Ⅴ.ビブリオ属の検査法

Ⅴ.ビブリオ属の検査法
1.はじめに
ビブリオ属は現在 30 数菌種が知られている。
ヒトの下痢症原因菌:
Vibrio cholerae O1、O139(コレラ菌)････3類感染症菌
V.cholerae non-O1、non-O139(NAG ビブリオ)
V.parahaemolyticus (腸炎ビブリオ) 食中毒菌
V.mimicus 、V.fluvialis 、V.furnissii
食品等の検査では、V.alginolyticus、V.vulnificus が分離されることが多い。
2. ビブリオ属の種類と特徴
1)コレラ菌(V.cholerae O1 および O139)
コレラの原因菌で、主な病原因子はコレラトキシン(CT)である。コレラの典
型的症状は、CT の作用で起こる大量の無痛性水様性下痢と脱水症状で、比較的軽
症のまま経過することもあり、最近はその傾向が強い。
一端単毛性のやや湾曲したグラム陰性、無芽胞桿菌で、発育に食塩を必要とし
ない。
① 分類:現在 V.cholerae は O1~O205 の血清型に分類されている。
3類感染症菌に指定されたコレラ菌は、表4に示す生化学的性状を示し、血清
型が O1 または O139 で、コレラトキシン(CT)を産生する菌である。
② 抗原型:V.cholerae O1 は、a・b・c抗原の量的な違いで小川型、稲葉型に分け
られる。市販の診断用血清(または感作ラテックス)で型別できる(表1)。
表1 コレラ菌の抗原型
診 断 用 血 清 感作ラテックス
混合(O1) 小川因子 稲葉因子 a b c
小川 + + - + + -
稲葉 + - + + - +
③ 生物型:V.cholerae O1 はアジア型とエルトール型に区別される(表2)。
表2 アジア型とエルトール型の鑑別性状
性状 溶血性 ﾆﾜﾄﾘ赤血 ﾎﾟﾘﾐｷｼﾝ B ﾌｧｰｼﾞⅣ ﾌｧｰｼﾞⅤ VP
生物型 (ﾋﾂｼﾞ) 球凝集性 感受性(50U) 感受性 感受性
アジア型 - - + + - -
エルトール型 + + - - + +
V.1

④ コレラ菌の取り扱い
* コレラ毒素を産生する菌(3類感染症)････行政上防疫対策の対象となる
* コレラ毒素を産生しない菌(食中毒菌扱い)････防疫対策とらない
* 真性患者・保菌者の決定は、衛生研究所が行う。(国内初発でない場合も含む)
2)V.cholerae non-O1 および non-O139(NAG ビブリオ)
NAG ビブリオはコレラ菌と分類学的に同じ種に属し、その生態も同じである。
本菌による感染症(食中毒)が発生したときは、防疫措置の対象ではない。
表4に示す生化学的性状を示し、血清型が O1 または O139 以外。
3)V.mimicus
選択分離培地上の所見は腸炎ビブリオと類似している。
発育に食塩を必要としない。
散発下痢症患者から分離されることは稀であり、海外旅行者に多い。
4)V.parahaemolyticus (腸炎ビブリオ)
わが国における食中毒の主要な原因菌の一つである。
汽水域および沿岸海水に生息し、夏期に主に魚介類から感染することが多い。
調理器具等を介して他の食品への二次感染によることも多い。
一端単毛性のグラム陰性、無芽胞桿菌で、発育に食塩を必要とする。
発育至適温度は 30~37℃で 42℃でも発育するが 10℃以下では発育しない。
至適 pH は 8.0 である。至適条件下での増殖は、他の感染型食中毒菌に比べて速い。
血清型:K抗原とO抗原の組み合わせによって型別される。
5)V.fluvialis および V.furnissii
食中毒菌に指定されているが、発生事例はほとんどない。
V.fluvialis は、ブドウ糖からガスを産生しない。
V.furnissii は、ブドウ糖からガスを産生する。
両菌とも発育に NaCl を必要とする。
6)V.vulnificus と V.alginolyticus
① V.vulnificus
分離培地上の外見は腸炎ビブリオに非常によく似ているが、耐塩性・ONPG 試験、セ
ロビオースの分解性で区別できる。慢性肝疾患、ガン、白血病等の患者に感染して
敗血症を起こし、多くの場合致死的な転帰をとる。
② V.alginolyticus
海産魚介類等のビブリオ属の検査で非常に高率に分離される。
ヒトの下痢症とは無関係と考えられている。分離平板上で大きな集落を形成する。
V.2

表3 ビブリオ属の種類と特徴まとめ
V.cholerae
病原因子(検査法) 特徴、血清型
CT
O1,O139 (RPLA,PCR) 血清型:O1(稲葉型、小川型)または O139
(コレラ菌)
ｺﾚﾗ菌(O1)の生物型:ｱｼﾞｱ型、ｴﾙﾄｰﾙ型
NAG ビブリオ なし 血清型:O2~O205 (O139 以外)
コレラ菌と同じ種に属し、その生態も同じ
V.mimicus TDH? 海外旅行者に多い
腸炎ビブリオ TDH
血清型:O:K の組み合わせ
(RPLA,PCR) 食中毒の主要な原因菌で魚介類から感染する
V.fluvialis なし 集団発生事例はほとんどない。
2.ビブリオ属の性状分離培地上の集落性状(表4)
ﾋﾄに激しい水様下痢を起こす
V. vulnificus ? 慢性肝疾患等患者は海水浴、生魚喫食に注意
V.alginolyticus なし 非病原菌
菌 種 TCBS ｸﾛﾓｱｶﾞｰﾋﾞﾌﾞﾘｵ
コレラ菌 黄色 青色
NAG ビブリオ 黄色 青色
V.mimicus 青緑色
V.fluvialis 黄色
V. vulnificus 青緑色
V.parahaemolyticus 青緑色 紫色
V.alginolyticus 黄色 白色
2)主な鑑別性状(表5)
生化学性状
菌 種
斜
面
TSI
高 ガ
層 ス
リ
ジ
ン
LIM イ
ン
ド 運
ー
ル 動
性
VP 0
%
耐塩性
3 6 8 10
% % % %
オ
キ
シ
ダ
ー
ゼ
O
N
P
G
コレラ菌 + + - - + + + d + + - - - + +
H2S
NAG ビブリオ + + - - + + + d + + - - - + +
V.mimicus - + - - + + + - + + - - - + +
V.fluvialis + + - - - d + - - + + - - + +
V.furnissii + + + - - d + - - + + - - + +
V.vulnificus - + - - + + + - - + + - - + +
V.parahaemolyticus - + - - + + + - - + + + - + -
V.alginolyticus + + - - + + + + - + + + + + -
V.3

3.ビブリオ属の検査法
1)使用培地
① 増菌培地:アルカリペプトン水(栄研)
(食塩ポリミキシンブイヨン)(栄研、ニッスイ)
② 分離培地:TCBS 寒天(栄研、ニッスイ、極東等)
クロモアガービブリオ(関東化学)
③ 生化学的性状確認培地:
* TSI 寒天、LIM 培地、VP 半流動培地、普通寒天斜面培地は、1%NaCl 加
* 耐塩性試験培地(0,6,8,10%NaCl 加 Tryptone water)
2)検査法
① コレラ菌
【便】 【食品、水等】
直接培養 増菌培養
TCBS ｱﾙｶﾘﾍﾟﾌﾟﾄﾝ水
37℃、 37℃、8-15h
一夜 分離培養
TCBS
37℃、一夜
疑わしいコロニーためし凝集(O1,O139)
(+) (-)
確認培養 コレラ菌陰性
TSI,LIM (他のﾋﾞﾌﾞﾘｵの可能性)
VP,NA
耐塩性試験(O,6,8,10%)
37℃、一夜
性状確認(表5)、血清型別(表1)
毒素試験(衛研で実施)
V.4
① 検体の処理(増菌培養)
【便】検体量:0.5~1g、増菌培地:10ml
【食品】検体量:10~25g(状況により)
増菌培地:90~225ml
【河川水、海水等】検体量:~2000ml
A;遠心分離法
検体を 8,000rpm で 30 分程度遠心分
離した沈査を試料とする。
B;ﾌｨﾙﾀｰ濾過法
検体を吸引濾過(ﾎﾟｱｰｻｲｽﾞ 0.22-0.45
μm)し、濾紙を試料とする。
* A または B の試料を増菌培地 10~
100ml に入れ増菌培養する。
C;2倍濃厚法
検体に2倍濃度に調整した増菌培地
を等量加え、増菌培養する。
②分離培養:増菌培養液1ｴｰｾﾞ画線培養
③ 疑わしいｺﾛﾆｰためし凝集、性状試験
* TCBS 上のコレラ菌様黄色ｺﾛﾆｰを
感作ﾗﾃｯｸｽ a、ｺﾚﾗ菌診断用血清、
O139 抗血清でｽﾗｲﾄﾞ凝集試験。
* 凝集(+):ｺﾚﾗ菌陽性の疑い。生化学
的性状、CT 産生試験を行い決定する。
* 凝集(-):ｺﾚﾗ菌陰性。必要に応じ、
生化学的性状を調べ菌種を特定。
④ 毒素産生試験
* RPLA 法、PCR 法で行う。(衛研で行う)

② 腸炎ﾋﾞﾌﾞﾘｵ(その他のﾋﾞﾌﾞﾘｵ)
【便】 【食品、環境等】
直接分離 増菌培養
ｱﾙｶﾘ性ﾍﾟﾌﾟﾄﾝ水 or
TCBS (食塩ﾎﾟﾘﾐｷｼﾝﾌﾞｲﾖﾝ)
ｸﾛﾓｱｶﾞｰﾋﾞﾌﾞﾘｵ 37℃、8-15h
37℃、 分離培養
一夜 TCBS
ｸﾛﾓｱｶﾞｰﾋﾞﾌﾞﾘｵ
37℃、一夜
疑わしいｺﾛﾆｰ 確認培養
TSI,LIM
VP,NA
耐塩性試験(O,6,8,10%)
37℃、一夜
性状確認(表5)、血清型別
耐熱性溶血毒(TDH)産生検査
(RPLA,PCR)
(3) 腸炎ﾋﾞﾌﾞﾘｵの定量培養(MPN)
検体の 10 倍希釈液作成
①10ml+2倍濃度ｱﾙｶﾘﾍﾟﾌﾟﾄﾝ水 10ml 3 本
② 1ml+ｱﾙｶﾘﾍﾟﾌﾟﾄﾝ水 10ml 3本
③ 0.1ml+ｱﾙｶﾘﾍﾟﾌﾟﾄﾝ水 10ml 3 本
37℃、一夜培養
分離培養
ｸﾛﾓｱｶﾞｰﾌﾞﾋﾞﾘｵ、(TCBS)
37℃、一夜培養
疑わしいｺﾛﾆｰ 確認培養
TSI,LIM,VP,NA
耐塩性試験(O,6,8,10%)
37℃、一夜培養
性状確認(表5)、
希釈系列毎の陽性試験関数を最確表に当
てはめ、MPN 値を求める。
V.5
① 増菌培養のための検体処理法は、
コレラ菌検査法と同じ
②分離平板上のコロニー性状は表4
参照
③ 血清型別:
腸炎ビブリオは、K 抗原と O 抗原の
組み合わせで型別される。
K 抗原型別:
* 生菌によるｽﾗｲﾄﾞ凝集試験
* NA または TSI 寒天上の菌を使用
O 抗原型別:
* 加熱死菌によるｽﾗｲﾄﾞ凝集試験
* NA または TSI 寒天上の菌を 3%食
塩水(約 1ml)に濃厚浮遊させる
* 121℃、30~60 分加熱
* 3､000 回転 20 分遠心分離した沈
渣を使用
海産物等の食品を検査対象とした検査
では、V.vulnificus が分離されることが
ある。腸炎ﾋﾞﾌﾞﾘｵと V.vulnificus の鑑別
は、ONPG 試験およびセロビオース分解試
験が有効である。
腸炎ﾋﾞﾌﾞﾘｵと V.vulnificus の鑑別
ONPG ｾﾛﾋﾞｵｰｽ分解性
腸炎ﾋﾞﾌﾞﾘｵ - -
V.vulnificus + +