkluzijskih telesc.
std – standardi »LMW-SDS Markers«
pred indukcijo – celični lizat pred indukcijo izražanja
po izražanju – celični lizat po izražanju
inkluzijska telesca – izolirana inkluzijska telesca
S puščico je označena lisa, ki pripada
rekombinantnemu SMOC-1. Molekulske mase
standardov so podane v kDa.
Vzorec rekombinantnega SMOC-1 smo uporabili za imunizacijo kunca, dobljen krvni serum pa
smo testirali na vzorcu inkluzijskih telesc. Protitelesa so se vezala ne le na SMOC-1, ampak tudi na
ostale proteine v vzorcu (slika 4.7), kar lahko pomeni, da gre pri ostalih lisah za fragmente SMOC-1
ali pa kaže na nespecifičnost seruma.
Slika 4.7: Imunodetekcija proteinov v
vzorcu izoliranih inkluzijskih telesc s
kunčjim serumom.
std – standardi »See Blue Plus 2«
IT – izolirana inkluzijska telesca
Molekulske mase standardov so v kDa.
Denaturiran SMOC-1 smo poskušali renaturirati. Po renaturaciji smo SMOC-1 zaznali v topni
frakciji, kar bi lahko pomenilo, da nam je protein uspelo renaturirati. Pod nereducirajočimi pogoji je
bila v vzorcu prisotna lisa z veliko navidezno molekulsko maso, ki je pri reduciranem vzorcu ni bilo
in je kazala na prisotnost z disulfidnimi vezmi povezanih agregatov (slika 4.8).
Slika 4.8: Elektroforetska analiza renaturacije SMOC-1.
std – standardi »LMW-SDS Markers«
+SH – reduciran vzorec renaturiranega SMOC-1
-SH – nereduciran vzorec renaturiranega SMOC-1
Molekulske mase standardov so v kDa.
Stran 41

4.2. Kloniranje in izražanje tiroglobulinskih domen SMOC-1 v E. coli
Rezultati
Posamezni tiroglobulinski domeni SMOC-1 (Tg1 in Tg2) smo želeli izraziti v E. coli v topni obliki.
Na sliki 4.9 je prikazana shema poteka dela v ta namen.
Slika 4.9 Shema poteka kloniranja, izražanja in izolacije posameznih
tiroglobulinskih domen SMOC-1.
S PCR smo z uporabo začetnih oligonukleotidov T1N in T1C pomnožili zapis za Tg1, z uporabo
začetnih oligonukleotidov T2N in T2C pa zapis za Tg2. Na 5' konca rekombinantnih zapisov smo
navzgor od zapisov za posamezni domeni uvedli restrikcijsko mesto NcoI, na 3' konca pa navzdol
od zapisov restrikcijsko mesto XhoI (slika 4.10). Ti dve restrikcijski mesti sta nam omogočali
ligacijo rekombinantnih zapisov v vektorje serije pET. Kot del restrikcijskega mesta NcoI smo
uvedli ATG kodon, potencialno mesto začetka translacije. Med tega in začetek zapisa za Tg1 je bil
vstavljen še kodon GGC, ki kodira za Gly, da se je ohranil bralni okvir, medtem ko je zapis za Tg2
neposredno sledil začetnem ATG kodonu. Na konec zapisov nismo vstavili stop kodonov, tako da
sta omogočala C-terminalne fuzije.
Stran 42

Rezultati
Slika 4.10: S PCR smo z uporabo začetnih oligonukleotidov T1N in T1C pomnožili zapis za Tg1, z
uporabo začetnih oligonukleotidov T2N in T2C pa zapis za Tg2 ter v oba rekombinantna zapisa uvedli
restrikcijski mesti NcoI in XhoI.
PCR produkte obeh reakcij smo očistili ter uspešnost pomnoževanja preverili na elektroforezi,
kjer smo pri obeh vzorcih ugotovili prisotnost fragmentov velikosti okoli 200 bp, ki sta ustrezala
pričakovanim PCR produktom obeh zapisov (slika 4.11).
Slika 4.11: Elektroforetska analiza pomnoževanja
rekombinantnih zapisov za Tg1 in Tg2 s PCR.
1 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 – produkti pomnoževanja zapisa za Tg1
3 – produkti pomnoževanja zapisa za Tg2
Ker smo v vzorcih opazili tudi druge fragmente DNA, smo fragmenta velikosti okoli 200 bp, ki
sta po velikosti ustrezala pričakovanima PCR produktoma, izolirali iz gela. Da bi preverili pravilnost
nukleotidnih zaporedij pomnoženih zapisov, smo izolirana fragmenta ligirali v vektor pPCR-Script
Amp SK(+), z ligacijsko mešanico pa transformirali celice E. coli DH5α. Na ploščah so zrasle tako
modre kot bele kolonije transformant. Po pet belih kolonij smo s PCR preverili na prisotnost zapisa
za Tg1 oz. Tg2, pozitiven rezultat pa smo dobili pri vseh desetih kolonijah (slika 4.12).
Slika 4.12: Elektroforetska analiza PCR bakterijskih
kolonij, s katero smo preverili prisotnost zapisov za Tg1
oz. Tg2 v vektorju pPCR-Script Amp SK(+).
1 in 7 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 do 6 – PCR produkti, dobljeni po PCR kolonij, ki smo
jih preverili na prisotnost zapisa za Tg1
8 do 12 – PCR produkti, dobljeni po PCR kolonij, ki smo
jih preverili na prisotnost zapisa za Tg2
Stran 43

Rezultati
Določili smo nukleotidna zaporedja po dveh zapisov za Tg1 in Tg2. Zaporedje enega izmed
zapisov za Tg1 je ustrezalo zaporedju cDNA zapisa, ustrezali pa sta tudi obe določeni zaporedji
zapisov za Tg2.
Iz vektorja pPCR-Script Amp SK(+) smo z uporabo restriktaz NcoI in XhoI izrezali po en zapis za
vsako domeno ter oba zapisa ligirali v predhodno rezan ekspresijski vektor pET-32b(+). Z ligacijo
smo dobili zapis za fuzijski protein Trx-Tg, sestavljen iz tioredoksina, S oznake, dveh His 6 oznak in
Tg1 oz. Tg2, iz katerega je mogoče z enterokinazo odcepiti domeno skupaj s C-terminalno
heksahistidinsko oznako (slika 4.13).
Slika 4.13: Shema fuzijskega proteina Trx-Tg.
Trx – tioredoksin, His 6 – His 6 oznaka, S – S oznaka, Tg –
tiroglobulinska domena SMOC-1; s puščico je označeno
mesto cepitve z enterokinazo.
Z ligacijsko mešanico smo transformirali celice E. coli DH5α in po šest kolonij transformant
preverili na prisotnost vsakega zapisa. Vse preverjene kolonije so vsebovale fragment DNA, ki je
po velikosti ustrezal zapisu za Tg1 oz. Tg2 (slika 4.14).
Slika 4.15: Elektroforetska analiza PCR bakterijskih kolonij, s katero smo preverjali prisotnost
zapisa za Tg1 oz. Tg2 v vektorju pET-32b(+).
1 in 14 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 do 7 – PCR produkti, dobljeni po PCR kolonij, ki smo jih preverili na prisotnost zapisa za Tg1
8 do 13 – PCR produkti, dobljeni po PCR kolonij, ki smo jih preverili na prisotnost zapisa za Tg2
Z izoliranim plazmidom pET-32b(+) z zapisom za Tg1 oz. Tg2 smo transformirali celice
ekspresijskega seva E. coli Rosetta-gami (DE3) pLysS in poskusili izraziti rekombinantni domeni.
Analiza celičnih lizatov je pokazala, da se je Tg2 izrazila, Tg1 pa ne. Fuzijski protein Trx-Tg2 smo
identificirali kot močno liso z navidezno molekulsko maso približno 30 kDa, kar se ujema z
izračunano molekulsko maso 26 kDa (slika 4.16). Ekvivalentne lise, ki bi pripadala fuzijskem
proteinu Trx-Tg1, nismo detektirali.
Stran 44

Slika 4.16: Analiza lizatov celic ob izražanju Tg1 in
Tg2 z NaDS PAGE.
std – standardi »LMW-SDS Markers«
pred indukcijo – lizat celic pred indukcijo izražanja
po izražanju Tg2 – lizat celic ob koncu izražanja Tg2
po izražanju Tg1 – lizat celic ob koncu izražanja Tg1
S puščico je označena lisa, ki pripada fuzijskem
proteinu Trx-Tg2. Molekulske mase standardov so v
kDa.
Rezultati
Fuzijski protein Trx-Tg2 smo izolirali z Ni-afinitetno kromatografijo. Analiza izolacije je pokazala,
da se je skoraj čist fuzijski protein Trx-Tg2 eluiral pri koncentraciji imidazola 150 mM, nekaj pa se
ga je skupaj z drugimi proteini eluiralo tudi pri koncentraciji imidazola 100 mM (slika 4.17).
Izkoristek izražanja in izolacije smo na podlagi elektroforetske analize in meritev A 280 ocenili na
okoli 6 mg Trx-Tg2 na liter bakterijske kulture, kar ustreza okoli 2 mg Tg2 na liter bakterijske
kulture.
Slika 4.17: NaDS PAGE analiza izolacije fuzijskega proteina Trx-Tg2 z Ni-afinitetno kromatografijo.
std – standardi »LMW-SDS Markers«
30 mM imidazol – frakcija, dobljena s spiranjem s 30 mM imidazolom
nevezano – nevezana frakcija
100 mM imidazol, 1 do 4 – frakcije, dobljene z eluiranjem s 100 mM imidazolom
150 mM imidazol, 1 do 4 – frakcije, dobljene z eluiranjem s 150 mM imidazolom
Molekulske mase standardov so v kDa.
Stran 45

4.3. Kloniranje in izražanje SMOC-1 v insektnih celicah
Rezultati
Shema poteka kloniranja in izražanja SMOC-1 v insektnih celicah z bakulovirusnim sistemom
Bac-to-Bac je prikazana na sliki 4.18.
Slika 4.18: Shema poteka kloniranja in izražanja SMOC-1 v insektnih celicah.
S PCR smo pomnožili celoten cDNA zapis za SMOC-1 z dvema kombinacijama začetnih
oligonukleotidov, tako da smo dobili dve različici rekombinantnega zapisa. Prva, ki smo jo
poimenovali SMOC-1-Bac, je neposredno navzgor od začetka zapisa za SMOC-1 vsebovala
restrikcijsko mesto BamHI, neposredno navzdol od konca zapisa za SMOC-1 pa restrikcijsko mesto
XhoI. Druga različica, imenovana SMOC-1-L21, pa je imela med restrikcijsko mesto BamHI in
začetek zapisa za SMOC-1 vrinjeno L21 zaporedje (slika 4.19). Restrikcijski mesti smo izbrali tako,
da omogočata kloniranje zapisa v vektor pFastBac 1.
Stran 46

Rezultati
Slika 4.19: S PCR smo pomnožili celoten cDNA zapis za SMOC-1. S kombinacijo začetnih oligonukleotidov
BACN in BACC smo dobili rekombinanten zapis SMOC-1-Bac, s kombinacijo BACL in BACC pa rekombinanten
zapis SMOC-1-L21. V oba zapisa smo uvedli restrikcijski mesti NcoI in XhoI, v zapis SMOC-1-L21 pa še L21
zaporedje.
PCR produkte obeh reakcij smo očistili ter uspešnost pomnoževanja preverili na elektroforezi,
kjer smo pri obeh vzorcih ugotovili prisotnost fragmentov velikosti dobrih 1300 bp, ki sta ustrezala
rekombinantnima zapisoma (slika 4.20).
Slika 4.20: Elektroforetska analiza pomnoževanja
rekombinantnih zapisov SMOC-1-Bac in SMOC-1-
L21 s PCR.
1 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 – produkti pomnoževanja rekombinantnega
zapisa SMOC-1-Bac s PCR
3 – produkti pomnoževanja rekombinantnega
zapisa SMOC-1-L21 s PCR
Ker smo v vzorcih opazili tudi druge fragmente DNA, smo fragmenta, ki sta po velikosti
ustrezala rekombinantnima zapisoma, izolirali iz gela. Da bi preverili pravilnost nukleotidnih
zaporedij pomnoženih zapisov, smo izolirana fragmenta ligirali v vektor pPCR-Script Amp SK(+), z
ligacijsko mešanico pa transformirali celice E. coli DH5α. Na ploščah so zrasle tako modre kot bele
kolonije transformant. Po pet belih kolonij smo s PCR preverili na prisotnost zapisa SMOC-1-Bac
oz. SMOC-1-L21, pozitiven rezultat pa smo dobili pri vseh preverjenih kolonijah (slika 4.21).
Stran 47

Slika 4.21: Elektroforetska analiza PCR bakterijskih kolonij, s katero smo
preverjali prisotnost zapisa SMOC-1-Bac oz. SMOC-1-L21 v vektorju pPCR-
Script Amp SK(+).
1 in 7 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 do 6 – PCR produkti, dobljeni po PCR kolonij, ki smo jih preverili na
prisotnost zapisa SMOC-1-Bac
8 do 12 – PCR produkti, dobljeni po PCR kolonij, ki smo jih preverili na
prisotnost zapisa SMOC-1-L21
Rezultati
Določili smo nukleotidna zaporedja dveh zapisov SMOC-1-Bac ter dveh zapisov SMOC-1-L21 in
ugotovili, da se vsi zapisi ujemajo s cDNA zapisom.
Iz vektorja pPCR-Script Amp SK(+) smo z uporabo restriktaz BamHI in XhoI izrezali fragmenta
DNA z zapisom SMOC-1-Bac oz. SMOC-1-L21 ter ju ligirali v predhodno rezan vektor pFastBac 1, z
ligacijsko mešanico pa smo transformirali celice E. coli DH5α. Po šest kolonij transformant smo na
prisotnost posameznega zapisa preverili s PCR. Identificirali smo po eno kolonijo, ki je vsebovala
plazmid pFastBac 1 z vstavljenim ustreznim zapisom (slika 4.22).
Slika 4.22: Elektroforetska analiza PCR bakterijskih kolonij, s katero smo preverjali
prisotnost zapisa SMOC-1-Bac oz. SMOC-1-L21 v vektorju pFastBac 1.
1 in 14 – standardi »GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus«
2 do 7 – PCR produkti, dobljeni po PCR kolonij, ki smo jih preverili na prisotnost
zapisa SMOC-1-Bac
8 do 13 – PCR produkti, dobljeni po PCR kolonij, ki smo jih preverili na prisotnost
zapisa SMOC-1-L21
Stran 48

Rezultati
Z izoliranim plazmidom pFastBac 1, ki je vseboval zapis SMOC-1-Bac oz. SMOC-1-L21 smo
transformirali celice E. coli DH10Bac. Dobili smo tako bele kot modre kolonije. Z αkomplementacijo
smo selekcionirali kolonije, pri katerih je prišlo do transpozicije ter izolirali
bakmidno DNA iz po desetih belih kolonij. Izolirano bakmidno DNA smo s PCR preverili na
prisotnost zapisa SMOC-1-Bac oz. SMOC-1-L21. Pri vseh vzorcih smo ugotovili prisotnost
fragmentov DNA velikosti približno 3500 bp, ki so predstavljali transponirano ekspresijsko kaseto z
vstavljenim rekombinantnim zapisom.
Z bakmidno DNA smo okužili insektne celice. Dobljeni P1 zalogi bakulovirusov smo amplificirali
ter P2 zalogama določili titer. V vdolbinici, ki je vsebovala 10 6 -krat redčene bakuloviruse z zapisom
SMOC-1-Bac, smo prešteli 47 plakov, v tisti, ki je vsebovala 10 6 -krat redčene bakuloviruse z
zapisom SMOC-1-L21, pa smo prešteli 49 plakov. Titra obeh P2 bakulovirusnih zalog sta bila torej
5×10 7 mL -1 .
Populaciji bakulovirusov smo prečistili, iz po osmih vzorcev izolirali DNA ter jo preverili na
prisotnost zapisa SMOC-1-Bac oz. SMOC-1-L21 s PCR. Vsi preverjeni vzorci bakulovirusne DNA so
vsebovali ustrezen zapis, saj so bili pri vseh PCR produktih prisotni fragmenti DNA velikosti
približno 3500 bp (slika 4.23).
Slika 4.23: Elektroforetska analiza produktov PCR bakulovirusne DNA, s katero smo preverili
prisotnost zapisov SMOC-1-Bac in SMOC-1-L21 v DNA bakulovirusov iz izoliranih plakov.
1 in 10 – standardi »GeneRuler 1kb DNA Ladder«
2 do 9 – PCR produkti, dobljeni po PCR DNA bakulovirusov iz izoliranih plakov, pri katerih smo
preverjali prisotnost zapisa SMOC-1-Bac
11 do 18 – PCR produkti, dobljeni po PCR DNA bakulovirusov iz izoliranih plakov, pri katerih smo
preverjali prisotnost zapisa SMOC-1-L21
Po en vzorec prečiščene P1 bakulovirusne zaloge smo dvakrat zapored amplificirali, tako da
smo dobili prečiščeni P3 bakulovirusni zalogi, ki ju bomo uporabili za izražanje rekombinantnega
SMOC-1 v večjem merilu.
Na podlagi rezultatov PCR bakulovirusne DNA smo sklepali, da celotna populacija neprečiščene
P2 bakulovirusne zaloge vsebuje ustrezen zapis, zato smo slednjo uporabili za poskusno izražanje
rekombinantnega SMOC-1. Pri analizi ekspresije smo rekombinanten SMOC-1 identificirali kot liso
z navidezno molekulsko maso okoli 55 kDa, ki je dokaj močna v celičnih frakcijah vzorcev celic,
transficiranih z bakulovirusi, ki so vsebovali zapis SMOC-1-L21, manj močna, a še vedno
prepoznavna pa pri ustreznih frakcijah gojišč. Pri vzorcih kultur, okuženih z bakulovirusi, ki so
vsebovali zapis SMOC-1-Bac, nismo mogli enoznačno identificirati lise, ki bi pripadala
rekombinantnemu SMOC-1. Primerjava vzorcev kultur, okuženih z enakim bakulovirusom pri
različnih multiplicitetah, je pokazala, da ni bistvenih razlik v izražanju pri povišanju multiplicitete
okužbe s 5 na 10 (slika 4.24).
Stran 49

Slika 4.24: NaDS PAGE analiza poskusnega izražanja SMOC-1 v insektnih celicah 48 ur po okužbi.
std – standardi »LMW-SDS Markers«
SMOC-1-Bac – kultura, okužena z bakulovirusi, ki so vsebovali zapis SMOC-1-Bac
SMOC-1-L21 – kultura, okužena z bakulovirusi, ki so vsebovali zapis SMOC-1-L21
MOI 5 – multipliciteta okužbe 5
MOI 10 – multipliciteta okužbe 10
celice – proteini v lizatu celične frakcije kulture
gojišče – proteini v gojišču kulture
Rezultati
S puščico sta označeni lisi, ki pripadata rekombinantnem SMOC-1. Molekulske mase standardov so v kDa.
Pri vzorcu insektnih celic, okuženih z bakulovirusom, ki vsebuje zapis SMOC-1-L21, smo
preverili tudi vpliv časa okužbe na izražanje rekombinantnega SMOC-1, in sicer smo primerjali
vzorce kultur, okuženih 48 ter 72 ur pri multipliciteti okužbe 5. Ugotovili smo, da podaljšanje časa
okužbe z 48 na 72 ur nima bistvenega vpliva niti na količino izraženega rekombinantnega SMOC-1
niti na njegovo lokalizacijo (slika 4.25). Pri okužbi z bakulovirusom, ki vsebuje zapis SMOC-1-L21,
multipliciteti okužbe 5 in trajanju okužbe 48 ur ocenjujemo izkoristek izražanja na okoli 2 mg
izločenega proteina na liter kulture.
Slika 4.25: Primerjava izražanja rekombinantnega
SMOC-1 48 ter 72 ur po okužbi z bakulovirusom, ki
vsebuje zapis SMOC-1-L21, pri multipliciteti okužbe 5.
std – standardi »LMW-SDS Markers«
48 ur – kultura 48 ur po okužbi
72 ur – kultura 72 ur po okužbi
celice – proteini v lizatu celične frakcije kulture
gojišče – proteini v gojišču kulture
Molekulske mase standardov so v kDa.
Stran 50

4.4. Molekulsko modeliranje tiroglobulinskih domen SMOC-1
Rezultati
Z uporabo molekulskega modeliranja smo zgradili modela obeh tiroglobulinskih domen SMOC-
1 (Tg1 in Tg2) ter po štiri modele z natančneje izračunano strukturo zank.
Primerjava dobljenih modelov s strukturo p41 fragmenta, ki je služil kot osnova za modeliranje,
pokaže bistveno razliko le v N-terminalni α-vijačnici, ki je pri modelih obeh domen daljša kot pri
p41 fragmentu, in sicer na račun insercij po petih ostankov v obeh domenah glede na p41. Pri Tg2
je nekoliko daljša tudi zanka med drugim in tretjim trakom β-ploskve, in sicer na račun insercije Thr
ostanka (slika 4.26).
Tg1
Tg2
Slika 4.26: Primerjava modelov Tg1 in Tg2 s strukturo p41
fragmenta. (zgoraj) Superpozicija modela Tg1 (moder) na p41
fragment (rumen). (spodaj) Superpozicija modela Tg2 (siv) na
p41 fragment (rumen). Sliki sta bili narejeni s programom
Accelrys ViewerLite 4.2.
Stran 51

Rezultati
Primerjava modelov Tg1 in Tg2, dobljenih z natančnejšim izračunavanjem strukture zank kaže,
da prihaja v obeh primerih do razlik v prvi in tretji zanki na spodnjem delu molekule. Pri modelih
Tg2 se pojavljajo tudi razlike v strukturi zanke med drugo in tretjo verigo β-ploskve (slika 4.27).
Tg1
Tg2
Slika 4.27: Modeli, dobljeni z natančnejšim izračunavanjem
strukture zank. (zgoraj) Modeli Tg1. (spodaj) Modeli Tg2. S
puščicami so označene zanke, katerih konformacije se pri
posameznih modelih razlikujejo. Sliki sta bili narejeni s
programom Accelrys ViewerLite 4.2.
Stran 52

5. Diskusija
Diskusija
SMOC-1 se nahaja izven celic, zato se njegove potencialne interakcije s katepsini vežejo na
pojavljanje le-teh v ekstracelularnem prostoru. Do sedaj je znano, da se nekateri katepsini nahajajo
tudi izven celic, kjer sodelujejo v mnogih fizioloških in patoloških procesih [zbrano v 4,8,9]. Seveda
ni izključeno, da se tudi ostali katepsini v določenih okoliščinah ne pojavljajo izven celic. Predvsem
o tistih, ki so bili odkriti v zadnjih nekaj letih, vemo zelo malo. RGD motiv prokatepsina X, ki se pri
mnogih ekstracelularnih proteinih pojavlja kot vezavno mesto za integrine [77], nakazuje, da bi se
katepsin X lahko nahajal ekstracelularno. Prav tako bi se katepsin W, katerega funkcija je povezana
s citotoksičnostjo limfocitov [17], v določenih primerih lahko znašel izven celic. Ali je kaj od tega
dejansko res, se bo pokazalo v prihodnje.
Za izražanje SMOC-1 v obliki inkluzijskih telesc v E. coli smo se odločili v prvi vrsti zato, ker je
proizvodnja sicer denaturiranih rekombinantnih proteinov v obliki inkluzijskih telesc relativno
preprosta, izkoristki so ponavadi visoki, izolacija hitra, izoliran rekombinanten protein pa dokaj čist.
Obenem so denaturirani proteini primerni za imunizacijo, ki je bila primaren namen uporabe
denaturiranega SMOC-1. Del protiteles, dobljenih z imunizacijo z denaturiranimi antigeni, je
sposoben prepoznati tudi epitope nativnih proteinov. Serum, pripravljen po podobnem postopku,
je že bil uspešno uporabljen za detekcijo SMOC-1 v mišjih tkivih [55].
Analiza kunčjega krvnega seruma je pokazala, da serum poleg proti-SMOC-1 protiteles vsebuje
tudi druga protitelesa. Ta so lahko posledica naravne imunosti kunca ali pa dodatka adjuvansa pri
imunizaciji. Slednjega smo dodali, ker poveča imunogenost vseh proteinov v vzorcu in s tem
poveča verjetnost uspešnosti postopka. Višjo specifičnost imunodetekcije na membrani bi morda
lahko dosegli že z manjšo uporabljeno količino seruma. Na podlagi hitrosti razvoja barvne reakcije,
ki je bila v primeru proti-SMOC-1 protiteles hitrejša kot pri ostalih, namreč sklepamo, da je titer teh
protiteles v serumu visok glede na ostala. Iz seruma bomo proti-SMOC-1 protitelesa izolirali z
uporabo afinitetne kromatografije z imobiliziranim denaturiranim SMOC-1, kakovost izoliranih
protiteles pa bomo določili z ELISA testom.
Ker je bil izkoristek izražanja visok, smo poskusili denaturiran SMOC-1 renaturirati, čeprav smo
ocenili, da je verjetnost renaturacije glede na kompleksnost zgradbe SMOC-1 majhna. Protein je
namreč zgrajen iz petih domen s skupno dvajsetimi Cys ostanki v desetih disulfidnih vezeh in
nepravilna tvorba katere koli izmed njih privede do nepravilno zvitega proteina. Po renaturaciji je
bil velik delež SMOC-1 v topni frakciji, smo pa zaznali tudi prisotnost agregatov z veliko molekulsko
maso. Ko smo z dializo odstranili komponente renaturacijskega pufra, se je prej topen SMOC-1
oboril. To je bila verjetno posledica zmanjšanja koncentracije L-arginina, ki je v denaturacijskem
pufru stabiliziral molekule, ki so bile le delno pravilno zvite [78]. Poskuse renaturacije SMOC-1 smo
začasno ustavili, saj na podlagi poskusne ekspresije pričakujemo dobre rezultate v insektnih
celicah.
Posamezni tiroglobulinski domeni SMOC-1 smo poskušali izraziti vzporedno tako v citoplazmi
E. coli kot v periplazmi z uporabo zapisov, kloniranih v vektor pET-22b(+). V periplazmi po
izražanju nismo zaznali nobene od domen, v citoplazmi pa smo zaznali le fuzijski protein Trx-Tg2.
Fuzijskega proteina Trx-Tg1 nismo uspeli pridobiti niti s spreminjanjem pogojev ekspresije, kot
so temperatura gojenja bakterij, dodatek glukoze v gojišču, uporaba drugačnega medija in
indukcija ekspresije v stacionarni fazi rasti bakterij. Prav tako se protein Tg1 ni izrazil v popolnoma
neodvisnem poskusu, kjer smo ga poskusili pridobiti v inkluzijskih telescih po istem postopku kot
cel SMOC-1. Pri večini neuspešnih poskusov smo opazili negativen vpliv indukcije izražanja na
bakterijsko kulturo, ki se je kazal kot upadanje števila celic po indukciji. Podobni primeri so znani iz
literature [79], podobne težave pa se kažejo tudi pri izražanju nekaterih tiroglobulinskih domen tipa
1 iz drugih proteinov [Pavšič, M., osebna komunikacija].
Nasprotno se je v primeru Trx-Tg2 izbira ekspresijskega sistema izkazala kot ustrezna, saj se je
fuzijski protein izrazil v topni obliki. V vzorcu smo opazili tudi agregate fuzijskih proteinov ter
polipeptidne verige z nižjo navidezno molekulsko maso, ki smo jih na podlagi analize N-terminalnih
zaporedij identificirali kot razgradne produkte fuzijskega proteina. Prisotnost agregatov in
primerjava vzorcev celičnega lizata po izražanju ter izoliranega fuzijskega proteina kažeta na to, da
je le del izraženega proteina topen. Pojav je znana posledica agregacije rekombinantnih in
čezmerno izraženih endogenih proteinov v E. coli zaradi visokih hitrosti translacije [80]. Težavo se
da omiliti z gojenjem kulture pri nižjih temperaturah [81] ali z bolj kontroliranimi pogoji gojenja v
Stran 53

Diskusija
bioreaktorjih. Problem agregatov in razgradnih produktov smo rešili z optimizacijo postopka
izolacije, tako da nam je relativno čist fuzijski protein Trx-Tg2 uspelo izolirati v enem koraku.
Izolirano Tg2 nameravamo uporabiti za študije interakcij s potencialnimi tarčnimi encimi, pridobili
pa jo bomo z odcepom fuzijskega partnerja z enterokinazo.
Pri poskusnem izražanju SMOC-1 v insektnih celicah se je skladno z objavljenimi podatki [73]
pokazal vpliv L21 zaporedja na izražanje rekombinantnega proteina, saj smo v primeru prisotnosti
tega zaporedja opazili nekajkrat večje količine izraženega SMOC-1. Primerjava časovnega poteka
proizvodnje rekombinantnega proteina kaže vrhunec proizvodnje 48 ur po infekciji. Optimalno
kombinacijo pogojev izražanja, in sicer okužbe pri multipliciteti 5 ter časa trajanja okužbe 48 ur,
smo določili na osnovi dokaj omejenega variiranja pogojev. Vsekakor bi se splačalo preveriti tudi
nižje multiplicitete infekcij. Enak izkoristek izražanja pri nižji multipliciteti okužbe bi namreč imel za
posledico zmanjšano porabo virusnih zalog, ki so pri velikih količinah celičnih kultur lahko
precejšnje, lahko pa tudi večjo količino izraženega rekombinantnega SMOC-1. Izkoristek izražanja
smo ocenili na 2 mg izločenega SMOC-1 na liter kulture. Vrednost je okvirna, do nje smo prišli na
podlagi subjektivnih ocen količine vzorca na NaDS PAGE, velja pa le za celice, gojene v enoslojni
kulturi, pri gostoti celic 1×10 6 ml -1 ob času sejanja. Pri drugačni gostoti celic se izkoristek seveda
ustrezno spremeni, saj je neposredno odvisen od števila celic, ne pa od volumna gojišča. Večje
količine rekombinantnega proteina nameravamo proizvesti v suspenzijskih kulturah, kjer zaradi
večje gostote celic pričakujemo večje količine proizvedenega rekombinantnega SMOC-1.
Pri izražanju SMOC-1 v celicah linije Sf9 se je le majhen del proizvedenega proteina izločil v
gojišče, večina pa ga je ostala v celicah, kar je za to celično linijo običajno [82]. Te celice so
namreč idealne za generiranje in razmnoževanje rekombinantnih bakulovirusov, niso pa vedno
primerne za proizvodnjo rekombinantnih proteinov [83]. Na podlagi primerjave z rekombinantnim
SMOC-1, izraženem v človeški celični liniji [84], je vprašljiva glikozilacija izločenega proteina v
celični liniji Sf9. Zato nameravamo SMOC-1 izraziti v celicah linije High Five [85], ki so primernejše
za proizvodnjo rekombinantnih ekstracelularnih proteinov [82].
Zgrajeni računalniški modeli kažejo na fleksibilnost prve in tretje zanke na spodnjem delu Tg1 in
Tg2. Fleksibilnost teh dveh zank pri tiroglobulinskih domenah tipa 1 je znana že iz strukture p41
fragmenta [31,61]. Pri modelu Tg2 opazimo tudi različne konformacije zanke med drugim in tretjim
trakom β-ploskve, kar kaže na to, da je struktura te zanke pri Tg2 drugačna kot pri p41 fragmentu,
ne pa na fleksibilnost tega dela domene. Ta del namreč vsebuje insercijo Thr ostanka glede na p41
fragment, torej je celotna zanka nekoliko daljša kot pri slednjem.
Na nivoju posameznih ostankov izstopa substitucija med tiropini ohranjenega Ser ostanka, ki
pri p41 fragmentu tvori vodikovo vez s Cys ostankom v aktivnem mestu katepsina L [31]. Ta
ostanek je je v Tg1 zamenjan s Tyr ostankom, ki je prav tako sposoben tvoriti vodikovo vez. Kot
problematične pa bi se lahko izkazale sterične interakcije, saj je stranska skupina Tyr večja od tiste
Ser. Seveda obstajajo tudi druge razlike na nivoju posameznih ostankov. Te so znotraj skupine
tiropinov zelo pomembne, saj določajo specifičnost posameznih predstavnikov do tarčnih
encimov.
Bistvena razlika med obema modeloma ter p41 fragmentom je podaljšana α-vijačnica obeh
domen SMOC-1. Taka insercija je prisotna tudi v tiroglobulinski domeni tipa 1 testikana-1, ki ni le
inhibitor, ampak tudi substrat nekaterih cisteinskih proteaz. Modela kompleksov te domene s
katepsinoma K in L kažeta, da se zaradi te insercije prva zanka domene v aktivno mesto encimov
veže v nekoliko drugačni konformaciji, kot je znana iz kompleksa p41 fragmenta in katepsina L. Ta
razlika morda pojasnjuje, zakaj domena testikana-1 deluje kot substrat katepsinov [Meh, P. in sod.,
v tisku]. Ker Tg1 in Tg2 vsebujeta enako dolgi inserciji kot domena testikana-1, obstaja verjetnost,
da se tudi ti dve domeni pojavljata v vlogi substratov katepsinov. Za potrditev te domneve bomo
seveda potrebovali eksperimentalne podatke o interakcijah med Tg1 in Tg2 ter tarčnimi encimi.
Izračunani modeli pa nam bodo služili kot osnova za razlago eksperimentalno potrjenih interakcij
na strukturnem nivoju.
Stran 54

6. Zaključek
Zaključek
V okviru diplomskega dela nam je uspelo izraziti rekombinanten SMOC-1 v inkluzijskih telescih
v E. coli, ki smo ga uporabili za imunizacijo kunca. Dobljen krvni serum vsebuje proti-SMOC-1
protitelesa, ki jih nameravamo uporabiti za detekcijo SMOC-1 v različnih sistemih, tudi in vivo.
Pripravili smo delujoč sistem za izražanje SMOC-1 v insektnih celicah, prav tako pa nam je
uspelo izraziti in izolirati drugo tiroglobulinsko domeno tipa 1 SMOC-1 v obliki topnega proteina v
E. coli.
Celotno delo v okviru tega diplomskega dela je služilo prvenstveno kot izhodišče za nadaljnje
delo. Pripravljeni ekspresijski sistemi so osnova za proizvedbo večjih količin rekombinantnih
proteinov, ki jih bomo potrebovali za karakterizacijo ter študije interakcij s potencialnimi tarčnimi
encimi.
Stran 55

7. Literatura
Literatura
1. Price, N. C. and Stewens, L., Fundamentals of Enzymology: The Cell and Molecular Biology of
Catalytic Proteins, 3rd edition, 1999, Oxford University Press, Oxford
2. Merops: the Peptidase Database 6.60, http://merops.sanger.ac.uk/, 2004
3. Barrett, A. J., Rawlings, N. D., and Woesner, J. F. Jr., Handbook of Proteolytic Enzymes, 1998,
Academic Press, London
4. Turk, B., Turk, D., and Turk, V. (2000) Lysosomal cysteine proteases: more than scavengers, Biochim
Biophys Acta, 1477, 98-111.
5. Polgar, L., Mechanisms of Protease Action, 1989, CRC Press Inc., Boca Raton, FL
6. Turk, D., Gunčar, G., Podobnik, M., and Turk, B. (1998) Revised definition of substrate binding sites
of papain-like cysteine proteases, Biol Chem, 379, 137-147.
7. Schechter, I. and Berger, A. (1967) On the size of the active site in proteases. I. Papain, Biochem
Biophys Res Commun, 27, 157-162.
8. Turk, B., Turk, D., and Salvesen, G.S. (2002) Regulating cysteine protease activity: essential role of
protease inhibitors as guardians and regulators, Curr Pharm Des, 8, 1623-1637.
9. Turk, D. and Gunčar, G. (2003) Lysosomal cysteine proteases (cathepsins): promising drug targets,
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 59, 203-213.
10. Chapman, H.A. (1998) Endosomal proteolysis and MHC class II function, Curr Opin Immunol, 10, 93-
102.
11. Shi, G.P., Villadangos, J.A., Dranoff, G., Small, C., Gu, L., Haley, K.J., Riese, R., Ploegh, H.L., and
Chapman, H.A. (1999) Cathepsin S required for normal MHC class II peptide loading and germinal
center development, Immunity, 10, 197-206.
12. Shi, G.P., Bryant, R.A., Riese, R., Verhelst, S., Driessen, C., Li, Z., Bromme, D., Ploegh, H.L., and
Chapman, H.A. (2000) Role for cathepsin F in invariant chain processing and major
histocompatibility complex class II peptide loading by macrophages, J Exp Med, 191, 1177-1186.
13. Nakagawa, T., Roth, W., Wong, P., Nelson, A., Farr, A., Deussing, J., Villadangos, J.A., Ploegh, H.,
Peters, C., and Rudensky, A.Y. (1998) Cathepsin L: critical role in Ii degradation and CD4 T cell
selection in the thymus, Science, 280, 450-453.
14. Tolosa, E., Li, W., Yasuda, Y., Wienhold, W., Denzin, L.K., Lautwein, A., Driessen, C., Schnorrer, P.,
Weber, E., Stevanovic, S., Kurek, R., Melms, A., and Bromme, D. (2003) Cathepsin V is involved in
the degradation of invariant chain in human thymus and is overexpressed in myasthenia gravis, J
Clin Invest, 112, 517-526.
15. Roth, W., Deussing, J., Botchkarev, V.A., Pauly-Evers, M., Saftig, P., Hafner, A., Schmidt, P.,
Schmahl, W., Scherer, J., Anton-Lamprecht, I., Von Figura, K., Paus, R., and Peters, C. (2000)
Cathepsin L deficiency as molecular defect of furless: hyperproliferation of keratinocytes and
pertubation of hair follicle cycling, FASEB J, 14, 2075-2086.
16. Linnevers, C., Smeekens, S.P., and Bromme, D. (1997) Human cathepsin W, a putative cysteine
protease predominantly expressed in CD8+ T-lymphocytes, FEBS Lett, 405, 253-259.
17. Wex, T., Wex, H., Hartig, R., Wilhelmsen, S., and Malfertheiner, P. (2003) Functional involvement of
cathepsin W in the cytotoxic activity of NK-92 cells, FEBS Lett, 552, 115-119.
18. Pham, C.T. and Ley, T.J. (1999) Dipeptidyl peptidase I is required for the processing and activation of
granzymes A and B in vivo, Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 8627-8632.
Stran 56

Literatura
19. Allende, L.M., Garcia-Perez, M.A., Moreno, A., Corell, A., Carasol, M., Martinez-Canut, P., and Arnaiz-
Villena, A. (2001) Cathepsin C gene: First compound heterozygous patient with Papillon-Lefevre
syndrome and a novel symptomless mutation, Hum Mutat, 17, 152-153.
20. Toomes, C., James, J., Wood, A.J., Wu, C.L., McCormick, D., Lench, N., Hewitt, C., Moynihan, L.,
Roberts, E., Woods, C.G., Markham, A., Wong, M., Widmer, R., Ghaffar, K.A., Pemberton, M.,
Hussein, I.R., Temtamy, S.A., Davies, R., Read, A.P., Sloan, P., Dixon, M.J., and Thakker, N.S.
(1999) Loss-of-function mutations in the cathepsin C gene result in periodontal disease and
palmoplantar keratosis, Nat Genet, 23, 421-424.
21. Wolters, P.J., Laig-Webster, M., and Caughey, G.H. (2000) Dipeptidyl peptidase I cleaves matrixassociated
proteins and is expressed mainly by mast cells in normal dog airways, Am J Respir Cell
Mol Biol, 22, 183-190.
22. Turk, V. and Bode, W. (1991) The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases, FEBS Lett,
285, 213-219.
23. Salvesen, G., Parkes, C., Abrahamson, M., Grubb, A., and Barrett, A.J. (1986) Human low-Mr
kininogen contains three copies of a cystatin sequence that are divergent in structure and in
inhibitory activity for cysteine proteinases, Biochem J, 234, 429-434.
24. Schick, C., Pemberton, P.A., Shi, G.P., Kamachi, Y., Cataltepe, S., Bartuski, A.J., Gornstein, E.R.,
Bromme, D., Chapman, H.A., and Silverman, G.A. (1998) Cross-class inhibition of the cysteine
proteinases cathepsins K, L, and S by the serpin squamous cell carcinoma antigen 1: a kinetic
analysis, Biochemistry, 37, 5258-5266.
25. Mason, R.W. (1989) Interaction of lysosomal cysteine proteinases with alpha 2-macroglobulin:
conclusive evidence for the endopeptidase activities of cathepsins B and H, Arch Biochem
Biophys, 273, 367-374.
26. Katunuma, N., Ohashi, A., Sano, E., Murata, E., Shiota, H., Yamamoto, K., Majima, E., and Le, Q.T.
(2003) New cysteine protease inhibitors in physiological secretory fluids and their medical
significance, Adv Enzyme Regul, 43, 393-410.
27. Ohashi, A., Murata, E., Yamamoto, K., Majima, E., Sano, E., Le, Q.T., and Katunuma, N. (2003) New
functions of lactoferrin and beta-casein in mammalian milk as cysteine protease inhibitors,
Biochem Biophys Res Commun, 306, 98-103.
28. Rozman, J., Stojan, J., Kuhelj, R., Turk, V., and Turk, B. (1999) Autocatalytic processing of
recombinant human procathepsin B is a bimolecular process, FEBS Lett, 459, 358-362.
29. Delaria, K., Fiorentino, L., Wallace, L., Tamburini, P., Brownell, E., and Muller, D. (1994) Inhibition of
cathepsin L-like cysteine proteases by cytotoxic T-lymphocyte antigen-2 beta, J Biol Chem, 269,
25172-25177.
30. Lenarčič, B. and Bevec, T. (1998) Thyropins - new structurally related proteinase inhibitors, Biol
Chem, 379, 105-111.
31. Gunčar, G., Pungerčič, G., Klemenčič, I., Turk, V., and Turk, D. (1999) Crystal structure of MHC class
II-associated p41 Ii fragment bound to cathepsin L reveals the structural basis for differentiation
between cathepsins L and S, EMBO J, 18, 793-803.
32. Stubbs, M.T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarčič, B., and Turk, V. (1990) The refined
2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine
proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction, EMBO J, 9, 1939-1947.
33. Atley, L.M., Mort, J.S., Lalumiere, M., and Eyre, D.R. (2000) Proteolysis of human bone collagen by
cathepsin K: characterization of the cleavage sites generating by cross-linked N-telopeptide
neoepitope, Bone, 26, 241-247.
Stran 57

Literatura
34. Bossard, M.J., Tomaszek, T.A., Thompson, S.K., Amegadzie, B.Y., Hanning, C.R., Jones, C., Kurdyla,
J.T., McNulty, D.E., Drake, F.H., Gowen, M., and Levy, M.A. (1996) Proteolytic activity of human
osteoclast cathepsin K. Expression, purification, activation, and substrate identification, J Biol
Chem, 271, 12517-12524.
35. Silver, I.A., Murrills, R.J., and Etherington, D.J. (1988) Microelectrode studies on the acid
microenvironment beneath adherent macrophages and osteoclasts, Exp Cell Res, 175, 266-276.
36. Garnero, P., Borel, O., Byrjalsen, I., Ferreras, M., Drake, F.H., McQueney, M.S., Foged, N.T., Delmas,
P.D., and Delaisse, J.M. (1998) The collagenolytic activity of cathepsin K is unique among
mammalian proteinases, J Biol Chem, 273, 32347-32352.
37. Gelb, B.D., Shi, G.P., Chapman, H.A., and Desnick, R.J. (1996) Pycnodysostosis, a lysosomal disease
caused by cathepsin K deficiency, Science, 273, 1236-1238.
38. Punturieri, A., Filippov, S., Allen, E., Caras, I., Murray, R., Reddy, V., and Weiss, S.J. (2000)
Regulation of elastinolytic cysteine proteinase activity in normal and cathepsin K-deficient human
macrophages, J Exp Med, 192, 789-799.
39. Reddy, V.Y., Zhang, Q.Y., and Weiss, S.J. (1995) Pericellular mobilization of the tissue-destructive
cysteine proteinases, cathepsins B, L, and S, by human monocyte-derived macrophages, Proc Natl
Acad Sci U S A, 92, 3849-3853.
40. Fiebiger, E., Maehr, R., Villadangos, J., Weber, E., Erickson, A., Bikoff, E., Ploegh, H.L., and Lennon-
Dumenil, A.M. (2002) Invariant chain controls the activity of extracellular cathepsin L, J Exp Med,
196, 1263-1269.
41. Brix, K., Lemansky, P., and Herzog, V. (1996) Evidence for extracellularly acting cathepsins mediating
thyroid hormone liberation in thyroid epithelial cells, Endocrinology, 137, 1963-1974.
42. Lemansky, P., Brix, K., and Herzog, V. (1998) Iodination of mature cathepsin D in thyrocytes as an
indicator for its transport to the cell surface, Eur J Cell Biol, 76, 53-62.
43. Tepel, C., Bromme, D., Herzog, V., and Brix, K. (2000) Cathepsin K in thyroid epithelial cells:
sequence, localization and possible function in extracellular proteolysis of thyroglobulin, J Cell Sci,
113 Pt 24, 4487-4498.
44. Kos, J. and Schweiger, A. (2002) Cathepsins and cystatins in extracellular fluids - useful biological
markers in cancer, Radiol Oncol, 36, 176-179.
45. Linebaugh, B.E., Sameni, M., Day, N.A., Sloane, B.F., and Keppler, D. (1999) Exocytosis of active
cathepsin B enzyme activity at pH 7.0, inhibition and molecular mass, Eur J Biochem, 264, 100-109.
46. Mach, L., Mort, J.S., and Glossl, J. (1994) Noncovalent complexes between the lysosomal proteinase
cathepsin B and its propeptide account for stable, extracellular, high molecular mass forms of the
enzyme, J Biol Chem, 269, 13036-13040.
47. Sloane, B.F., Moin, K., Sameni, M., Tait, L.R., Rozhin, J., and Ziegler, G. (1994) Membrane association
of cathepsin B can be induced by transfection of human breast epithelial cells with c-Ha-ras
oncogene, J Cell Sci, 107 ( Pt 2), 373-384.
48. Buck, M.R., Karustis, D.G., Day, N.A., Honn, K.V., and Sloane, B.F. (1992) Degradation of
extracellular-matrix proteins by human cathepsin B from normal and tumour tissues, Biochem J,
282 ( Pt 1), 273-278.
49. Premzl, A., Zavašnik-Bergant, V., Turk, V., and Kos, J. (2003) Intracellular and extracellular cathepsin
B facilitate invasion of MCF-10A neoT cells through reconstituted extracellular matrix in vitro, Exp
Cell Res, 283, 206-214.
50. Kostoulas, G., Lang, A., Nagase, H., and Baici, A. (1999) Stimulation of angiogenesis through
cathepsin B inactivation of the tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, FEBS Lett, 455, 286-
290.
Stran 58

Literatura
51. Alberts, B, Johnson, A., Lewis, J., Raff, M, Roberts, K, and Walter, P, Molecular Biology of the Cell,
4th edition, 2002, Garland Science, New York
52. Hohenester, E. and Engel, J. (2002) Domain structure and organisation in extracellular matrix
proteins, Matrix Biol, 21, 115-128.
53. Yurchenco, P.D., Amenta, P.S., and Patton, B.L. (2004) Basement membrane assembly, stability and
activities observed through a developmental lens, Matrix Biol, 22, 521-538.
54. Dziadek, M., Paulsson, M., Aumailley, M., and Timpl, R. (1986) Purification and tissue distribution of a
small protein (BM-40) extracted from a basement membrane tumor, Eur J Biochem, 161, 455-464.
55. Vannahme, C., Smyth, N., Miosge, N., Gosling, S., Frie, C., Paulsson, M., Maurer, P., and Hartmann,
U. (2002) Characterization of SMOC-1, a novel modular calcium-binding protein in basement
membranes, J Biol Chem, 277, 37977-37986.
56. Hohenester, E., Maurer, P., and Timpl, R. (1997) Crystal structure of a pair of follistatin-like and EFhand
calcium-binding domains in BM-40, EMBO J, 16, 3778-3786.
57. Vannahme, C., Gosling, S., Paulsson, M., Maurer, P., and Hartmann, U. (2003) Characterization of
SMOC-2, a modular extracellular calcium-binding protein, Biochem J, 373, 805-814.
58. Malthiery, Y. and Lissitzky, S. (1987) Primary structure of human thyroglobulin deduced from the
sequence of its 8448-base complementary DNA, Eur J Biochem, 165, 491-498.
59. Molina, F., Bouanani, M., Pau, B., and Granier, C. (1996) Characterization of the type-1 repeat from
thyroglobulin, a cysteine-rich module found in proteins from different families, Eur J Biochem, 240,
125-133.
60. Lenarčič, B., Ritonja, A., Štrukelj, B., Turk, B., and Turk, V. (1997) Equistatin, a new inhibitor of
cysteine proteinases from Actinia equina, is structurally related to thyroglobulin type-1 domain, J
Biol Chem, 272, 13899-13903.
61. Chiva, C., Barthe, P., Codina, A., Gairi, M., Molina, F., Granier, C., Pugniere, M., Inui, T., Nishio, H.,
Nishiuchi, Y., Kimura, T., Sakakibara, S., Albericio, F., and Giralt, E. (2003) Synthesis and NMR
structure of p41icf, a potent inhibitor of human cathepsin L, J Am Chem Soc, 125, 1508-1517.
62. Strubin, M., Long, E.O., and Mach, B. (1986) Two forms of the Ia antigen-associated invariant chain
result from alternative initiations at two in-phase AUGs, Cell, 47, 619-625.
63. Bevec, T., Stoka, V., Pungerčič, G., Dolenc, I., and Turk, V. (1996) Major histocompatibility complex
class II-associated p41 invariant chain fragment is a strong inhibitor of lysosomal cathepsin L, J
Exp Med, 183, 1331-1338.
64. Bevec, T., Stoka, V., Pungerčič, G., Cazzulo, J.J., and Turk, V. (1997) A fragment of the major
histocompatibility complex class II-associated p41 invariant chain inhibits cruzipain, the major
cysteine proteinase from Trypanosoma cruzi, FEBS Lett, 401, 259-261.
65. Yamashita, M. and Konagaya, S. (1996) A novel cysteine protease inhibitor of the egg of chum
salmon, containing a cysteine-rich thyroglobulin-like motif, J Biol Chem, 271, 1282-1284.
66. Lenarčič, B. and Turk, V. (1999) Thyroglobulin type-1 domains in equistatin inhibit both papain-like
cysteine proteinases and cathepsin D, J Biol Chem, 274, 563-566.
67. Galeša, K., Pain, R., Jongsma, M.A., Turk, V., and Lenarčič, B. (2003) Structural characterization of
thyroglobulin type-1 domains of equistatin, FEBS Lett, 539, 120-124.
68. Lenarčič, B., Krishnan, G., Borukhovich, R., Ruck, B., Turk, V., and Moczydlowski, E. (2000) Saxiphilin,
a saxitoxin-binding protein with two thyroglobulin type 1 domains, is an inhibitor of papain-like
cysteine proteinases, J Biol Chem, 275, 15572-15577.
Stran 59

Literatura
69. Alliel, P.M., Perin, J.P., Jolles, P., and Bonnet, F.J. (1993) Testican, a multidomain testicular
proteoglycan resembling modulators of cell social behaviour, Eur J Biochem, 214, 347-350.
70. Bocock, J.P., Edgell, C.J., Marr, H.S., and Erickson, A.H. (2003) Human proteoglycan testican-1
inhibits the lysosomal cysteine protease cathepsin L, Eur J Biochem, 270, 4008-4015.
71. Marr, H.S. and Edgell, C.J. (2003) Testican-1 inhibits attachment of Neuro-2a cells, Matrix Biol, 22,
259-266.
72. LaVallie, E.R., DiBlasio, E.A., Kovačič, S., Grant, K.L., Schendel, P.F., and McCoy, J.M. (1993) A
thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli
cytoplasm, Biotechnology (N Y ), 11, 187-193.
73. Sano, K., Maeda, K., Oki, M., and Maeda, Y. (2002) Enhancement of protein expression in insect cells
by a lobster tropomyosin cDNA leader sequence, FEBS Lett, 532, 143-146.
74. Vaughn, J.L., Goodwin, R.H., Tompkins, G.J., and McCawley, P. (1977) The establishment of two cell
lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae), In Vitro, 13, 213-217.
75. Fiser, A., Do, R.K., and Sali, A. (2000) Modeling of loops in protein structures, Protein Sci, 9, 1753-
1773.
76. Sali, A. and Blundell, T.L. (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints, J
Mol Biol, 234, 779-815.
77. Nagler, D.K. and Menard, R. (1998) Human cathepsin X: a novel cysteine protease of the papain
family with a very short proregion and unique insertions, FEBS Lett, 434, 135-139.
78. Arakawa, T. and Tsumoto, K. (2003) The effects of arginine on refolding of aggregated proteins: not
facilitate refolding, but suppress aggregation, Biochem Biophys Res Commun, 304, 148-152.
79. Mambetisaeva, E.T., Martin, P.E., and Evans, W.H. (1997) Expression of three functional domains of
connexin 32 as thioredoxin fusion proteins in Escherichia coli and generation of antibodies, Protein
Expr Purif, 11, 26-34.
80. Gribskov, M. and Burgess, R.R. (1983) Overexpression and purification of the sigma subunit of
Escherichia coli RNA polymerase, Gene, 26, 109-118.
81. Schein, C.H. and Noteborn, M.H.M. (1988) Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia
coli is favored by lower growth temperature, Bio/Technology, 6, 291-294.
82. Keith, M.B., Farrell, P.J., Iatrou, K., and Behie, L.A. (1999) Screening of transformed insect cell lines
for recombinant protein production, Biotechnol Prog, 15, 1046-1052.
83. Anderson, D., Harris, R., Polayes, D., Ciccarone, V., Donahue, R., Gerard, G., and Jessee, J. (1996)
Rapid Generation of Recombinant Baculovirus and Expression of Foreign Genes Using the Bac-to-
Bac TM Baculovirus Expression System , Focus (glasilo Gibco BRL), 17, 53-58.
84. Vannahme, C. (2000) Isolierung und Charakterisierung neuer extracellulaerer Calcium-bindender
Proteine der BM-40 Familie, Univerza Koeln, Nemčija
85. Granados, R.R., Guoxun, L., Derksen, A.C.G., and McKenna, K.A. (1994) A New Insect Cell Line from
Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4) Susceptible to Trichoplusia ni Single Enveloped Nuclear
Polyhedrosis Virus, J Invertebr Pathol, 64, 260-266.
Stran 60